Abstract
Nello studio sulla patogenesi di encefalite virale, il metodo infezione è critica. La prima delle due principali vie infettive al cervello è la via ematogena, che coinvolge l'infezione delle cellule endoteliali e periciti del cervello. Il secondo è il intracerebroventricolare (ICV) percorso. Una volta all'interno del sistema nervoso centrale (CNS), i virus possono diffondersi nello spazio subaracnoideo, meningi, e plesso coroideo attraverso il fluido cerebrospinale. In modelli sperimentali, le prime fasi di distribuzione virale del sistema nervoso centrale non sono ben caratterizzati, e non è chiaro se solo alcune cellule infettate sono inizialmente. Qui, abbiamo analizzato la distribuzione del citomegalovirus (CMV) particelle durante la fase acuta dell'infezione, chiamato viremia primaria, seguendo ICV o intravascolare (IV) iniezione nel cervello neonatale mouse. Nel modello di iniezione ICV, 5 ml di murino CMV (MCMV) o microsfere fluorescenti sono stati iniettati nel ventricolo laterale al midpoint tra l'orecchio e l'occhio utilizzando una siringa da 10 microlitri con un ago 27 G. Nel modello di iniezione IV, è stata utilizzata una siringa da 1 ml con un ago 35 G. Un transilluminatore stato usato per visualizzare temporale (facciale) vena superficiale del mouse neonatale. Abbiamo infuso 50 ml di MCMV o microsfere fluorescenti nella vena temporale superficiale. Brains sono state raccolte in diversi momenti dopo l'iniezione. Genomi MCMV sono stati rilevati utilizzando il metodo di ibridazione in situ. microsfere fluorescenti o proteina verde fluorescente che esprimono particelle MCMV ricombinanti sono stati osservati al microscopio a fluorescenza. Queste tecniche possono essere applicate a molti altri patogeni per studiare la patogenesi di encefalite.
Introduction
Studiando encefalite virale, la distribuzione iniziale di particelle virali è molto importante per comprendere patogenesi della malattia e per identificare bersagli virali nel cervello. Maggior parte dei virus variano in dimensioni da 20 a 300 nm, sebbene il pandoravirus è superiore a 700 nm di dimensione 1. La distribuzione delle particelle virali in fase acuta dell'infezione può dipendere dalla dimensione delle particelle, la distribuzione dei recettori cellulari, o l'affinità dei recettori cellulari di virus. In modelli animali, intracerebroventricolare (ICV), intraperitoneale, placentari diretta, e per via endovenosa (IV) le infezioni sono state usate per studiare la patogenesi di encefalite virale. ICV inoculazione con il virus viene spesso utilizzato per stabilire le infezioni del sistema nervoso centrale (CNS) nei topi. Gli studi che utilizzano questa tecnica riportano infezione diffusa, in particolare delle cellule nelle zone periventricolari e nelle regioni del cervello in diretto contatto con il liquido cerebrospinale (CSF), similar agli effetti ventriculoencephalitis virale. Le piccole dimensioni del virus adeno-associato (AAV) particelle (20 - 25 nm di diametro) facilita la loro diffusione in tutto il cervello nelle infezioni ICV 2-4. Intraperitoneale 5, placentari diretta 6, e IV iniezioni 7 rappresentano la somministrazione sistemica hematogenic. La penetrazione delle particelle virali attraverso la barriera emato-encefalica (BBB) consente di raggiungere il parenchima cerebrale neonatale, rappresentando diffuse noduli microgliali 8,9.
Citomegalovirus (CMV) è un virus comune che appartiene alla famiglia herpes virus. Negli Stati Uniti, il 50% - 80% delle persone hanno avuto infezione da CMV per età 40. infezioni da CMV raramente sono dannosi, ma possono causare malattie nei pazienti immunocompromessi e feti. Di tutte le consegne, 0,2% - 2% sono nati con CMV 10, con conseguente sintomi gravi, come la microcefalia, calcificazioni periventricolare, ipoplasia cerebellare, microftalmia, e del nervo ottico atrofia 11,12. Inoltre, il ritardo mentale, sordità neurosensoriale, difetti visivi, convulsioni ed epilessia si verificano in circa il 10% dei non-fatalmente neonati CMV-infettati 13,14. CNS erettile è il sintomo caratteristico più comune di CMV anomalia congenita. Più i bambini sono permanentemente disabilitati ogni anno da CMV congenito che da sindrome di Down, la sindrome alcolica fetale, o spina bifida 15. Non ci sono vaccinazioni contro CMV disponibile al momento attuale, chiedendo la necessità di un vaccino sicuro ed efficace. Studiando l'interazione di particelle CMV con i loro recettori nella primissima fase di infezione è importante capire l'effetto della vaccinazione.
