Summary
質量分析ベースのphyloproteomics（MSPP）は、 カンピロバクター・ジェジュニ SSPのコレクションを入力するために使用された。doylei多座配列タイピング（MLST）と比較して、歪みレベルで分離します。
Abstract
MALDI-TOF MSは、ひずみレベルで、種や亜種のレベルではなくても、以下にするだけでなく、いくつかの細菌を区別する可能性を提供しています。検出可能なバイオマーカーイオンの対立遺伝子のアイソフォームを単離固有の質量シフトをもたらします。質量分析ベースのphyloproteomics（MSPP）ゲノムと比較して、分離株、特定の質量シフトからphyloproteomic関係の控除は、参照株の配列決定を可能にする方式では、質量分析検出可能なバイオマーカーの質量を組み合わせた新規な技術です。推定アミノ酸配列は、その後、MSPPベースの樹状図を計算するために使用されます。
ここでは、 カンピロバクター・ジェジュニの SSPを入力してMSPPのワークフローを説明します。doyleiは 7株のコレクションを分離します。すべての7株は、それらの遺伝的多様性を実証したヒト由来と多座配列タイピング（MLST）でした。 MSPPタイピングは、十分にそのPHYを反映して、7つの異なるMSPPシーケンスの種類をもたらしましたlogenetic関係。
C.ジェジュニ SSP。doylei MSPP方式は、14の異なるバイオマーカーイオン、2〜11キロダルトンの質量範囲内の大部分はリボソームタンパク質を含んでいます。 MSPPは、原則として、拡張質量範囲を有する他の質量分析プラットフォームに適合させることができます。従って、この技術は、ひずみレベル微生物タイピングのための有用なツールになる可能性があります。
Introduction
過去十年間の間に、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（MALDI-TOF MS）は、臨床微生物学1,2における微生物の属および種の同定のための非常に価値の標準的な方法であることが進んでいます。種の同定は、無傷細胞または細胞溶解物の小タンパク質フィンガープリントの記録に基づいています。日常的な臨床微生物学で使用される質量分析計のための典型的な質量範囲は2-20 kDaです。さらに、得られたスペクトルは、以下の種と下記亜種のレベル3での株を識別するために使用することができます。初期の先駆的な研究では、 カンピロバクター・ジェジュニ 4株の特定のサブグループ、 クロストリジウム・ディフィシル 5、 サルモネラ菌の SSPの特定のバイオマーカーイオンを同定しました。エンテリカ血清型チフス 6、 黄色ブドウ球菌 7から9、およびE12 - scherichiaは10コリ 。
対立遺伝子のアイソフォームに対応するいくつかの変数バイオマーカーの質量の組み合わせは、より深いサブタイプのオプションを提供しています。以前は、我々が正常にCに質量分析ベースphyloproteomics（MSPP）と呼ば有意義かつ再現性のphyloproteomic関係に質量プロフィールにおけるこれらの変化に変換する方法を実装しましたジェジュニ SSP。 ジェジュニ分離株のコレクション13。 MSPPは、多座配列タイピング（MLST）のようなDNA配列に基づくサブタイピング技術と質量分析と同等に使用することができます。
カンピロバクター種は、世界中で、細菌性胃腸炎14、15の主要な原因です。カンピロバクター感染後後遺症の結果として、すなわち、ギラン・バレー症候群、反応性関節炎および炎症性腸疾患は、16を生じる可能性があります。感染症の主な供給源であります鶏、七面鳥、豚、牛、羊、アヒル、牛乳と表面水15、17からの汚染された家畜の肉。したがって、食品の安全性の文脈における定期的な疫学的サーベイランス研究が必要です。 MLSTは、 カンピロバクター種18のための分子タイピングの「ゴールドスタンダード」です。サンガーシーケンシングベースのMLST法は、労働集約的であるため、時間がかかり、比較的高価な、MLSTタイピングは、比較的小さな分離株コホートに制限されています。したがって、安価で高速サブタイピング方法に対する必要性が存在します。この必要性は、MSPPのような質量分析法によって満たされる可能性があります。
本論文では、分離株doylei。 カンピロバクター SSPのコレクションを使用してMSPPタイピングのための詳細なプロトコルを提示し、MLSTとその可能性の比較。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.バイオセーフティ条件を考慮した安全な職場を準備
- 微生物で作業するための関連性のある研究室や安全規制に精通。ほとんどのヒト病原性微生物がバイオセーフティーレベル2の条件が、このようなサルモネラエンテリカ血清型チフスなどのいくつかを、処理される必要があり、それぞれの病原体を扱うレベル3.情報がwww.cdc.gov/biosafetyでアクセスすることができるバイオセーフティーレベルを必要とします。
- かかわらず、特定の微生物のバイオハザード分類の、処分前にオートクレーブ処理されなければならない感染性廃棄物としての感染性病原体と接触したすべての材料を考えています。有害物質や生体物質のための地域安全ガイドラインを尊重します。汚染された可能性材料（バイオハザード）の迅速かつ適切な処分のための適切な容器が使用可能であることを確認してください。
- （その滅菌機器（接種ループ）、ソリューションおよび培地を確認寒天プレート）は、細菌培養を開始する前に利用可能です。
- 直ちに感染性微生物を処理した後に消毒石鹸とぬるま湯で手を洗ってください。
2. [参照とコレクション分離株
- 選択し、一つの標準ゲノム配列決定を参照を取得は、理想的にはFASTA形式で、エンコードされたプロテオームのシーケンスと一緒に分離します。より多くのゲノム配列を決定した株が利用可能である場合は、分析にこれらが含まれています。
注：この分離株は、/これらの分離株は、後に質量分析において観察された質量ピークの同一性を予測するために使用される（セクション7参照）。 - 彼らが関心の種や亜種の系統発生をカバーするような方法で、潜在的に多様な分離株の様々なを選択し得ます。
注：これらの分離株は、後で集団におけるバイオマーカーの変動性を実証するために使用されます（セクション8を参照）。 - コレクション全体と基準分離（s）がプロであることを確認します20 - perlyこの特定の生物18のためのそれぞれのゴールドスタンダードが入力しました。
