Abstract
In der Studie über die Pathogenese von Virusenzephalitis, ist die Infektion Methode kritisch. Die erste der beiden Hauptinfektionswege zum Gehirn ist die hämatogene Route, die Infektion der Endothelzellen und Perizyten des Gehirns beinhaltet. Die zweite ist die intracerebroventricular (ICV) Route. Einmal innerhalb des zentralen Nervensystems (ZNS), ausbreiten können Viren auf den Subarachnoidalraum, Meningen und Plexus über den Liquor. In experimentellen Modellen werden die frühesten Stadien der ZNS-viralen Verbreitung nicht gut charakterisiert, und es ist unklar, ob nur bestimmte Zellen zunächst infiziert sind. Hier haben wir die Verteilung von Cytomegalovirus (CMV) Teilchen während der akuten Phase der Infektion untersucht, bezeichnet als primäre Virämie nach ICV oder intravaskulären (IV) Injektion in den neonatalen Mäusegehirn. Im ICV-Injektion-Modell, 5 ul murinen CMV (MCMV) oder fluoreszierenden Mikrokugeln wurden in den lateralen Ventrikel injiziert am midpoint zwischen dem Ohr und Auge, die eine 10-ul-Spritze mit einer Nadel 27 G verwendet wird. In der IV-Injektion-Modell, eine 1-ml-Spritze mit einer 35 G-Nadel verwendet wurde. Ein Durchleuchtungs wurde verwendet, um die oberflächliche zeitliche (facial) Vene des Neugeborenen Maus sichtbar zu machen. Wir infundiert 50 ul MCMV oder fluoreszierende Mikrokügelchen in die oberflächliche zeitliche Vene. Gehirne wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion geerntet. MCMV - Genome wurden unter Verwendung der in situ - Hybridisierungsverfahren nachgewiesen. Fluoreszierende Mikrokügelchen oder grün fluoreszierendes Protein exprimierenden rekombinanten MCMV Partikel wurden durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. Diese Techniken können auf viele andere Pathogene angewendet werden, um die Pathogenese von Encephalitis zu untersuchen.
Introduction
Wenn virale Enzephalitis zu studieren, ist die initiale Verteilung viraler Partikel sehr wichtig Krankheitsentstehung zu verstehen und virale Targets im Gehirn zu identifizieren. Die meisten Viren im Bereich von 20 bis 300 nm in der Größe, obwohl die Pandoraviren mehr als 700 nm 1 groß ist. Die Verteilung der viralen Partikel in der akuten Phase der Infektion kann auf die Größe der Partikel abhängen, die Verteilung von zellulären Rezeptoren oder die Affinität der zellulären Rezeptoren für Viren. In Tiermodellen intracerebroventricular (ICV), intraperitoneale, direkte Plazenta und intravenöse (IV) Infektionen verwendet wurden, um die Pathogenese von Virusenzephalitis zu studieren. ICV Inokulation mit dem Virus wird häufig verwendet, Zentralnervensystem (ZNS) Infektionen in Mäusen herzustellen. Studien dieser Technik berichten weit verbreitete Infektion verwendet, insbesondere von Zellen in der periventrikulären Zonen und in Regionen des Gehirns, in direktem Kontakt mit der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF), similar zu den Wirkungen der viralen ventriculoencephalitis. Die geringe Größe des adeno-assoziierten Virus (AAV) Teilchen (20 bis 25 nm im Durchmesser) erleichtert ihre Verbreitung im Gehirn in ICV Infektionen 2-4. Die intraperitoneale 5, direkte Plazenta 6 und IV - Injektionen 7 repräsentieren hematogenic systemische Verabreichung. Das Eindringen von Viruspartikeln durch die Blut-Hirn - Schranke (BBB) ermöglicht ihnen das Parenchym der neonatalen Gehirn zu erreichen, was diffuse microglial Knötchen 8,9.
Cytomegalovirus (CMV) ist ein verbreitetes Virus, das das Herpes-Virus-Familie gehört. In den Vereinigten Staaten, 50% - 80% der Menschen haben CMV-Infektion durch das Alter hatte 40. CMV-Infektionen selten schädlich sind, aber Krankheiten bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem und Föten führen. Von allen Lieferungen, 0,2% - 2% sind mit CMV 10 geboren, was zu schweren Symptomen wie Mikrozephalie, periventrikuläre Verkalkung, Kleinhirnhypoplasie, microphthalmia und Sehnervenatrophie 11,12. Des Weiteren, geistige Retardierung, Innenohrschwerhörigkeit, Sehstörungen, Krampfanfällen und Epilepsie treten bei etwa 10% der nicht-tödlich CMV-infizierten Säuglingen 13,14. ZNS-Dysfunktion ist die häufigste charakteristisches Symptom von CMV angeborene Anomalie. Mehr Kinder werden dauerhaft jedes Jahr durch kongenitale CMV als durch das Down - Syndrom, das fetale Alkoholsyndrom oder Spina bifida 15 deaktiviert. Es gibt keine Impfung gegen CMV in der Gegenwart, für ein Bedürfnis nach einem sicheren und wirksamen Impfstoff ruft. Untersuchung der Wechselwirkung von CMV-Teilchen mit ihren Rezeptoren in der frühesten Phase der Infektion ist wichtig, die Wirkung der Impfung zu verstehen.