Ventriculoencephalitis e noduli microgliali diffuse sono le due principali caratteristiche patologiche di CMV Encefalite 16. E 'stato chiaro come le particelle CMV (150 - 300 nm) diffondono attraverso il cervello nella fase acuta dell'infezione unnd come la distribuzione dei recettori cellulari e la loro affinità per i virus contribuiscono alla diffusione virale. Kawasaki et al. Hanno valutato ICV e IV infezioni dal punto di vista della distribuzione delle particelle e dei loro recettori (β1 integrine) nella fase più antica di infezione. Abbiamo scoperto che la diffusione di particelle CMV e l'espressione di β1 integrina sono ben correlata nella primissima fase di infezione sia ICV e le infezioni IV 8. infezione ICV è un modello di ventriculoencephalitis e l'infezione IV è un modello di noduli microgliali diffuse. Studiando le dinamiche di particelle virali o fluorescenti darebbe utili informazioni sull'effetto della dimensione delle particelle, interazioni virali con recettori cellulari, e il meccanismo di penetrazione BBB nel cervello. Il seguente protocollo potrebbe essere utilizzato per studiare qualsiasi infezione virale e vettore virale nel SNC.
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Protocol
Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato Animal Care di Hamamatsu University of School of Medicine.
1. Preparazione del MCMV (ceppo Smith) e ricombinante M32-enhanced proteina fluorescente verde (EGFP) -MCMV
- Generare ricombinante M32-EGFP-MCMV secondo il metodo come segue (1,2 - 1.9) e come precedentemente descritto 8.
- Utilizzare i virus ricombinanti derivati dal ceppo Smith di wild-type MCMV (numero adesione: U68299). Inserire EGFP (4.361 coppie di basi; bp) tra 37.089 e 41.450 bp (M32 - M31 locus) nel genoma MCMV per ricombinazione omologa.
- Amplifica per reazione a catena della polimerasi del MCMV M32 (41.450 - 39.286 bp, a sinistra fiancheggiante sequenza e M31 (37.089 - 39.246 bp, fiancheggiante destra gene sequenza loci utilizzando i seguenti primer: M32, 5'-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '(primer forward), 5 '-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '(Primer reverse); M31, 5'-CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3' (primer forward), 5'-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3 '(primer reverse).
- Inserire il locus M32 nel vettore EGFP che esprimono utilizzando NheI e BamHI siti di restrizione. Inserire il locus M31 nella M32-EGFP -recombinant plasmide utilizzando siti AflII e XbaI. Fendere l'M32 - EGFP - sequenza M31 con NheI e AflII dalla M32 - EGFP - M31 ricombinazione plasmide e sciogliere in H 2 O.
- Trasfezione il costrutto spaccati in nuclei di MCMV (Smith ceppo) -infected cellule NIH3T3 24 ore dopo l'infezione (HPI), utilizzando un sistema di elettroporazione per indurre ricombinazione omologa.
- A 3 giorni dopo l'infezione, co-coltura le cellule con il mouse non infetti fibroblasti embrionali (MEF) in un rapporto di 1 / 1.000 in sei pozzetti e schermo per focolai EGFP che esprimono delle cellule infette.
- harvest il surnatante contenente il virus, dai pozzetti contenenti fuochi fluorescente verde e diluire dieci volte. Per la depurazione, scegliere pozzi che visualizzano singoli focolai fluorescenti verdi.
- Quando tutto focolai derivante dalla limitazione diluizione visualizzazione infezione espressione EGFP, la preparazione virus è puro, che indica che nessun virus wild-type rimane. Quantificare il virus con il metodo placca-test come descritto in precedenza 17.
- Trattare MCMV in cappe di sicurezza biologica certificata a livello di biosicurezza 2 indossando guanti e maschera.
- Passaggio MCMV (Smith ceppo) e MCMV ricombinante in MEF preparati da 12 giorni di età embrioni di topo ICR come precedentemente descritto 17.
- Rimuovere le cellule dai supernatanti delle colture infette MEF per centrifugazione a 3.000 × g per 20 minuti a 16 ° C.
- Ultracentrifuga il surnatante per 40 min a 70.000 × g. Risospendere il pellet contenenti virioni in 1 ml di soluzione salina tamponata con Tris e trasferire su una s lineare preformatoorbitol pendenza (25% - 70%). Ultracentrifuga di nuovo a 70.000 x g per 60 min 18.
- Raccolto il gruppo virione contenente con una siringa. Pellet virioni raccolte da un passo ultracentrifugazione supplementare a 70.000 g per 40 min.
- Risospendere il pellet in 1 ml di tampone fosfato salino (PBS) e conservare a -80 ° C fino agli esperimenti di infezione.