これは、（サブ）-typing様々な方法を含んでいてもよいが、そう、まだほとんどの微生物種の遺伝的多様性を実証するための標準的な方法である、MLSTに頼らます：注意してください。 - MLSTデータ21のためのMEGA6ソフトウェアの算術平均（UPGMA）で重み付けされていないペアグループ法を用いて、 例えば 、コレクション内の系統発生を推測タイピングデータから系統樹を計算します。 MLSTデータの場合、また、MLSTデータベースを参照し、シーケンスの種類とそれぞれのクローン複合体22を割り当てます 。
注：これは、後に以前のゴールドスタンダードタイピング法（セクション9を参照）でMSPPの一致を分析するために使用されます。
3. MALDIターゲットプレートを準備
注意：TFAが強い酸です。 TFAの不適切な使用は、重篤な皮膚の薬傷、眼の損傷や重度の刺激oのリスクを負います上気道fを吸入します。したがって、厳格な安全対策が尊重されなければならないとTFAを取り扱いながら、安全ゴーグル、フェイスシールド、適切な手袋、長靴、あるいは完全な防護服など、適切な個人用保護具（PPE）は、必要とされています。 TFAへの曝露の可能性は、効果的な排気換気システムで十分な換気の下で物質を処理することによって制御されなければなりません。換気が不十分な場合には、認可されたフィルターの付いた呼吸を使用する必要があります。さらに、TFAは長期的影響により水生生物に有害です。環境への排水中のTFAのいずれかのリリースは避けなければなりません。
注意：プレートを以前に使用された場合は、MALDI標的上にサンプルをスポットする前に、徹底的にターゲットプレートを清掃してください。
- 30ミリリットルの脱イオン水と70ミリリットルの純粋なエタノールを使用して100ミリリットル70％エタノール水溶液を準備します。
- 50を混合することにより、80％水性トリフルオロ酢酸（TFA）の溶液250μLを準備反応管内の脱イオン水と200μlの100％TFAμlの1分間チューブをボルテックス。
- ガラス皿にそれを入れて、室温で約5分間、70％エタノール水溶液中でそれを浸すことにより、MALDI標的を清掃してください。
- お湯の下にターゲットをすすぎます。
- ティッシュペーパーを使用して、すべての前の試料及び他の潜在的な破片を除去するために70％エタノール水溶液で集中ターゲットプレートを拭きます。
- さらにクリーニングが必要な場合は、ティッシュペーパーで拭いながら、お湯の下にすすいでください。
- 80％のTFA水溶液（96スポットあたり〜100μl）をの薄層でターゲット表面を覆い、ティッシュペーパーできれいにすべての目標位置を拭くことによって、残留削除、および潜在的に目に見えない、汚染物質。
- 最後に、酸を除去し、それはティッシュペーパーを使用して乾燥拭き、残留液体を蒸発させるために、室温で少なくとも15分間それを残すために、ターゲットをすすぎます。
4.準備45;内部キャリブラントを含むシアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸マトリックスソリューション
- 50％アセトニトリル47.5％の水、2.5％TFAの混合物1ml中の10mgのαシアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸（HCCA）を溶解させて飽和マトリックス溶液を調製します。溶液が飽和している場合は、残留未溶解HCCAは残ります。
- 内部較正物質として組換えヒトインスリンを追加します。このために、さらなる使用のために-20℃で50％アセトニトリル水溶液、アリコートとストアでは10pg /μlの最終濃度に原液を準備します。
前記MALDI-TOF質量分析
注：興味の生物のための具体的な培養条件は、使用する必要があります。 MALDI-TOF MS用のサンプルは、塗抹標本作製または抽出のいずれかによって調製することができる、生物に応じて（セクション8.4.1を参照）。エタノール、ギ酸抽出方法は、病原体の十分な不活性化を提供するが、塗抹標本作製はsuff下で行われなければなりません必要に応じてicientバイオセーフティ条件（セクション1を参照）。通常、マトリクスの適用後に、しかし、不活性化プロトコルが必要とされる具体的な特定の病原体の感染の危険性はありません。したがって、例えば、 ノカルジア種のMALDI-TOF MSは、タンパク質23のエタノール沈殿により以下、沸騰水中の細菌の前の溶解を必要とします。 EIKhéchine ら 。水および0.5％のTween 20 24を含むスクリューキャップチューブ中で1時間95℃で細菌のコロニーを加熱、 マイコバクテリアの不活性化のための手順を開発しました。
- スミアの準備
- MALDIターゲットプレートの位置（ 'スポット'）上に直接細菌コロニーのピンヘッドサイズの量を広げます。
- 内部較正物質を含むHCCA正則行列や行列の1μlの各スポットをオーバーレイし、室温で結晶化さために残します。較正ピークの正確な質量の決意、制御SPオーバーレイ1μlの試験標準および内部較正物質を含むHCCAマトリックスの1μlのでオト。
注：ここでは、 大腸菌 DH5αの試験規格として抽出物をMALDI-TOF MSで特徴的なタンパク質フィンガープリントを示しているが使用されます。これは、検出可能な質量範囲の上限を拡張する二つのタンパク質と一緒にスパイクされます。
- 抽出法
- 収穫は約5白金耳と寒天平板培養からのコロニーと徹底的に1.5ミリリットルの反応チューブに300μlの二重蒸留水に懸濁します。 900μlのに無水エタノールを追加し、細菌コロニーが完全に中断されるまで、繰り返しピペッティングにより完全に混和します。
注：このステップではそれが可能であるとも-20℃でサンプルを保存するために設立。さらに、病原体の不活性化は、最適な成長条件でのインキュベーション後、適切な寒天プレート上に抽出物の1から10μLをストリーキングすることによって試験することができます。で成功活性化は、微生物の増殖の欠如によって示されます。 - 遠心分離機1分間13,000×gでのサンプル、上清を捨て、そして10分間室温でペレットを乾燥します。徹底的に70％ギ酸50μl中上下をピペットでペレットを再懸濁。
- アセトニトリルの50μLを加え、混合します。 2分間13,000×gで遠心分離することによってゴミを取り除きます。 MALDIターゲットプレート上のサンプル位置への転写上清の1μLを、室温で5分間乾燥するままにしておきます。
- 内部較正物質を含むHCCAマトリックスの1μlの各スポットをオーバーレイし、室温で結晶化さために残します。
- 収穫は約5白金耳と寒天平板培養からのコロニーと徹底的に1.5ミリリットルの反応チューブに300μlの二重蒸留水に懸濁します。 900μlのに無水エタノールを追加し、細菌コロニーが完全に中断されるまで、繰り返しピペッティングにより完全に混和します。