Ventriculoencephalitis und diffuse Mikroglia Knötchen sind die beiden wichtigsten pathologischen Merkmale von CMV - 16 - Enzephalitis. Es ist ungewiss, wie die CMV-Partikel (150-300 nm) in der akuten Phase der Infektion eine durch das Gehirn ausgebreitetnd, wie die Verteilung von zellulären Rezeptoren und ihre Affinität für Viren tragen zur Ausbreitung des Virus. Kawasaki et al. Haben ICV und IV Infektionen aus der Perspektive der Verteilung der Teilchen und ihre Rezeptoren (β1 Integrin) in der frühesten Phase der Infektion beurteilt. Wir haben gefunden, dass die Verbreitung von CMV - Teilchen und der Expression von β1 - Integrin gut in der frühesten Phase der Infektion sowohl ICV und IV Infektionen 8 korreliert sind. ICV-Infektion ist ein Modell der ventriculoencephalitis und IV-Infektion ist ein Modell der diffusen Mikroglia Knötchen. auf die Wirkung der Teilchengröße, viral Wechselwirkungen mit Zellrezeptoren und den Mechanismus der BBB Eindringen in das Gehirn würde nützliche Information, die die Dynamik von viralen oder fluoreszierenden Teilchen zu studieren. Das folgende Protokoll kann jede viralen Infektionen und viralen Vektor in das ZNS zu untersuchen, verwendet werden.
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Protocol
Alle experimentellen Protokolle wurden von der Animal Care Committee von Hamamatsu Universität School of Medicine zugelassen.
1. Herstellung von MCMV (Smith-Stamm) und rekombinante M32-enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) -MCMV
- Erzeugen rekombinante M32-EGFP-MCMV gemäß dem Verfahren wie folgt (1,2-1,9) und wie zuvor 8 beschrieben.
- Verwenden Sie abgeleitete rekombinante Viren aus dem Smith-Stamm von Wildtyp MCMV (Zugangsnummer: U68299). Insert EGFP (4361 Basenpaare; bp) zwischen 37.089 und 41.450 bp (M32 - M31 Locus) im MCMV Genom durch homologe Rekombination.
- Amplify durch Polymerase - Kettenreaktion , die MCMV M32 (41.450 - 39.286 bp, links flankierende Sequenz und M31 (37.089 - 39.246 bp rechten flankierenden Sequenz Genorte unter Verwendung der folgenden Primer: M32, 5'-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '(Vorwärts - Primer), 5 '-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '(Reverse - Primer); M31, 5'-CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3' (Vorwärts - Primer), 5'-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3 '(Reverse - Primer).
- Legen Sie die M32 - Locus in den EGFP-exprimierenden Vektor mit NheI und BamHI Restriktionsstellen. Legen Sie die M31 - Locus in die M32-EGFP -recombinant mit AflII und XbaI - Stellen Plasmid. Spalten die M32 - EGFP - M31 - Sequenz mit NheI und AflII vom M32 - EGFP - M31 Rekombinationsplasmid und lösen sich in H 2 O.
- Transfizieren das gespaltene Konstrukt in die Kerne von MCMV (Smith-Stamm) infizierten NIH3T3-Zellen 24 Stunden nach der Infektion (hpi) ein Elektroporationssystem mit homologe Rekombination zu induzieren.
- Bei 3 Tage nach Infektion, Co-Kultur die Zellen mit nicht-infizierten embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) in einem Verhältnis von 1 / 1.000 in Platten mit sechs Vertiefungen und Bildschirm für EGFP-exprimierenden Foci von infizierten Zellen.
- Harvest die virushaltigen Überstände aus den Vertiefungen grün fluoreszierenden Foci enthält, und das Zehnfache verdünnt. Zur Reinigung wählen Vertiefungen, die einzelne grüne fluoreszierende Foci anzuzeigen.
- Wenn alle von der Grenzverdünnung Infektion Anzeige EGFP-Expression resultierenden Brennpunkten ist das Viruspräparat rein, was darauf hinweist, dass keine Wildtyp-Virus bleibt. Quantifizierung des Virus durch den Plaque-Assay - Verfahren , wie zuvor beschrieben 17.
- Behandeln Sie MCMV in zertifizierten biologischen Sicherheit Schränke auf Biosicherheitsstufe 2 Handschuhe und Maske tragen.
- Passage MCMV (Smith - Stamm) und rekombinantem MCMV in MEFs , hergestellt aus 12 Tage alten ICR - Mäuseembryos , wie zuvor beschrieben 17.
- Entfernen Zellen aus den Überständen von infizierten MEF Kulturen durch Zentrifugation bei 3.000 × g für 20 min bei 16 ° C.
- Ultracentrifuge die Überstände für 40 Minuten bei 70.000 × g. Resuspendieren der Pellets Virionen in 1 ml Tris-gepufferter Kochsalzlösung und Transfer auf eine vorgeformten linearen s enthältOrbitol Gradienten (25% - 70%). Ultracentrifuge wieder bei 70.000 x g für 60 min 18.
- Ernten Sie die Virion haltige Band mit einer Spritze. Pellet die geernteten Virionen durch einen zusätzlichen Ultrazentrifugationsschritt bei 70.000 × g für 40 min.
- Das Pellet in 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und bei -80 ° C, bis die Infektionsversuche.
