Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Yenidoğan Beyin içine Viral Parçacıklar ve Floresan mikro boncuklar intraserebroventriküler ve İntravasküler Enjeksiyon

Published: July 24, 2016 doi: 10.3791/54164
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 1
1Department of Regenerative & Infectious Pathology, Hamamatsu University School of Medicine, 2First Department of Medicine, Hamamatsu University School of Medicine, 3Faculty of Health Science, Tokoha University

Abstract

viral ensefalit patogenezinde çalışmada, enfeksiyon yöntemi önemlidir. beyne iki enfeksiyon güzergah birinci endotel hücreleri ve beynin perisitlerin tarafından enfekte kan yoluyla yoldur. İkinci intraserebroventriküler (ICV) yoldur. Bir kez merkezi sinir sistemi (MSS) dahilinde, virüsler beyin omurilik sıvısı yoluyla subaraknoid, meninkslerin ve koroid pleksus yayılabilir. deneysel modellerde, MSS viral dağıtım erken aşamaları iyi karakterize değildir ve sadece belirli hücreler başlangıçta enfekte olup olmadığı bilinmemektedir. Burada, enfeksiyonun akut fazında sitomegalovirüs (CMV) parçacıkların dağılımını analiz ettik, yenidoğan fare beyninin içine ICV veya damar içi (IV) enjeksiyonu takiben, birincil viremi olarak adlandırılan. ICV püskürtme modelinde, fare CMV (MCMV) ya da flüoresan mikro-5 ul midpoi yanal ventrikül içine enjekte edilmiştirnt 27 G iğne ile 10 ul şırınga kullanarak kulak ve göz arasındaki. IV enjeksiyonu modelinde, 35 G iğne ile bir 1 ml şırınga kullanıldı. Bir transillüminator yenidoğan fare yüzeysel zamansal (yüz) damar görselleştirmek için kullanıldı. Biz yüzeysel temporal ven içine MCMV veya floresan mikro-50 ul aşılamıştır. Brain farklı zaman noktalarında Enjeksiyondan sonra toplandı. MCMV genomları in situ hibridizasyon yönteminde kullanılarak tespit edildi. Rekombinant MCMV parçacıkları ifade Floresan mikro-veya yeşil floresan proteini flüoresans mikroskopisi ile tespit edilmiştir. Bu teknikler, ensefalit patogenezini araştırmak için diğer patojenlere uygulanabilir.

Introduction

Viral ensefalit okuyan zaman viral parçacıkların ilk dağıtım hastalık patogenezi anlamak ve beyinde viral hedefleri tespit etmek çok önemlidir. Pandoravirus büyüklüğü 1 fazla 700 nm, ancak çok virüs, 20 ila 300 nm arasında boyutu değişir. akut dönemdeki viral partiküllerin dağılım parçacıklarının büyüklüğü, hücresel reseptörlere dağılımı ya da virüs hücresel reseptörlerin afinite ile bağlı olabilir. Hayvan modellerinde, intraserebroventriküler (ICV), intraperitonal, doğrudan plasental ve damar içi (IV) enfeksiyonları, viral ensefalit hastalık oluşumunun incelenmesinde kullanılmıştır olarak. virüs ICV aşılama genellikle farelerde, merkezi sinir sistemi (CNS) enfeksiyonları kurmak için kullanılır. Bu teknik kullanılarak yapılan çalışmalar, özellikle periventriküler bölgelerinde hücre ve beyin omurilik sıvısı (CSF), Simila ile doğrudan temas halinde beyin bölgelerinde yaygın bir enfeksiyon raporViral ventriculoencephalitis etkilerine R. Adeno-ilişkili virüs (AAV) parçacıklar, küçük boyutlu (20 - çapı 25 nm) ICV enfeksiyonlar 2-4 beyin boyunca yayılmasını kolaylaştırır. İntraperitoneal 5, direkt plasental 6, ve IV enjeksiyonlar 7 hematojenik sistemik yönetimini temsil etmektedir. Kan-beyin bariyerinin (KBB) viral parçacıkların penetrasyon onları yaygın mikroglial nodüller 8,9 temsil yenidoğan beyin parankimi ulaşmasını sağlar.

Sitomegalovirüs (CMV), herpes virüsü ailesine ait ortak bir virüstür. Amerika Birleşik Devletleri'nde,% 50 - insanların% 80 40. CMV enfeksiyonları nadiren zararlı ama immün sistemi baskılanmış hastalarda ve fetuslarda hastalıklara neden olabilir yaş CMV enfeksiyonu vardı. Tüm doğumların% 0.2 -% 2 gibi mikrosefali, periventriküler kalsifikasyon, serebellar hipoplazi, MICR gibi şiddetli semptomlar sonuçlanan CMV 10 ile doğarlaroftalmi ve optik sinir atrofisi 11,12. Ayrıca, mental retardasyon, işitme kaybı, görme kusurları, nöbet ve epilepsi olmayan ölümcül CMV ile enfekte bebeklerin 13,14 yaklaşık% 10'unda görülür. MSS disfonksiyonu CMV konjenital anomali en sık görülen karakteristik belirtidir. Daha çocuk kalıcı olarak Down sendromu, fetal alkol sendromu veya spina bifida 15 tarafından daha doğuştan CMV tarafından her yıl devre dışıdır. güvenli ve etkili bir aşı ihtiyacı için çağrıda, şu anda CMV ye karşı hiçbir aşı mevcut. enfeksiyonun erken fazında reseptörleriyle CMV parçacıkların etkileşimi incelemek aşılamanın etkisini anlamak önemlidir.

