Summary
질량 분석 기반 phyloproteomics (MSPP)는 캄 필로 박터 jejuni와 SSP의 모음을 입력하는 데 사용되었다. doylei는 multilocus 시퀀스 입력 (MLST)에 비해 변형 수준에서 분리합니다.
Abstract
MALDI-TOF MS는 종 및 아종 수준 그러나 심지어 아래 균주 수준에서뿐만 아니라 일부 박테리아를 차별화 할 수있는 가능성을 제공한다. 검출 가능한 바이오 마커의 대립 이온 이성체 분리는 특정 질량 변화 될. 질량 분석 기반 phyloproteomics (MSPP)를 참조 균주 염기 서열을 게놈에 비해 분리 특정 질량 변화에서 phyloproteomic 관계의 공제를 허용하는 방식으로 질량 분석 검출 바이오 마커의 질량을 결합하는 새로운 기술이다. 추론 된 아미노산 서열은 MSPP 기반 dendrograms을 계산하는 데 사용된다.
여기서 우리는 캄 필로 박터 jejuni와의 SSP를 입력하여 MSPP의 흐름을 설명합니다. 일곱 균주의 분리 수집을 doylei. 모든 일곱 균주는 유전 적 다양성을 보여 인간의 기원과 multilocus 시퀀스 입력 (MLST)의했다. MSPP-입력 충분히 자신의 PHY를 반영 일곱 가지 MSPP 시퀀스 유형의 결과logenetic 관계.
C. jejuni와는 SSP. MSPP 방식은 2 ~ 11 kDa의 질량 범위에서 14 개 바이오 마커 이온, 주로 리보솜 단백질을 포함 doylei. MSPP 원칙적으로, 확장 된 질량 범위와 다른 질량 분석 플랫폼에 적용 할 수있다. 따라서,이 기술은 변형 된 미생물 레벨 입력을위한 유용한 도구가 될 가능성이있다.
Introduction
지난 십년 동안, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 형 질량 분석계 (MALDI-TOF MS)가 임상 미생물학 1,2 미생물 속과 종의 식별을위한 높은 값의 표준 방법으로 진행 하였다. 종 식별은 그대로 세포 또는 세포 용 해물의 작은 단백질 지문의 기록에 기초한다. 일상적인 임상 미생물에서 사용되는 질량 분석 장치의 일반적인 질량 범위는 2-20 kDa 이상이다. 또한, 결과적인 스펙트럼은 다음 종의 균주 및 아종 이하 레벨 3을 구별하는데 사용될 수있다. 초기 선구적인 연구는 캄 필로 박터 jejuni와 4 균주의 특정 하위 그룹, 클로스 트리 디움 디피 5, 살모넬라 엔테 SSP에 대한 특정 바이오 마커 이온을 확인했다. 엔테의 혈청 형 Typhi (6), 황색 포도상 구균 7-9, 및 E12 - scherichia 10 대장균.
대립 유전자 아형에 해당하는 여러 변수 바이오 마커 대중의 조합은 더 깊은 하위 유형에 대한 옵션을 제공합니다. 이전에, 우리는 성공적으로 C.에 질량 분석 기반 phyloproteomics (MSPP)라는 의미와 재현 phyloproteomic 관계로 대량 프로필에서 이러한 변화를 변환하는 방법을 구현 jejuni와의 SSP. jejuni와 격리 컬렉션 13. MSPP는 multilocus 시퀀스 입력 (MLST)과 같은 DNA 서열을 기초 subtyping이 기술에 질량 분석 당량 사용할 수있다.
캄 필로 박터 종은 세균성 위장염의 주요 원인 전세계 14, 15이다. 캄 필로 박터 감염 후 후유증의 결과, 즉, 길랑 바레 증후군, 반응성 관절염 및 염증성 장 질환 (16)를 발생할 수있다. 감염의 주요 소스는닭, 칠면조, 돼지, 소, 양, 오리, 우유, 표면의 물 (15), (17)로부터 오염 된 가축의 고기. 따라서, 식품 안전의 맥락에서 일정한 역학 감시 연구가 필요하다. MLST는 캄 필로 박터 종 (18)에 대한 분자 입력의 "황금 표준"입니다. MLST 방법을 기반으로 생거 시퀀싱은 노동 집약적, 시간과 상대적으로 고가이기 때문에, MLST 입력은 상대적으로 작은 분리 집단에 제한됩니다. 따라서, 저렴하고 빠른 하위 유형의 방법이 필요하다. 이 필요 MSPP 같은 질량 분석 방법에 의해 충족 될 수있다.
이 논문은 캄 필로 박터 jejuni와 SSP의 컬렉션을 사용하여 MSPP-입력에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. doylei 분리 및 MLST와 잠재력의 비교.
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Protocol
1. 바이오 안전성 조건을 고려하여 안전한 작업 환경을 준비
- 미생물 작업을위한 관련이있는 실험실 및 안전 규정에 익숙해집니다. 대부분의 인간의 병원성 미생물, 바이오 안전성 수준에서 살모넬라 엔테의 혈청 형의 Typhi 등이 조건에 있지만, 일부를 처리 바이오 안전성 레벨을 www.cdc.gov/biosafety에 액세스 할 수있는 각 병원체를 처리 수준 3. 정보를 요구해야합니다.
- 에 관계없이 특정 미생물의 생물 학적 분류, 폐기 전에 멸균해야 감염성 폐기물 등의 감염원과 접촉 온 모든 재료를 생각. 유해 물질 및 생물학적 물질에 대한 지역 안전 지침을 존중합니다. 잠재적으로 오염 물질 (생물 학적)의 즉각적이고 적절한 처분이 적절한 용기 사용할 수 있는지 확인합니다.