- Quantificare il titolo del virus dal metodo placca test come descritto in precedenza 19.
- Visualizza l'espressione EGFP delle particelle MCMV ricombinanti (eccitazione a 489 nm, emissione a 508 nm) mediante microscopia a fluorescenza (Figura 1A) e la struttura delle particelle mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) 8 (Figura 1B).
2. Preparazione di microperle Nile Red fluorescenti
- Acquisto carbossilico fluorescente Nilo microsfere rosso e posto 500 ml di microsfere in tubi in base al diametro (0,04- 0,06 micron, circa 3,63 × 10 12 particelle; 0,1 - 0,3 mm, circa 5,75 × 10 10 particelle; e 1,7-2,2 micron, circa 6,85 × 10 7 particelle).
- Trattare perline con 500 ml di 0,1 M NaOH per circa 1 giorno per rimuovere eventuali endotossine e risospendere le sfere in acqua sterile a temperatura ambiente.
- Adsorbire le perline O / N con siero di topo 10% ottenuta da topi C57BL / 6 a RT prima dell'uso.
- Per separare gli aggregati, vortice le perline e sonicare bene prima dell'uso.
3. ICV Iniezione di MCMV e fluorescenti microperle in topi neonati
- Mantenere normali topi in gravidanza ICR in un impianto a temperatura controllata nell'ambito di un ciclo di 12 ore luce / buio. I neonati sono designati come P 0,5 il giorno della nascita.
- Sterilizzare una siringa da 10 microlitri e un ago 27 G con il 70% di alcol.
- Caricare la soluzione di iniezione (5 ml) contenente MCMV o micro fluorescentein perle dell'ago tirando con attenzione lo stantuffo della siringa.
- Trattenere il mouse neonatale (P 0.5) mettendo il mouse sul ghiaccio per 3 - 4 minuti. Una volta che l'animale è sotto anestesia, utilizzare il metodo di risposta toe-pinch per determinare la profondità dell'anestesia.
- Mark il sito di iniezione con una penna di laboratorio non tossico in una posizione circa 0,7 - 1,0 millimetri lateralmente alla sutura sagittale e 0.7 - 1,0 millimetri caudale dalla neonatale bregma (Figura 2A).
- Inserire l'ago 2 mm di profondità, perpendicolare alla superficie del cranio al sito di iniezione marcata. Per riferimento, segnare 2 mm dalla punta dell'ago con un produttore non tossico.
- Lentamente iniettare 5 ml di MCMV (circa 5 × 10 5 PFU) nel ventricolo laterale senza aprire il cuoio capelluto (Figura 2B).
- In un altro gruppo di topi, iniettare una soluzione 5 ml contenente microsfere fluorescenti (0,1 - 0,3 mm, circa 5,75 × 10 8 particelle) dalo stesso metodo.
- Lentamente rimuovere l'ago 10 - 20 secondi dopo aver sospeso il movimento del pistone per impedire il riflusso.
- Per recuperare, mantenere i topi per 5 - 10 minuti in un contenitore caldo fino a quando il movimento e la reattività generale vengono ripristinati.
- Raccolto il cervello come descritto nella sezione 5 in una serie di punti di tempo (3, 12, 24, 48, e 72 ore) dopo l'iniezione.
4. IV Iniezione di MCMV o fluorescenti microperle in topi neonati
- Trattenere il mouse neonatale (P 0.5) mettendo il mouse sul ghiaccio per 3 - 4 minuti.
- Utilizzare una siringa da 1 ml con un ago 35 G per eseguire l'iniezione endovenosa di MCMV in P 0,5 neonati.
- Utilizzare un transilluminatore (vena finder) per visualizzare il temporale vena superficiale (del viso). Prima dell'iniezione, fissare il neonato al transilluminatore con del nastro chirurgico (Figura 2C).
- Mentre indossa lenti d'ingrandimento (1.5X), infondere lentamente 50 ml di MCMV (circa 5,45 ×; 10 9 particelle) o microsfere fluorescenti (0,04 - 0,06 micron, circa 3,63 × 10 11 particelle; 0,1 - 0,3 micron, circa 5,75 × 10 9 particelle e 1,7 - 2,2 micron, circa 6,85 × 10 6 particelle) nella vena temporale superficiale (Figura 2D).
- Dopo aver rimosso l'ago, usare una garza contenente il 70% di alcool per esercitare una pressione al sito di iniezione fino a quando l'emorragia cessa.
- Dare il neonato di circa 5 minuti in un contenitore caldo per recuperare prima di tornare alla gabbia.
- Raccogliere il cervello come descritto nel capitolo 5 in una serie di punti di tempo (3, 12, 24, e 72 hr) dopo l'iniezione.