- Quantifizierung der Virustiter durch den Plaque-Assay - Verfahren , wie zuvor beschrieben 19.
- Visualisieren der EGFP - Expression der rekombinanten MCMV Teilchen (Anregung bei 489 nm, Emission bei 508 nm) durch Fluoreszenzmikroskopie (1A) und der Partikelstruktur durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) 8 (1B).
2. Herstellung von Nile Red Fluorescent Microbeads
- Kauf Carboxy fluoreszierende Nil rot Mikrokügelchen und legen 500 ul Mikrokügelchen in die Rohre zu Durchmesser nach (0,04- 0,06 & mgr; m, etwa 3,63 × 10 12 Partikel; 0,1-0,3 & mgr; m, etwa 5,75 × 10 10 Partikel; und 1,7 bis 2,2 & mgr; m, etwa 6,85 × 10 7 Teilchen).
- Behandeln Sie Perlen mit 500 ul 0,1 M NaOH für circa 1 Tag keine Endotoxine zu entfernen und die Perlen in sterilem Wasser bei RT resuspendieren.
- Adsorbieren die Perlen O / N mit 10% Mausserum von C57BL / 6-Mäusen bei RT vor erhalten zu verwenden.
- Zur Trennung Aggregate, die Perlen Wirbel und beschallen gründlich vor dem Gebrauch.
3. ICV Injektion von MCMV und Fluorescent Microbeads in Neonatal Mäuse
- Pflegen normalen schwangeren ICR-Mäuse in einer temperaturgesteuerten Anlage unter einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus. Die Neugeborenen werden als P 0,5 am Tag der Geburt bezeichnet.
- Sterilisieren eine 10-ul-Spritze und einer 27 G-Nadel mit 70% Alkohol.
- Laden Sie die Injektionslösung (5 ul), die MCMV oder fluoreszierende MikroPerlen in die Nadel durch vorsichtiges den Kolben der Spritze gezogen wird.
- Verhalt neonatalen Maus (P 0.5), indem Sie die Maus für 3 auf Eis setzen - 4 min. Sobald das Tier unter Narkose ist, verwenden Sie die Zehen Prise Antwortverfahren der Narkosetiefe zu bestimmen.
- Mark die Injektionsstelle mit einem nicht-toxischen Labor Stift an einer Stelle etwa 0,7 bis 1,0 mm zu der sagittalen Naht lateral und 0,7 bis 1,0 mm caudal von der neonatalen Bregma (2A).
- Die Nadel 2 mm tief, senkrecht zu der Schädeloberfläche an der markierten Injektionsstelle. Als Referenz markieren 2 mm von der Spitze der Nadel mit einem nicht-toxischen Hersteller.
- Injizieren langsam 5 ul MCMV (etwa 5 × 10 5 PFU) in den lateralen Ventrikel ohne die Kopfhaut (2B) zu öffnen.
- In einer anderen Gruppe von Mäusen, injizieren eine 5 ul Lösung fluoreszierende Mikrokügelchen , die (0,1-0,3 & mgr; m, etwa 5,75 × 10 8 Teilchen) durchdie gleiche Methode.
- 20 Sekunden nach der Kolbenbewegung Rückfluss zu verhindern Absetzen - langsam die 10 Nadel entfernen.
- Wiederherzustellen, halten Sie die Mäuse 5 - 10 min in einem warmen Behälter, bis Bewegung und allgemeine Reaktions wiederhergestellt werden.
- Ernten Sie die Gehirne, wie in Abschnitt 5 in einem Bereich von Zeitpunkten beschrieben (3, 12, 24, 48 und 72 h) nach der Injektion.
4. IV Injektion von MCMV oder Fluorescent Microbeads in Neonatal Mäuse
- Verhalt neonatalen Maus (P 0.5), indem Sie die Maus für 3 auf Eis setzen - 4 min.
- Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze mit einer 35 G-Nadel die intravenöse Injektion von MCMV in P 0,5 Neugeborenen durchzuführen.
- Verwenden Sie einen Transilluminator (Vene Finder) die oberflächliche zeitliche (Gesichts-) Vene sichtbar zu machen. Vor der Injektion sichern die Neugeborener auf die Transilluminator chirurgischen Band (2C).
- Während Lupen tragen (1.5X), ziehen lassen langsam 50 ul MCMV (etwa 5,45 ×; 10 9 Partikel) oder fluoreszierende Mikrokügelchen (0,04 bis 0,06 & mgr; m, etwa 3,63 × 10 11 Partikel; 0,1-0,3 & mgr; m, etwa 5,75 × 10 9 Partikel und 1,7 bis 2,2 & mgr; m, etwa 6,85 × 10 6 Teilchen) in die oberflächliche zeitliche Vene (2D).
- Nachdem die Nadel entfernt haben, verwenden Gaze 70% Alkohol enthält, Druck auf die Injektionsstelle zu gelten, bis die Blutung aufhört.
- Geben dem neonate etwa 5 min in einen warmen Behälter, bevor es in den Käfig zurückkehrt zu erholen.
- Ernten Sie die Gehirne, wie in Abschnitt 5 in einem Bereich von Zeitpunkten beschrieben (3, 12, 24 und 72 Stunden) nach der Injektion.
5. Gehirngewebe Probenvorbereitung für die Paraffinschnitte
- Legen Sie die injizierten Neugeborenen in einem kleinen Plastikschale auf zerstoßenem Eis.