Ventriculoencephalitis ve yaygın mikroglial nodüller CMV iki ana patolojik özellikleri 16 ensefalit vardır. (- 300 nm 150) enfeksiyonu a akut fazında beynin yoluyla yayılan CMV parçacıkları nasıl belirsiz olmuşturnd nasıl hücresel reseptörlerin dağılımı ve virüsler için kendi afinite viral yayılmasına katkıda bulunur. Kawasaki vd. ICV ve parçacıklar ve enfeksiyon en erken aşamasında reseptörleri (β1 integrin) dağılımı açısından IV enfeksiyonları değerlendirilmiştir. CMV parçacıkları ve β1 integrin ekspresyonu yayılması de ICV, IV enfeksiyonlar 8 hem de enfeksiyon en erken aşamasında ilişkili olduğunu bulmuşlardır. ICV enfeksiyonu ventriculoencephalitis bir modeldir ve IV enfeksiyonu yaygın mikroglial nodüllerin bir modeldir. Viral veya floresan parçacıkların dinamiği incelenmesi parçacık boyutu, hücresel reseptörlere viral etkileşimleri ve beyinde BBB penetrasyon mekanizması etkisi hakkında yararlı bilgi verir. Aşağıdaki protokol CNS'de bir viral enfeksiyon ve viral vektör araştırmak için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bütün deneysel protokoller Tıp Fakültesi Hamamatsu Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı.

MCMV (Smith ve soyu) ve rekombinan hazırlanması 1. M32-gelişmiş yeşil floresan proteini (EGFP) -MCMV

  1. Ve daha önce tarif edilen 8 - (1.9 1.2), aşağıdaki yönteme göre rekombinant M32-EGFP-MCMV oluşturur.
  2. Vahşi tip MCMV (: U68299 erişim sayısı) Smith soyundan türetilen yeniden birleştirici virüsleri kullanın. Ekle EGFP (4361 baz çifti; bp) 37.089 ve 41.450 bp arasında - homolog rekombinasyon yoluyla MCMV genomunda (M32 M31 lokus).
  3. M32, 5'-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '(ileri doğru primer), 5: polimeraz zincir reaksiyonu ile MCMV M32 yükseltin (41.450 - hemen aşağıdaki primerler kullanılarak dizisi gen lokusu kuşatan, 39.246 BP - 39286 bp dizisi ve M31 (37.089 eteklenen kalan '-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT3 '(ters primer), M31, 5'-CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3' (ileri doğru primer) 5'-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3 '(ters primer).
  4. Nhel ve BamHI sınırlama bölgeleri kullanılarak EGFP ifade vektörüne M32 lokusu yerleştirin. Afili ve Xbal siteleri kullanarak plazmit -recombinant M32-EGFP içine M31 odağı yerleştirin. EGFP - - M32 dan Nhel ve Afili ile M31 dizisi - EGFP - M32 tutunmaya M31 rekombinasyon plazmid ve H 2 O çözülür
  5. MCMV (Smith suşu) çekirdekleri içine bölünmüş yapı transferinde homolog rekombinasyon ikna etmek için bir elektroporasyon sistemi kullanılarak NIH3T3 hücreler 24 saat sonrası enfeksiyon (hpi) ile enfekte.
  6. 3 gün sonra enfeksiyon, enfekte olmuş hücrelerin EGFP ifade odaklar için altı oyuklu plakalar içinde 1 / 1.000 oranına ve ekranda enfekte edilmemiş fare embriyonik fibroblastlar (MEF'ler) ile birlikte kültür hücreleri de.
  7. harveYeşil floresan odakları içeren kuyulardan st virüs içeren süpernatantlar ve on kat sulandırmak. Saflaştırma için, tek yeşil flüoresan odakları görüntüler kuyuları seçin.
  8. Tüm odaklar sınırlayıcı seyreltme enfeksiyonu görüntüleme EGFP ifade kaynaklanan zaman, virüs preparasyonu Resim vahşi tip virüs kalmasını gösteren saftır. Daha önce 17 açıklandığı gibi plak tahlil yöntemi ile virüs ölçmek.
  9. eldiven ve maske takıyor biyogüvenlik seviye 2 sertifikalı biyogüvenlik dolaplarında mcmv davranın.
  10. 12 günlük ICR fare embriyoları hazırlanan MEFS Passage MCMV (Smith suşu) ve rekombinant MCMV daha önce 17 nitelendirdi.
  11. 16 ° C'de 20 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüj ile enfekte MEF kültürlerin yüzer hücreleri çıkarmak.
  12. Ultrasantrifüj işlemi 70.000 x g'de 40 dakika boyunca süpernatanlar. Tris-tamponlu tuzlu su, 1 ml virionlar içeren pelet yeniden süspanse edin ve önceden oluşturulmuş bir lineer S üzerine aktarmakorbitol gradyanı (% 25 -% 70). 60 dakika için 18 Ultracentrifuge yine de 70,000 x g.
  13. bir şırınga ile viryon içeren grup hasat. 40 dakika boyunca 70.000 x g'de ek ultrasantrifüj aşamasından sonra hasat virionlar Pelet.
  14. enfeksiyon deneyler kadar -80 ° C'de fosfat tamponlu salin (PBS) ve mağaza 1 ml pelletini.
  15. Daha önce tarif edildiği gibi 19 plak deneyi yöntemi ile virüs titresi ölçmek.
  16. Floresan mikroskobu (Şekil 1 A) ve transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) 8 (Şekil 1B) partikül yapısı (489 nm, 508 nm emisyon uyarma) rekombinant MCMV parçacıkların EGFP ifade görselleştirme.

Nil Kırmızı Floresan mikro-boncuk 2. Hazırlık

  1. Satınalma karboksil floresan Nil kırmızı mikroboncuklar ve çapına göre tüpler içine mikro-500 ul koyun (0.04- Yaklaşık 0.06 um, 3.63 x 10 ila 12 parçacıkları; 0.1 - yaklaşık 5.75 x 10 10 parçacıkların 0.3 um; ve 1,7-2,2 um, yaklaşık 6.85 x 10 7 parçacıkları).
  2. Herhangi bir endotoksin çıkarın ve oda sıcaklığında steril su içinde yeniden süspanse boncuklar yaklaşık 1 gün için 0.1 M NaOH ve 500 ul boncuk tedavi edin.
  3. kullanımdan önce, oda sıcaklığında, C57BL / 6 farelerinden elde edilen,% 10, fare serumu ile boncuk O / N adsorbe eder.
  4. agrega, girdap boncuk ayırmak ve kullanmadan önce iyice sonikasyon.