5. Cervello preparazione dei tessuti del campione per le sezioni di paraffina
- Mettere i neonati iniettati in un piccolo piatto di plastica su ghiaccio tritato.
- Una volta che l'animale è sotto anestesia, utilizzare il metodo di risposta in punta pizzico per determinare la profondità di anesthesia.
- Fare uno tagli centrali o due estremità orizzontali estremità attraverso la gabbia toracica per aprire la cavità toracica.
- Fare un taglio nell'atrio con forbici affilate. Infondere 4% paraformaldeide soluzione (PFA) nell'atrio. Smettere di perfusione quando si osservano movimento spontaneo (PFA danza) e alleggerito-colore del fegato. Non Exsanguinate.
- Sezionare il neonato (come descritto in precedenza 20) rimuovendo prima testa con un paio di forbici.
- Effettuare una incisione sulla linea mediana lungo il tegumento dal collo al naso per esporre il cranio.
- Posizionare la punta di un paio di forbici iris nel foro occipitale su un lato, con attenzione scorrevole lungo la superficie interna del cranio.
- Fare un taglio che si estende fino al margine posteriore della superficie posteriore del cranio, e fare un taglio identico sul lato controlaterale. Sgombrare il cranio intorno al cervelletto.
- sbucciare indietro con cautela il cranio su un lato per evitare danni al cervello. ripetere questaprocedura sull'altro lato del cervello.
- Utilizzando una spatola, recidere i bulbi olfattivi e connessioni nervose lungo la superficie ventrale del cervello.
- separare delicatamente il cervello dalla testa, tagliare qualsiasi dura che collegano ancora il cervello al cranio con le forbici, e rimuovere il cervello.
- Posizionare il cervello in una fiala di fissativo contenente 4% PFA almeno 10 volte il volume del cervello per 24 ore a 4 ° C.
- Disidratare il tessuto attraverso una serie di bagni di etanolo graduate per spostare l'acqua, e poi infiltrarsi paraffina, formando un blocco. Tagliare il blocco di paraffina con un microtomo fettine 4 micron di spessore 21.
- Deparaffinare e reidratare le diapositive dei cervelli infetti 22. Procedere alla ibridazione in situ per le sezioni paraffina.
6. Cervello preparazione dei tessuti campione per sezioni congelate
- Rimuovere il cervello seguendo la procedura descritta in 5,1-5,11.
- Per osservare le microsfere fluorescenti e M32-EGFP-MCMV, posizionare il cervello asportato il cryomolds fondo piatto. Aggiungere mezzo di inclusione per coprire completamente i campioni cervello. Snap congelare i cryomolds in n esano pre-raffreddata (-80 ° C), con pinze per tenere il bordo delle cryomolds prima di collegarlo al mandrino.
- Per il sezionamento, collegare il blocco di tessuto congelato sul mandrino criostato pre-raffreddata. Trasferire il tessuto congelato con il mandrino in una camera criostato e abbassare la temperatura fra -10 e -20 ° C, e tagliare le fette di circa 8 - 10 micron di spessore 23.
- Fissare le sezioni con cytofixative (miscela di alcool isopropilico e polietilenglicole) mediante spruzzatura. Far asciugare le sezioni per 30 minuti a temperatura ambiente subito dopo la spruzzatura, e conservarli a - 80 ° C fino a nuovo uso.
- Equilibrare sezioni torna a RT e lavare tre volte con PBS.
- Macchiare le sezioni con fluoresceina isotiocianato (FITC) coniugata Griffonia simplicifolia isolectin B4 ad una concentrazione di 1: 100 per 10 minuti in PBS a RT (Figura 5) o con l'anticorpo CD31 PE-coniugato ad una concentrazione di 1: 100 per 30 minuti in PBS a RT (Figura 6).
- Lavare le sezioni con PBS per tre volte.
- Dopo il lavaggio, macchiare sezioni con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per visualizzare nuclei cellulari. Montare le sezioni in anti-sbiadimento reagente e immagine DAPI (eccitazione a 345 nm, emissione a 455 nm), EGFP (eccitazione a 489 nm, emissione a 508 nm), e del Nilo rosso (eccitazione a 553 nm, emissione a 637 nm) con un microscopio a fluorescenza (figure 3, 5, 6).
7. ibridazione in situ fluorescente (FISH) per paraffina Sezioni
- Preparare la sonda FISH etichettato direttamente con fluoroforo per il DNA ibridazione in situ da traduzione nick utilizzando un cromosoma artificiale batterico contenente l'intero DNA MCMV genome (pSM3fr) 19. La concentrazione della sonda FISH è di 0,1 mg / mL.
- Deparaffinare e reidratare le diapositive dei cervelli infetti 22.