- Sobald das Tier unter Narkose ist, verwenden Sie die Zehen Prise Antwortverfahren die Tiefe der anesthes zu bestimmenia.
- Machen Sie eine zentrale oder zwei Ende horizontal Ende schneidet durch den Brustkorb der Brusthöhle zu öffnen.
- Machen Sie einen Schnitt in das Atrium mit einer scharfen Schere. 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung in das Atrium ziehen lassen. Stopp-Perfusion, wenn spontane Bewegung (PFA Tanz) und aufgehellt Farbe der Leber beobachtet. Nicht exsanguinate.
- Präparieren Sie die Neugeborenen (wie zuvor 20 beschrieben) , indem Sie zuerst den Kopf Entfernen einer Schere.
- Machen Sie einen Mittelschnitt entlang der integument vom Hals an der Nase, den Schädel zu belichten.
- Legen Sie das scharfe Ende eines Paares von Iris Schere in das Foramen magnum auf der einen Seite, vorsichtig entlang der inneren Oberfläche des Schädels schieben.
- Machen Sie einen Schnitt an der distalen Kante der hinteren Schädeloberfläche erstreckt, und stellen Sie einen identischen Schnitt auf der Gegenseite. Deaktivieren Sie den Schädel um das Cerebellum entfernt.
- Ziehen Sie vorsichtig den Schädel auf einer Seite zu verhindern Schädigung des Gehirns zurück. Wiederholen Sie diesen VorgangVerfahren auf der anderen Seite des Gehirns.
- Mit einem Spatel, trennen die Riechkolben und Nervenverbindungen entlang der ventralen Oberfläche des Gehirns.
- mit einer Schere, und entfernen Sie das Gehirn vorsichtig trennen das Gehirn aus dem Kopf, jede dura Trimmen, die noch das Gehirn an den Schädel zu verbinden.
- Platzieren das Gehirn in einer Phiole Fixiermittel, enthaltend 4% PFA mindestens 10-mal das Volumen des Gehirns für 24 h bei 4 ° C.
- Dehydratisieren, um das Gewebe durch eine Reihe von abgestuften Ethanolbädern, das Wasser zu verdrängen, und dann mit Paraffinwachs infiltrieren, einen Block zu bilden. Schneiden Sie den Paraffinblock mit einem Mikrotom in Scheiben 4 um dicke 21.
- Entparaffinieren und Rehydrierung die Folien der infizierten Gehirne 22. Fahren Sie mit in - situ - Hybridisierung für Paraffin eingebettete Schnitte.
6. Gehirngewebe Probenvorbereitung für die Gefrierschnitte
- Entfernen Sie das Gehirn nach den beschriebenen Schritten in 5,1-5,11.
- Um die fluoreszierenden Mikrokügelchen und M32-EGFP-MCMV, legen Sie das reseziert Gehirn auf flachem Boden cryomolds beobachten. In Einbettmedium vollständig die Gehirnprobe abzudecken. Schnapp gefrieren die cryomolds in vorgekühltem n - Hexan (-80 ° C), einer Pinzette den Rand der cryomolds es dem Futter zu befestigen vor zu halten.
- Für sectioning, das gefrorene Gewebeblock auf dem vorgekühlten Kryostaten Futter befestigen. Übertragen Sie das gefrorene Gewebe mit dem Futter in einer Kryostatkammer und Absenken der Temperatur auf zwischen -10 und -20 ° C, und die Scheiben ca. 8 - 10 & mgr; m dick 23.
- Fixieren die Abschnitte mit cytofixative (Gemisch aus Isopropylalkohol und Polyethylenglykol) durch Aufsprühen. Luft trocknen die Abschnitte für 30 min bei RT sofort nach dem Spritzen und lagern Sie sie bei - 80 ° C bis zur weiteren Verwendung.
- Äquilibrieren die Abschnitte auf RT zurück und waschen dreimal mit PBS.
- Beflecken die Abschnitte mit Fluorescein - Isothiocyanat (FITC) -konjugiertem Griffonia simplicifolia isolectin B4 bei einer Konzentration von 1: 100 für 10 min in PBS bei RT (Figur 5) oder mit PE-konjugierten CD31 - Antikörper in einer Konzentration von 1: 100 für 30 min in PBS bei RT (Abbildung 6).
- Waschen Sie die Abschnitte mit dreimal PBS.
- Nach dem Waschen beflecken die Abschnitte mit 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Zellkerne sichtbar zu machen. Montieren der Abschnitte in anti-fade-Reagenz und Bild DAPI (Anregung bei 345 nm, Emission bei 455 nm), EGFP (Anregung bei 489 nm, Emission bei 508 nm) und Nilrot (Anregung bei 553 nm, Emission bei 637 nm) mit einem Fluoreszenzmikroskop (Figuren 3, 5, 6).
7. Fluoreszenz - in - situ - Hybridisierung (FISH) für Paraffin eingebettete Schnitte
- Bereiten Sie die FISH - Sonde direkt mit Fluorophor für die DNA - in situ - Hybridisierung durch Nick - Translation unter Verwendung eines bakteriellen künstlichen Chromosom enthält die gesamte MCMV DNA Gen markiertome (pSM3fr) 19. Die Konzentration der FISH-Sonde beträgt 0,1 ug / ul.