- (즉, 멸균 장치 (접종 루프), 솔루션 및 문화 미디어를 확인한천 플레이트) 세균 배양을 시작하기 전에 사용할 수 있습니다.
- 바로 감염성 미생물을 처리 한 후 살균 비누와 따뜻한 물로 손을 씻으십시오.
2. 참조 및 컬렉션 분리 된 균주
- 선택하고 하나의 표준 게놈 염기 서열 참조를 취득 이상적 FASTA 형식으로 인코딩 된 프로테옴의 시퀀스와 함께 격리. 더 게놈 염기 서열 균주를 사용할 경우, 분석이 포함되어 있습니다.
주 :이 분리는 / 이러한 분리 이후에 질량 스펙트럼에서 관찰 된 질량 피크의 신원을 예측하는데 사용된다 (제 7 참조). - 선택하고 그들이 종 또는 관심의 종의 계통을 포함하는 방식으로 잠재적으로 다양한 균주의 다양한 얻을 수 있습니다.
참고 :이 분리 된 이후에 인구에서 바이오 마커의 변화를 설명하는 데 사용됩니다 (8 항 참조). - 전체 수집 및 참조 분리 (들)이 프로인지 확인20 - 페를 리이 특정 유기체 (18)에 대한 각각의 황금 표준으로 입력했습니다.
이것은 (서브) -typing 다양한 방법을 포함 할 수 있지만 가능성이 여전히 대부분의 미생물 종의 유전 적 다양성을 설명하는 표준 방법입니다 MLST에 의존합니다 있습니다. - 콜렉션 내에서 계통 발생을 추론하기, MLST 데이터 (21)에 대한 MEGA6 소프트웨어의 산술 평균 (UPGMA)와 비가 쌍 그룹 방법을 사용하여, 예를 들어 입력 데이터에서 phylogram을 계산한다. MLST 데이터의 경우, 또한 MLST 데이터베이스를 참조 시퀀스 유형과 각각의 클론 단지 (22)을 지정합니다.
참고 :이 나중에 이전 금 표준 입력 방식 (섹션 9 참조) MSPP의 일치 성을 분석하는 데 사용됩니다.
3. MALDI 대상 플레이트를 준비
주의 : TFA는 강산이다. TFA 잘못 사용하면 피부에 심한 화상, 눈 손상 및 심한 자극 오의 위험을 부담상부 호흡기 f를 흡입하면. 따라서, 엄격한 안전 조치를 존중해야하며, 보안경, 얼굴 방패, 적절한 장갑, 부츠, 또는 전체 보호 복을 포함한 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 TFA를 처리하는 동안, 필요합니다. TFA에 가능한 노출은 효과적인 배기 환기 시스템과 적절한 환기 하에서 물질을 처리하여 제어되어야한다. 환기가 충분하지 않은 경우에는 승인 된 여과기가 달린 방독면을 사용해야합니다. 또한, TFA는 장기적 영향에 의해 수생 생물에게 유해하다. 환경에 폐수에서 TFA의 모든 자료는 피해야한다.
참고 : 접시는 이전에 사용 된 경우 MALDI 대상에 샘플에 얼룩을지게하기 전에 철저하게 표적 판을 청소합니다.
- 30 ml의 탈 이온수 70 ml의 순수한 에탄올을 사용하여 100 ml의 70 % 에탄올 수용액을 준비합니다.
- (50)을 혼합하여 80 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA) 용액 250 μl를 준비탈 이온수 200 ㎕의 반응 관에 100 % TFA 1 분 동안 튜브를 볼 텍싱의 μL.
- 실온에서 약 5 분 동안 70 % 수성 에탄올을 유리 접시에 넣는하고 담근다하여 MALDI 표적을 청소한다.
- 뜨거운 물에서 대상을 씻어.
- 티슈 페이퍼를 사용하여, 모든 이전 샘플 및 다른 잠재적 인 파편을 제거하기 위해 70 % 에탄올 수용액으로 집중적 표적 판 와이프.
- 또한 청소가 필요하다면 종이 티슈로 닦아 동안, 뜨거운 물에서 씻어.
- 80 %의 수성 TFA 박층으로 타겟 표면을 피복함으로써, 잔류하고 잠재적으로 보이지 않는 오염물을 제거 (96 ~ 100 점마다 μL) 및 종이 티슈 깨끗 모든 대상 위치를 닦아.
- 마지막으로, 산을 제거가 종이 티슈를 사용하여 건조 닦아, 잔류 액체를 증발 실온에서 적어도 15 분 정도를 떠나 목표를 씻어.
4. 제조45; 내부 Calibrant 함유 시아 노 -4- 히드 록시 계피산 매트릭스 솔루션
- 50 % 아세토 니트릴, 47.5 % 물, 2.5 % TFA의 혼합물을 1 ml의 10 mg을 α 시아 노 -4- 히드 록시 계피산 (HCCA)에 용해시켜 포화 매트릭스 용액을 제조 하였다. 용액이 포화되는 경우 잔류 용해되지 않은 HCCA는 유지됩니다.
- 내부 calibrant으로 재조합 인간 인슐린을 추가합니다. 이를 위해, 상기 사용 -20 ° C에서 50 % 아세토 니트릴, 분취 저장 10 PG / μL 최종 농도 원액을 준비한다.
