Abstract
I studien på patogenesen av viral encefalit, är infektionen metoden kritisk. Den första av de två viktigaste infektionsvägar till hjärnan är den hematogen väg, som innebär infektion av endotelceller och pericyter i hjärnan. Den andra är den intracerebroventrikulära (ICV) vägen. Väl inne i centrala nervsystemet (CNS), kan virus sprids till subaraknoidalrummet, hjärnhinnorna, och choroid plexus via cerebrospinalvätskan. I experimentella modeller, är de tidigaste stadierna av CNS viral spridning inte väl karakteriserade, och det är oklart om endast vissa celler initialt infekterade. Här har vi analyserat fördelningen av cytomegalovirus (CMV) partiklar under den akuta fasen av infektion, kallas primär viremi efter ICV eller intravaskulärt (IV) injektion i neonatal mushjärna. I ICV injektion modell, var 5 pl mus CMV (MCMV) eller fluorescerande mikropärlor injiceras i den laterala ventrikeln vid midpoint mellan örat och ögat med en 10-il spruta med en 27 G nål. I IV injektion modellen gjordes en 1-ml spruta med en 35 G nål används. En transilluminator användes för att visualisera ytliga temporala (ansiktet) ven neonatal mus. Vi infunderas 50 pl MCMV eller fluorescerande mikrokulor i den ytliga temporala ven. Hjärnor skördades vid olika tidpunkter efter injektion. MCMV genomen upptäcktes med hjälp av in situ hybridisering metod. Fluorescerande mikropärlor eller grönt fluorescerande protein som uttrycker rekombinanta MCMV partiklar observerades genom fluorescensmikroskopi. Dessa tekniker kan appliceras på många andra patogener för att undersöka patogenesen av encefalit.
Introduction
När man studerar viral encefalit, är den ursprungliga distributionen av viruspartiklar mycket viktigt att förstå sjukdomen patogenes och identifiera virala mål i hjärnan. De flesta virus varierar i storlek från 20 till 300 nm, även om Pandoravirus är mer än 700 nm i storlek 1. Fördelningen av de virala partiklarna i den akuta fasen av infektion kan bero på storleken av partiklarna, fördelningen av cellulära receptorer, eller affiniteten av de cellulära receptorer för virus. I djurmodeller, intracerebroventrikulär (ICV), intraperitoneala, direkt placenta, och intravenös (IV) infektioner har använts för att studera patogenesen av viral encefalit. ICV ympning med virus används ofta för att fastställa centrala nervsystemet (CNS) infektioner hos möss. Studier som använder denna teknik rapportera utbredd infektion, särskilt av celler i periventrikulära zonerna och i områden av hjärnan i direkt kontakt med cerebrospinalvätska (CSF), Similar att effekterna av virus ventriculoencephalitis. Den lilla storleken av adenoassocierat virus (AAV) partiklar (20-25 nm i diameter) underlättar spridning i hela hjärnan i ICV infektioner 2-4. Intraperitoneala 5, direkt placenta 6, och IV injektioner 7 representerar hematogenic systemisk administration. Penetrationen av virala partiklar genom blod-hjärnbarriären (BBB) tillåter dem att nå den parenkymet av den neonatal hjärna, som representerar diffusa mikrogliaceller knutor 8,9.
Cytomegalovirus (CMV) är ett vanligt virus som tillhör herpesvirusfamiljen. I USA, 50% - har 80% av de människor hade CMV-infektion efter ålder 40. CMV-infektioner sällan skadligt, men kan orsaka sjukdomar hos patienter med nedsatt immunförsvar och foster. Av alla förlossningar, 0,2% - är 2% föds med CMV 10, vilket resulterar i allvarliga symtom som mikrocefali, periventrikulär förkalkning, cerebellär hypoplasi, microphthalmia och synnerven atrofi 11,12. Dessutom mental retardation, sensorineural hörselnedsättning, synfel, beslag, och epilepsi förekommer i cirka 10% av icke-dödligt CMV-infekterade spädbarn 13,14. CNS dysfunktion är den vanligaste karakteristiska symptom på CMV medfödd anomali. Fler barn är permanent inaktiv varje år av medfödd CMV än av Downs syndrom, fetalt alkoholsyndrom, eller ryggmärgsbråck 15. Det finns inga vaccinationer mot CMV finns för närvarande, kräver ett behov av ett säkert och effektivt vaccin. Studera interaktionen av CMV-partiklar med deras receptorer i den tidigaste fasen av infektion är viktigt att förstå effekten av vaccinationen.