- Trattare le sezioni di tessuto con RNasi (100 ug / ml in PBS) per rilevare il DNA virale.
- Eseguire recupero dell'antigene con un NP40 0,05%, 0,01 M tampone citrato (pH 6,0) a 95 - 98 ° C per 20 min. Raffreddare le diapositive fino a temperatura ambiente per 20 min.
- In una vaschetta di colorazione di vetro Coplin, lavare i vetrini in acqua pura tre volte per 2 minuti ogni volta. Eseguire un passo antigene recupero supplementare con un pepsina 0,06%, 0,01 soluzione N HCl per 5 min a 37 ° C.
- Sciacquare i vetrini tre volte in acqua pura per 2 minuti ogni volta in un barattolo di pittura su vetro Coplin.
- Disidratare le sezioni di tessuto nuovo trasferendo i vetrini dal 70% di etanolo, 85% di etanolo, e poi a 100% di etanolo.
- Per la preparazione di 10 ml di tampone di ibridazione, mescolare 1,25 ml di sali di ibridazione in situ (3 M di NaCl, 100 mM Tris-HCl PH 8.0, 100 mM sodio fosfato pH 6,8, 50 mM EDTA) con 5 ml formammide deionizzata, 2,5 ml 50% di solfato di destrano, 250 microlitri 50x soluzione di Denhardt, 125 microlitri di 100 mg / ml tRNA, e 875 microlitri H 2 O.
- Diluire la sonda di DNA marcata direttamente con fluorofori che riconoscono l'intero genoma MCMV casualmente nel buffer di ibridazione. Il volume finale deve essere di 10 microlitri (tampone di ibridazione 7 microlitri, sonda 1 ml (0,1 mg / mL), e 2 ml di acqua distillata).
- Aggiungere il mix di sonda (10 ml) per ogni diapositiva e coprire con un coprioggetto (15 × 15 mm). Sigillare il coprioggetto con mastice. Denaturare il mix della sonda per 5 minuti a 85 ° C, e completare la fase di ibridazione O / N a 42 ° C.
- Lavare i vetrini con lo 0,3% NP40, SSC 0.4x a 73 ° C per 2 min; con 0,1% NP40, 0.4x SSC a 73 ° C per 1 min; e con 2x SSC due volte.
- Controcolorare i nuclei con DAPI (10 ng / ml) e coprire il vetrino con un coprioggetto.
- Montaresezioni a anti-sbiadimento reagente e DAPI immagine (eccitazione a 345 nm, emissione a 455 nm) e EGFP (eccitazione a 489 nm, emissione a 508 nm) con un microscopio a fluorescenza (Figura 4).
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Representative Results
In studi sulla patogenesi di encefalite virale, il metodo infezione è importante. Il percorso ematogena rappresenta un'infezione acuta delle cellule endoteliali e periciti del cervello, mentre il percorso ICV rappresenta un'infezione acuta diffondere attraverso il CSF attraverso lo spazio subaracnoideo, raggiungendo le meningi e del plesso coroide. Per analizzare la prima distribuzione di particelle in encefalite acuta, ibridazione in situ rilevare i genomi MCMV e l'osservazione diretta di particelle M32-EGFP-MCMV o microsfere fluorescenti sono stati utilizzati.
Generazione di ricombinante MCMV (M32-EGFP-MCMV)
Il protocollo illustra come ricombinante M32-GFP-MCMV è stata generata. EGFP è stato inserito tra 37.089 e 41.450 bp (M32-M31 locus) nel genoma MCMV per ricombinazione omologa. Un EGFP protein è stata fusa con una proteina virale (M32) e EGFP è stato espresso entro le particelle virali. Dopo la ricombinazione omologa, un preparato virus è stato considerato puro quando tutti foci derivanti dall'infezione limitativo diluizione visualizzata espressione EGFP, indicando che nessun virus wild-type rimasto. Si può richiedere più procedure di diluizione per purificare il virus ricombinante. La figura 1A mostra segnali EGFP di purificato ricombinante MCMV (M32-EGFP-MCMV) e Figura 1B mostra un'immagine TEM di particelle M32-EGFP-MCMV contenenti il genoma del virus nel nucleo virale .
Iniezione intracerebroventricular e intravascolare Iniezione
La Figura 2 mostra i siti di iniezione di topo neonatale (P 0,5) dove virus o microsfere sono state iniettate per via ICV o il percorso IV. In ICV, il sito di iniezione è a metà tral'orecchio e l'occhio, in una posizione di circa 0,7 - 1,0 millimetri lateralmente alla sutura sagittale e 0,7 - 1,0 millimetri caudale dal bregma neonatale (Figura 2A). L'ago deve essere iniettato nel ventricolo laterale 2 mm di profondità, perpendicolare alla superficie del cranio (Figura 2B). Figura 2C e 2D mostrano che MCMV o microsfere sono iniettati nella vena facciale temporale dei topi neonati. Un transilluminatore e lenti d'ingrandimento sono utili strumenti di visualizzazione in modo chiaro piccole vene.