- Entparaffinieren und Rehydrierung die Folien der infizierten Gehirne 22.
- Behandeln die Gewebeschnitte mit RNase (100 & mgr; g / ml in PBS) viraler DNA zu detektieren.
- Führen Antigen-Retrieval mit 0,05% NP40, 0,01 M Citratpuffer (pH 6,0) bei 95 bis 98 ° C für 20 min. Kühlen Sie die Folien bis auf RT für 20 min.
- In einem Färbeküvette Glas Coplin, waschen Sie die Folien in reinem Wasser dreimal für 2 Minuten jedes Mal. Durchführen eines zusätzlichen Antigen-Retrieval-Schritt mit einer 0,06% Pepsin, 0,01 N HCl-Lösung für 5 min bei 37 ° C.
- Rinse gleitet dreimal in reinem Wasser für 2 Minuten jedes Mal in einem Färbeküvette Glas Coplin.
- Dehydratisieren der Gewebeschnitte wieder durch den Objektträger aus 70% Ethanol Übertragung bis 85% Ethanol und dann mit 100% Ethanol.
- 10 ml des Hybridisierungspuffers zur Herstellung mischen 1,25 ml in situ Hybridisierungssalze (3 M NaCl, 100 mM TrisHCl pH 8,0, 100 mM Natriumphosphat pH 6,8, 50 mM EDTA) mit 5 ml entionisiertes Formamid, 2,5 ml 50% Dextransulfat, 250 & mgr; l 50x Denhardt-Lösung, 125 ul 100 mg / ml tRNA und 875 & mgr; l H 2 O.
- Verdünne die DNA-Sonde direkt markiert mit Fluorophoren, die die gesamte MCMV-Genom zufällig in dem Hybridisierungspuffer zu erkennen. Das Endvolumen sollte 10 & mgr; l (7 & mgr; l Hybridisierungspuffer, 1 & mgr; l Sonde (0,1 ug / ul) und 2 & mgr; l destilliertes Wasser) sein.
- Fügen Sie die Sondenmischung (10 ul) zu jeder Folie und Deckel mit einem Deckglas (15 x 15 mm). Deckglasränder mit Gummi-Zement. Denaturieren die Sondenmischung für 5 min bei 85 ° C, und schließen Sie den Hybridisierungsschritt O / N bei 42 ° C.
- Waschen der Objektträger mit 0,3% NP40, 0,4x SSC bei 73 ° C für 2 min; mit 0,1% NP40, 0,4x SSC bei 73 ° C für 1 min; und mit 2x SSC zweimal.
- Counterstain die Kerne mit DAPI (10 ng / ml) und die Folie mit einem Deckglas abdecken.
- Montierendie Abschnitte in anti-fade - Reagenz und Bild DAPI (Anregung bei 345 nm, Emission bei 455 nm) und EGFP (Anregung bei 489 nm, Emission bei 508 nm) mit einem Fluoreszenz - Mikroskop (Abbildung 4).
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Representative Results
In Untersuchungen zur Pathogenese von viralen Enzephalitis, ist die Infektion Verfahren wichtig. Die hämatogenen Weg stellt eine akute Infektion der Endothelzellen und Perizyten des Gehirns, während der ICV Route eine akute Infektion stellt über das CSF durch den Subarachnoidalraum ausbreitet, bis zu den Meningen und Plexus choroideus. Um die erste Verteilung der Partikel in akuten Enzephalitis analysieren, in - situ - Hybridisierung der MCMV Genome und die direkte Beobachtung von M32-EGFP-MCMV Partikel oder fluoreszierende Mikrokügelchen wurden Detektion verwendet.
Erzeugung von rekombinanten MCMV (M32-EGFP-MCMV)
Das Protokoll zeigt, wie rekombinante M32-GFP-MCMV generiert wurde. EGFP wurde zwischen 37.089 und 41.450 bp (M32-M31 locus) in dem MCMV - Genom durch homologe Rekombination eingefügt. Ein EGFP protein wurde mit einem viralen Protein (M32) fusioniert und EGFP wurde innerhalb der viralen Teilchen ausgedrückt. Nach homologe Rekombination wurde ein Viruspräparat rein betrachtet, wenn alle aus dem Grenzverdünnungs Infektion resultierende Brennpunkte EGFP-Expression angezeigt, was darauf hinweist, dass kein Wildtyp-Virus geblieben. Es können mehrere Verdünnungsverfahren nehmen das rekombinante Virus zu reinigen. 1A zeigt EGFP Signale von gereinigtem rekombinantem MCMV (M32-EGFP-MCMV) und 1B zeigt ein TEM - Bild von M32-EGFP-MCMV - Partikel das Virus - Genom in den viralen Kern , enthaltend .
Intracerebroventricular Injektion und intravaskuläre Injektion
Figur 2 zeigt die Injektionsstellen der neonatalen Maus (P 0,5) , wobei Virus- oder Mikrokugeln durch den ICV Route oder der IV Weg injiziert. In ICV ist die Injektionsstelle am Mittelpunkt zwischendas Ohr und Auge, an einer Stelle etwa 0,7 bis 1,0 mm lateral der Sutura sagittalis und 0,7 bis 1,0 mm caudal von der neonatalen Bregma (2A). Die Nadel sollte in den lateralen Ventrikel 2 mm tief, senkrecht zu der Schädeloberfläche (2B). 2C und 2D eingespritzt werden , zeigen , dass MCMV oder Microbeads in die Schläfen Vena facialis neonataler Mäuse injiziert werden. Ein Durchleuchtungs und Lupen sind hilfreiche Werkzeuge zu deutlich kleinen Venen sichtbar zu machen.