5. MALDI-TOF 질량 분석
주 : 관심있는 미생물에 대한 특정 배양 조건이 사용되어야한다. MALDI-TOF MS에 대한 샘플 스미어 준비 또는 추출하거나 제조 할 수있다, 유기체에 따라 (섹션 8.4.1 참조). 에탄올 포름산 추출법 병원균을 충분히 불활 화를 제공하지만, 스미어 준비 suff 하에서 수행되어야필요에 따라 icient 바이오 안전성 조건 (섹션 1 참조). 일반적으로,이 매트릭스의 적용 후 감염의 위험성이 없지만, 특정 병원균에 대한 특정 불활 프로토콜이 요구된다. 따라서, 예를 들면 노 카르 디아 종의 MALDI-TOF MS는 끓는 물에 23 단백질의 에탄올 침전에 의해 다음의 세균 용해 이전을 필요로한다. EI Khéchine 등. 물 및 0.5 % 트윈 20 (24)을 포함하는 스크류 캡 튜브에서 1 시간 동안 95 ℃에서 세균 콜로니를 가열, 마이코 박테리아의 불활 화를위한 방법을 개발 하였다.
- 얼룩 준비
- 직접 MALDI 타겟 판 위치 ( '자리')에 세균성 식민지의 핀 머리 크기의 양을 확산.
- 내부 calibrant를 포함 HCCA 일반 매트릭스 또는 매트릭스의 1 μl를 각 지점을 오버레이 실온에서 crystalize에 둡니다. 교정 피크의 정확한 질량 결정 용, 제어 SP 오버레이1 μl의 시험 규격 내부 calibrant 함유 HCCA 행렬 1 μL와 OT.
참고 : 여기에, 대장균 DH5 알파의 추출물이 MALDI-TOF MS의 특성 단백질 지문을 보여줍니다 사용된다 시험 규격으로. 이것은 검출 질량 범위의 상한을 연장 두 단백질과 아군이다.
- 추출 방법
- 수확 1.5 ml의 반응 관에서 약 5 접종 루프와 한천 플레이트의 문화 식민지 철저 300 μL에 일시 중지를 두 번 증류수. 900 μL를 무수 에탄올을 추가하고 세균 콜로니가 완전히 중단 될 때까지 반복 피펫으로 잘 섞는다.
주의 :이 단계에서 가능하고 잘 -20 ° C에서 샘플들을 저장하도록 세웠다. 또한, 병원균의 불 활성화는 최적의 성장 조건에서 배양 한 다음 적절한 한천 플레이트에 추출물의 1 ~ 10 μl를 질주하여 테스트 할 수 있습니다. 성공활성화는 미생물 성장의 유무로 표시된다. - 1 분 동안 13,000 XG에서 샘플을 원심 분리하여 상층 액을 제거하고, 실온에서 10 분 동안 펠렛을 건조. 충분히 70 % 포름산 50 μL에 상하로 피펫 팅하여 펠렛을 재현 탁.
- 아세토 니트릴 50 μl를 추가하고 혼합한다. 2 분 동안 13,000 XG에서 원심 분리하여 이물질을 제거합니다. 전송 1 MALDI 표적 플레이트에 샘플 위치 상 μL의 상등액을 실온에서 5 분 동안 건조 떠난다.
- 내부 calibrant 함유 HCCA 행렬의 1 ㎕의 각 지점을 오버레이 실온 crystalize하는 떠난다.
- 수확 1.5 ml의 반응 관에서 약 5 접종 루프와 한천 플레이트의 문화 식민지 철저 300 μL에 일시 중지를 두 번 증류수. 900 μL를 무수 에탄올을 추가하고 세균 콜로니가 완전히 중단 될 때까지 반복 피펫으로 잘 섞는다.
- 질량 스펙트럼의 기록
참고 : 피크 따기 질량 스펙트럼에서 권장 표준 절차를 사용하여 수행됩니다 (무게 중심 알고리즘, S / N 비 :. 2; 확인해 강도 임계 값 : 2 %, 피크 폭 3m / Z, 기본 공제 : TopHat)- 제조 업체의 protoc에 따라 장비를 교정올.
- 각 지점의 경우, 100 샷 단계 600 스펙트럼을 수집합니다.
- 질량 분석기의 구성 소프트웨어의 "AutoXecute"탭으로 이동합니다. "방법"버튼과 풀다운 메뉴에서 방법의 예를 들면, "MBT_AutoX를"선택에 왼쪽 클릭하여 "방법"을 엽니 다.
- 은 "AutoXecute 방법 편집기"를 엽니 다 "방법"메뉴의 "편집 ..."버튼 오른쪽 왼쪽 버튼을 클릭하십시오. 은 "축적"탭으로 이동합니다. 은 "요약"값을 "600"과 _x_ "촬영 단계"값을 "100"를 "에서 만족스러운 샷"을 설정합니다.
- 내부 스펙트럼 교정 절차
주 : 할인 측정 오차가 질량 분석에 고유하다. 간헐 기기 사용 기기 온도 및 재 캘리브레이션에 따라 얻어진 측정 값은 실험에 따라 다를 수있다. 다음 사전 측정 기기의 교정 및 내부에 calibrant 후 측정 스펙트럼 보정 간의 스펙트럼 비교를 보장하는 가장 정확한 방법이다.- 각 교정 피크 목록에 대해 다음 절차를 수행합니다 :
- 스펙트럼 브라우저 시작 (예를 들어, flexAnalysis 오픈 스펙트럼 :. 메뉴 "파일"→ "열기 ...")
- calibrant 피크와 질량 제어 목록을 만듭니다 메뉴 "방법"→ "열기 ...".
- 방법을 선택합니다 MBT_Standard.FAMSMethod → "열기".
- 편집 질량 제어 목록 : 모든 캘리 선택을 취소합니다.
- 하단에 Calibrant 피크를 추가 피크 레이블 : "Insulin_HIStag [M + H] + _ 평균"; m_z : "5808.29"; 공차 [PPM] : "50"; Calibrant 확인란을 선택합니다.