La distribuzione di Viral Particelle / genomi e microperle fluorescenti
Le seguenti figure mostrano la distribuzione delle particelle virali / genomi e microsfere fluorescenti nella fase acuta. La Figura 3 mostra i segnali microsfere di sezioni congelate del cervello. Figure 3A e 3B mostrano ladistribuzione dei 0,1 -. 0,3 micron fluorescenti Nilo microsfere rossi nella zona marginale (MA) (Figura 3a) e del plesso coroide e zona subventricolare (SVZ) (Figura 3B) a iniezione dopo ICV 2 ore Figura 3C e 3D mostrano la distribuzione dei 0,1 - 0,3 micron fluorescenti Nilo microsfere rossi nel MA e la zona vascolare (Figura 3C) e il plesso coroide e SVZ (Figura 3D) a iniezione 2 ore dopo IV. È probabile che, dopo ICV e iniezione IV, le particelle non si diffondono immediatamente uniforme in tutto il parenchima. Piuttosto, sono rimasti nella SVZ, MA, e la zona vascolare in fase acuta dell'infezione. La dimensione delle particelle è il fattore primario compromettere la loro distribuzione nel cervello in fase acuta dopo ICV e iniezione IV. La Figura 4 mostra la FISH del genoma MCMV sulle paraffina sezioni del cervello. Il genoma MCMV (macchie verdi) è stato rilevato nelSVZ a iniezione dopo ICV 3 ore (Figura 4B). I genomi MCMV (macchie verdi) sono stati rilevati nel MA e la zona vascolare a 3 ore dopo l'iniezione IV (Figura 4C). La distribuzione del MCMV (figura 4) e microsfere (Figura 3) erano molto simili. La Figura 5 mostra i modelli di distribuzione dipendenti dalle dimensioni delle microsfere in sezioni congelate del cervello dopo l'iniezione IV. Microsfere di diametro 1,7 - 2,2 micron (Figura 5B), 0.1 - 0,3 mm (Figura 5D), e 0,04 - 0.06 micron (Figura 5E) sono indicati rispettivamente. Microsfere piccoli avevano la tendenza a essere all'extravasazione fuori della zona vascolare nel parenchima. Figura 6 mostra la distribuzione delle particelle M32-EGFP-MCMV in sezioni congelate del cervello. Segnali punti GFP (particelle M32-EGFP-MCMV) sono stati principalmente osservati nel MA (figura 6A) e del plesso coroide e SVZ (
Figura 1:. Generazione di particelle ricombinante M32-EGFP-MCMV (A) ultracentrifugati M32-EGFP-MCMV sono visti come macchie verdi di microscopia a fluorescenza. Barra di scala:. 2.4 micron (B) la microscopia elettronica a trasmissione rivela che le particelle M32-EGFP-MCMV possiedono una struttura del virus tipico. barra della scala: 77 nm.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54164/54164fig1large.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: siti di iniezione del mouse neonatale. (A, B) ICV iniezione di 5 microlitri MCMV (circa 5 × 10 5 PFU) o di 5 microperle microlitri (circa 5,75 x 10 9 particelle). (A) Il sito di iniezione è a metà tra l'orecchio e l'occhio (A una posizione circa 0,7 - 1,0 millimetri lateralmente alla sutura sagittale e 0,7 -. 1,0 millimetri caudale dal bregma neonatale) (B) a 27 G ago con una siringa da 10 microlitri viene utilizzato per l'iniezione nel ventricolo laterale 2 mm di profondità, perpendicolarmente alla superficie del cranio. (C, D) MCMV o microsfere sono iniettati nella vena facciale temporale dei topi neonati. (C) (D) Una siringa da 1 ml con un ago 35 G viene utilizzato per eseguire il IV iniezione di MCMV. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
. Figura 3: Visualizzazione dei fluorescenti Nilo Red microperle nel cervello (A, B) 0,1 - 0,3 micron fluorescenti Nilo microperle segnali rosso (rosso) sono stati osservati in MA (A) e il plesso coroide e SVZ (B) a 2 ore iniezione dopo ICV (C, D) 0,1 -. 0,3 micron fluorescenti Nilo microsfere rosso introdotte nel cervello neonatale del mouse per iniezione IV dopo l'iniezione 2 ore. Nilo microsfere rossi sono stati osservati in the MA e zona vascolare (C) e il plesso coroide e SVZ (D). Il quadrato bianco è amplificato nell'inserto allargata in alto a destra (D) (A, C) Barra di scala:. 50 micron (B, D) Barra di scala:. 150 micron. Le frecce indicano Nilo microsfere rosso. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: MCMV Genoma distribuzione nel cervello di topo Dopo ICV iniezione e iniezione IV (A) La vista ingrandimento minore.. Il quadrato bianco indica dove l'immagine ingrandita (B) è stato catturato. (B) Il genoma MCMV (macchie verdi) viene prima rilevata nel SVZ a iniezione dopo ICV 3 ore. DAPI (4 ',, 6-diamidino-2-fenilindolo) viene utilizzato per l'acido nucleare colorazione (nucleare). Barra di scala:. 30 micron (C) Il genoma MCMV (macchie verdi) viene rilevato nella zona vascolare e meningi a iniezione 12 ore dopo IV. DAPI viene utilizzato per la colorazione acido nucleare. barra della scala: 30 micron. Le frecce indicano rappresentante genoma MCMV (macchie verdi). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5:. Il rapporto tra il diametro di microperle e la distribuzione delle microsfere fluorescenti Nilo microsfere rossi (50 ml) sono introdotte nel cervello di topo neonatale per iniezione IV. Nelle sezioni congelate preparate a 2 colonne di iniezione ore, segnali rossi del Nilo (rosso, indicati dalle frecce) si osservano in giro per la vasculzona ar del parenchima. L'area vascolare è macchiato con lectina fluorescente (verde) (A, B) 1,7 -.. 2.2 micron microsfere (A) La vista ingrandimento minore. Il quadrato bianco indica dove l'immagine ingrandita (B) è stato catturato (B) Il quadrato bianco è aumentato in quanto l'inserto allargata in alto a destra (B) (C, D) 0,1 -... 0.3 micron microsfere (C) La inferiore vista di ingrandimento. Il quadrato bianco indica dove l'immagine ingrandita (D) è stato catturato (D) Il quadrato bianco è aumentato in quanto l'inserto allargata in alto a destra (D) (E, F) 0.04 -... 0,06 micron microsfere (E) L' inferiore vista di ingrandimento. Il quadrato bianco indica dove l'immagine ingrandita (F) è stato catturato. (F) Il quadrato bianco è aumentato in quanto l'inserto allargata in alto a destra
Figura 6: osservazione di particelle virali nella fase di infezione acuta. (A, B) segnali dot EGFP (particelle M32-EGFP-MCMV) sono principalmente osservata nella MA (indicata dalle frecce; A), plesso coroide e SVZ (indicata dalle frecce; B) a 2 ore dopo ICV iniezione. I quadrati bianchi sono ingrandite come gli inserti ingrandita in alto a destra (A) e (B). Bar Scala:. 20 micron (C, D) verso l'iniezione 3 ore dopo IV, le particelle MCMV (verde, indicati dalle frecce) si trovano all'interno e all'esterno della zona vascolareparenchima (C), il plesso coroide, e SVZ (D) (rosso: cellule CD31-positive). I quadrati bianchi sono ingrandite come gli inserti ingrandita in alto a destra (C) e (D). Barra della scala:. 20 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In modelli animali, ICV, intraperitoneale, placentare diretta e infezioni IV sono stati utilizzati per studiare la patogenesi di encefalite virale. Ci siamo concentrati sui modelli ICV ed iniezione IV di topi neonatale per la semplicità delle procedure e il beneficio di iniezione diretta di particelle nella regione di destinazione. Anche se l'infezione intraperitoneale è un metodo facile, particelle virali diffuse sistemica attraverso un processo indiretto 5,24. un'infezione placentare Direct è un buon metodo per studiare infezione sistemica embrionale. Tuttavia, questo metodo richiede una formazione specifica per produrre risultati stabili e ha una bassa percentuale di successo. Il metodo infezione è anche un procedimento indiretto attraverso la placenta ed è difficile controllare la quantità di iniezione nel feto a ogni prova 6. Come il mouse neonatale è molto vulnerabile ai virus come la CMV, in questo studio abbiamo potuto confrontare la distribuzione delle particelle virali e quella delle cellule infette ai primissimi PHAe di infezione. Il modello di iniezione ICV è vantaggioso per studiare il comportamento infezione che bypassa la BBB 25, mentre il modello di infezione IV è un modello di infezione sistemica simile infezione naturale compresa l'interazione del virus con il BBB.