Yenidoğan Farelerde içine MCMV ve Floresan mikro boncuklar 3. ICV enjeksiyon

  1. 12 saat ışık / karanlık döngüsü altında sıcaklık kontrollü bir tesiste normal gebe ICR farelerine koruyun. yenidoğanların doğum gününde P 0.5 olarak belirlenmiştir.
  2. 10 ul şırınga ve% 70 alkol ile 27 G iğne sterilize edin.
  3. MCMV veya floresan mikro içeren enjeksiyon çözeltisi (5 ul) yükdikkatle şırınga pistonu çekerek iğne içine boncuk.
  4. 4 dakika - 3 buz üzerinde fare koyarak yenidoğan fare (P 0.5) kısıtlamaktadır. hayvan anestezi altına alındıktan sonra, anestezi derinliğini belirlemek için ayak tutam yanıt yöntemini kullanın.
  5. Mark yaklaşık 0,7 bir yerde toksik olmayan bir laboratuvar kalemle enjeksiyon sitesi - 1,0 mm sagital sütür ve 0.7 yanal - yenidoğan Bregma (Şekil 2A) 1.0 mm kaudal.
  6. iğne işaretli enjeksiyon yerinde kafatası yüzeye dik derin 2 mm, yerleştirin. Referans olarak, bir toksik-olmayan makinesi ile iğne ucu 2 mm işaretleyin.
  7. Yavaş yavaş kafa derisi (Şekil 2B) açmadan lateral ventrikül içine MCMV (yaklaşık 5 × 10 5 PFU) 5 ul enjekte edilir.
  8. (- Yaklaşık 5.75 0.3 um x 10 8 parçacıklar 0.1) farelerin başka bir grubunda, floresan mikroboncukları ihtiva eden bir 5 ul çözelti enjekteaynı yöntem kullanılır.
  9. geri akışı önlemek için piston hareketini kestikten sonra 20 sn - Yavaşça iğne 10 kaldırın.
  10. Kurtarmak için 5 fareler tutmak için - hareket ve genel tepki restore kadar sıcak bir kap içinde 10 dakika.
  11. zaman noktalarında (3, 12, 24, 48 ve 72 saat), enjeksiyon sonrası bir aralığında bölüm 5'de tarif edilen şekilde beyin hasat.

Yenidoğan Farelerde içine MCMV veya Floresan mikro boncuklar 4. IV Enjeksiyon

  1. 4 dakika - 3 buz üzerinde fare koyarak yenidoğan fare (P 0.5) kısıtlamaktadır.
  2. P 0.5 yenidoğan MCMV intravenöz enjeksiyon yapmak için 35 g bir iğne ile bir 1 ml şırınga kullanın.
  3. Yüzeyel temporal (yüz) ven görselleştirmek için bir transilluminator (damar bulucu) kullanın. Enjeksiyon öncesinde, cerrahi bant (Şekil 2C) kullanarak transilluminator'de yenidoğan sabitleyin.
  4. (1.5x) büyüteç giyerek, yavaş yavaş MCMV (yaklaşık 5,45 × 50 ul demlenmeye; 10 9 parçacıklar) veya floresan mikro boncuk (0.04 - yaklaşık 0.06 mikron, 3.63 × 10 11 parçacıklar 0.1 - yaklaşık 0,3 um, 5.75 × 10 9 parçacıkları ve 1,7-2,2 mikron, yaklaşık 6.85 × 10 6 parçacıklar) yüzeysel temporal ven içine (Şekil 2B).
  5. iğneyi çıkardıktan sonra, kanama geçene kadar enjeksiyon yerinde baskı uygulamak için% 70 alkol içeren gazlı bez kullanın.
  6. Yenidoğan sıcak konteyner kafesine dönmeden önce kurtarmak için yaklaşık 5 dakika verin.
  7. zaman noktalarında (3, 12, 24 ve 72 saat) enjeksiyon sonrası bir aralığında bölüm 5'de tarif edilen şekilde beyin hasat.

Parafin Bölüm 5. Beyin Dokusu Numune Hazırlama

  1. ezilmiş buz üzerinde küçük bir plastik tabak enjekte yenidoğanlar yerleştirin.
  2. hayvan anestezi altına alındıktan sonra, anesthes derinliğini belirlemek için ayak tutam yanıt yöntemini kullanınia.
  3. göğüs boşluğu açmak için göğüs kafesi üzerinden bir merkezi ya da iki uç yatay uç kesim yapmak.
  4. keskin bir makas ile atrium bir kesim olun. atrium içine% 4 paraformaldehid (PFA) çözümü demlenmeye. Karaciğerin spontan hareket (PFA dansı) ve hafifletilmiş renkli gözlenen zaman perfüzyon durdurun. asıl bulbus olfaktoryusları alındı ​​etmeyin.
  5. İlk bir makas kullanarak kafa kaldırarak (daha önce 20 tarif) yenidoğan teşrih.
  6. kafatası açığa çıkarmak için burun boyundan kabuklarıyla birlikte bir orta hat kesi olun.
  7. dikkatlice kafatasının iç yüzeyi boyunca kayar, bir tarafta foramen magnum içine iris makas keskin ucunu yerleştirin.
  8. arka kafatası yüzeyi uzak kenarına kadar uzanan bir kesim yapmak ve karşı tarafta aynı kesim yapmak. beyincik etrafında kafatası kaldırmak.
  9. Dikkatle beyne zarar görmesini önlemek için bir tarafta kafatasını geri soyma. bu işlemi tekrarlayınbeynin diğer tarafında prosedür.
  10. Bir spatula kullanarak, beynin ventral yüzeyi boyunca koku ampuller ve sinir bağlantılarını kesmek.
  11. Yavaşça hala makas kullanarak kafatası beyin bağlayın ve beyin kaldırmak herhangi bir dura kırpma, baş beyin ayırın.
  12. % 4 PFA, 4 ° C'de 24 saat süre ile, beynin en az 10 katı volüm içeren sabitleştirici bir şişede beyin yerleştirin.
  13. su yer değiştirmesi için kademeli etanol banyoları, bir dizi doku kurutmak ve daha sonra bir blok oluşturur parafin mumu ile infiltre. 21 4 mikron kalınlığında dilimler halinde bir mikrotom ile parafin blok kesin.
  14. Deparaffinize enfekte beyinleri 22 slaytlar rehydrate ve. Parafin kesitler için in situ hibridizasyon geçin.