- 質量スペクトルの記録
注：ピークピッキング質量スペクトルからは、推奨標準的な手順を使用して行われている（重心アルゴリズム; S / N比：2;相対強度閾値：2％、ピーク幅3メートル/ zの、ベースライン減算：トップハット）- メーカーのprotocによる器具のキャリブレーションオール。
- 各スポットについて、100ショットの段階で600のスペクトルを収集します。
- 質量分析計の設定ソフトウェアの「AutoXecute」タブに移動します。 「メソッド」ボタンをクリックし、プルダウンメニューからメソッド例えば、「MBT_AutoX」を選択する上で左クリックして、「メソッド」を開きます。
- 「AutoXecuteメソッドエディタ」を開くには、「メソッド」メニューの「編集...」ボタンの右を左クリックします。 「蓄積」タブに移動します。 「最大合計する」の値を「600」と「100」に_x_「ショット・ステップ」の値」で満足のいくショット」に設定します。
- 内部スペクトルキャリブレーション手順
注：分の測定誤差は、質量分析法に固有です。断続的な器具の使用、機器の温度及び再較正に応じて、得られた測定値は、実験の間で変化してもよいです。以下の事前測定機器の校正と内部較正に、測定後のスペクトルキャリブレーションは、相互スペクトルの比較可能性を確保するための最も正確な方法です。- 各キャリブレーションピークリストについては、次の手順を実行します。
- スペクトルブラウザ起動（ 例えば 、flexAnalysisとオープンスペクトル：メニュー「ファイル」→「開きます...」。）
- 較正ピークに質量制御リストを作成する：メニュー「メソッド」→「開きます...」。
- MBT_Standard.FAMSMethod→「開く」：メソッドを選択してください。
- 編集マスコントロールリスト：すべてのキャリブラントをオフにします。
- 下部にキャリブラントのピークを追加します。ピークレーベル：「Insulin_HIStag [M + H] + _平均」。 m_z： "5808.29";公差[PPM]： "50";キャリブラントのチェックボックスをチェックしてください。
- 例えば 、「MSPPの較正リスト」として保存します。
- 各スペクトルについて、リストからキャリブラントのピークを選択し、「自動割り当て」をクリックして、「OK」を押します。
- 各キャリブレーションピークリストについては、次の手順を実行します。
- 実験的にキャリブレーションピークの正確な質量を決定。
- 1μlの試験規格各（ステップ5.1.1）で2つのスポットを準備します。 1μlの定期的なHCCAマトリックス、1μlの較正スパイクマトリックスと第二との最初のオーバーレイ。
- 各スポット（セクション5.3）からの質量スペクトルを取得し、内部テスト標準ピーク（セクション5.4）に調整します。
- 中に存在しなければならないこれは、：（メニューの「ファイル」→「開く...」 など、flexAnalysis、オープンスペクトル）と予想される質量（インスリンのm / z = 5,808.29）にピークを見つけるスペクトルブラウザでそれらを開くことによって、両方のスペクトルをオーバーレイ較正スパイクスペクトルではなく、定期的なマトリックスで得られたスペクトルインチ
- キャリブラントピークが目的の生物の任意の他のバイオマーカーによって覆い隠されていないことを確認してください。
- 参照株とオベで2つのスポット（セクション5.1）を準備1μlの正則行列、1μlの較正スパイクマトリックスと第二との最初のrlay。
- 両方のスポット（セクション5.3）から質量スペクトルを取得し、スペクトルのブラウザでそれらを開くことによって、得られたスペクトルをオーバーレイ（ 例えば、flexAnalysisとオープンスペクトル：メニューの「ファイル」→「開きます...」）。較正ピークがスパイクされたマトリックスを用いて得られたし、隣接する他の信号によって隠されていないスペクトルにはっきりと見えることを確認してください。そうでない場合、この特定の生物のために別の較正を選択します。
注意：スパイク内部較正物質を使用することで大幅にバイオマーカーの質量の変化を決定するために、精度を向上させます。この方法を使用して、1ダまでの質量差を検出することができます。また、生物由来のも不変質量は、校正物質として使用することができます。それ以外の場合は証明されない限り、しかし、定義により、すべての生物由来の塊は、潜在変数を考慮しなければなりません。
- 内部キャリブラントとマトリックススパイクを使用して、参照株のマススペクトルを測定します。
- （ 'スポット'）を直接MALDIターゲットプレートの位置にピンの頭のサイズの細菌コロニー（セクション5.1）の量または細菌タンパク質抽出物（5.2節）の1μLを広げます。
- 内部較正物質を含むHCCAマトリックスの1μlの各スポットをオーバーレイし、室温（5.1.2 / 5.2.4）で結晶化さターゲットプレートを残します。
- 参照株の録音質量スペクトル（5.3節）。
- 内部リファレンス較正質量スペクトルキャリブレーション（ここでのm / z = 5,806.29でインスリン）を、続いてベースライン減算（トップハット）とスムージング（パラメータ：SavitzkyGolay;幅：2メートル/ zの、10サイクル）によって前処理。
- 例えば、flexAnalysisとオープンスペクトルスペクトルブラウザ（開始：メニュー「ファイル」→「開きます...; "）。
- プルダウンメニュー「メソッド」→「開く...」、選択の方法を左クリックし、 例えば、「MBT_Standard.FAMSMethod」→「開く」：メソッドを選択してください。
- プルダウンメニュー「キャリブレーション」から「内部... "を選択することで、スペクトルを調整します。ウィンドウには、較正ピーク（複数可）（セクション5.4）をリスト表示されます。較正ピーク（インスリン）を左クリック→「OK」を左クリックします。 「プロセス」プルダウンメニューから「プロセス・スペクトル」を選択します。
- ベースライン減算に右側のスペクトルリストにスペクトルを活性化させます。 「プロセス」プルダウンメニューから「マススペクトルのベースラインを引く」を選択します。
- スペクトルを平滑化するには、右サイドでのスペクトルリストにスペクトルを活性化させます。 「プロセス」プルダウンメニューから「スムーズ質量スペクトルのベースライン」を選択します。