Con il metodo di iniezione ICV, abbiamo fatto in modo di penetrare almeno 2 mm di profondità nel cranio. L'ago è stato tenuto all'interno dei ventricoli cerebrali per circa 10 - 20 sec per impedire il riflusso dalla ventricoli 26. Una volta fatto con cura, l'iniezione ICV è un facile e veloce in modo vivo. Tuttavia, le iniezioni a volte imprecisi, tra cui il riflusso indesiderato o profonda / la penetrazione superficiale dell'ago al cervello può accadere. sono necessarie procedure attento e osservazioni dopo l'iniezione per eseguire questo protocollo con successo. Considerando gli errori di iniezione, ci siamo concentrati solo sui modelli di distribuzione delle particelle e non sulla quantità, e non abbiamo osservato gli effetti del trattamento di drogas o anticorpi funzionali nel nostro studio.
Ci sono diverse procedure per eseguire l'iniezione murino IV neonatale, attraverso diversi siti come vene superficiali temporali, vena giugulare esterna, e del seno retro-orbitale. La vena temporale superficiale del neonato è facilmente visualizzabile utilizzando una lente transilluminatore e l'ingrandimento. Iniezione può essere completata da un singolo individuo con esperienza con un alto successo rate.We ha scelto la vena temporale superficiale come il sito di iniezione IV. Il metodo di iniezione IV richiede un po 'di formazione come ad esempio posizionando il mouse neonatale e la procedura di iniezione. La testa del mouse neonatale deve essere posizionato con nastro per la vena temporale sia sulla parte superiore e piatta. L'ago 35 G deve essere inserito nel vaso è tale che la punta dell'ago è completamente circondato dalla nave. Un transilluminatore e lenti d'ingrandimento sono utili strumenti di visualizzazione in modo chiaro piccole vene. Iniezione di grandi volumi fino a 100microlitri dovrebbe essere infusa lentamente per confermare il flusso del contenuto. In caso di fallimento della iniezione primo processo, l'altro lato della vena temporale è disponibile per un altro processo. Dopo l'iniezione, i cuccioli sperimentano disagio minimo e recuperare rapidamente. Non è chiaro il motivo per cui una media di uno su 20 cuccioli di esperienza maggiore disagio e non recuperano. Tuttavia, il basso tasso di occorrenza di questo evento danneggia minimamente l'intero disegno sperimentale.
Poiché il metodo di iniezione IV ha un alto tasso di successo (oltre il 80%), si potrebbe confrontare il modello di distribuzione con e senza trattamenti sistemici come i farmaci o anticorpi funzionali. Abbiamo già condotto un esperimento in cui i topi neonati sono stati iniettati con anti-β1 integrina anticorpi bloccanti funzionali (50 ml a 20 mcg / g) gli anticorpi di controllo o isotipo (50 ml a 20 mcg / g) nella vena temporale superficiale di topi neonati. l'iniezione di anticorpi dopo un'ora, 5 × 106 PFU (50 ml) di MCMV stati infusi nell'altro lato della vena temporale. Il numero di cellule MCMV-positivi per sezione di CD29 criceto anti-topo (β1 catena integrina, clonare Ha2 / 5) cervello -treated erano significativamente più bassi nel confronto con quella di isotipo anticorpale trattati cervello 8. Utilizzando lo stesso metodo in indagini future, gli effetti dei farmaci o anticorpi neutralizzanti contro virus può essere determinato osservando la distribuzione delle particelle virali e cellule infettate.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane | Sigma-Aldrich | T-6791 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H-1758 | |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S-1876 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04 - 0.06 | Spherotech, Inc. | FP-00556-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1 - 0.3 | Spherotech, Inc. | FP-0256-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7 - 2.2 | Spherotech, inc. | FP-2056-2 | |
| 10% mouse serum | DAKO | X0910 | |
| C57BL/6 mouse | SLC, Inc. | ||
| ICR mouse | SLC, Inc. | ||
| Modified Microliter Syringes (7000 Series) | Hamilton company | ||
| 35-gauge needle | Saito Medical | ||
| A Wee Sight Transilluminator | Phillips Healthcare | 1017920 | |
| O.C.T.Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Nonidet(R) P-40 | Nacalai | 25223-04 | |
| citrate buffer (pH 6) x 10 | Sigma-Aldrich | C9999-100ml | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| EDTA | dojindo | N001 | |
| Formamide | TCI | F0045 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | 42867-5G | |
| Denhardt's Solution (50x) | ThermoFishcer sceintific | 750018 | |
| Yeast tRNA (10 mg/ml) | ThermoFishcer sceintific | AM7119 | |
| SSC 20x | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| DAPI | ThermoFishcer sceintific | D1306 | |
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| superfrost plus glass | ThermoFishcer sceintific | 12-55-18 | |
| Cytokeep II | Nippon Shoji Co. | ||
| FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 | Vector laboratories, Inc. | L1104 | |
| Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE | ebioscience | 12-0311 | |
| ProLong Gold | ThermoFishcer sceintific | P36934 | |
| BIOREVO | KEYENCE | BZ-9000E |
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