- 예를 들면, "MSPP의 calibrant리스트"로 저장합니다.
- 각 스펙트럼의 경우, 목록에서 calibrant 피크를 선택, "자동 할당"을 클릭하고 "OK"를 누릅니다.
- 각 교정 피크 목록에 대해 다음 절차를 수행합니다 :
- 실험적으로 교정 피크의 정확한 질량을 결정합니다.
- 1 μl의 시험 규격 각 (단계 5.1.1) 두 지점을 준비합니다. 1 μL 일반 HCCA 행렬, 1 μL의 calibrant 아군 매트릭스와 두 번째와 첫 번째 오버레이.
- 각 지점 (5.3 절)에서 질량 스펙트럼을 구하는, 내부적으로 테스트 표준 피크 (5.4)로 조정.
- 스펙트럼 브라우저를 열고 (예를 들어, flexAnalysis 오픈 스펙트럼 : 메뉴 "파일"→ "열기 ...")가 모두 스펙트럼을 오버레이 예상되는 대량의 피크와 발견 (인슐린 m / z = 5,808.29)에 존재한다 calibrant 아군 스펙트럼 아닌 정규 행렬 얻어진 스펙트럼이다.
- Calibrant 피크가 관심의 유기체의 모든 다른 바이오 마커에 의해 가려진되지 않았는지 확인합니다.
- 기준 변형 및 비켜 두 점 (5.1 절)를 준비1 μL 일반 행렬, 1 μL의 calibrant 아군 매트릭스와 두 번째와 첫 번째 rlay.
- 두 지점에서 질량 스펙트럼 (5.3 절)을 획득하고 스펙트럼 브라우저를 열어 결과 스펙트럼을 오버레이 (예를 들어, flexAnalysis 오픈 스펙트럼 : 메뉴 "파일"→ "열기 ..."). calibrant 피크가 아군 행렬을 얻을 다른 인접 신호에 의해 가려하지 스펙트럼에서 명확하게 볼 수 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 특정 미생물에 대한 또 다른 선택 calibrant.
주 : 아군 내부 calibrant를 사용하여 크게 바이오 마커 질량의 변화를 결정하는 정밀도를 증가시킨다. 이 방법을 사용하면, 하나 다에 다운 질량 차이를 검출 할 수있다. 또는, 미생물 유래 또한 불변 대중 캘리로서 사용될 수있다. 그렇지 않으면 입증 않는 한, 정의에 의해, 모든 생물 유래의 질량은 잠재적 변수를 고려해야합니다.
- 내부 Calibrant와 매트릭스 가시를 사용하여 참조 스트레인의 질량 스펙트럼을 측정합니다.
- 직접 MALDI 타겟 판 위치 ( '자리')에 세균 콜로니 (5.1 절) 또는 세균의 단백질 추출물 (5.2 절) 1 μL의 핀 머리 크기의 양을 확산.
- 내부 calibrant를 포함 HCCA 행렬의 1 μl를 각 지점을 오버레이 실온 (섹션 5.1.2 / 5.2.4)에 crystalize하는 표적 판을 둡니다.
- 기준 균주의 기록 질량 스펙트럼 (5.3 절).
- 내부적으로 참조 상기 calibrant 질량 스펙트럼 보정 (여기 : m / z = 5,806.29에서 인슐린을), 이후 기본 공제 (TopHat) 및 평활화 (매개 변수 : SavitzkyGolay, 폭 2 m / Z, 10 사이클)에 의해 전처리.
- 예를 들어, flexAnalysis 오픈 스펙트럼 스펙트럼 브라우저 (시작 메뉴 "파일"→ "열기 ...] ").
- 방법 선택 : 풀다운 메뉴 "방법"→ "열기 ...", 선택의 방법, 예를 들어, "MBT_Standard.FAMSMethod"→ "열기"를 왼쪽 클릭합니다.
- 풀다운 메뉴 "교정"에서 "내부 ..."을 선택하여 스펙트럼을 보정합니다. 창은 calibrant 피크 (들) (섹션 5.4) 목록을 엽니 다. "OK"버튼을 클릭 왼쪽 → calibrant 피크 (인슐린)을 왼쪽 버튼을 클릭하십시오. "프로세스"풀다운 메뉴에서 "프로세스 스펙트럼"을 선택합니다.
- 기준선 공제 우측 스펙트럼 목록의 스펙트럼을 활성화. 선택 "프로세스"풀다운 메뉴에서 "질량 스펙트럼 기준을 빼기".
- 스펙트럼을 부드럽게, 우측 스펙트럼 목록의 스펙트럼을 활성화. 선택 "프로세스"풀다운 메뉴에서 "질량 스펙트럼 기준을 부드럽게".
- 참조 균주의 게놈 서열 데이터로부터의 계산 theoreticaL 개의 모노 이소 서열 정렬 편집기를 사용하여 상응하는 아미노산 서열로 DNA 서열을 변환하여 상기 인코딩 된 각 단백질의 분자량. ExPASy 생물 정보학 자원 포털 (http://web.expasy.org/compute_pi/)에서의 입력 상자에이 단백질 서열을 복사 - 붙여 넣습니다. 를 눌러 / Mw가를 파이 계산하기 위해 "여기를 클릭하십시오." C.의 경우 jejuni와 SSP. doylei (14) 검출 바이오 마커의 질량을 계산한다.
- 하나의 유전자 식별자를 포함하는 열 및 다음 분자량과, 스프레드 시트에 결과를 복사합니다. 정렬 계산 된 분자량에 의해 행은 대중의 쉬운 검색을 용이하게한다. 참고 : 다른 열은 선택 사항입니다; 기능 주석 나중에 해석에 특히 유용 할 수있다.