- 参照株のゲノム配列決定データから、theoreticaを計算配列アラインメントエディタを使用して、対応するアミノ酸配列へのDNA配列を翻訳することにより、コードされたタンパク質の各々のLモノアイソトピック分子量を有します。 ExPASyバイオインフォマティクスリソースポータル（http://web.expasy.org/compute_pi/）での入力ボックスに、このタンパク質配列をコピーし、貼り付けます。プレスは、PI / Mwが計算するために「ここをクリックしてください」。 Cの場合、 ジェジュニ SSP。doylei 14の検出可能なバイオマーカーの質量を計算します。
- 一つの遺伝子識別子を含む列と次の分子量で、スプレッドシートに結果をコピーします。大衆のより容易な検索を容易にするために、計算された分子量によって行を並べ替えます。注：他の列はオプションです。機能的な注釈は後で解釈のために特に有用である可能性があります。
- モノアイソトピック分子量から135ダを減算、デmethioninated形の分子量のためにスプレッドシートに第二カラムを挿入します。注：いくつかのタンパク質はポストを受けるためですN末端メチオニンのタンパク質分解除去による翻訳後修飾。
- （ 表1）上記で調製したゲノムテーブルから測定された質量を検索することにより基準歪みから算出した大衆に主要な各測定されたバイオマーカーの量を割り当てます。
- バイオマーカーイオンは、予測遺伝子産物に割り当てることができない場合は、他の翻訳後修飾（メチル化、アセチル化、プレニル化、 などを検討し、修正し、関連する質量の変化のコンパイルにhttp://www.abrf.org/delta-massを参照してください。 ）。頻繁に興味のある生物で観察されている任意の他の既知の翻訳後修飾のためのテーブルに別の列を追加し、脱methioninatedフォームのためのプロセスに類似した分子量を再計算します。
- 別のスプレッドシートのタブを設定し、別のテーブルのカラム内の質量と識別子イオン各バイオマーカーのために記録します。
8.バイオマーカー変動を評価します人口で
- コレクションから得られた質量スペクトルを校正の基準株（複数可）（セクション5.4.2）のために行ったように、分離しています。
- 質量スペクトルでバリアントバイオマーカーを同定します。変形量は、基準スペクトルと基準内に存在しない新規な塊の外観を既知の質量の欠如によって特徴づけられます。質量差は、単一のアミノ酸交換（ 表2）、またはそれらの組合せに適合しなければなりません。
- 行につき1分離株では、各バイオマーカーおよびそれぞれのテーブルの列の予測アイソフォームに対する測定された質量を記録します。
注：まれに、いくつかの質量シフトは、いくつかの異なるアミノ酸の交換に起因しないかもしれない、 例えば、両方とも、NはDで交換し、QはEで交換し、その逆、0.985ダ（ 表2）の質量シフトをもたらします。この本質的な問題だけでは、質量分析によって解決することはできません。したがって、タンパク質配列レベルで異なるアイソフォームは、同じ質量を持ちます単一MSPP型として扱われなければなりません。特定のバイオマーカーイオン遺伝子の並列サンガー配列決定は、Cを MSPPは、入力中にこの問題が発生しなかったことを確認しましたジェジュニ SSP。doylei本研究で使用したコレクションを分離します。 - PCRで増幅して、それぞれのバイオマーカー遺伝子を配列決定による新規MSPPの種類を確認してください。今度は、これはまた、バイオマーカーのアイデンティティが正しく割り当てられていることの確認として機能します。
- 培養細菌は、最適な増殖条件下で分離します。文化C.ジェジュニ SSP。微好気性条件（5％O 2、10％CO 2、85％のN 2）下、37℃で5％ヒツジ血液を補充したコロンビア寒天上で菌株をdoylei。約インキュベート48時間。それぞれが交差汚染を避けるために隔離するために別々の寒天プレートを使用してください。
- 製造者の指示に従って、適切なDNA抽出キット/自動化された機械を使用して細菌の分離株のゲノムDNAを抽出します。 <。Liが> 表3に示すプライマーを用いて、それぞれのバイオマーカー遺伝子を増幅する全てのPCR以下の条件で反応を行います。30秒間、94℃で変性し、 30秒間55℃のアニーリング; 30秒間の72℃での伸び。
- ゲノムDNAの適切な量を用いてサンガーの配列決定によって、各アンプリコンのDNA配列を決定し、通常、このことによって行われ、増幅プライマーの一方（（DNAの通常600~700 ngの約100 ngの/μlの濃度で十分です）サービスプロバイダの使用）。
9. MSPPベースの系統を計算し、ゴールド・スタンダードと比較
- Tに属する特定のバイオマーカーのアミノ酸配列の連結このようなBioEdit（http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html）26またはバイオマーカーのスプレッドシートのような配列アラインメントエディタを使用して、1つの連続したシーケンスへの分離株、の彼MSPPタイプ。
- ゴールドスタンダードタイピングデータ、 例えば 、UPGMAクラスタリング21のために行われるようクラスタリングにより系統樹を計算します。
- ゴールドスタンダード4、13で得られたものにMSPPベースの系統発生を比較。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
以前は、我々が正常にCのMSPPスキームを確立しますジェジュニ SSP。 ジェジュニ 13。ここでは、兄弟の亜種Cにメソッドを拡張することを目的としましたジェジュニ SSP。doylei。この特定の設定では、7 C.ジェジュニ SSP。doylei分離株は、微生物/微生物学UGent BCCM / LMGゲント、ベルギーの研究室のベルギーのコレクションから取得しました。私たちの分析に使用されるすべての7分離株は、ヒト由来のものでした。元々下痢と2歳のオーストラリア人の子供の糞便から単離されたゲノム配列を決定菌株ATCC 49349（LMG 8843）は、参照を務めました。コレクションから、6つの追加の株が利用可能であった：LMG 9143、LMG 9243、およびLMG 9255は、子供の下痢に苦しんで、ブリュッセル、ベルギーに住んでいるの糞便から分離されました。ドイツからの個々の胃生検試料から単離されたLMG 7790（ATCC 49350）;そして、LMG 8870（NCTC A613 / 87）だけでなく、LMG 8871（NCTC A603 / 87）、南アフリカの子どもたちから引き出された異なる血液試料から単離し両方。
すべてのC.ジェジュニ SSP。doylei分離株は、5％O（新たに各分析のために解凍し、微好気性条件下で37℃で48時間、5％ヒツジ血液およびインキュベーションを補ったコロンビア寒天ベースを使用して培養し、精子バンクストックとして-80℃で保存しました2、10％CO 2、85％のN 2）。