Die Verteilung von Viruspartikeln / Genomen und Fluorescent Microbeads
Die folgenden Abbildungen zeigen die Verteilung der viralen Partikel / Genome und fluoreszierende Mikrokügelchen in der akuten Phase. Abbildung 3 zeigt die Mikrobead Signale von Gefrierschnitten des Gehirns. 3A und 3B die zeigen ,Verteilung der 0,1 -. 0,3 um fluoreszierende Nil rot Mikrokügelchen im Randbereich (MA) (3A) und den Plexus und Subventrikularzone (SVZ) (3B) bei 2 Stunden nach ICV Injektion 3C und 3D zeigen die Verteilung der 0,1 bis 0,3 & mgr; m fluoreszierende Nil rot Mikrokügelchen in der MA und Gefäßbereich (3C) und den Plexus und SVZ (3D) in 2 Stunden nach der IV - Injektion. Es ist wahrscheinlich, dass nach ICV und IV Injektion Teilchen nicht sofort gleichförmig über das Parenchym ausgebreitet hat. Vielmehr blieben sie in der SVZ, MA, und Gefäßbereich in der akuten Infektionsphase. Die Größe der Partikel ist der primäre Faktor , ihre Verteilung im Gehirn in der akuten Phase nach ICV und IV - Injektion zu beeinträchtigen. 4 zeigt die FISH des MCMV - Genoms an den Paraffin eingebettete Schnitte des Gehirns. Das MCMV-Genom (grüne Punkte) wurde in der detektierteSVZ bei 3 Stunden nach ICV Injektion (4B). Die MCMV Genome (grüne Punkte) wurden in der MA und Gefäßbereich bei 3 Stunden nach der IV - Injektion (4C) nachgewiesen. Die Verteilung des MCMV (Abbildung 4) und Mikrokugeln (Figur 3) waren recht ähnlich. 5 zeigt die größenabhängigen Verteilungsmuster von Mikrokügelchen in den Gefrierschnitten des Gehirns nach intravenöser Injektion. Microbeads mit Durchmessern von 1,7 bis 2,2 & mgr; m (5B), 0,1-0,3 & mgr; m (5D) und 0,04 bis 0,06 um (5E) jeweils gezeigt. Kleinere Mikrokügelchen hatten eine Tendenz , aus dem Gefäßbereich im Parenchym werden extravasierten. 6 zeigt die Verteilung von M32-EGFP-MCMV - Teilchen in den Gefrierschnitten des Gehirns. GFP Punktsignale (M32-EGFP-MCMV - Teilchen) wurden in der MA (6A) und Plexus choroideus und SVZ hauptsächlich beobachtet (
Abb . 1: Erzeugung von rekombinanten M32-EGFP-MCMV (A) ultrazentrifugiert M32-EGFP-MCMV Partikel werden als grüne Flecken durch Fluoreszenzmikroskopie gesehen. Maßstabsbalken:. 2,4 um (B) Transmissionselektronenmikroskopie zeigt , dass M32-EGFP-MCMV - Partikel besitzen eine typische Virusstruktur. Maßstabsbalken: 77 nm.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54164/54164fig1large.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Injektionsstellen der Neonatal - Maus. (A, B) ICV Injektion von 5 & mgr; l MCMV (etwa 5 × 10 5 PFU) oder von 5 & mgr; l - Mikrokügelchen (etwa 5,75 × 10 9 Teilchen). (A) Die Injektionsstelle ist in der Mitte zwischen dem Ohr und Auge (bei eine Position ungefähr 0,7-1,0 mm auf der sagittalen Naht und 0,7 lateral -. 1,0 mm caudal von der neonatalen Bregma) (B) A 27 G Nadel mit einem 10-ul - Spritze für die Injektion in den lateralen Ventrikel 2 mm tief eingesetzt, senkrecht zu der Schädeloberfläche. (C, D) MCMV oder Microbeads in die Schläfen Vena facialis neonataler Mäuse injiziert werden. (C) (D) Eine 1-ml - Spritze mit einer 35 G - Nadel verwendet wird , um die IV - Injektion von MCMV auszuführen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
. Abbildung 3: Visualisierung von Fluoreszenz Nile Red Microbeads im Gehirn (A, B) von 0,1 bis 0,3 & mgr; m fluoreszierende Nil rot Microbeads Signale (rot) sind in der MA (A) und den Plexus und SVZ (B) in 2 h beobachtet Post ICV Injektion (C, D) 0,1 -. 0,3 um fluoreszierendes Nilrot Mikrobeads in die neonatale Maus Gehirn eingeführt durch IV - Injektion bei 2 Stunden nach der Injektion. Nil roten Mikrokügelchen werden in th beobachtete MA und Gefäßbereich (C) und den Plexus und SVZ (D). Das weiße Quadrat wird in der erweiterten Einsatz in oben rechts (D) vergrößert (A, C) Maßstab:. 50 um (B, D) Maßstab:. 150 & mgr; m. Die Pfeile zeigen Nil rot Microbeads. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: MCMV Genom Verteilung im Gehirn der Maus Nach ICV Injektion und intravenöse Injektion (A) Die untere Vergrößerungsansicht.. Das weiße Quadrat zeigt an, wo das vergrößerte Bild (B) erfasst wurde. (B) Die MCMV - Genom (grüne Punkte) zuerst in der SVZ bei 3 Stunden nach ICV Injektion festgestellt wird. DAPI (4 ';, 6-diamidino-2-phenylindole) wird für die Kernsäure (Kern-) Färbung verwendet. Maßstabsbalken:. 30 & mgr; m (C) Das MCMV - Genom (grüne Punkte) in der Gefäßbereich und Meningen bei 12 Stunden nach der IV - Injektion festgestellt. DAPI wird für die Kernsäure-Färbung verwendet. Maßstabsbalken: 30 & mgr; m. Die Pfeile zeigen repräsentative MCMV - Genoms (grüne Punkte). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5:. Die Beziehung zwischen dem Durchmesser von Microbeads und die Verteilung der Microbeads Fluorescent Nil rot Mikrokügelchen (50 ul) in neonatalen Mäusegehirnen durch IV - Injektion eingeführt. In Gefrierschnitte 2 Stunden nach der Injektion, Nil rote Signale (rot, angedeutet durch Pfeile) sind in und um die vascul beobachtetar Bereich des Parenchyms. Die Gefäßbereich ist gefärbt mit fluoreszierenden Lektin (grün) (A, B) 1,7 -.. 2,2 um Mikrokugeln (A) Die untere Vergrößerungsansicht. Das weiße Quadrat zeigt an, wo das vergrößerte Bild (B) aufgenommen wurde (B) Das weiße Quadrat als der erweiterten Einsatz in der oberen rechten Seite von (B) vergrößert wird (C, D) 0,1 -... 0,3 um Mikrokügelchen (C) Das geringer Vergrößerung Ansicht. Das weiße Quadrat zeigt an, wo das vergrößerte Bild (D) aufgenommen wurde (D) Das weiße Quadrat als der erweiterten Einsatz in der oben rechts (D) vergrößert wird (E, F) 0,04 -... 0,06 um Mikrokugeln (E) geringer Vergrößerung Ansicht. Das weiße Quadrat zeigt an, wo das vergrößerte Bild (F) erfasst wurde. (F) Das weiße Quadrat als der erweiterten Einsatz in der rechts oben vergrößert
Abbildung 6: Beobachtung von Viruspartikeln in der akuten Infektionsphase. (A, B) EGFP Punktsignale (M32-EGFP-MCMV - Partikel) werden hauptsächlich in der MA beobachtet (angezeigt durch Pfeile, A), Plexus choroideus und SVZ (angedeutet durch Pfeile, B) in 2 h Nacheinspritzung ICV. Die weißen Quadrate werden als die vergrößerte Einsätze in der oberen rechten Seite von (A) und (B) vergrößert. Maßstabsbalken:. 20 & mgr; m (C, D) in 3 Stunden nach der IV - Injektion, die MCMV Partikel (grün, angezeigt durch Pfeile) innerhalb und außerhalb des Gefäßbereich gefunden vondas Parenchym (C), Plexus, und SVZ (D) (rot: CD31-positive Zellen). Die weißen Quadrate werden als die vergrößerte Einsätze in der oberen rechten Seite von (C) und (D) vergrößert. Maßstabsbalken:. 20 & mgr; m Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
In Tiermodellen, ICV, intraperitoneale, direkte Plazenta und IV-Infektionen verwendet wurden, die Pathogenese von Virusenzephalitis zu studieren. Wir konzentrierten uns auf die ICV und IV-Injektion Modelle von neugeborenen Mäusen für die Einfachheit der Verfahren und der Nutzen der direkten Injektion von Partikeln in den Zielbereich. Obwohl intraperitoneale Infektion ist eine einfache Methode, verteilt Viruspartikel systemisch über einen indirekten Prozess 5,24. Direkte plazentaren Infektion ist eine gute Methode embryonalen systemische Infektion zu studieren. Jedoch erfordert dieses Verfahren eine spezielle Ausbildung stabile Ergebnisse zu erhalten und eine niedrige Erfolgsquote. Die Infektion Verfahren ist auch ein indirektes Verfahren durch die Plazenta und es ist schwierig , bei jedem Versuch 6 die Menge der Einspritzung in den Fötus zu steuern. Da die neonatale Maus sehr anfällig für Viren, wie CMV ist, in dieser Studie konnten wir die Verteilung von viralen Partikeln und der infizierten Zellen bei den sehr frühen phas vergleichene der Infektion. Der ICV Injektion Modell ist von Vorteil , um die Infektion Verhalten zu untersuchen, die die BBB 25 umgeht, während die IV - Infektionsmodell eine systemische Infektion Modell ähnelt einer natürlichen Infektion einschließlich der Interaktion des Virus mit der BBB ist.