Dondurulmuş Bölüm 6. Beyin Dokusu Numune Hazırlama

  1. 5.1 özetlenen adımları izleyerek beyin çıkarın - 5.11.
  2. Floresan mikrobilyeleri ve M32-EGFP-MCMV gözlemlemek, düz dipli cryomolds üzerine rezeke beyin yerleştirin. tamamen beyin örneği kapsayacak şekilde gömme orta ekleyin. Yapış chuck taktıktan önce cryomolds kenarına tutmak için forseps kullanarak, önceden soğutulmuş n-heksan (-80 ºC) içinde cryomolds dondurma.
  3. kesit için, önceden soğutulmuş kriyostat chuck üzerinde dondurulmuş doku bloğunu takın. Bir kriyostat bölmesinde halinde ayna dondurulmuş doku transferi ve -10 ila -20 ° C sıcaklık daha düşük ve yaklaşık 8 dilimlemek - 23 10 um kalınlığındadır.
  4. püskürterek cytofixative (izopropil alkol ve polietilen glikol karışımı) olan bölümlerin tespit edin. Hava derhal püskürtmeden sonra oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bölümler kuru ve saklayın - sonraki kullanıma kadar 80 ° C.
  5. Lütfen, oda sıcaklığına kadar bölümler dengelenmesi ve üç kez PBS ile yıkayın.
  6. G ile konjüge edilmiş flöresin izotiyosiyanat (FITC) ile bölümleri Leke1 bir konsantrasyonda, 100 oda sıcaklığında PBS içinde 10 dakika boyunca (Şekil 5) ya da PE-konjuge CD31 antikoru ile: riffonia 1 bir konsantrasyonda B4 isolectin simplicifolia 100 oda sıcaklığında PBS içinde 30 dakika boyunca (Şekil 6).
  7. PBS ile üç kez bölümleri yıkayın.
  8. Yıkama işleminden sonra, hücre, çekirdeklerini görselleştirmek için 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile bölümleri leke. EGFP (489 nm uyarma, 508 nm emisyon) (345 nm, 455 nm emisyon uyarma), anti-solmaya reaktif ve görüntü DAPI bölümleri mount ve Nil kırmızı (553 nm uyarma, 637 nm emisyon) bir fluoresan mikroskobu ile (Şekil 3, 5, 6).

Parafin Gömülü Bölüm in situ Hibridizasyon (FISH) 7. Floresan

  1. Bütün MCMV DNA gen ihtiva eden bir bakteriyel suni kromozom kullanılarak çentik translasyonu ile in situ hibridizasyon DNA florofor ile doğrudan işaretlenmiş FISH probu hazırlanmasıOMe (pSM3fr) 19. BALIK prob konsantrasyonu 0.1 ug / ml.
  2. Deparaffinize enfekte beyinleri 22 slaytlar rehydrate ve.
  3. viral DNA tespit etmek için RNase (PBS içinde 100 ug / ml) ile doku bölümleri tedavi edin.
  4. 20 dakika boyunca 98 ° C -% 0.05 NP40, 95 0.01 M sitrat tampon maddesi (pH 6.0) ile antijen alımı gerçekleştirmek. 20 dakika boyunca oda sıcaklığına kadar aşağı kayar soğutun.
  5. cam Coplin boyama kavanoz, 2 dakika, her seferinde saf suda üç defa slaytlar yıkayın. Bir% 0.06 pepsin, 37 ° C'de 5 dakika boyunca 0.01 N HCI çözeltisi ile ek bir antijen alma aşamasını gerçekleştirir.
  6. Yıkama, 2 dakika için bir cam Coplin boyama kavanoz her saf suda üç defa açılır.
  7. % 85 etanol, ardından% 100 etanol,% 70 etanol ile slaytlar aktarma yeniden doku bölümleri kurutmak.
  8. Hibridizasyon tamponu 10 ml hazırlamak için, in situ hibridizasyon tuzları (3 M NaCI, 100 mM Tris içinde 1.25 ml karıştırın-HCI PH 8.0, 5 ml deiyonize formamid ile 100 mM sodyum fosfat pH 6.8, 50 mM EDTA), 2.5 ml% 50 Dekstran sülfat, 250 ul 50x Denhardt çözeltisi, 125 | il 100 mg / ml tRNA ve 875 ul H2O
  9. doğrudan melezleme tamponu rastgele bütün MCMV genomunu tanıyan fluorophores etiketli DNA probu sulandırmak. Nihai hacim 10 ul (7 ul hibridizasyon tamponu, 1 ul prob (0.1 ug / ml) ve 2 ul damıtılmış su) olması gerekir.
  10. Her slayta prob karışımı (10 ul) ekleyin ve bir lamel (15 × 15 mm) ile kaplayın. lastik çimento ile lamel mühür. 85 ° C'de 5 dakika boyunca prob karışımı denatüre ve 42 ° C'de hibridizasyon, basamak O / N doldurun.
  11. 2 dakika boyunca 73 ° C'de% 0.3 NP40, 0.4x SSC ile slaytlar yıkayın; % 0.1 NP40, 1 dakika boyunca 73 ° C'de 0.4x SSC ile; ve 2x SSC ile iki kez.
  12. DAPI (10 ng / ml) ve bir lamel ile slayt kapağı ile çekirdekleri Counterstain.
  13. dağbir floresan mikroskobu (Şekil 4), anti-solma reaktif ve görüntü DAPI (345 nm'de eksıtasyonla 455 nm'de emisyon) ve EGFP (489 nm'de eksıtasyonla 508 nm'de emisyon) bölümler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