- 모노 이소 토픽 분자량에서 135을 뺀 다 탈 methioninated 형태의 분자량에 대한 스프레드 시트에 두 번째 열을 삽입합니다. 참고 : 일부 단백질이 게시물을 받아야하기 때문이다N 개의 말단 메티오닌의 단백질 분해 제거하여 번역 후 변형.
- (표 1) 상기 제조 된 게놈 테이블에서 상기 측정 된 질량을 조회하여 상기 기준 균주로부터 계산 된 질량을 각각 측정 중요한 바이오 마커 질량을 할당한다.
- 바이오 마커 이온 예측 된 유전자 산물에 할당 될 수없는 경우 등에, 다른 번역 후 변형 (메틸화, 아세틸, prenylation을 고려, 변형의 편집과 관련된 질량 변화 http://www.abrf.org/delta-mass 참조 ). 자주 주목 유기체에서 관찰되는 임의의 다른 공지 된 번역 후 변형은 테이블에 다른 열을 추가하고 탈 methioninated 형태의 프로세스와 유사한 분자량 계산의 경우.
- 다른 스프레드 시트 탭을 설정하고 별도의 테이블 컬럼의 질량과 식별자 이온 각각의 바이오 마커에 대한 기록한다.
8. 바이오 마커 변동성을 평가인구의
- 컬렉션에서 얻은 질량 스펙트럼을 보정 기준 변형 (들) (섹션 5.4.2)에 대해 수행으로, 분리합니다.
- 질량 스펙트럼에서 변형 바이오 마커를 확인합니다. 변형 질량 기준 스펙트럼과 기준에없는 신규 질량 외관 공지 질량이없는 것을 특징으로한다. 질량 차이는 하나의 아미노산 교환 (표 2), 또는 이들의 조합에 부합해야한다.
- 행 당 하나의 분리에서, 각각의 바이오 마커 및 각각의 테이블 열에서 예측 된 이소 형에 대한 측정 된 질량을 기록한다.
주 : 드물게 일부 질량 변화는 모두, 예를 들면, 여러 가지 아미노산 교환에 기인하지 않을 수는 N이 D에 의해 교환 및 Q는 E로 교환하고, 그 반대가 0.985 다 (표 2)의 질량 변화 될. 이러한 극한 문제 형 질량 분석에 의해 해결 될 수 없다. 따라서, 단백질 서열 수준에서 다른 이성체는 동일한 질량을 갖는하나의 MSPP 유형으로 처리해야합니다. 특정 바이오 마커 유전자의 이온 병렬 생거 시퀀싱은 C.를 MSPP가 타이핑하는 동안 이러한 문제가 발생하지 않은 것을 확인 jejuni와 SSP. doylei 본 연구에 사용 된 컬렉션을 격리 할 것. - PCR은 증폭하고, 각각의 바이오 마커 유전자 시퀀싱에 의해 새로운 MSPP 유형을 확인합니다. 차례로, 이것은 또한 바이오 마커 ID가 올바르게 할당 된 확인로서 기능한다.
- 세균 배양 최적 성장 조건 하에서 분리. 문화 C. jejuni와 SSP. 호기성 조건 (5 % O 2, 10 % CO 2, 85 % N 2)하에 37 ℃에서 5 % 양 혈액 첨가 한천 컬럼비아 균주 doylei. 약 품어 48 시간. 각각의 교차 오염을 방지하기 위해 분리에 대해 별도의 한천 플레이트를 사용합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 적절한 DNA 추출 키트 / 자동화 기계를 사용하여 박테리아 균주의 게놈 DNA를 추출합니다. <. 리> 표 3에 표시된 프라이머를 이용하여 각각의 바이오 마커 유전자를 증폭 모든 PCR을 다음과 같은 조건에서 반응을 수행하여 30 초 동안 94 ℃에서 변성; 30 초 동안 55 ° C에서 어닐링; 30 초 동안 72 ° C에서 신장.
- 게놈 DNA 적당량을 사용 생거 시퀀싱하여 각 앰플 리콘의 DNA 서열을 결정 보통이 수행되고, 증폭 프라이머 중 하나 ((DNA 보통 600-700 NG는 약 100 NG / μL의 농도로 충분하다) 서비스 제공자의 사용).
9. MSPP 기반의 계통을 계산하고 골드 표준에 비교
- 특정 바이오 마커의 아미노산 서열을 t 속하는 연결할이러한 BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html) 26 또는 바이오 마커 스프레드 시트와 같은 서열 정렬 편집기를 사용하여 하나의 연속적인 순서로 분리,의 그는 MSPP 유형입니다.
- 황금 표준 입력 데이터, 예를 들어, UPGMA 클러스터링 (21)에 대해 수행으로 클러스터링에 의해 계통을 계산합니다.
- 황금 표준 4, 13 얻은 하나에 MSPP 기반의 계통을 비교합니다.
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Representative Results
이전에, 우리는 성공적으로 C.에 대한 MSPP 체계를 확립 jejuni와의 SSP. 13 jejuni와. 여기서, 우리는 C. 형제를 아종하는 방법을 확장하는 목적 jejuni와의 SSP. doylei. 이 특정 설정에서 일곱 C. jejuni와의 SSP. doylei 분리는 / 연구소 미생물학 UGent BCCM / LMG 겐트, 벨기에의 미생물의 벨기에 컬렉션에서 획득 하였다. 우리의 분석에 사용 된 모든 일곱 분리는 인간의 기원이었다. 설사가 기준으로 봉사와 게놈 염기 서열을 변형 ATCC 49349 (8843 LMG)는 원래 2 세의 호주 아이의 대변에서 분리. LMG 9143, LMG 9243 및 LMG 9255 어린이 설사 고통과 벨기에 브뤼셀에 살고의 대변에서 분리; 컬렉션에서 여섯 추가 균주를 사용할 수 있었다 독일에서 개인의 위 생검 샘플에서 분리 LMG 7790 (ATCC 49350); 및 LMG 8870 (NCTC A613 / 87)뿐만 아니라 LMG (8)871 (NCTC A603 / 87), 두 남 아프리카 어린이 그린 다른 혈액 샘플에서 격리.