CのMSPP技術の確立とは対照的に、 ジェジュニ SSP。 ジェジュニ 13は、より大きな配列コレクション由来のアイソフォームのデータベース上のメソッドをベースにすることはできませんでした。単一のC.ジェジュニ SSP。エントリをdoyleiは rMLSTデータベースに存在し、これは参照株C.に対応しましたジェジュニ SSP。doylei ATCC 49349 27。したがって、各バイオC.株と比較して検出されたマーカの質量シフトジェジュニ SSP。doylei ATCC 49349は、アイソフォームのデータベースに新しいエントリだったとサンガー配列決定によって再確認する必要がありました。
得られたCの多様性を分析するために、 ジェジュニ SSP。doylei分離株、MLSTを行い、7を含むMLSTベースUPGMA-デンドログラムはCを調べジェジュニ SSP。doylei分離株とC.ジェジュニ SSP。（ 図1）を計算外集団としてジェジュニ株81から176まで。各C.ジェジュニ SSP。doylei分離株は2サブクラスタに落下、異なるMLST配列型に属していました。残りのCに比べて歪みLMG7790は最長の系統発生的距離を持っていましたジェジュニ SSP。doylei分離株。
C.の記録MALDI-TOF基準質量スペクトルジェジュニ SSP。doylei 図2）によって識別することができた14単独で帯電したバイオマーカーイオンを含有していました。
152939117、S20-M、およびS15-M（ 図3）|コレクション内では、様々なアイソフォームは、L32-M、L33、架空のGIによってコードされたタンパク質を検出しました。バイオマーカーイオンに割り当てられ、残りの質量が試験されたCで不変でしたジェジュニ SSP。doylei分離株。質量シフトに対応するアミノ酸置換は、PCR増幅および表3に記載されたプライマーを用いて、特定の遺伝子のサンガー配列決定により同定された。 表4 MSPPスキームに含まれる全てのバイオマーカーイオンのアミノ酸配列、ならびに検出された対立遺伝子のアイソフォーム。
MSPPベースphyloproteomic UPGMA-ツリー（ 図4）は、同じ7 C.について計算しましたジェジュニ SSP。doylei分離株とC.ジェジュニ SSP。参照株におけるそれらの分子量のために、すべての14のバイオマーカーイオンの連結されたアミノ酸配列を用いて、外集団としてジェジュニ菌株81から176。各分離株は、個々のMSPPシーケンスの種類を表します。得られphyloproteomic関係はMLST、Cによって得られたものと完全に同一ではありませんでしたが、 ジェジュニ SSP。doyleiは再び2のサブクラスタに配置された分離株。 1番目のサブクラスタは、MLST解析で見られるように、LMG 8843、LMG 8870、およびLMG 9243、LMG 9255、LMG 9143、LMG 8871およびLMG 7790.によって、第2によって形成されたLMG7790はMSPP-で最長phyloproteomic距離を示した分離株分析。
図 1：MLST-BAsedの系統発生UPGMAツリー。バランスMLSTベースUPGMA-樹状図7 C.から構築ジェジュニ SSP。doylei分離株とC.ジェジュニ SSP。 ジェジュニ株81から176まで。ひずみカラーコード：LMG 8843（黒）、LMG 8870（グレー）、LMG 9243（青）、LMG 9255（ターコイズ）、LMG 9143（緑）、およびLMG 8871（ピンク）、LMG 7790（黄色）、および81- 176（白）。 MLST配列型は、各分離株の名前の後ろに与えられています。すべてのC.ジェジュニ SSP。doyleiは隔離異なるMLST配列型に属します。 X軸は、結合距離を示します。ひずみLMG 7790は、残りの6つの分離株に比べ最長系統発生的距離を示しています。菌株LMG 8843、LMG 8870、およびLMG 9243と同様にLMG 9255、LMG 9143、およびLMG 8871形C.内の二つの異なるサブクラスタジェジュニ SSP。doyleiクラスタ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 2：Cのゲノム相関の仮割り当て ジェジュニ SSP。doylei 観測されたバイオマーカーの大衆に ATCC 49349（LMG 8843）。C.の全ゲノム配列から予測したORFの計算塊（平均同位体比）に基づいて、 ジェジュニ SSP。ATCC 49349株をdoylei、バイオマーカーの質量はコード配列に対応するタンパク質に割り当てられていました。リボソームサブユニットL31（MW = 7315ダ）、S17（MW = 9549ダ）、およびS18（MW = 10285ダ）、ならびにそれらのデmethioninatedアイソフォーム（インセットのm / zのためしかし、測定範囲内で、バイオマーカーの塊= 7,000-7,200 Da）で明確に割り当てることができませんでした。したがって、L31、S17、およびS18は、Cに含まれていませんでしたジェジュニ SSP。MSPPスキームをdoylei。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 3：Cの具体的なバイオマーカーの質量ピーク ジェジュニ SSPは。MSPP スキームをdoylei。各パネルでは、すべての7の質量スペクトルは、Cをテストしました。 ジェジュニ SSP doylei分離株（ 図1のようにカラーコード）特定のMSPPタイプに対応するには、原因対立遺伝子のアイソフォームにバイオマーカーの質量シフトを示すために重ねてきた：（A）L36 + H +; （B）L34 + H +。 （C）L32-M + H +。 （D +。 （E）S14-M + H +。 （F）L29 + H +、L28、M + H +、およびL35-M + H +。 （G）L24-M + H +。 （H）GI | 152939117 + H +; （I）L27-M + H +。 （J）S20-M + H +。 （K）S15-M + H +。 （L）S19-M + H +。 （M）リボソームタンパク質S18の可変潜在的なバイオマーカーのピークを不明瞭に強烈な質量。 （N）、S20-M + 2H +。 （O）L15-M + 2H +。 X軸：質量[ダ]・チャージ1の比率、スケール200ダ。 Y軸：強度[任意単位]はスペクトルが個別の低強度ピークのより良い視覚化のための同等の騒音レベルに調整しました。リボソームサブユニットの名前の後に「-M」は、デmethioninatedアイソフォームを示している。 彼女をクリックしてくださいeは、この図の拡大版を表示します。