viral ensefalit patogenezi ile ilgili çalışmalarda, enfeksiyon yöntemi önemlidir. ICV rota akut enfeksiyon, subaraknoid uzayda BOS yoluyla yayılan meninkslerde ve koroid pleksus ulaşan temsil ederken hematojen yol, endotel hücreleri ve beyin perisitlerin akut enfeksiyon temsil eder. MCMV genom ve M32-EGFP-MCMV parçacıklar veya floresan mikro-doğrudan gözlem tespit in situ hibridizasyon akut ensefalit partiküllerin ilk dağılımını analiz etmek için kullanıldı.

Rekombinant MCMV Generation (M32-EGFP-MCMV)

protokol M32-GFP-MCMV oluşturulan nasıl rekombinant göstermektedir. EGFP, homolog rekombinasyon ile MCMV genomunda 37.089 ve 41.450 bp'lik (M32-M31 lokus) arasına yerleştirilmiştir. Bir EGFP protein viral protein (M32) ile birleştirilir ve EGFP viral parçacıklar içinde ifade edildi. sınırlayıcı seyreltme enfeksiyonundan kaynaklanan tüm odakları, vahşi tip virüs kaldığını gösteren EGFP ifade görüntülendiğinde, homolog rekombinasyon sonra, virüs preparasyonu saf olarak kabul edildi. Bu rekombinant virüs saflaştırmak için birden fazla seyreltme prosedürlerinin alabilir. Şekil 1A saflaştırılmış rekombinant MCMV (M32-EGFP-MCMV) ait EGFP sinyallerini ve Şekil 1B, viral çekirdek virüs genomunu içeren M32-EGFP-MCMV partiküllerin bir TEM görüntüsü gösterilmektedir .

Intraserebroventriküler enjeksiyonu ve damar içi enjeksiyonu

Şekil 2 virüs ya da microbeads ICV rota veya IV yoldan enjekte edildi neonatal fare (P 0.5) enjeksiyon siteleri gösterir. ICV, enjeksiyon yeri arasındaki orta olanbir yerde kulak ve göz, yaklaşık 0,7 - Yenidoğan bregma (Şekil 2A) den 1,0 mm kaudal - 1,0 mm sagital sütür ve 0.7 lateral. İğne kafatası yüzeyi (Şekil 2B). Şekil 2C ve 2D dik derin 2 mm, MCMV ve mikro-neonatal farelerde zamansal yüz damar içine enjekte edilir olduğunu göstermektedir yan ventrikül içine enjekte edilmelidir. Bir transillüminator ve büyütücü gözlük açıkça küçük damarları görselleştirmek için yararlı araçlardır.

Viral Parçacıklar / Genomlarının ve Floresan mikro boncuklar Dağılımı

Aşağıdaki şekiller, viral parçacık / genomları ve akut faz içinde flüoresan mikro-dağılımını göstermektedir. 3 beyin Dondurulmuş kesitlerin mikroboncuk sinyallerini göstermektedir. Şekil 3a ve 3b0.1 dağılımı -., marjinal bölgede 0.3 mikron floresan Nil kırmızısını mikro-(MA) (Şekil 3A) ve koroid pleksus ve subventriküler bölge 2 saat sonra ICV enjeksiyonundan (SVZ) (Şekil 3B) Şekil 3C ve 3D dağılım gösterir 2 saat sonra IV enjeksiyonundan MA ve damar alanı (Şekil 3C) ve koroid pleksus ve SVZ'unda (Şekil 3D) 0,3 mikron floresan Nil kırmızı mikro-- 0.1. ICV, IV enjeksiyonu takiben, partiküller hemen parankimi boyunca eşit olarak yayılmamış, olasıdır. Aksine, onlar akut enfeksiyon aşamasında SVZ'unda, MA, ve vasküler bölgede kaldı. Parçacıkların büyüklüğü ICV ve IV enjeksiyonu takiben akut dönemde beyinde dağılımlarını etkileyen başlıca faktördür. 4 beynin parafin kesitlerinde MCMV genomunun FISH göstermektedir. MCMV genomu (yeşil noktalar) tespit edildi3 saat sonrası ICV enjeksiyonundan SVZ (Şekil 4B). MCMV genomları (yeşil noktalar) 3 saat sonrası IV enjeksiyon (Şekil 4C) de MA ve damar alanda tespit edildi. MCMV (Şekil 4) ve mikro boncuklar (Şekil 3) dağılımı oldukça benzerdir. 5 IV enjeksiyonu takiben beynin donmuş bölümlerinde mikro-boyut-bağımlı dağılım desenleri göstermektedir. 2.2 um (Şekil 5B), 0.1 - - 0.3 um (Şekil 5D) ve 0.04 - çapları 1.7 ile mikro-0.06 um (Şekil 5E), gösterilmiştir. Küçük mikroboncuklarının parenkimde damar alanı dışında ekstravaze gereken bir eğilim vardı. 6 Şekil beynin donmuş bölümlerinde M32-EGFP-MCMV parçacıkların dağılımını göstermektedir. GFP nokta sinyalleri (M32-EGFP-MCMV partiküller) esas olarak, MA (Şekil 6A) gözlenen edildi ve koroid pleksus ve SVZ ( ng> 2 saat sonrası ICV enjeksiyonundan Şekil 6B). MCMV parçacıkları içinde ve parankiminde (Şekil 6C) ve koroid pleksus ve SVZ (Şekil 6D) vasküler alanı dışında bulundu. M32-EGFP-MCMV parçacıklar, vasküler alanın dışına extravagation oranı MA ve koroid pleksus damarları oranla daha geçirgen olduğunu belirten menenjlerin ve beyin parankimi daha koroid pleksus yüksekti parankim.