모든 C. jejuni와 SSP. doylei 균주 cryobank 축적량 갓 호기성 조건 (5 % O하에 37 ℃에서 48 시간 동안 5 % 양 혈액 배양 보충 컬럼비아 아가베이스를 이용하여 각각의 분석을 위해 해동 배양으로서 -80 ° C에서 저장 하였다 이 10 % CO 2, 85 % N 2).
C. MSPP위한 기술의 확립 대조적 jejuni와의 SSP. jejuni와 13가 큰 순서 컬렉션에서 파생 된 이소 데이터베이스의 방법을 기반으로 할 수 없었습니다. 단 하나의 C. jejuni와 SSP. rMLST 항목이 데이터베이스에 존재 doylei, 이는 기준 C. 변형에 대응 jejuni와의 SSP. doylei ATCC 49349 (27). 따라서 각 바이오마커 질량 시프트 C. 균주에 비해 검출 jejuni와의 SSP. ATCC 49349 doylei는 새로운 기능 이소 데이터베이스 항목 및 생거 시퀀싱에 의해 재확인 될 필요가 있었다.
얻어진 C.의 다양성을 분석 jejuni와 SSP. doylei 분리, MLST 수행하고 칠을 포함하는 MLST 기반 UPGMA - dendrogram은은 C.를 검토 jejuni와 SSP. doylei 분리 및 C. jejuni와 SSP. 외집단 계산 (그림 1)과 같은 jejuni와 변형 81-176. 각 C. jejuni와의 SSP. doylei 분리는 두 개의 하위 클러스터에 떨어지는 다른 MLST 시퀀스 종류를 지배했습니다. C. 나머지에 비해 변형 LMG7790 최장 거리 계통 있었다 jejuni와 SSP. doylei 분리.
C. 기형의 MALDI-TOF 질량 기준 스펙트럼 jejuni와의 SSP. doylei (도 2)을 산출 분자 질량의 비교에 의해 식별 될 수있다 (14) 단독으로 하전 된 이온 바이오 마커를 함유 하였다.
152,939,117, S20-M, 및 S15-M (그림 3) | 컬렉션 내에서 다양한 이성체는 L32-M, L33, 병사에 의해 암호화 된 가상의 단백질을 검출 하였다. 바이오 마커 이온에 할당 된 나머지 대중은 테스트 C에서 불변이었다 jejuni와 SSP. doylei 분리. 질량 변화에 대응하는 아미노산 치환뿐만 아니라 PCR 증폭 및 4에는 모든 바이오 마커 이온의 아미노산 서열은 MSPP 방식에 포함되는 표 3. 표에 표시된 프라이머를 이용하여 특정 유전자의 생거 시퀀싱에 의해 확인되었다 검출 된 대립 유전자 이성체.
MSPP 기반 phyloproteomic UPGMA-트리 (도 4)가 동일한 일곱 C. 계산 된 jejuni와 SSP. doylei 분리 및 C. jejuni와의 SSP. 기준 균주에서의 분자량의 순서로 14 개의 바이오 마커 이온 연결된 아미노산 서열을 사용하여 외집단 jejuni와 같은 변형 81-176. 각 분리 개별 MSPP 시퀀스 유형을 나타낸다. 얻어진 phyloproteomic 관계는 MLST의 C.에 의해 얻어진 것과 완전히 동일하지했지만 jejuni와의 SSP. doylei은 다시 두 개의 하위 클러스터에 배치 분리합니다. 첫 번째 서브 클러스터는 LMG 8843, LMG 8870 및 LMG 9243, LMG 9255에 의해 제 2, LMG 9143에 의해 형성되었다, LMG 8871 및 MLST 분석으로 알 수있는 바와 같이 LMG 7790.는 분리 LMG7790는 MSPP-에서 가장 긴 phyloproteomic 거리를 보여 주었다 분석.