図 4：MSPPベースphyloproteomic UPGMA木描かphyloproteomic UPGMA木が同じ7 Cを含んでいます。 ジェジュニ SSP。doylei分離株とC.ジェジュニ SSP。 図1のようにジェジュニ株81から176まで。着色されたスポット（ 図1のようにカラーコード）は、各菌株を示しています。より良い比較のための分離株は、MLSTベースの木から得られた順であった入力順に配置されています。デンドログラム以下の軸が連携距離を示しています。得られphyloproteomic関係は系統発生MLSTベースのツリーと完全に同一ではありませんが、全体像は同等です。人口は二つのグループに分割：3はLMG 8843、LMG 8870、およびLMG 9243形1 CLUSTを分離しますえー、LMG 9255ながら、LMG 9143は、LMG 8871およびLMG 7790は、第2のクラスタを形成します。このクラスタLMG 7790は、このサブクラスタのLMG内LMG 9255、LMG 9143、およびLMG 8871.によって形成されたサブクラスタに比べて最長phyloproteomic距離を示している内に9143あっても、それぞれが表す隔離MSPP法を使用して、しかしLMG 9255.との関係で位置を切り替えます個々のMSSP-シーケンスタイプ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表 1：C.のすべての注釈付きのORFの計算大衆 ジェジュニ SSP。ATCC 49349 株をdoylei。Cで符号化された各タンパク質の全ての計算されたモノアイソトピック分子量の一覧ジェジュニ SSP。doylei ATCC 49349ゲノム。 ExPASyバイオインフォマティクスリソースポータルは、特定の分子量の計算に使用しました。 C列がデmethioninatedアイソフォームの一覧を示し、一方、列Bはmethioninatedアイソフォームが一覧表示されます。バイオマーカーの質量はCに含まれますジェジュニ SSP。doylei MSPP方式は、赤色で強調表示されます。注：バイオマーカータンパク質L36は、Cのゲノム配列に注釈を付けていませんジェジュニ SSP。ATCC49349をdoylei。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
表 2：単一のSNPに起因する、アミノ酸の変化によって誘発される質量変化は、すべての潜在的な一塩基多型は、標準的な遺伝コードを使用して得られたアミノ酸交換を調べました。すべてのサイレント変異は破棄され、非同義変異は、RESUと一緒にコンパイルされました質量変化lting。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
表 3：Cの配列決定のために使用されるオリゴヌクレオチドプライマー ジェジュニ SSP。MSPP-スキームに含まれる遺伝子を doylei このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
表 4：Cに含まれる全てのアイソフォームの概要 ジェジュニ SSP。doylei MSPP-方式。すべてのバイオマーカーイオンはCに含まれる。この表は、 ジェジュニ SSP。doylei MSPPの皮下ヘム。参照株ATCC 49349のアミノ酸配列が完全に与えられています。さらに、検出可能なアイソフォームの場合は、唯一の特定のアミノ酸置換が記載されています。アミノ酸番号付けは、常に、開始メチオニンを含みます。質量分析法が存在しないことを示す場合には、ブラケット（M）に書き込まれます。各アイソフォームの分子量は、質量差が示されているアイソフォームのデータセット内の株ATCCに49349アイソフォームおよび周波数を参照する。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MSPPスキームの確立に最も重要なステップは、バイオマーカーイオンアイデンティティの明確な遺伝的決意です。それは間違いなくバイオマーカーを同定することが可能でない場合、それはスキーム13から除外されるべきです。
C.ジェジュニ SSP。doylei方式は、14の異なるバイオマーカーイオンを含んでいます。これらは、5以下Cに比較され、検出可能なCの間ジェジュニ SSP。 ジェジュニ MSPPスキーム13【選択最も大きな違いジェジュニ SSP。 ジェジュニとC.ジェジュニ SSP。doyleiバイオマーカーは、L31（-M）およびL35（-M）13の場合のアミノ末端メチオニンの翻訳後除去しました。
試験Cに示すようにジェジュニ SSP。doyleiコレクションを分離、MSPPは、すべての7つの異なるMLSTシーケンスの種類を識別することができました。これは、すべての試験された分離株は、特定のMSPPのsequに属していることを意味しますレンスタイプ。また、MSPPは、Cの間の亜種の分化を可能にしますジェジュニ SSP。 ジェジュニとC.ジェジュニ SSP。doylei。
一般には、MSPPによって以下のひずみレベルでの分離株を区別する可能性がMLSTのようなDNA配列に基づく方法に比べて低くなっています。十分に確立されたアイソフォームデータベースを仮定すると、細菌の分離株のサブタイプは、DNA配列決定法4、13と比較してはるかに速く、非常に安価です。
このような主成分分析（PCA）4、10、28またはバイナリピークマッチングの比較結果の数学的マトリックスのUPGMA分析プロファイル29,30を使用するなどICMS-スペクトルの階層的クラスタリング手法と比較してMSPPの最大の利点高い固有の再現性があります。一方、このような異なるculturなど異なる文化的諸条件電子メディア、異なる寒天料金、異なるインキュベーション温度、および異なるインキュベーション期間が大幅にPCAによって計算phyloproteomic関係に影響を与え、彼らはMSPP演繹関係6、13には影響を与えません。この高い再現性の主な理由は、一般的な13のピーク強度と質量スペクトルの質の独立性です。単離物の質量スペクトルでMSPP関連するピークは間違いなく識別することができない場合は、再度、個々の単離物の質量スペクトルを記録する必要があります。