Ventriculoencephalitis och diffusa microglial knölar är de två viktigaste patologiska egenskaperna hos CMV encefalit 16. Det har varit oklart hur CMV partiklar (150-300 nm) sprids genom hjärnan i den akuta fasen av infektion ennd hur fördelningen av cellulära receptorer och deras affinitet för virus bidrar till viral spridning. Kawasaki et al. Har utvärderat ICV och IV infektioner från perspektivet av fördelningen av partiklar och deras receptorer (β1 integrin) i den tidigaste fasen av infektion. Vi har funnit att spridningen av CMV partiklar och uttrycket av β1 integrin är väl korrelerade i den tidigaste fasen av infektion hos både ICV och IV-infektioner 8. ICV-infektion är en modell av ventriculoencephalitis och IV-infektion är en modell av diffusa mikrogliaceller knölar. Studera dynamiken i virala eller fluorescerande partiklar skulle ge användbar information om effekten av partikelstorleken, virala interaktioner med cellulära receptorer, och mekanismen för BBB penetration i hjärnan. Följande protokoll kan användas för att undersöka varje virusinfektion och virusvektor i CNS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella protokoll godkändes av Animal Care kommittén för Hamamatsu University of School of Medicine.
1. Framställning av MCMV (Smith stam) och Recombinant M32-förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) -MCMV
- Generera rekombinant M32-EGFP-MCMV i enlighet med metoden enligt följande (1,2-1,9) och som tidigare beskrivits 8.
- Använda rekombinanta virus erhållna från Smith-stammen av vildtyp MCMV (accessionsnummer: U68299). Insert EGFP (4,361 baspar; bp) mellan 37089 och 41450 bp (M32 - M31-locus) i MCMV-genomet genom homolog rekombination.
- Amplifiera genom polymeraskedjereaktion MCMV M32 (41450 - 39286 bp, vänster flankerande sekvensen och M31 (37089 - 39246 bp, höger flankerande sekvensen genloci för användning av följande primrar: M32, 5'-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '(framåtriktad primer), 5 '-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '(Reverse primer); M31, 5'-CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3' (framåtriktad primer), 5'-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3 '(omvänd primer).
- Sätt i M32 locus i EGFP-uttryckande vektor med hjälp av Nhel och BamHI restriktionsställen. Sätt i M31 locus i M32-EGFP -recombinant plasmid med hjälp av Aflll och Xbal-ställen. Klyva M32 - EGFP - M31 sekvens med Nhel och Aflll från M32 - EGFP - M31 rekombination plasmid och lös i H2O
- Transfektera den kluvna konstruktionen i kärnan av MCMV (Smith stam) infekterade NIH3T3-celler 24 timmar efter infektion (HPI) med en elektrosystem för att framkalla homolog rekombination.
- Vid 3 dagar efter infektion, sam-odla cellerna med oinfekterade mus embryonala fibroblaster (MEF) vid ett förhållande av 1/1000 i sex-brunnars plattor och skärm för EGFP-uttryck foci av infekterade celler.
- Harvest virusinnehållande supernatanter från brunnar som innehåller grönt fluorescerande fokus och späd tiofaldigt. För rening väljer brunnar som visar enstaka gröna fluorescerande härdar.
- När all foci uppstått genom den begränsande-späd infektion display EGFP expression, är viruspreparatet ren, vilket indikerar att ingen vildtypsvirus kvarstår. Kvantifiera viruset av plack-analysmetoden som tidigare beskrivits 17.
- Behandla MCMV i certifierade biosäkerhet skåp på skyddsnivå 2 handskar och mask.
- Passage MCMV (Smith stam) och rekombinant MCMV i MEF framställda från 12 dagar gamla ICR musembryon som tidigare beskrivits 17.
- Avlägsna celler från supernatanterna av infekterade MEF kulturer genom centrifugering vid 3000 x g under 20 min vid 16 ° C.
- Ultracentrifug supernatanterna under 40 minuter vid 70.000 x g. Resuspendera pellets innehållande virioner i 1 ml Tris-buffrad koksaltlösning och överföra på en förformad linjär sOrbitol-gradient (25% - 70%). Ultracentrifug igen vid 70.000 x g under 60 min 18.
- Skörda virion-innehållande band med en spruta. Pelletera de skördade virioner genom ett ytterligare ultracentrifugesteg vid 70000 x g under 40 min.
- Återsuspendera pelleten i 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och förvara vid -80 ° C tills de infektionsexperiment.
- Kvantifiera viruset titer av plack-analysmetoden som tidigare beskrivits 19.
- Visualisera EGFP expression av de rekombinanta MCMV partiklarna (excitation vid 489 nm, emission vid 508 nm) genom fluorescensmikroskopi (figur 1 A) och partikelstruktur med hjälp av transmissionselektronmikroskopi (TEM) 8 (Figur 1B).
2. Beredning av Nile Red fluorescerande mikropärlor
- Köp karboxyl fluorescerande Nile Red mikrokulor och placera 500 ul av mikrokorn i rör enligt diameter (0,04- 0,06 um, ca 3,63 x 10 12 partiklar; 0,1-0,3 um, ca 5,75 x 10 10 partiklar; och 1,7-2,2 um, ungefär 6,85 x 10 7 partiklar).