Şekil 1
Şekil 1:. Rekombinant M32-EGFP-MCMV (A) ultra santrifüje M32-EGFP-MCMV partiküllerin üretimi flüoresan mikroskopi ile yeşil noktalar olarak görülmektedir. Ölçü bar:. 2.4 um (B), transmisyon elektron mikroskopisi M32-EGFP-MCMV parçacıklar tipik virüs yapısına sahip olduklarını ortaya koymaktadır. Ölçek çubuğu: 77 nm.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54164/54164fig1large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: Yenidoğan fare enjeksiyon siteler. 5 ul MCMV (yaklaşık 5 × 10 5 PFU) ya da (yaklaşık 5.75 × 10 9 parçacıklar) 5 ul mikro boncuklar (A, B) ICV enjeksiyonu. (A) enjeksiyon yerinde de (kulak ve göz arasındaki orta noktada olduğunu 1,0 mm sagital sütür ve 0.7 yanal - - ​​yaklaşık 0,7 bir konum. yenidoğan bregmadan 1,0 mm kaudal) (B) 10-ul şırınga ile 27 G iğne, lateral ventrikül içine enjeksiyon için 2 mm derinliğinde kullanılır kafatası yüzeyi dik. (C, D) MCMV ve mikro-neonatal farelerde zamansal yüz damarına enjekte edilir. (C) (D) A 1 ml'lik şırınga MCMV IV enjeksiyonu gerçekleştirmek için kullanılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
. Şekil 3: Beyindeki Floresan Nile Red mikro-görselleştirilmesi (A, B) 0.1 - (kırmızı) 2 saatte MA (A) ve koroid pleksus ve SVZ'unda (B) gözlenen 0.3 mikron floresan Nil kırmızısını mikro-sinyalleri Mesajı ICV enjeksiyonu (C, D) 0,1 -. 2 saat sonra enjeksiyonda IV enjeksiyon yoluyla yenidoğan fare beyninin içine 0.3 mikron floresan Nil kırmızı mikroboncuklar. Nil kırmızı mikroboncuklarının inci gözlenmektedire MA ve damar alanı (C) ve koroid pleksus ve SVZ (D). Beyaz kare (D) sağ üst genişlemiş prospektüste büyütülmüş (A, C) Ölçek çubuğu:. 50 mikron (B, D) Ölçek çubuğu:. 150 mikron. Oklar Nil kırmızı mikrobilyeleri gösteriyor. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4: ICV Enjeksiyon ve IV Enjeksiyon sonrasında Fare Beyin MCMV Genom Dağılımı (A) alt büyütme görünümü.. Büyütülmüş görüntü (B) yakalandı nerede beyaz kare gösterir. (B) MCMV genom (yeşil noktalar) ilk 3 saat sonrası ICV enjeksiyonundan SVZ'unda tespit edilir. DAPI (4 ',, 6-diamidino-2-fenilindol) Nükleer asit (nükleer) boyama için kullanılır. Ölçek çubuğu:. 30 mikron (C) MCMV genom (yeşil noktalar) 12 saat sonrası IV enjeksiyon damar alan ve meninkslerde tespit edilir. DAPI çekirdek asit boyama için kullanılır. Ölçek çubuğu: 30 mikron. Oklar temsilcisi MCMV genomunu (yeşil noktalar) göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5:. Mikro boncuklar Çapı ve mikro boncuklar Dağılımı Arasındaki İlişki Floresan Nil kırmızı mikro boncuk (50 ul) IV enjeksiyonu ile yenidoğan fare beyinleri sokulur. Dondurulmuş bölümlerde ve vascul etrafında gözlenmektedir 2 saat sonrası enjeksiyon (oklarla gösterilen kırmızı) Nil kırmızı sinyaller hazırlananparankim ar alanı. . Vasküler alan floresan lektin (yeşil) (A, B) 1,7 ile lekeli -. 2.2 mikron mikro boncuklar (A) alt büyütme görünümü. Beyaz kare büyütülmüş görüntü (B) yakalandı nerede olduğunu gösterir (B) beyaz kare (B) sağ üst genişlemiş insert olarak büyütülür (C, D) 0,1 -... 0.3 mikron mikro boncuk (C) alt büyütme görünümü. Beyaz kare büyütülmüş görüntü (D) yakalandı nerede olduğunu gösterir (D) beyaz kare (D) sağ üst genişlemiş insert olarak büyütülür (E, F) 0.04 -... 0.06 mikron mikro boncuk (E) alt büyütme görünümü. Beyaz kare büyütülmüş görüntü (F) yakalandı nereye gösterir. (F) beyaz kare sağ üst genişlemiş insert olarak büyütülür Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6: Akut Enfeksiyon Aşamada Virüs Parçacıkların Gözlem. (A, B) EGFP nokta sinyalleri (M32-EGFP-MCMV partiküller) esas MA gözlenmiştir (oklarla gösterilen A), koroid pleksus ve SVZ (oklarla gösterilen, B) 2 saat post ICV enjeksiyonundan. Beyaz kareler (A) ve (B) sağ üst genişlemiş ekler olarak büyütülmüş. Ölçü bar:. 20 uM (C, D) 3 saat sonra, IV enjeksiyonu olarak, (oklarla gösterilen yeşil) MCMV parçacıklar vasküler alanı içinde ve dışında bulunanparankima (C), koroid pleksus ve SVZ (d) (kırmızı: CD31-pozitif hücreler). Beyaz kareler (C) ve (D) sağ üst genişlemiş ekler olarak büyütülmüş. Ölçek çubuğu:. 20 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hayvan modellerinde, ICV, intraperitoneal, doğrudan plasental ve IV enfeksiyonları, viral ensefalit hastalık oluşumunun incelenmesinde kullanılmıştır. Biz prosedürlerin basitlik ve hedef bölgeye partiküllerin direkt enjeksiyon yararına yenidoğan farelerin ICV ve IV enjeksiyon modelleri üzerinde duruldu. Karın içi enfeksiyon kolay bir yöntem olmasına rağmen, viral partiküller dolaylı süreç 5,24 üzerinden sistematik yayıldı. Doğrudan plasental enfeksiyon embriyonik sistemik enfeksiyon çalışmak için iyi bir yöntemdir. Ancak, bu yöntem istikrarlı sonuçlar elde etmek için özel eğitim gerektiren ve düşük başarı oranına sahiptir. Enfeksiyon yöntemi de plasenta aracılığıyla dolaylı işlem olup, her bir deneme 6 fetusun içine enjeksiyon miktarını kontrol etmek zordur. yenidoğan fare CMV gibi virüslere karşı çok duyarlı olduğu için, bu çalışmada, çok erken PHA viral parçacıkların dağılımı ve enfekte olmuş hücrelerin bu karşılaştırabilirsinizenfeksiyonun örn. IV enfeksiyon modeli BBB ile virüsün etkileşimi dahil olmak üzere doğal enfeksiyon benzeyen bir sistemik enfeksiyon modeli ise ICV enjeksiyon modeli, BBB 25 atlar enfeksiyon davranışlarını incelemek için faydalıdır.