MSPPの方法は、すべての微生物種を、原則的に、適合させることができます。特に、 クロストリジウム・ディフィシレ 、 大腸菌 、 黄色ブドウ球菌 、およびサルモネラ菌 SSP。 エンテリカのような臨床関連する微生物種のサブタイプは、潜在的な将来のアプリケーションです。毒性因子または耐性遺伝子の発現は、PHYLと相関している場合oproteomic関係、MSPPは、日常の臨床診断において革新的なツールになることができます。それによって検出可能なピークとMSPP方式に含まれるバイオマーカーイオンの数の数は、潜在的に、特に真菌31の場合には、特定の抽出及び/又は溶解プロトコルを使用することによって増加することができます。
最近使用されたMALDI-TOF技術は、主にのみ非常に豊富なリボソームタンパク質を検出することができます。これらの非常に豊富なタンパク質は、質量スペクトルにおける毒性因子としてほぼすべての他のより小さなタンパク質を妨害します。小さなタンパク質は、ESI-TOF-MS（飛行質量分析のエレクトロスプレーイオン化時間）及びHPLC（高速液体クロマトグラフィー）32を連結することによって検出することができました。しかし、現在、この方法は、より大きな分離株のコホートを特徴づけるには余りにも労力とコスト集約的です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | 34967 | |
| Autoflex III TOF/TOF 200 system | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | GT02554 G201 | Mass spectrometer |
| bacterial test standard BTS | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 604537 | |
| BioTools 3.2 SR1 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 263564 | Software Package |
| Bruker IVD Bakterial Test Standard | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 8290190 | 5 tubes |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG8843 | ATCC 49349;IMVS 1141;NCTC 11951;strain 093 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG9143 | Goossens Z90 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG7790 | ATCC 49350;CCUG 18265;Kasper 71;LMG 8219;NCTC 11847 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG9243 | Goossens N130 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG8871 | NCTC A603/87 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG9255 | Goossens B538 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG8870 | NCTC A613/87 |
| Columbia agar base | Merck, Darmstadt, Germany | 1.10455 .0500 | 500 g |
| Compass for FlexSeries 1.2 SR1 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 251419 | Software Package |
| defibrinated sheep blood | Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Germany | SR0051 | |
| ethanol | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | 02854 Fluka | |
| formic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | F0507 | |
| HCCA matrix | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 604531 | |
| Kimwipes paper tissue | Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z188956 | |
| MALDI Biotyper 2.0 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 259935 | Software Package |
| Mast Cryobank vials | Mast Diagnostica, Reinfeld, Germany | CRYO/B | |
| MSP 96 polished steel target | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 224989 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 51304 | |
| recombinant human insulin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | I2643 | |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | T6508 | |
| water, molecular biology-grade | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | W4502 |
References
- Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
- Bader, O. MALDI-TOF-MS-based species identification and typing approaches in medical mycology. Proteomics. 13 (5), 788-799 (2013).
- Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
- Zautner, A. E., et al. Discrimination of multilocus sequence typing-based Campylobacter jejuni subgroups by MALDI-TOF mass spectrometry. BMC Microbiol. 13, 247 (2013).
- Reil, M., et al. Recognition of Clostridium difficile PCR-ribotypes 001, 027 and 126/078 using an extended MALDI-TOF MS system. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 30 (11), 1431-1436 (2011).
- Kuhns, M., Zautner, A. E., et al. Rapid discrimination of Salmonella enterica serovar Typhi from other serovars by MALDI-TOF mass spectrometry. PLoS One. 7 (6), e40004 (2012).
- Wolters, M., et al. MALDI-TOF MS fingerprinting allows for discrimination of major methicillin-resistant Staphylococcus aureus lineages. Int J Med Microbiol. 301 (1), 64-68 (2011).
- Josten, M., et al. Analysis of the matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrum of Staphylococcus aureus identifies mutations that allow differentiation of the main clonal lineages. J Clin Microbiol. 51 (6), 1809-1817 (2013).
- Lu, J. J., Tsai, F. J., Ho, C. M., Liu, Y. C., Chen, C. J. Peptide biomarker discovery for identification of methicillin-resistant and vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strains by MALDI-TOF. Anal Chem. 84 (13), 5685-5692 (2012).
- Novais, A., et al. MALDI-TOF mass spectrometry as a tool for the discrimination of high-risk Escherichia coli clones from phylogenetic groups B2 (ST131) and D (ST69, ST405, ST393). Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2014).
- Matsumura, Y., et al. Detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia coli ST131 and ST405 clonal groups by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 52 (4), 1034-1040 (2014).
- Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF Mass Spectrometry Strain Typing during a Large Outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), e101924 (2014).
- Zautner, A. E., Masanta, W. O., Weig, M., Groß, U., Bader, O. Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP): A novel microbial typing Method. Scientific Reports. 5, (2015).
- The global view of campylobacteriosis. WHO. World Health Organisation (WHO), , Available from: http://www.who.int/foodsafety/publications/campylobacteriosis/en/ (2013).
- Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
- Zautner, A. E., et al. Seroprevalence of campylobacteriosis and relevant post-infectious sequelae. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (6), 1019-1027 (2014).
- Zautner, A. E., Herrmann, S., Groß, U. Campylobacter jejuni - The Search for virulence-associated factors. Archiv Fur Lebensmittelhygiene. 61 (3), 91-101 (2010).
- Dingle, K. E., et al. Multilocus sequence typing system for Campylobacter jejuni. J Clin Microbiol. 39 (1), 14-23 (2001).
- Dingle, K. E., et al. Molecular characterization of Campylobacter jejuni clones: a basis for epidemiologic investigation. Emerg Infect Dis. 8 (9), 949-955 (2002).
- Cody, A. J., et al. Real-time genomic epidemiological evaluation of human Campylobacter isolates by use of whole-genome multilocus sequence typing. J Clin Microbiol. 51 (8), 2526-2534 (2013).
- Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol Biol Evol. 30 (12), 2725-2729 (2013).
- Jolley, K. A., Chan, M. S., Maiden, M. C. mlstdbNet - distributed multi-locus sequence typing (MLST) databases. BMC Bioinformatics. 5, 86 (2004).
- Verroken, A., et al. Evaluation of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry for Identification of Nocardia Species. J Clinl Microbiol. 48 (11), 4015-4021 (2010).
- El Khéchine, A., Couderc, C., Flaudrops, C., Raoult, D., Drancourt, M. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry Identification of Mycobacteria in Routine Clinical Practice. PLoS ONE. 6 (9), e24720 (2011).
- Goujon, M., et al. A new bioinformatics analysis tools framework at EMBL-EBI. Nucleic Acids Research. 38, Web Server issue 695-699 (2010).
- Hall, T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series. 41, 95-98 (1999).
- Jolley, K. A., et al. Ribosomal multilocus sequence typing: universal characterization of bacteria from domain to strain. Microbiology. 158, 1005-1015 (2012).
- Suarez, S., et al. Ribosomal proteins as biomarkers for bacterial identification by mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. J Microbiol Methods. 94 (3), 390-396 (2013).
- Teramoto, K., et al. Phylogenetic classification of Pseudomonas putida strains by MALDI-MS using ribosomal subunit proteins as biomarkers. Anal Chem. 79 (22), 8712-8719 (2007).
- Teramoto, K., Kitagawa, W., Sato, H., Torimura, M., Tamura, T., Tao, H. Phylogenetic analysis of Rhodococcus erythropolis based on the variation of ribosomal proteins as observed by matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry without using genome information. J Biosci Bioeng. 108 (4), 348-353 (2009).
- Bernhard, M., Weig, M., Zautner, A. E., Gross, U., Bader, O. Yeast on-target lysis (YOTL), a procedure for making auxiliary mass spectrum data sets for clinical routine identification of yeasts. J Clin Microbiol. 52 (12), 4163-4167 (2014).
- Stark, T., et al. Mass spectrometric profiling of Bacillus cereus strains and quantitation of the emetic toxin cereulide by means of stable isotope dilution analysis and HEp-2 bioassay. Anal Bioanal Chem. 405 (1), 191-201 (2012).