그림 1 : MLST - 바SED 계통 UPGMA 나무. 균형 MLST 기반 UPGMA - dendrogram은 일곱 C.로 구성 jejuni와 SSP. doylei 분리 및 C. jejuni와의 SSP. jejuni와 변형 81-176. 스트레인 색상 코드 : LMG 8843 (검정), (회색) LMG 8870, LMG 9243 (파란색), LMG 9255 (청록색), LMG 9143 (녹색) 및 (핑크) LMG 8871, LMG 7790 (노란색), 및 81- 176 (흰색). MLST - 시퀀스 유형은 각각 분리의 이름 뒤에 설명한다. 모든 C. jejuni와 SSP. doylei는 격리 다른 MLST 시퀀스 유형에 속한다. X 축은 결합 거리를 나타낸다. 스트레인 LMG 7790은 나머지 6 균주에 비해 가장 긴 계통의 거리를 보여줍니다. 균주 LMG 8843, LMG 8870 및 LMG 9243뿐만 아니라 LMG 9255, LMG 9143 및 LMG C. 내 8871 양식 두 개의 서로 다른 하위 클러스터 jejuni와의 SSP. doylei 클러스터입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : C.의 게놈 상관 관계의 임시 할당 jejuni와 SSP. doylei 관찰 된 바이오 마커 대중에게 ATCC 49349 (LMG 8843). C의 전체 게놈 시퀀스에서 예측 개의 ORF의 계산 된 질량 (평균 동위 원소 조성)을 바탕으로 jejuni와 SSP. ATCC 49349 균주를 doylei, 바이오 마커 대중은 코딩 서열 해당 단백질에 할당되었다. 그러나, 측정 범위 내에서, 바이오 마커 리보솜 소단위의 L31에 대한 질량 (MW = 7315 다), S17 (MW = 9549 다) 및 S18 (MW = 10,285 다)뿐만 아니라 역 methioninated 이성체 (삽입 m / z = 7,000-7,200 다)를 명확하게 할당 할 수 없습니다. 따라서, L31, S17 및 S18은 C.에 포함되지 않았다 jejuni와는 SSP. MSPP 방식을 doylei. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : C.의 특정 바이오 마커의 질량 피크 jejuni와는 SSP. MSPP 방식을 doylei. 각 패널에서 질량 스펙트럼을 모두 일곱 C. 시험의 . MSPP 특정 유형에 대응 jejuni와는 SSP doylei 균주 (도 1에서 컬러 코드)에 의한 대립 이성체 바이오 마커 질량 변화를 나타 내기 위해 중첩 된 (A) L36 + H +; (B) L34 + H +; (C) L32-M + H +를; (D +; (E) S14-M + H +; (F) + H + L29, L28-M + H +, 및 L35-M + H +; (G) L24-M + H +; (H) GI | 152,939,117 + H +; (I) L27-M + H +; (J) S20-M + H +; (K) S15-M + H의 +; (L) S19-M + H +; (M) 리보솜 단백질 S18의 변수 잠재적 인 바이오 마커의 피크를 가리는 강렬한 질량; (N) S20-M + 2H +; (O) L15-M + 2H +; X 축 : 질량 [다] · 전하 1의 비율로, 규모 (200) 다. Y 축 : 강도 [임의의 단위는, 스펙트럼은 개별적으로 낮은 강도 피크의 더 나은 시각화를위한 비교 가능한 노이즈 레벨로 조정 하였다. 리보솜 서브 유닛의 이름 뒤에 "-M"이 드 methioninated 이소을 나타냅니다. 그녀를 클릭하세요전자는이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
그림 4 :. MSPP 기반 phyloproteomic UPGMA 나무 도시 된 phyloproteomic UPGMA 나무는 같은 일곱 C. 포함 jejuni와 SSP. doylei 분리 및 C. jejuni와 SSP. 그림 1과 jejuni와 변형 81-176. 착색 자리 (그림 1과 색상 코드)는 각 변형을 나타냅니다. 보다 나은 비교를 위해 분리는 MLST 기반 나무로부터 얻어진 순이었다 입력 순서로 배열된다. dendrogram은 아래 축이 결합 거리를 나타낸다. 얻어진 phyloproteomic 관계가 계통 MLST 기반 트리 완전히 동일하지 않지만, 글로벌 사진 비교입니다. 인구는 두 그룹으로 분할 : 세 가지가 LMG 8843, LMG 8870 및 LMG 9243 양식 한 clust 분리어, LMG 9255 동안, LMG 9143, LMG 8871 및 LMG 7790 양식 두 번째 클러스터. 이 클러스터 LMG 7790이 서브 클러스터의 LMG 내 LMG 9255, LMG 9143 및 LMG 8871. 의해 형성된 서브 클러스터에 비해 긴 phyloproteomic 거리를 나타낸다 내에 9143에도 각각 나타낸다 분리 MSPP-방법을 사용하지만 LMG 9255. 관련 위치 스위치 개인 MSSP 시퀀스 유형. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 : C. 모든 주석의 ORF의 계산 된 질량 jejuni와의 SSP는. ATCC 49349 균주를 doylei. 목록을 C로 인코딩 된 각 단백질의 모든 계산 된 모노 이소 토픽 분자량의 jejuni와의 SSP. ATCC 493 doylei49 게놈. ExPASy 정보학 리소스 포털 특정 분자 질량의 계산에 사용 하였다. 열 B는 C가 드 methioninated 이성체를 나열 열 반면 methioninated 이소을 보여줍니다. 바이오 마커의 질량은 C.에 포함 jejuni와의 SSP. doylei MSPP 방식은 빨간색으로 강조 표시됩니다. 주 : 바이오 마커 단백질 L36는 C.의 게놈 서열에 주석되지 jejuni와는 SSP. ATCC49349을 doylei. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2. 인해 하나의 SNP에 대한 아미노산 변화에 의한 질량 변화는 모든 잠재적 인 단일 염기 다형성은 표준 유전자 코드를 사용하여 생성 된 아미노산 교환을 확인 하였다. 모든 침묵 돌연변이는 폐기하고, nonsynonymous 돌연변이는 resu과 함께 컴파일질량 변화 lting. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3 : C의 순서에 사용되는 올리고 뉴클레오티드 프라이머 jejuni와 SSP. MSPP-계획에 포함 된 유전자를 doylei 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 4 : 모든 이성체의 개요는 C.에 포함 jejuni와 SSP. MSPP-방식을 doylei.이 표는 모든 바이오 마커 이온은 C.에 포함 jejuni와의 SSP. MSPP 사우스 캐롤라이나 doylei헴. 참조 균주 ATCC 49349의 아미노산 서열은 완전하게 설명한다. 더 검출 동종를 들어, 특정 아미노산 치환이 나열됩니다. 아미노산 번호는 항상 개시 메티오닌을 포함하고; 질량 분석기가 없음을 표시하는 경우, 그것은 괄호 (M)로 작성되었습니다. 각 이소 분자량의 경우, 질량 차이가 표시되는 이소 데이터 세트 내에서 변형 ATCC에게 49,349 이성체 및 주파수를 참조. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
MSPP 방식의 설립에서 가장 중요한 단계는 바이오 마커 이온 정체성의 명확한 유전 적 결정이다. 그것은 틀림없이 바이오 마커를 식별 할 수 없다면, 이것은 반응식 13에서 제외한다.