Mit dem ICV Injektionsverfahren haben wir sicher, mindestens 2 mm tief in den Schädel eindringt. Die Nadel wurde in den Hirnventrikel gehalten ca. 10 - 20 sec 26 Rückfluss aus dem Ventrikel zu verhindern. Wenn sorgfältig durchgeführt, ist ICV Injektion eine schnelle und einfache In - vivo - Verfahren. Aber manchmal ungenau Injektionen einschließlich unerwünschten Rückfluss oder tief / flach Eindringen der Nadel in das Gehirn kann passieren. Eine sorgfältige Verfahren und Beobachtungen nach der Injektion sind erforderlich, um dieses Protokoll erfolgreich durchzuführen. die Injektionsfehler Unter Berücksichtigung konzentrieren wir uns nur auf die Verteilungsmuster der Partikel und nicht auf die Menge, und hat die Behandlung Auswirkungen der Droge nicht beobachtens oder funktioneller Antikörper in unserer Studie.
Es gibt verschiedene Verfahren, um die Maus Neugeborenen IV-Injektion, durch mehrere Seiten wie oberflächlichen Schläfenadern, externe Halsvene und retro-orbitalen Sinus auszuführen. Die oberflächliche zeitliche Vene Neugeborener wird unter Verwendung eines Durchleuchtungs und Vergrößerungslinse leicht sichtbar gemacht. Injektion kann durch einen einzigen erfahrenen Person mit einem hohen Erfolg abgeschlossen werden, wählte rate.We die oberflächliche zeitliche Vene als Ort der IV-Injektion. Die IV-Injektionsverfahren erfordert eine Ausbildung wie die Neugeborenen-Maus und das Injektionsverfahren zu positionieren. Der Leiter der Neugeborenen-Maus sollte mit Klebeband positioniert werden, um die zeitliche Vene oben und flach. Die 35 G Nadel sollte in den Behälter weit genug, dass die Spitze der Nadel durch das Gefäß vollständig umgeben eingefügt werden. Ein Durchleuchtungs und Lupen sind hilfreiche Werkzeuge zu deutlich kleinen Venen sichtbar zu machen. Injektion großer Volumina bis zu 100ul sollte langsam werden, um zu bestätigen, die Strömung des Inhalts infundiert. Im Falle des Scheiterns der Einspritzung auf den ersten Versuch, die andere Seite des Schläfenader ist für eine weitere Testversion zur Verfügung. Nach der Injektion erleben Welpen minimal Not und schnell zu erholen. Es ist nicht klar, warum im Durchschnitt eine von 20 Welpen großen Not geraten und nicht erholen. Allerdings ist die niedrige Rate des Auftretens dieses Ereignisses minimal schädigt die ganze experimentelle Design.
Da das IV-Injektionsverfahren eine hohe Erfolgsrate (über 80%) hat, könnten wir die Verteilungsmuster mit und ohne systemische Behandlungen wie Medikamente oder funktionelle Antikörper vergleichen. Wir haben geführt zuvor ein Experiment, bei dem neonatalen Mäusen, die mit anti-β1-Integrin-funktionellen blockierende Antikörper (50 & mgr; l bei 20 & mgr; g / g) oder Isotyp-Kontrollantikörper (50 & mgr; l bei 20 & mgr; g / g) in die oberflächlichen temporal vein neonataler Mäuse injiziert wurden. Eine Stunde nach der Antikörper-Injektion, 5 x 106 PFU (50 ul) von MCMV wurden in die andere Seite der zeitlichen Vene infundiert. Die Zahl der MCMV-positiven Zellen pro Abschnitt von Hamster - anti-Ratten - CD29 (β1 - Integrin - Kette, klonen Ha2 / 5) behandelten Gehirn signifikant niedriger waren , als mit der Isotyp Antikörper behandelten Gehirn 8 verglichen werden . Unter Verwendung des gleichen Verfahrens in zukünftigen Untersuchungen können die Wirkungen von Arzneimitteln oder neutralisierenden Antikörpern gegen Viren durch Beobachten der Verteilung von viralen Partikeln und infizierten Zellen ermittelt werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane | Sigma-Aldrich | T-6791 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H-1758 | |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S-1876 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04 - 0.06 | Spherotech, Inc. | FP-00556-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1 - 0.3 | Spherotech, Inc. | FP-0256-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7 - 2.2 | Spherotech, inc. | FP-2056-2 | |
| 10% mouse serum | DAKO | X0910 | |
| C57BL/6 mouse | SLC, Inc. | ||
| ICR mouse | SLC, Inc. | ||
| Modified Microliter Syringes (7000 Series) | Hamilton company | ||
| 35-gauge needle | Saito Medical | ||
| A Wee Sight Transilluminator | Phillips Healthcare | 1017920 | |
| O.C.T.Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Nonidet(R) P-40 | Nacalai | 25223-04 | |
| citrate buffer (pH 6) x 10 | Sigma-Aldrich | C9999-100ml | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| EDTA | dojindo | N001 | |
| Formamide | TCI | F0045 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | 42867-5G | |
| Denhardt's Solution (50x) | ThermoFishcer sceintific | 750018 | |
| Yeast tRNA (10 mg/ml) | ThermoFishcer sceintific | AM7119 | |
| SSC 20x | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| DAPI | ThermoFishcer sceintific | D1306 | |
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| superfrost plus glass | ThermoFishcer sceintific | 12-55-18 | |
| Cytokeep II | Nippon Shoji Co. | ||
| FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 | Vector laboratories, Inc. | L1104 | |
| Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE | ebioscience | 12-0311 | |
| ProLong Gold | ThermoFishcer sceintific | P36934 | |
| BIOREVO | KEYENCE | BZ-9000E |
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