- Behandla pärlorna med 500 | il 0,1 M NaOH under cirka en dag för att avlägsna eventuella endotoxiner och återsuspendera pärlorna i sterilt vatten vid RT.
- Adsorbera pärlorna O / N med 10% musserum erhölls från C57BL / 6-möss vid RT före användning.
- För att separera aggregat, virvel pärlorna och sonikera noggrant före användning.
3. ICV Injektion av MCMV och fluorescerande mikropärlorna i neonatala möss
- Upprätthålla normala gravida ICR möss i en temperaturstyrd anläggning under en 12 timmar ljus / mörker-cykel. De nyfödda betecknas som P 0,5 på dagen för födelsen.
- Sterilisera en 10-il spruta och en 27 G nål med 70% alkohol.
- Ladda injektionslösningen (5 pl) innehållande MCMV eller fluorescerande mikropärlor i nålen genom att försiktigt dra kolven i sprutan.
- Hålla neonatal mus (P 0,5) genom att sätta musen på is i 3-4 minuter. När djuret är under narkos, använd toe-nypa svarsmetoden för att bestämma djupet av anestesi.
- Märk injektionsstället med en giftfri laboratorium penna på en plats cirka 0,7 till 1,0 mm i sidled till sagittala suturen och 0,7 till 1,0 mm kaudalt från neonatal bregma (Figur 2A).
- In nålen 2 mm djupa, vinkelrätt mot skallen ytan på den markerade injektionsstället. För referens, markera 2 mm från spetsen av nålen med en icke-toxisk maker.
- Injicera långsamt 5 pl av MCMV (ungefär 5 x 10 5 PFU) i den laterala ventrikeln utan att öppna hårbotten (Figur 2B).
- I en annan grupp av möss, injicera en 5 pl lösning innehållande fluorescerande mikropärlor (0,1-0,3 um, ungefär 5,75 x 10 8 partiklar) genomsamma metod.
- Sakta ut kanylen 10-20 sekunder efter avbruten kolvrörelsen för att förhindra backflöde.
- Att återhämta sig, hålla mössen för 5-10 min i en varm behållare tills rörelse och allmän känslighet återställs.
- Skörda hjärnor som beskrivs i avsnitt 5 på en rad olika tidpunkter (3, 12, 24, 48, och 72 h) efter injektion.
4. IV Injektion av MCMV eller fluorescerande mikropärlor i neonatala möss
- Hålla neonatal mus (P 0,5) genom att sätta musen på is i 3-4 minuter.
- Använd en 1-ml spruta med en 35 G nål för att utföra intravenös injektion av MCMV i P 0,5 nyfödda.
- Använd en transilluminator (ven finder) att visualisera ytliga temporala (ansiktet) ven. Före injektion, säkra det nyfödda barnet till transilluminator med hjälp av kirurgtejp (figur 2C).
- Iklädd förstoringsglas (1,5X), långsamt ingjuta 50 pl MCMV (ca 5,45 ×; 10 9 partiklar) eller fluorescerande mikropärlor (0,04 - 0,06 um, ungefär 3,63 x 10 11 partiklar; 0,1 - 0,3 um, ungefär 5,75 x 10 9 partiklar, och 1,7 - 2,2 um, ungefär 6,85 x 10 6 partiklar) i den ytliga temporala ven (figur 2D).
- Efter avlägsnande av nålen, använd gasväv innehåller 70% alkohol för att utöva tryck på injektionsstället tills blödningen upphör.
- Ge nyfödda cirka 5 minuter i en varm behållare för att återhämta sig innan han återvände till buren.
- Skörda hjärnor som beskrivs i avsnitt 5 på en rad olika tidpunkter (3, 12, 24, och 72 timmar) efter injektion.
5. hjärnvävnad Provberedning för Paraffinsnitt
- Placera injicerade nyfödda i en liten plastskål på krossad is.
- När djuret är under narkos, använd toe-nypa svarsmetoden för att bestämma djupet av anesthesia.
- Göra en central eller två änden horisontella end skär genom bröstkorgen för att öppna upp brösthålan.
- Gör ett snitt i atrium med vass sax. Ingjuta 4% paraformaldehyd (PFA) lösning in i förmaket. Stoppa perfusion när spontan rörelse (PFA dans) och lättade-färg i levern iakttas. Inte exsanguinate.
- Dissekera nyfödda barnet (såsom tidigare beskrivits 20) genom att först ta huvudet med hjälp av en sax.
- Göra en mittlinje snitt längs integument från halsen till näsan för att exponera skallen.
- Placera den vassa änden av ett par av iris sax in i foramen magnum på ena sidan, noggrant glider längs den inre ytan av skallen.
- Gör ett snitt som sträcker sig till den bakre kanten hos den bakre skallytan, och gör en identisk snitt på den kontralaterala sidan. Rensa bort skallen runt lillhjärnan.
- Dra försiktigt tillbaka skallen på en sida för att förhindra skador på hjärnan. Upprepa dettaförfarande på den andra sidan av hjärnan.
- Användning av en spatel, kapa de lukt glödlampor och nervösa anslutningar längs den ventrala ytan av hjärnan.
- separera försiktigt hjärnan från huvudet, trimma någon dura som fortfarande ansluta hjärnan till skallen med sax och ta bort hjärnan.
- Placera hjärnan i en injektionsflaska med fixativ innehållande 4% PFA minst 10 gånger volymen av hjärnan under 24 h vid 4 ° C.
- Dehydratisera vävnaden genom en serie graderade etanol bad för att tränga undan vattnet, och sedan infiltrera med paraffinvax, som bildar ett block. Skär paraffin block med en mikrotom i skivor 4 um tjockt 21.
- Avparaffinera och rehydrera bilderna av de infekterade hjärnor 22. Fortsätt till in situ hybridisering för paraffininbäddade snitt.
6. hjärnvävnad Provberedning för frysta snitt
- Ta bort hjärnan efter stegen i 5,1-5,11.
- Att iaktta de fluorescerande mikropärlor och M32-EGFP-MCMV placerar opererande hjärnan på flatbottnade cryomolds. Lägg bädda mediet att helt täcka hjärnan provet. Snap frysa cryomolds i förkyld n-hexan (-80 ° C), med hjälp av pincett för att hålla kanten av cryomolds innan du ansluter den till chucken.
- För sektionering, bifoga den frusna vävnadsblock på förkylda kryostaten chucken. Överföra den frysta vävnaden med chucken in i en kryostat kammare och sänka temperaturen till mellan -10 och -20 ° C, och skär skivorna cirka 8-10 | j, m tjocka 23.
- Fäst sektioner med cytofixative (blandning av isopropylalkohol och polyetylenglykol) genom sprutning. Lufttorka sektioner för 30 min vid RT omedelbart efter sprutning, och förvara dem vid - 80 ° C tills vidare användning.
- Jämvikta sektionerna tillbaka till RT och tvätta tre gånger med PBS.
- Färga sektioner med fluoresceinisotiocyanat (FITC) konjugerad Griffonia simplicifolia isolectin B4 vid en koncentration av 1: 100 under 10 min i PBS vid RT (fig 5) eller med PE-konjugerad CD31-antikropp vid en koncentration av 1: 100 under 30 min i PBS vid RT (Figur 6).
- Tvätta sektioner med PBS tre gånger.
- Efter tvättningen, färga sektioner med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) för att visualisera cellkärnor. Montera delarna i anti-fade reagens och bild DAPI (excitation vid 345 nm, emission vid 455 nm), EGFP (excitation vid 489 nm, emission vid 508 nm), och Nile Red (excitation vid 553 nm, emission vid 637 nm) med ett fluorescensmikroskop (figurerna 3, 5, 6).
7. Fluorescent in situ hybridisering (FISH) för Paraffininbäddade snitt
- Förbered FISH sonden märkt direkt med fluorofor för DNA in situ hybridisering genom nick-translation med användning av en bakteriell artificiell kromosom som innehåller hela MCMV DNA genome (pSM3fr) 19. Koncentrationen av FISH sonden är 0,1 ug / ul.
- Avparaffinera och rehydrera bilderna av de infekterade hjärnor 22.
- Behandla sektionerna vävnads med RNas (100 | ig / ml i PBS) för att upptäcka virus-DNA.
- Utföra antigenåtervinning med en 0,05% NP40, 0,01 M citratbuffert (pH 6,0) vid 95 till 98 ° C under 20 min. Kyla glasen ner till RT i 20 min.
- I en glas Coplin färgning burk, tvätta objektglasen i rent vatten tre gånger i 2 minuter varje gång. Utföra ett ytterligare antigenåtervinning steg med en 0,06% pepsin, 0,01 N HCl-lösning under 5 min vid 37 ° C.
- Skölj objektglasen tre gånger i rent vatten under 2 minuter varje gång i en glas Coplin färgning burk.
- Dehydratisera vävnadssnitt igen genom att överföra bilderna från 70% etanol, till 85% etanol, och därefter till 100% etanol.
- För framställning av 10 ml av hybridiseringsbuffert, blanda 1,25 ml hybridisering in situ alter (3 M NaCl, 100 mM TrisHCl pH 8,0, 100 mM natriumfosfat pH 6,8, 50 mM EDTA) med 5 ml avjoniserat formamid, 2,5 ml 50% dextransulfat, 250 | j, l 50x Denhardts lösning, 125 | j, l 100 mg / ml tRNA och 875 | j, l H2O
- Späd DNA-sonden direkt märkt med fluoroforer som känner igen hela MCMV genomet slumpvis i hybridiseringsbuffert. Den slutliga volymen bör vara 10 ^ (7 l hybridisering buffert, 1 pl sond (0,1 mikrogram / l) och 2 pl destillerat vatten).
- Tillsätt sondblandningen (10 ul) till varje bild och täck med ett täck (15 × 15 mm). Täta täck med gummicement. Denaturera sondblandningen under 5 minuter vid 85 ° C och fyll hybridiseringssteget O / N vid 42 ° C.
- Tvätta objektglasen med 0,3% NP40, 0.4x SSC vid 73 ° C under 2 min; med 0,1% NP40, 0.4x SSC vid 73 ° C under 1 min; och med 2 x SSC två gånger.
- Motfärg kärnorna med DAPI (10 ng / ml) och täcka objektglaset med ett täckglas.
- Monterasektionerna i anti-fade reagens och bild DAPI (excitation vid 345 nm, emission vid 455 nm) och EGFP (excitation vid 489 nm, emission vid 508 nm) med ett fluorescensmikroskop (Figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I studier på patogenesen av viral encefalit, är viktigt infektionen metoden. Den hematogen väg utgör en akut infektion i endotelceller och pericyter i hjärnan, medan ICV väg representerar en akut infektion sprider sig via CSF genom subaraknoidalrummet, nå till hjärnhinnorna och choroid plexus. För att analysera den första fördelningen av partiklar i akut encefalit, in situ hybridisering att detektera de MCMV genom och direkt observation av M32-EGFP-MCMV partiklar eller fluorescerande mikropärlor användes.
Generation av rekombinant MCMV (M32-EGFP-MCMV)
Protokollet visar hur rekombinant M32-GFP-MCMV genererades. EGFP sattes in mellan 37089 och 41450 bp (M32-M31-locus) i MCMV-genomet genom homolog rekombination. En EGFP protein smältes med ett virusprotein (M32) och EGFP uttrycktes inom viruspartiklar. Efter homolog rekombination gjordes en virusberedning anses ren när all foci uppstått genom den begränsande-späd infektion visas EGFP expression, vilket indikerar att ingen vildtypvirus återstod. Det kan ta flera utspädningsprocedurer för att rena det rekombinanta viruset. Figur 1A visar EGFP signaler renat rekombinant MCMV (M32-EGFP-MCMV) och figur 1B visar en TEM bild av M32-EGFP-MCMV partiklar innehållande virusgenomet i viruskärnan .
Intracerebroventrikulär Injection och intravaskulär injektion
Figur 2 visar injektionsställen av neonatal mus (P 0,5) där virus eller mikropärlor injicerades genom ICV rutt eller IV vägen. I ICV, är injektionsstället vid mittpunkten mellanörat och ögat, vid en plats cirka 0,7 - 1,0 mm lateralt till den sagittala suturen och 0,7 - 1,0 mm kaudalt från den neonatala bregma (Figur 2A). Nålen ska injiceras i den laterala ventrikeln 2 mm djupa, vinkelrätt mot skallen ytan (Figur 2B). Figur 2C och 2D visar att MCMV eller mikrokorn sprutas in i tids ansiktet ven av neonatala möss. En transilluminator och förstoringsglas är användbara verktyg för att tydligt visualisera små vener.
Fördelning av viruspartiklar / genom och fluorescerande mikropärlor
Följande siffror visar fördelningen av viruspartiklar / genom och fluorescerande mikrokulor i det akuta skedet. Figur 3 visar mikrokorn signaler av frysta sektioner av hjärnan. Figur 3A och 3B visarfördelning av 0,1 -. 0,3 | j, m fluorescerande Nile Red mikrokulor i kantområdet (MA) (figur 3a) och choroid plexus och subventrikulära zonen (SVZ) (figur 3B) vid 2 h efter ICV injektion Figur 3C och 3D visar fördelningen av 0,1 - 0,3 pm fluorescerande Nile röda mikrokulor i MA och kärlområdet (figur 3C) och choroid plexus och SVZ (figur 3D) vid två timmar efter IV-injektion. Det är troligt att efter ICV och IV-injektion, partiklar inte omedelbart jämnt fördelade över parenkymet. Snarare de stannade i SVZ, MA, och kärlområdet i akut infektion fasen. Storleken på partiklarna är den viktigaste faktorn som påverkar deras fördelning i hjärnan i den akuta fasen efter ICV och IV-injektion. Figur 4 visar FISH av MCMV genomet på paraffininbäddade snitt av hjärnan. MCMV-genomet (gröna fläckar) detekterades i denSVZ vid 3 h efter ICV-injektion (figur 4B). De MCMV-genom (gröna fläckar) detekterades i MA och vaskulär area på 3 timmar efter IV-injektion (figur 4C). Fördelningen av MCMV (Figur 4) och mikropärlor (Figur 3) var ganska lika. Figur 5 visar de storleksberoende fördelningsmönster för mikrokorn i de frysta sektioner av hjärnan efter intravenös injektion. Mikropärlor med diametrar 1,7 - 2,2 | j, m (Figur 5B), 0,1 - 0,3 pm (Figur 5D), och 0,04-0,06 ^ m (Figur 5E) visas respektive. Mindre mikropärlor hade en tendens att vara extravaserats ut från det vaskulära området i parenkymet. Figur 6 visar fördelningen av M32-EGFP-MCMV-partiklar i de frysta sektioner av hjärnan. GFP dot signaler (M32-EGFP-MCMV partiklar) observerades huvudsakligen i MA (figur 6A) och choroid plexus och SVZ (
Figur 1:. Framställning av rekombinant M32-EGFP-MCMV (A) ultracentrifuger M32-EGFP-MCMV partiklar ses som gröna fläckar av fluorescerande mikroskopi. Skala bar:. 2,4 m (B) Transmissionselektronmikroskopi visar att M32-EGFP-MCMV partiklar har en typisk virusstrukturen. Skala bar: 77 nm.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54164/54164fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Injektions platser i neonatal musen. (A, B) ICV injektion av 5 ^ MCMV (cirka 5 x 10 5 PFU) eller av 5 pl mikropärlor (cirka 5,75 x 10 9 partiklar). (A) vid injektionsstället är vid mittpunkten mellan örat och ögat (vid ett läge cirka 0,7 - 1,0 mm lateralt till den sagittala suturen och 0,7 -. 1,0 mm kaudalt från den neonatala bregma) (B) A 27 G-nål med en 10-il spruta används för injektion i den laterala ventrikeln 2 mm djup, vinkelrätt mot skallen ytan. (C, D) MCMV eller mikropärlor injiceras i den tidsmässiga ansikts venen hos neonatala möss. (C) (D) En 1-ml spruta med en 35 G nål används för att utföra IV injektion av MCMV. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Fig. 3: Visualisering av fluorescerande Nile Red mikrokulor i hjärnan (A, B) 0,1 - 0,3 pm fluorescerande Nile Red mikropärlor signaler (röd) observeras i MA (A) och choroid plexus och SVZ (B) vid 2 h post ICV-injektion (C, D) 0,1 -. 0,3 | j, m fluorescerande Nile red mikropärlor som införs i neonatal mushjärna genom IV-injektion vid 2 h efter injektion. Nile Red mikropärlor observeras i the MA och kärlområdet (C) och choroid plexus och SVZ (D). Den vita kvadrat är förstorat i den förstorade insatsen i det övre högra hörnet (D) (A, C) Skala bar. 50 pm (B, D) Skala bar:. 150 nm. Pilar indikerar Nile röda mikropärlor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: MCMV Genome Distribution i mushjärna Efter ICV Injection och IV Injection (A) lägre förstoring vy.. Den vita kvadrat visar var den förstorade bilden (B) fångades. (B) MCMV-genomet (gröna fläckar) är först upptäcktes i SVZ vid tre timmar efter ICV injektion. DAPI (4 ';, 6-diamidino-2-fenylindol) används för kärnsyra (nukleär) färgning. Skala bar. 30 m (C) Den MCMV genomet (gröna fläckar) detekteras i kärlområdet och hjärnhinnorna vid 12 h efter IV-injektion. DAPI används för kärn syra färgning. Skala bar: 30 pm. Pilar indikerar representativa MCMV genomet (gröna fläckar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. Förhållandet mellan diameter mikrokulor och distributionen av mikropärlorna Fluorescent Nile Red mikropärlor (50 | il) införs i neonatala mushjärnor genom intravenös injektion. I frusna sektioner framställes 2 h efter injektion, Nile Red signaler (röd, som anges av pilarna) observeras i och runt vascular område av parenkymet. Den vaskulära område färgas med fluorescerande lektin (grön) (A, B) 1,7 -.. 2,2 um mikropärlor (A) lägre förstoring vy. Den vita kvadrat visar var den förstorade bilden (B) fångades (B) den vita kvadraten förstoras när den förstorade insatsen i det övre högra hörnet (B) (C, D) 0,1 -... 0,3 pm mikropärlor (C) den lägre förstoring vy. Den vita kvadrat visar var den förstorade bilden (D) fångades (D) den vita kvadraten förstoras när den förstorade insatsen i det övre högra hörnet (D) (E, F) 0,04 -... 0,06 um mikropärlor (E) den lägre förstoring vy. Den vita kvadrat visar var den förstorade bilden (F) togs. (F) den vita kvadraten förstoras när den förstorade insatsen i det övre högra hörnet
Figur 6: Observation av viruspartiklar i akut infektion fas. (A, B) EGFP dot signaler (M32-EGFP-MCMV partiklar) är huvudsakligen observeras i MA (anges med pilar; A), choroid plexus, och SVZ (anges med pilar; B) vid 2 h efter ICV-injektion. De vita rutor förstoras när de förstorade insatserna i det övre högra hörnet (A) och (B). Skalstreck:. 20 | j, m (C, D) Vid 3 timmar efter IV-injektion, är de MCMV partiklarna (grön, indikerade med pilar) finns inuti och utanför det vaskulära området förparenkymet (C), choroid plexus, och SVZ (D) (röd: CD31-positiva celler). De vita rutor förstoras när de förstorade insatserna i det övre högra hörnet (C) och (D). Skala bar:. 20 pm klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I djurmodeller, ICV, intraperitoneal, direkt placental och IV infektioner har använts för att studera patogenesen av viral encefalit. Vi fokuserade på de ICV och IV injektion modeller av neonatala möss för enkelheten av de förfaranden och nyttan av direkt injektion av partiklar in i målregionen. Även intraperitoneal infektion är en enkel metod, viruspartiklar sprids systemiskt via en indirekt process 5,24. Direkt placental infektion är en bra metod för att studera embryonala systemisk infektion. Detta kräver dock att metoden särskild utbildning för att ge stabila resultat och har en låg framgång. Infektionen Metoden är också en indirekt process genom moderkakan och det är svårt att kontrollera mängden injektion i fostret vid varje försök 6. Som neonatal musen är mycket känsliga för virus såsom CMV, i denna studie kunde vi jämföra fördelningen av viruspartiklar och att av infekterade celler vid ett mycket tidigt phase för infektion. ICV injektion modellen är fördelaktigt för att studera infektions beteende som kringgår BBB 25, under det att IV-infektionsmodell är en systemisk infektion modell som liknar naturlig infektion inklusive interaktionen av viruset med BBB.
Med ICV injektionsmetoden, såg vi till att penetrera åtminstone 2 mm djupt in i skallen. Nålen hölls inne i cerebrala ventriklarna för ca 10-20 sekunder för att förhindra backflöde från kamrarna 26. När det görs noggrant, är ICV injektion en snabb och enkel in vivo-metod. Men ibland felaktiga injektioner inklusive oönskad återströmning eller djup / grund penetration av nålen till hjärnan kan hända. Noggranna rutiner och observationer efter injektion krävs för att utföra detta protokoll framgångsrikt. Med tanke på injektions fel, bara fokuserat vi på distributionsmönster hos partiklarna och inte på kvantitet, och inte följa behandlingseffekterna av läkemedels eller funktionella antikroppar i vår studie.
Det finns flera förfaranden för att utföra den murina neonatal IV-injektion, genom flera platser såsom ytliga temporala vener, yttre halsvenen, och retro-orbital sinus. Den ytliga temporala ven för neonatal enkelt visualiseras med hjälp av en transilluminator och förstoringsglas. Injektion kan kompletteras med en enda erfaren individ med ett bra resultat rate.We valde ytliga temporala ven som platsen för intravenös injektion. Den intravenös injektion metoden kräver lite träning såsom positionering av neonatal mus och injektionsproceduren. Chefen för den neonatala musen bör placeras med tejp för den tidsmässiga ven att vara på topp och platt. 35 G-nål bör införas i kärlet tillräckligt långt att nålspetsen är helt omgiven av fartyget. En transilluminator och förstoringsglas är användbara verktyg för att tydligt visualisera små vener. Injektion av stora volymer upp till 100il bör infunderas långsamt för att bekräfta flödet av innehållet. I händelse av fel på den injektion vid första försöket, är den andra sidan av den tidsmässiga ven för en annan studie. Efter injektion, valpar uppleva minimal stress och återhämta sig snabbt. Det är inte klart varför i genomsnitt en av 20 valpar upplever stor nöd och inte återhämta sig. Men den låga förekomsten av denna händelse minimalt skadar hela experimentell design.
Eftersom IV injektionsmetoden har en hög framgångsgrad (mer än 80%), kunde vi jämföra distributionsmönstret med och utan systemiska behandlingar såsom droger eller funktionella antikroppar. Vi har tidigare genomfört ett experiment där neonatala möss injicerades med anti-β1 integrin funktionella blockerande antikroppar (50 ^ vid 20 ug / g) eller isotyp kontrollantikroppar (50 ^ vid 20 mikrogram / g) i ytliga temporala ven av neonatala möss. En timme efter antikroppsinjektion, 5 × 106 PFU (50 fil) av MCMV infunderades in i den andra sidan av den temporala venen. Antalet MCMV-positiva celler per avsnitt av hamster anti-råtta CD29 (β1 grinkedjan, klona Ha2 / 5) -behandlade hjärna var betydligt lägre vid en jämförelse med den hos isotyp antikropp-behandlade hjärn 8. Med användning av samma metod i framtida undersökningar, kan effekterna av läkemedel eller neutraliserande antikroppar mot virus bestämmas genom att observera fördelningen av virala partiklar och infekterade celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane | Sigma-Aldrich | T-6791 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H-1758 | |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S-1876 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04 - 0.06 | Spherotech, Inc. | FP-00556-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1 - 0.3 | Spherotech, Inc. | FP-0256-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7 - 2.2 | Spherotech, inc. | FP-2056-2 | |
| 10% mouse serum | DAKO | X0910 | |
| C57BL/6 mouse | SLC, Inc. | ||
| ICR mouse | SLC, Inc. | ||
| Modified Microliter Syringes (7000 Series) | Hamilton company | ||
| 35-gauge needle | Saito Medical | ||
| A Wee Sight Transilluminator | Phillips Healthcare | 1017920 | |
| O.C.T.Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Nonidet(R) P-40 | Nacalai | 25223-04 | |
| citrate buffer (pH 6) x 10 | Sigma-Aldrich | C9999-100ml | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| EDTA | dojindo | N001 | |
| Formamide | TCI | F0045 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | 42867-5G | |
| Denhardt's Solution (50x) | ThermoFishcer sceintific | 750018 | |
| Yeast tRNA (10 mg/ml) | ThermoFishcer sceintific | AM7119 | |
| SSC 20x | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| DAPI | ThermoFishcer sceintific | D1306 | |
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| superfrost plus glass | ThermoFishcer sceintific | 12-55-18 | |
| Cytokeep II | Nippon Shoji Co. | ||
| FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 | Vector laboratories, Inc. | L1104 | |
| Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE | ebioscience | 12-0311 | |
| ProLong Gold | ThermoFishcer sceintific | P36934 | |
| BIOREVO | KEYENCE | BZ-9000E |
References
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Passini, M. A., et al. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice. J Virol. 77 (12), 7034-7040 (2003).
- Kim, J. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur J Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
- McLean, J. R., et al. Widespread neuron-specific transgene expression in brain and spinal cord following synapsin promoter-driven AAV9 neonatal intracerebroventricular injection. Neurosci Lett. 576, 73-78 (2014).
- Hsu, K. M., Pratt, J. R., Akers, W. J., Achilefu, S. I., Yokoyama, W. M. Murine cytomegalovirus displays selective infection of cells within hours after systemic administration. J Gen Virol. 90. 90 (Pt 1), 33-43 (2009).
- Sakao-Suzuki, M., et al. Aberrant fetal macrophage/microglial reactions to cytomegalovirus infection. Annals of Clinical and Translational Neruology. 1 (8), 570-588 (2014).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. J Vis Exp. (93), e52037 (2014).
- Kawasaki, H., et al. Cytomegalovirus initiates infection selectively from high-level beta1 integrin-expressing cells in the brain. Am J Pathol. 185 (5), 1304-1323 (2015).
- Rahim, A. A., et al. Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system. FASEB J. 25 (10), 3505-3518 (2011).
- Cannon, M. J., Davis, K. F. Washing our hands of the congenital cytomegalovirus disease epidemic. Bmc Public Health. 5, (2005).
- Frenkel, L. D., Keys, M. P., Hefferen, S. J., Rola-Pleszczynski, M., Bellanti, J. A. Unusual eye abnormalities associated with congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 66 (5), 763-766 (1980).
- Becroft, D. M. Prenatal cytomegalovirus infection: epidemiology, pathology and pathogenesis. Perspect Pediatr Pathol. 6, 203-241 (1981).
- Conboy, T. J., et al. Intellectual development in school-aged children with asymptomatic congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 77 (6), 801-806 (1986).
- Fowler, K. B., et al. The outcome of congenital cytomegalovirus infection in relation to maternal antibody status. N Engl J Med. 326 (10), 663-667 (1992).
- Cannon, M. J. Congenital cytomegalovirus (CMV) epidemiology and awareness. J Clin Virol. 46 Suppl 4, S6-S10 (2009).
- Grassi, M. P., et al. Microglial nodular encephalitis and ventriculoencephalitis due to cytomegalovirus infection in patients with AIDS: two distinct clinical patterns. Clin Infect Dis. 27 (3), 504-508 (1998).
- Kawasaki, H., Mocarski, E. S., Kosugi, I., Tsutsui, Y. Cyclosporine inhibits mouse cytomegalovirus infection via a cyclophilin-dependent pathway specifically in neural stem/progenitor cells. J Virol. 81 (17), 9013-9023 (2007).
- Britt, W. J. Human cytomegalovirus: propagation, quantification, and storage. Curr Protoc Microbiol. Chapter 14, Unit 14E 13 (2010).
- Kawasaki, H., Kosugi, I., Arai, Y., Iwashita, T., Tsutsui, Y. Mouse embryonic stem cells inhibit murine cytomegalovirus infection through a multi-step process. PLoS One. 6 (3), e17492 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cutting sections of paraffin-embedded tissues. CSH Protoc. , (2008).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. J Vis Exp. (8), e308 (2007).
- Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart. J Vis Exp. (97), (2015).
- Ohshima, M., et al. Intraperitoneal and intravenous deliveries are not comparable in terms of drug efficacy and cell distribution in neonatal mice with hypoxia-ischemia. Brain Dev. 37 (4), 376-386 (2015).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. (91), e51863 (2014).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. J Vis Exp. (56), (2011).