C. jejuni와의 SSP. doylei 방식은 14 개 바이오 마커 이온을 포함한다. 이 5 이하 C. 비교입니다 검출 가능한 C. 사이 jejuni와의 SSP. jejuni와 MSPP 방식 (13) 국지적 가장 큰 차이 jejuni와 SSP. jejuni와와 C. jejuni와의 SSP. doylei 바이오 마커는 L31 (-M) 및 L35 (-M) (13)의 경우에는 아미노 - 말단 메티오닌의 번역 후 제거했다.
C. 시험에 도시 된 바와 같이 jejuni와 SSP. doylei 모음을 분리, MSPP는 모두 일곱 가지 MLST 시퀀스 유형을 구별 할 수 있었다. 이 모든 테스트를 분리 특정 MSPP의 sequ를 지배한다는 것을 의미줬어 유형입니다. 또한, MSPP는 C. 사이의 종 분화 할 수 있습니다 jejuni와 SSP. jejuni와와 C. jejuni와의 SSP. doylei.
일반적으로 판별 할 가능성이 낮은 MLST 같은 DNA 서열 기반의 방법에 비교하여 MSPP 이하 균주 수준에서 분리. 잘 확립 이성체 데이터베이스 가정 세균 균주의 하위 유형은 DNA 서열 분석 방법 (4) (13)에 비해 훨씬 더 빠르고 훨씬 더 저렴하다.
이러한 주성분 분석 (PCA) 4, 10, 28 또는 이진 피크의 매칭의 비교 결과 수학 행렬 UPGMA 분석 프로파일 (29) (30)를 사용하는 것과 ICMS - 스펙트럼 계층 클러스터링 방법에 비해 MSPP의 가장 큰 장점 높은 고유 재현성이다. 동안 서로 다른 cultur 등 다양한 문화 조건E 매질 다른 한천 전하 상이한 배양 온도 및 다른 배양 기간이 크게 PCA에 의해 계산 된 관계에 영향을 phyloproteomic 그들은 MSPP 관계 추론 6,13- 영향을 미치지 않는다. 재현성이 주된 이유는 일반적으로 (13)의 피크 강도와 질량 스펙트럼의 품질의 독립이다. 분리의 질량 스펙트럼의 피크 MSPP 관련 의심 할 나위 식별 할 수없는 경우, 다시 개별 분리의 질량 스펙트럼을 기록 할 필요가있다.
MSPP 방법은 모든 미생물 종 원칙적으로 적응 될 수있다. 특히, 클로스 트리 디움 디피, 대장균, 황색 포도상 구균, 살모넬라 엔테 SSP. 엔테 같은 임상 관련 미생물 종의 하위 유형은 미래의 잠재적 응용 프로그램입니다. 독성 인자 또는 저항성 유전자의 발현이 phyl과 연관 있다면oproteomic 관계, MSPP는 일상적인 임상 진단에서 혁신적인 도구가 될 수 있습니다. 이에 피크 검출 및 MSPP 방식에 포함되는 바이오 마커 이온의 수의 수는 잠재적 특히 진균 (31)의 경우에는, 특정 추출 및 / 또는 용해 프로토콜을 사용함으로써 증가 될 수있다.
최근에 사용 MALDI-TOF 기술은 주로 만 매우 풍부한 리보솜 단백질을 검출 할 수있다. 이 매우 풍부한 단백질은 질량 스펙트럼에서 독성 요인으로 거의 모든 다른 작은 단백질을 방해. 작은 단백질 ESI-TOF-MS (비행 질량 분석의 전자 분무 이온화 시간) 및 HPLC (고성능 액체 크로마토 그래피) (32)을 연결함으로써 검출 될 수있다. 그러나 현재이 방법은 너무 노동과 큰 분리 집단의 특성에 집중 비용이다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | 34967 | |
| Autoflex III TOF/TOF 200 system | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | GT02554 G201 | Mass spectrometer |
| bacterial test standard BTS | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 604537 | |
| BioTools 3.2 SR1 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 263564 | Software Package |
| Bruker IVD Bakterial Test Standard | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 8290190 | 5 tubes |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG8843 | ATCC 49349;IMVS 1141;NCTC 11951;strain 093 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG9143 | Goossens Z90 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG7790 | ATCC 49350;CCUG 18265;Kasper 71;LMG 8219;NCTC 11847 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG9243 | Goossens N130 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG8871 | NCTC A603/87 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG9255 | Goossens B538 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG8870 | NCTC A613/87 |
| Columbia agar base | Merck, Darmstadt, Germany | 1.10455 .0500 | 500 g |
| Compass for FlexSeries 1.2 SR1 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 251419 | Software Package |
| defibrinated sheep blood | Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Germany | SR0051 | |
| ethanol | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | 02854 Fluka | |
| formic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | F0507 | |
| HCCA matrix | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 604531 | |
| Kimwipes paper tissue | Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z188956 | |
| MALDI Biotyper 2.0 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 259935 | Software Package |
| Mast Cryobank vials | Mast Diagnostica, Reinfeld, Germany | CRYO/B | |
| MSP 96 polished steel target | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 224989 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 51304 | |
| recombinant human insulin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | I2643 | |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | T6508 | |
| water, molecular biology-grade | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | W4502 |
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