ICV enjeksiyon yöntemi ile, derin kafatası içine en az 2 mm nüfuz emin yaptı. Ventriküllerden 26'dan akışı önlemek için 20 sn - İğne yaklaşık 10 serebral ventriküller içinde tutuldu. Dikkatle Bittiğinde, ICV enjeksiyon hızlı ve in vivo yönteminde kolay bir olduğunu. Ancak, istenmeyen backflow veya meydana gelebilecek beyin iğne derin / sığ penetrasyon dahil bazen yanlış enjeksiyonlar. Dikkatli prosedürler ve gözlemler sonrası enjeksiyon başarıyla bu protokolü gerçekleştirmek için gereklidir. Enjeksiyon hatalarını göz önüne alındığında, biz sadece parçacıkların ve nicelik değil dağıtım desenleri üzerinde duruldu ve ilacın tedavi etkisi gözlenmediS ya da Çalışmamızda fonksiyonel antikorlar.

Böyle yüzeysel zamansal damarlar, dış juguler ven ve retro-orbital sinüs gibi çeşitli siteleri aracılığıyla fare yenidoğan IV enjeksiyonu, gerçekleştirmek için çeşitli prosedürler vardır. yenidoğanın yüzeysel zamansal ven kolayca transillüminator ve büyütme merceği ile görüntülenmiştir. Enjeksiyon rate.We IV enjeksiyon yerinde olarak yüzeysel zamansal ven seçti yüksek başarı ile tek bir tecrübeli kişi tarafından tamamlanabilir. IV enjeksiyon yöntemi, yenidoğan fare ve enjeksiyon prosedürü konumlandırma gibi bazı eğitim gerektirir. Temporal ven üst ve düz olmak üzere yenidoğan fare baş bandı ile yerleştirilmelidir. 35 G iğne iğne ucu tamamen gemi ile çevrili olduğunu yeterince damar içine sokulmalıdır. Bir transillüminator ve büyütücü gözlük açıkça küçük damarları görselleştirmek için yararlı araçlardır. kadar 100 büyük hacimli enjeksiyonul içeriğinin akışını onaylamak için yavaş yavaş infüzyon yoluyla uygulanmalıdır. İlk çalışmada, enjeksiyon arızalanması durumunda, temporal ven diğer tarafında başka bir deneme için kullanılabilir. Enjeksiyondan sonra, yavrular en az sıkıntı yaşamaya ve hızla iyileşir. bir 20 üzerinden yavruların ortalama büyük sıkıntı yaşarsınız ve kurtarmak değil neden belli değildir. Ancak, bu olayın minimal hasar bütün deneysel tasarım gerçekleşme oranı düşük.

IV enjeksiyon yöntemi yüksek başarı oranına (% 80'den fazla) olduğu gibi, biz ve bu tür ilaçların veya fonksiyonel antikorlar gibi sistemik tedaviler olmadan dağılım biçimini karşılaştırabilirsiniz. Biz daha önce yenidoğan fareler yenidoğan farelerin yüzeysel temporal ven içine (20 ug / g 50 ul) ya da izotop kontrol antikorları (20 ug / g 50 ul), anti-β1 fonksiyonel engelleme antikorlar integrin enjekte edildi bir deney yaptık. Bir saat sonra antikor enjeksiyonu, 5 × 10MCMV 6 PFU (50 ul) temporal ven diğer tarafında infüze edildi. Hamster anti-fare CD29 için birim MCMV-pozitif hücrelerin sayısı izotip antikor ile tedavi edilen beyin 8 bununla karşılaştırırken enjekte edilmiş, beyin düşüktü (ß1 integrin zincirine, Ha2 / 5 klon). sonraki araştırmalarda, aynı yöntem kullanılarak, virüslere karşı ilaçlar ya da nötralize edici antikorların etkileri, viral parçacıklar ve enfekte olan hücrelerin dağılımı gözlenmesiyle belirlenebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane Sigma-Aldrich T-6791
HCl Sigma-Aldrich H-1758
pEGFP-N1 vector  Clontech #6085-1
D-sorbitol Sigma-Aldrich S-1876
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04 - 0.06 Spherotech, Inc. FP-00556-2
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1 - 0.3 Spherotech, Inc. FP-0256-2
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7 - 2.2 Spherotech, inc.  FP-2056-2
10% mouse serum DAKO  X0910
C57BL/6 mouse SLC, Inc.
ICR mouse SLC, Inc.
Modified Microliter Syringes (7000 Series) Hamilton company
35-gauge needle Saito Medical
A Wee Sight Transilluminator Phillips Healthcare 1017920
O.C.T.Compound Sakura Finetek 4583
RNase A Sigma-Aldrich R4642
Nonidet(R) P-40 Nacalai 25223-04
citrate buffer (pH 6) x 10 Sigma-Aldrich C9999-100ml
pepsin Sigma-Aldrich P6887
EDTA dojindo N001
Formamide TCI F0045
Dextran sulfate sodium salt Sigma-Aldrich 42867-5G
Denhardt's Solution (50x) ThermoFishcer sceintific 750018
Yeast tRNA (10 mg/ml) ThermoFishcer sceintific AM7119
SSC 20x Sigma-Aldrich S6639
DAPI ThermoFishcer sceintific D1306
n-Hexane Sigma-Aldrich 296090
superfrost plus glass ThermoFishcer sceintific 12-55-18
Cytokeep II Nippon Shoji Co.
FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 Vector laboratories, Inc. L1104
Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE ebioscience 12-0311
ProLong  Gold ThermoFishcer sceintific P36934
BIOREVO KEYENCE BZ-9000E

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
  2. Passini, M. A., et al. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice. J Virol. 77 (12), 7034-7040 (2003).
  3. Kim, J. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur J Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
  4. McLean, J. R., et al. Widespread neuron-specific transgene expression in brain and spinal cord following synapsin promoter-driven AAV9 neonatal intracerebroventricular injection. Neurosci Lett. 576, 73-78 (2014).
  5. Hsu, K. M., Pratt, J. R., Akers, W. J., Achilefu, S. I., Yokoyama, W. M. Murine cytomegalovirus displays selective infection of cells within hours after systemic administration. J Gen Virol. 90. 90 (Pt 1), 33-43 (2009).
  6. Sakao-Suzuki, M., et al. Aberrant fetal macrophage/microglial reactions to cytomegalovirus infection. Annals of Clinical and Translational Neruology. 1 (8), 570-588 (2014).
  7. Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. J Vis Exp. (93), e52037 (2014).
  8. Kawasaki, H., et al. Cytomegalovirus initiates infection selectively from high-level beta1 integrin-expressing cells in the brain. Am J Pathol. 185 (5), 1304-1323 (2015).
  9. Rahim, A. A., et al. Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system. FASEB J. 25 (10), 3505-3518 (2011).
  10. Cannon, M. J., Davis, K. F. Washing our hands of the congenital cytomegalovirus disease epidemic. Bmc Public Health. 5, (2005).
  11. Frenkel, L. D., Keys, M. P., Hefferen, S. J., Rola-Pleszczynski, M., Bellanti, J. A. Unusual eye abnormalities associated with congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 66 (5), 763-766 (1980).
  12. Becroft, D. M. Prenatal cytomegalovirus infection: epidemiology, pathology and pathogenesis. Perspect Pediatr Pathol. 6, 203-241 (1981).
  13. Conboy, T. J., et al. Intellectual development in school-aged children with asymptomatic congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 77 (6), 801-806 (1986).
  14. Fowler, K. B., et al. The outcome of congenital cytomegalovirus infection in relation to maternal antibody status. N Engl J Med. 326 (10), 663-667 (1992).
  15. Cannon, M. J. Congenital cytomegalovirus (CMV) epidemiology and awareness. J Clin Virol. 46 Suppl 4, S6-S10 (2009).
  16. Grassi, M. P., et al. Microglial nodular encephalitis and ventriculoencephalitis due to cytomegalovirus infection in patients with AIDS: two distinct clinical patterns. Clin Infect Dis. 27 (3), 504-508 (1998).
  17. Kawasaki, H., Mocarski, E. S., Kosugi, I., Tsutsui, Y. Cyclosporine inhibits mouse cytomegalovirus infection via a cyclophilin-dependent pathway specifically in neural stem/progenitor cells. J Virol. 81 (17), 9013-9023 (2007).
  18. Britt, W. J. Human cytomegalovirus: propagation, quantification, and storage. Curr Protoc Microbiol. Chapter 14, Unit 14E 13 (2010).
  19. Kawasaki, H., Kosugi, I., Arai, Y., Iwashita, T., Tsutsui, Y. Mouse embryonic stem cells inhibit murine cytomegalovirus infection through a multi-step process. PLoS One. 6 (3), e17492 (2011).
  20. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  21. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cutting sections of paraffin-embedded tissues. CSH Protoc. , (2008).
  22. Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. J Vis Exp. (8), e308 (2007).
  23. Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart. J Vis Exp. (97), (2015).
  24. Ohshima, M., et al. Intraperitoneal and intravenous deliveries are not comparable in terms of drug efficacy and cell distribution in neonatal mice with hypoxia-ischemia. Brain Dev. 37 (4), 376-386 (2015).
  25. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. (91), e51863 (2014).
  26. Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. J Vis Exp. (56), (2011).

Tags

Nörobilim Sayı 113 sitomegalovirüs floresan olan mikro FISH beyin,
Yenidoğan Beyin içine Viral Parçacıklar ve Floresan mikro boncuklar intraserebroventriküler ve İntravasküler Enjeksiyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kawasaki, H., Kosugi, I.,… More

Kawasaki, H., Kosugi, I., Sakao-Suzuki, M., Meguro, S., Tsutsui, Y., Iwashita, T. Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain. J. Vis. Exp. (113), e54164, doi:10.3791/54164 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter