Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

inndeling i undergrupper av Published: October 30, 2016 doi: 10.3791/54165
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institut für Medizinische Mikrobiologie, Universitätsmedizin Göttingen

Summary

Massespektrometri-baserte phyloproteomics (MSPP) ble brukt til å skrive en samling av Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolerer på stammenivå i forhold til multilocus sekvens typing (MLST).

Abstract

MALDI-TOF MS tilbyr muligheten for å skille enkelte bakterier ikke bare på arter og underarter nivå, men til og med under, ved belastningen nivå. Allele isoformer av de påvisbare biomarkør ioner resultere i isolat spesifikke masse skift. Massespektrometri-baserte phyloproteomics (MSPP) er en ny teknikk som kombinerer massespektrometri påvisbare biomarkør massene i en ordning som gjør fradrag for phyloproteomic relasjoner fra isolere bestemte masse skift i forhold til et genom sekvensert referansestamme. Den utledede aminosyresekvenser blir så brukt til å beregne MSPP-baserte dendrogrammer.

Her beskriver vi arbeidsflyten av MSPP ved å skrive en Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolat samling av syv stammer. Alle de syv stammene var av menneskelig opprinnelse og multilocus sekvens typing (MLST) viste deres genetiske mangfold. MSPP-typing resulterte i syv forskjellige MSPP sekvenstyper, tilstrekkelig gjenspeiler deres grafilogenetic relasjoner.

Den C. jejuni ssp. doylei MSPP ordningen omfatter 14 forskjellige biomarkør ioner, for det meste ribosomale proteiner i massen området fra 2 til 11 kDa. MSPP kan i prinsippet tilpasses andre massespektrometri plattformer med en utvidet masse utvalg. Derfor, har denne teknikken potensial til å bli et nyttig verktøy for belastning nivå mikrobiell skrive.

Introduction

I løpet av det siste tiåret, har matrise-assistert laser desorpsjon ionisering time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF MS) avansert til å være en høyt verdsatt standard metode for mikrobiell slekten og artsbestemmelse i klinisk mikrobiologi 1, 2. Artsbestemmelse er basert på opptak av små protein fingeravtrykk av intakte celler eller cellelysatene. Den typiske masseområde for et massespektrometer som brukes i rutinemessig klinisk mikrobiologi er 2-20 kDa. I tillegg kan det resulterende spektra bli brukt til å diskriminere stammer ved under-arter og underarter under-nivå 3. Tidlige banebrytende studier har identifisert konkrete biomarkør ioner for en bestemt undergruppe av stammer i Campylobacter jejuni 4, Clostridium difficile 5, Salmonella ente ssp. ente serovar typhi 6, Staphylococcus aureus 7-9, og Escherichia coli 10-12.

Kombinasjonen av flere variable biomarkør masser tilsvarende allele isoformer gir mulighet for dypere inndeling i undergrupper. Tidligere implementert vi en metode for å konvertere disse variasjoner i masse profiler i meningsfulle og reproduserbare phyloproteomic relasjoner kalles massespektrometri basert phyloproteomics (MSPP) på en C. jejuni ssp. jejuni isolat samling 13. MSPP kan brukes en massespektrometrisk tilsvarende DNA sekvens basert subtyping teknikker som multilocus sekvens typing (MLST).

Campylobacter arter er den ledende årsak til bakteriell gastroenteritt verdensomspennende 14, 15. Som en konsekvens av Campylobacteriose post-infektiøs sekvele, nemlig, Guillain-Barré syndrom, reaktiv artritt og inflammatorisk tarmsykdom kan oppstå 16. De viktigste smittekildene erforurenset husdyr kjøtt fra kylling, kalkun, svin, storfe, sau og ender, melk og overvann 15, 17. Derfor vanlige epidemiologiske overvåking studier i sammenheng med mattrygghet er nødvendig. MLST er "gullstandarden" i molekylær typing for Campylobacter arter 18. Fordi Sanger-sekvensering basert MLST metode er arbeidskrevende, tidkrevende og relativt kostbart, er MLST typing begrenset til relativt små isolere kullene. Det er derfor et behov for billigere og raskere subtyping metoder. Dette behovet kan dekkes ved massespektrometri metoder som MSPP.

Dette notatet presenterer en detaljert protokoll for MSPP-typing ved hjelp av en samling av Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolater og sammenligning av sitt potensial med MLST.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Lag en trygg arbeidsplass ved Vurderer biosikkerhet betingelser

  1. Bli kjent med laboratoriet og sikkerhetsbestemmelser som er av relevans for å arbeide med mikroorganismer. De fleste humanpatogene mikroorganismer skal håndteres på biosikkerhetsnivå 2 forhold, men noen, som for eksempel Salmonella ente serovar typhi, krever biosikkerhetsnivå 3. Opplysninger om nivået håndtere hver patogen kan nås på www.cdc.gov/biosafety.
  2. Uavhengig av biohazard klassifisering av den spesifikke mikroorganismen, betrakte alle materialer som kom i kontakt med smittestoffet som smittefarlig avfall som må autoklaveres før de kastes. Respekter regionale sikkerhetsretningslinjer for farlige stoffer og biologiske stoffer. Sørg for at egnede beholdere for umiddelbar og riktig disponering av potensielt forurensede materialer (biohazards) er tilgjengelig.
  3. Sikre at sterile instrumenter (inokulasjon sløyfer), løsninger og kultur media (agar plater) er tilgjengelig før du begynner bakteriekultur.
  4. Vask hendene med antiseptisk såpe og varmt vann umiddelbart etter håndtering av smittemikroorganismer.

2. Velg Referanse og samling isolater

  1. Velge og skaffe en standard genom-sekvensert referanse isolere sammen med sekvensene av det kodede proteome, ideelt sett i FASTA format. Hvis flere genom-sekvensert stammer er tilgjengelig, inkluderer disse i analysen.
    Merk: Denne isolat / disse isolatene vil senere bli brukt til å forutsi hvem som masse topper observert i massespektrometri (se kapittel 7).
  2. Velge og oppnå en rekke potensielt forskjellige isolatene på en slik måte at de dekker phylogeny av de arter eller underarter av interesse.
    Merk: Disse isolatene vil senere bli brukt til å demonstrere variabiliteten av biomarkører i befolkningen (se kapittel 8).
  3. Sørg for at hele samlingen og referanse isolat (e) er proPerly skrevet av de respektive gullstandarden for denne organismen 18-20.
    Merk: Dette kan omfatte en rekke (sub) -typing metoder, men vil trolig ty til MLST, som fortsatt er standard metode for å demonstrere genetisk mangfold fleste mikrobielle arter.
  4. Å utlede fylogeni innen innsamling, beregne en phylogram fra skrive data, for eksempel ved hjelp av uvektet paret gruppen metode med aritmetisk gjennomsnitt (UPGMA) i MEGA6 programvare for MLST data 21. For MLST data, også oppsøke MLST database og tilordne sekvenstyper og respektive klonale komplekser 22.
    Merk: Dette vil senere bli brukt til å analysere congruency av MSPP med den tidligere gullstandarden skrive metoden (se kapittel 9).

3. Utarbeide en MALDI sikteplate

FORSIKTIG: TFA er en sterk syre. Feil bruk av TFA bærer risikoen for alvorlige hudforbrenninger, øyeskade og sterk irritasjon of de øvre luftveiene ved innånding. Derfor må strengere tiltak sikkerhets bli respektert og riktig personlig verneutstyr (PVU) inkludert vernebriller, ansikt skjold, egnede hansker, støvler, eller enda en full beskyttelsesdrakt er nødvendig, mens håndtering TFA. Mulig eksponering for TFA må kontrolleres ved å håndtere stoffet under adekvat ventilasjon med en effektiv eksosventilasjonssystem. Ved utilstrekkelig ventilasjon, må pusteapparat med godkjent filter brukes. I tillegg er TFA skadelig for vannlevende organismer med langtidseffekter. Enhver frigivelse av TFA i avfallsvann til omgivelsene må unngås.

Merk: Før spotting prøvene på en MALDI mål, rydde skyteskiven grundig hvis platen ble brukt tidligere.

  1. Fremstille 100 ml 70% vandig etanol-løsning med 30 ml avionisert vann og 70 ml ren etanol.
  2. Fremstille 250 ul av en 80% vandig trifluoreddiksyre (TFA) løsning ved å blande 50ul avionisert vann og 200 pl 100% TFA i et reaksjonsrør og virvling røret i 1 min.
  3. Rens MALDI målet ved å sette den inn i en glassskål og oppslukt det i 70% vandig etanol i omtrent 5 min ved romtemperatur.
  4. Skyll målet etter varmt vann.
  5. Ved hjelp av en silkepapir, tørk av sikteplate intensivt med 70% vandig etanol løsning for å fjerne alle tidligere prøver og andre potensielle rusk.
  6. Hvis ytterligere rengjøring er nødvendig, skyll under varmt vann mens tørke med et papirlommetørkle.
  7. Fjerning av resterende, og potensielt usynlige, forurensninger, ved å dekke skiveoverflate med et tynt lag av 80% vandig TFA (~ 100 ul pr 96 flekker) og ved å tørke alle målposisjoner ren med et silkepapir.
  8. Til slutt, skyll målet å fjerne syre den tørkes ved hjelp av et papirlommetørkle, og la den i minst 15 minutter ved romtemperatur for å fordampe restvæsken.

4. Fremstilling av en45 -cyano-4-hydroksy-kanelsyre Matrix oppløsning inneholdende en intern kalibrerings

  1. Fremstille en mettet matriseoppløsning ved å oppløse 10 mg α-cyano-4-hydroksy-kanelsyre (HCCA) i 1 ml av en blanding av 50% acetonitril, 47,5% vann og 2,5% TFA. Gjenværende uoppløste HCCA vil forbli hvis oppløsningen er mettet.
  2. Legg rekombinant humant insulin som en intern kalibrerings. For dette, fremstille en stamoppløsning til en endelig konsentrasjon på 10 pg / mL i 50% vandig acetonitril, alikvoter og oppbevar ved -20 ° C for videre bruk.

5. MALDI-TOF massespektrometri

Merk: Kultur betingelser som er spesifikke for organismene av interesse må brukes. Prøver for MALDI-TOF MS kan fremstilles enten ved å smøre forberedelse eller ekstraksjon, avhengig av organismen (se avsnitt 8.4.1). Mens etanol-maursyre ekstraksjonsmetode gir tilstrekkelig inaktivering av patogener, har smøre preparatet som skal gjennomføres under sufficient biosikkerhet betingelser som kreves (se kapittel 1). Vanligvis er det ingen risiko for smitte etter påføring av matriksen, men for bestemte patogener spesifikke inaktiveringsprotokoller er nødvendig. Således kan for eksempel MALDI-TOF MS av Nocardia arter krever tidligere lysis av bakteriene i kokende vann, som følge av etanolutfelling av proteiner 23. EI Khéchine et al. utviklet en fremgangsmåte for inaktivering av Mycobacteria, oppvarming av bakteriekolonier ved 95 ° C i 1 time i skrukork inneholdende vann og 0,5% Tween 20 24.

  1. smear Forberedelse
    1. Spre et knappenålshode-størrelse mengde en bakteriekoloni direkte på en MALDI sikteplate posisjon ( "spot").
    2. Overlegg hver spot med 1 mL av HCCA vanlig matrise eller matrise som inneholder interne kalibrerings og la crystalize ved romtemperatur. For bestemmelse av den nøyaktige massen av kalibrerings topp, overlappe en kontroll spot med en ul Test Standard og en ul HCCA matrise som inneholder interne kalibrerings.
      Merk: Her, som Test Standard et utdrag av Escherichia coli DH5 alfa brukes som viser en karakteristisk protein fingeravtrykk i MALDI-TOF MS. Det er tilsatt det med to proteiner som strekker seg den øvre grensen av den påvisbare masseområdet.
  2. utvinning Metode
    1. Avling omtrent fem kolonier fra en agarplate kultur med en vaksinasjon løkke og grundig suspendere i 300 ul dobbeltdestillert vann i et 1,5 ml reaksjonsrøret. Legg 900 mL absolutt etanol og bland godt ved gjentatt pipettering til bakteriekolonier er fullstendig stanset.
      Bemerk: Ved dette trinnet er det mulig og godt etablert for å lagre prøvene ved -20 ° C. I tillegg kan inaktivering av patogener testes ved å stryke 1-10 pl av ekstraktet på en passende agarplate etter inkubasjon ved optimale vekstforhold. vellykket iaktivering indikeres ved fravær av mikrobiell vekst.
    2. Sentrifuger prøven ved 13 000 xg i 1 min, kaste supernatanten, og tørke pellet ved romtemperatur i 10 minutter. Resuspender pelleten grundig ved pipettering opp og ned i 50 ul 70% maursyre.
    3. Tilsett 50 mL acetonitril og bland. Fjern avfall ved sentrifugering ved 13 000 x g i 2 min. Transfer 1 mL av supernatanten på en prøve posisjon på en MALDI sikteplate og la det tørke i 5 min ved romtemperatur.
    4. Overlegg hver spot med 1 mL av HCCA matrise som inneholder interne kalibrerings og la crystalize ved romtemperatur.
  3. Opptak av Mass Spectra
    Merk: Peak-plukking fra massespektra gjøres ved hjelp av standard prosedyrer anbefalt (Tyngdepunktet algoritme, S / N-forholdet. 2; rel Intensitet terskel: 2%; toppens bredde 3 m / z, baseline subtraksjon: Hat)
    1. Kalibrere instrumentet i henhold til produsentens protocol.
    2. For hver spot, samle 600 spektra i 100-shots trinn.
      1. Gå til "AutoXecute" fanen i konfigurasjonsprogrammet massespektrometer. Åpne "Method" ved å venstreklikke på "Method" knappen og velge metode for eksempel "MBT_AutoX" fra rullegardinmenyen.
      2. Venstre-klikk på "Rediger ..." knappen til høyre i "Method" -menyen for å åpne "AutoXecute Method Editor". Gå til "Oppsamling" -kategorien. Sett "Oppsummere" verdien til "600" og "tilfredsstillende skudd i" _X_ "skutt skritt" verdien til "100".
  4. Intern Spectrum kalibrering
    Merk: Minutt målefeil er iboende til massespektrometri. Avhengig av intermitterende instrument bruk, instrument temperatur og re-kalibrering, kan de oppnådde måleverdiene varierer mellom eksperimenter. Etter pre-måleinstrument kalibrering og post-måling spekteret kalibrering av en intern kalibrerings er den mest presise måten å sikre inter-spektrum sammenlignbarhet.
    1. Utfør følgende prosedyrer for hver kalibrering topp liste:
      1. Begynn spektrum nettleser (f.eks flexAnalysis og åpent Spektrum. Menyen "File" → "Open ...")
      2. Lag masse iste med kalibrerings peak: menu "Method" → "Open ...".
      3. Velg metode: MBT_Standard.FAMSMethod → ​​"Open".
      4. Rediger Mass Control List: Fjern alle Calibrants.
      5. Legg kalibrerings topp på bunn: Peak Etikett: «Insulin_HIStag [M + H] + _ avg"; m_z: "5808,29"; Toleranse [ppm]: "50"; Sjekk kalibrerings boksen.
      6. Lagre som, for eksempel "MSPP kalibreringsliste".
    2. For hvert spektrum, velger kalibrerings topp fra listen, klikk på "Automatic Assign" og trykk "Ok".
ove_title "> 6. Kontroller Internal kalibrering

  1. Eksperimentelt Bestem Nøyaktig masse av kalibrerings Peak.
    1. Forbered to flekker med en mL Test Standard hvert (trinn 5.1.1). Overlegg den første med 1 mL vanlig HCCA matrise, den andre med en ul kalibrerings-piggete matrise.
    2. Skaff massespektra fra hver spot (punkt 5.3), og internt kalibrere til teststandarden topper (§ 5.4).
    3. Overlegg både spektra ved å åpne dem med spektrum nettleser (f.eks flexAnalysis og åpent Spektrum menyen "File" → "Open ...") og finne topp på den forventede masse (insulin m / z = 5,808.29), som bør være til stede i den kalibrerings-spiked spektrum, men ikke i spekteret oppnådd med det faste matrisen.
  2. Sjekk at kalibrerings Peak ikke er skjult av: Andre Biomarker av organismen av interesse.
    1. Forbered to flekker (punkt 5.1) med referanse belastning og overlay den første med 1 mL vanlig matrise, den andre med en ul kalibrerings-piggete matrise.
    2. Acquire massespektra fra begge stedene (punkt 5.3) og overlappe den resulterende spektra ved å åpne dem med spektrum nettleser (f.eks flexAnalysis og åpent Spektrum menyen "File" → "Open ..."). Pass på at kalibrerings toppen er godt synlig i spekteret oppnådd med piggete matrise og ikke skjules av en annen tilstøtende signal. Hvis dette ikke er tilfelle, å velge en annen kalibrerings for denne organisme.
      Merk: Bruk en piggete interne kalibrerings øker presisjonen å bestemme varianter av biomarkør massene betydelig. Ved hjelp av denne metoden, kan masse forskjeller ned til 1 Da oppdages. Alternativt kan også invariante masser som stammer fra organismer benyttes som calibrants. Imidlertid, ved definisjon, alle organismeavledet masser må betraktes som potensielt variabel, med mindre det motsatte er bevist.

  1. Mål masse spektrum av Reference Strain, ved hjelp av matrise Spiked med Internal kalibrerings.
    1. Spre et knappenålshode-størrelse mengde en bakteriekoloni (punkt 5.1) eller en fil av bakteriell proteinekstrakt (punkt 5.2) direkte på en MALDI sikteplate posisjon ( "spot").
    2. Overlegg hver spot med 1 mL av HCCA matrise som inneholder interne kalibrerings og la skyteskiven til crystalize ved romtemperatur (avsnitt 5.1.2 / 5.2.4).
    3. Record massespektra av referansen stamme (punkt 5.3).
  2. Internt kalibrere referansespekteret til kalibrerings masse (her: insulin ved m / z = 5,806.29), og etterfølgende pre-prosessen ved baseline subtraksjon (Hat) og glatting (parametre: SavitzkyGolay, bredde: 2 m / z, 10 sykluser).
    1. Begynn spektrum nettleser (f.eks flexAnalysis og åpent Spektrum menyen "File" → "Open ...; ").
    2. Velg metode: nedtrekksmenyen "Method" → "Open ...", Venstre-klikk metoden for valg, for eksempel "MBT_Standard.FAMSMethod" → "Open".
    3. Kalibrer spekteret ved å velge "Internal ..." fra rullegardinmenyen "Kalibrering". Et vindu åpnes notering kalibrerings peak (er) (avsnitt 5.4). Venstre-klikk på kalibrerings peak (insulin) → Venstre-klikk "OK". Velg "Process spektra" fra "Process" rullegardinmenyen.
    4. For baseline subtraksjon aktivere spekteret i spekteret listen på høyre side. Velg "Trekk fra massespektrum Baseline" fra "Process" rullegardinmenyen.
    5. Å glatte spekteret, aktivere spektrum i spekteret listen på høyre side. Velg "Smooth masse spektrum Baseline" fra "Process" rullegardinmenyen.
  3. Fra genomet sekvenseringsdata fra referanse stamme, beregne theoretical monoisotopic molekylvekt av hver av de kodede proteinene ved å oversette DNA-sekvensen til det tilsvarende aminosyresekvens ved bruk av en sekvenssammenstilling editor. Copy-paste dette proteinet sekvensen inn i boksen på ExPASy Bioinformatikk Resource Portal (http://web.expasy.org/compute_pi/). og trykk på "Klikk her" for å beregne pi / Mw. I tilfelle av C. jejuni ssp. doylei beregne massen av 14 detekterbare biomarkører.
  4. Kopiere resultatene inn i et regneark, med en kolonne som inneholder genet identifikator og neste molekylvekten. Sorter radene av beregnet molekylvekt for å lette lettere oppslag av massene. Merk: Andre kolonner er valgfritt; funksjonell annotering kan være spesielt nyttig senere for tolkning.
  5. Sette inn en andre kolonne i regnearket for molekylvekten av de-methioninated form, å subtrahere 135 Da fra monoisotopic molekylvekt. Merk: Dette er fordi noen proteiner gjennomgå posttranslasjonell modifikasjon av proteolytisk fjerning av det N-terminale metionin.
  6. Tilordne hvert store målte biomarkør massen til de beregnede massene fra referansestamme ved å slå opp den målte masse fra genomet tabell fremstilt ovenfor (tabell 1).
  7. Hvis biomarkør ionene ikke kan tildeles spådd genprodukter, vurdere andre posttranslational modifikasjoner (metylering, acetylering, prenylation etc., se http://www.abrf.org/delta-mass for en samling av modifikasjoner og tilhørende masseendringer ). For en hvilken som helst annen kjent posttranslasjonell modifikasjon som ofte observeres i organismene av interesse legge til en annen kolonne i tabellen og beregne molekylvekten som er analog med fremgangsmåten for den de-methioninated form.
  8. Sett opp et annet regneark kategorien, og registrerer for hver biomarkør ion massen og identifikator i en egen tabell kolonne.

8. Vurdere Biomarker Variasjoni Folke

  1. Kalibrere masse spektra fra samlingen isolater, som på referansestamme (er) (avsnitt 5.4.2).
  2. Identifisere variant biomarkører i massespektra. En variant masse er karakterisert ved fravær av en masse som er kjent fra referansespekteret og utseende av en ny masse ikke er til stede i referansen. Massen Forskjellen må samsvare med en enkel aminosyre utveksling (tabell 2), eller en kombinasjon derav.
  3. På ett isolat per rad, registrerer den målte masse for hver biomarkør og spådd isoformen i de respektive tabellkolonner.
    Merk: I sjeldne tilfeller kan enkelte masse skift tilskrives flere forskjellige aminosyrer utveksling, for eksempel begge, N byttet av D og Q utvekslet med E, og vice versa, resultere i en masseforskyvning av 0,985 Da (tabell 2). Denne iboende problemet kan ikke løses ved massespektrometri alene. Derfor er forskjellige isoformer på proteinsekvensen nivå har den samme massemå behandles som en enkelt MSPP type. Parallell Sanger-sekvensering av de spesielle biomarkør ion gener bekreftet at dette problemet ikke oppstår mens MSPP-skrive C. jejuni ssp. doylei isolere samling anvendt i denne studien.
  4. Bekreft nye MSPP typer av PCR-forsterke og sekvense de respektive biomarkør gener. I sin tur, denne fungerer også som en bekreftelse på at biomarkør identitet er blitt tildelt riktig.
    1. Kultur bakterielle isolater under optimale vekstbetingelser. Kultur C. jejuni ssp. doylei påkjenningene på Columbia-agar supplementert med 5% saueblod ved 37 ° C under mikroaerofile betingelser (5% O 2, 10% CO2, 85% N2). Inkuber i ca. 48 hr. Bruk en separat agar plate for hver isolere for å unngå krysskontaminering.
    2. Pakk genomisk DNA av bakterieisolatene ved hjelp av en passende DNA-ekstraksjon kit / automatiserte maskiner i henhold til produsentens instruksjoner.
      3. <li> forsterke respektive biomarkør gener ved å bruke primere som er oppført i tabell 3. Utfør alle PCR-reaksjoner under følgende betingelser:. denaturering ved 94 ° C i 30 sekunder; annealing ved 55 ° C i 30 sekunder; forlengelse ved 72 ° C i 30 sek.
    3. Bestemme DNA-sekvensen av hvert fragment av Sanger-sekvensering ved anvendelse av en passende mengde av genomisk DNA (vanligvis 600-700 ng DNA er tilstrekkelig ved en konsentrasjon på ca 100 ng / mL) og en av amplifikasjonsprimerne (vanligvis gjøres dette ved bruk av en tjenesteleverandør).
  5. I en egen tabell (se tabell 4), ta den utledede proteinsekvens for hver roman isoform ved hjelp av et egnet oversettelsesverktøy (f.eks Transseq: http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/) 25.

9. Beregn en MSPP basert Fylogeni og sammenlign til Gold Standard

  1. Sette sammen de spesielle biomarkør aminosyresekvenser tilhørighet til than MSPP type isolatene i en sammenhengende sekvens ved hjelp av en sekvens innretting editor, for eksempel BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html) 26 eller biomarkør regneark.
  2. Beregn fylogeni av clustering som på gullstandarden skrive data, for eksempel, UPGMA clustering 21.
  3. Sammenligne den MSPP baserte fylogenien til den som ble oppnådd med gullstandarden 4, 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tidligere har vi opprettet en MSPP ordning for C. jejuni ssp. jejuni 13. Her har vi som mål å utvide metoden til søsken underarter C. jejuni ssp. doylei. I denne bestemt innstilling, syv C. jejuni ssp. doylei isolater ble kjøpt fra den belgiske samling av mikroorganismer / Laboratory of Microbiology UGent BCCM / LMG Ghent, Belgia. Alle de syv isolater som brukes for våre analyser var av menneskelig opprinnelse. Genomet-sekvensert stamme ATCC 49349 (LMG 8843), opprinnelig isolert fra avføringen til en to år gammel australsk barn med diaré fungert som referanse. Fra samlingen, seks ekstra påkjenningen var tilgjengelige: LMG 9143, LMG 9243, og LMG 9255 isolert fra avføring av barn som lider diaré og bor i Brussel, Belgia; LMG 7790 (ATCC 49350) isolert fra en gastrisk biopsiprøve fra et individ fra Tyskland; og LMG 8870 (NCTC A613 / 87), så vel som LMG 8871 (NCTC A603 / 87), både isolert fra ulike blodprøver hentet fra sørafrikanske barn.

All C. jejuni ssp. doylei isolatene ble lagret ved -80 ° C som cryobank aksjer, ferskt tint for hver analyse og dyrket ved hjelp av Columbia-agar basen supplert med 5% saueblod og inkubasjon i 48 timer ved 37 ° C under mikroaerofile betingelser (5% O 2, 10% CO2, 85% N2).

I motsetning til etableringen av MSPP teknikk for C. jejuni ssp. jejuni 13 var det ikke mulig å basere fremgangsmåten på en isoform database avledet fra en større sekvens samling. Bare en enkelt C. jejuni ssp. doylei oppføring var til stede i den rMLST databasen, og dette samsvarer med referansestamme C. jejuni ssp. doylei ATCC 49349 27. Derfor hver biomarkør masse skift oppdaget i forhold til belastning C. jejuni ssp. doylei ATCC 49349 var en ny oppføring i isoform database og trengte å bli bekreftet av Sanger-sekvensering.

Å analysere mangfoldet av det oppnådde C. jejuni ssp. doylei isolater, MLST ble utført og en MLST basert UPGMA-dendrogram inkludert de sju undersøkte C. jejuni ssp. doylei isolater og C. jejuni ssp. jejuni belastning 81-176 som outgroup beregnet (figur 1). Hver C. jejuni ssp. doylei isolat tilhørte en annen MLST-sekvenstype, faller inn i to subclusters. Strain LMG7790 hadde den lengste fylogenetisk avstand i forhold til den gjenværende C. jejuni ssp. doylei isolater.

Den skriv MALDI-TOF referanse massespektrum av C. jejuni ssp. doylei (figur 2).

I samlingen, ble forskjellige isoformer detektert for L32-M, L33, det hypotetiske protein kodet for av GI | 152939117, S20-M, og S15-M (figur 3). De resterende massene tildelt biomarkør ioner var uforanderlig i testet C. jejuni ssp. doylei isolater. Den aminosyresubstitusjon som svarer til masse skift er blitt identifisert ved PCR-amplifisering og Sanger-sekvensering av det bestemte genet ved bruk av primere som er oppført i tabell 3. Tabell 4 angir aminosyresekvensene til alle biomarkør ioner som inngår i MSPP ordningen samt de oppdagede alleliske isoformene.

En MSPP basert phyloproteomic UPGMA-tre (figur 4) ble beregnet for de samme syv C. jejuni ssp. doylei isolater og C. jejuni ssp. jejuni stamme 81-176 som outgroup ved hjelp av de sammenkjedede aminosyresekvensene til alle 14 biomarkør ioner i rekkefølge av deres molekylvekt i referansestamme. Hvert isolat representerte en individuell MSPP-sekvens type. Selv om de oppnådde phyloproteomic forbindelser var ikke fullstendig identiske med dem som oppnås ved MLST, C. jejuni ssp. doylei isolater igjen arrangert i to subclusters. Den første subcluster ble dannet av LMG 8843, LMG 8870, og LMG 9243, den andre av LMG 9255, LMG 9143, LMG 8871 og LMG 7790. Som sett med MLST-analyse, isolere LMG7790 viste den lengste phyloproteomic avstand i MSPP- analyse.

Figur 1
Figur 1: MLST-based fylogenetisk UPGMA-treet. Balansert MLST baserte UPGMA-dendrogram konstruert fra syv C. jejuni ssp. doylei isolater og C. jejuni ssp. jejuni belastning 81-176. Strain fargekode: LMG 8843 (svart), LMG 8870 (grå), LMG 9243 (blå), LMG 9255 (turkis), LMG 9143 (grønn), og LMG 8871 (rosa), LMG 7790 (gul), og 81- 176 (hvitt). Den MLST-sekvenstype er gitt bak navnet på hvert isolat. Hver C. jejuni ssp. doylei isolere tilhører en annen MLST-sekvens type. X-aksen viser ledd avstander. Strain LMG 7790 viser lengste fylogenetisk avstand i forhold til de resterende seks isolater. Stammer LMG 8843, LMG 8870, og LMG 9243 samt LMG 9255, LMG 9143, og LMG 8871 danner to forskjellige subclusters innenfor C. jejuni ssp. doylei klynge. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Foreløpig tildeling av genomisk korrelater til C. jejuni ssp. doylei ATCC 49349 (LMG 8843) til observerte biomarkør massene. Basert på de beregnede massene (gjennomsnittlig isotoper) av predikerte ORF fra hele genomsekvens av C. jejuni ssp. doylei stamme ATCC 49349, ble biomarkør masser som er tilordnet det tilsvarende protein-kodende sekvenser. Men innenfor måleområdet, den biomarkør massene for de ribosomale subenheter L31 (MW = 7315 Da), S17 (molekylvekt = 9549 Da) og S18 (MW = 10 285 Da) samt deres de-methioninated isoformer (innfelt m / z = 7,000-7,200 Da) ikke ble entydig tilordnet. Derfor, L31, S17, og S18 ble ikke inkludert i C. jejuni ssp. doylei MSPP ordningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Spesifikke biomarkør masse toppene av C. jejuni ssp. doylei MSPP ordningen. I hvert panel massespektra av alle sju testet C. . jejuni ssp doylei isolater (fargekode som i figur 1) som svarer til de spesielle MSPP typer er blitt overlagt for å indikere biomarkør masseskift som skyldes alleliske isoformer: (A) L36 + H +; (B) L34 + H +; (C) L32-M + H +; (D +; (E) S14-M + H +; (F) L29 + H +, L28-M + H +, og L35-M + H +; (G) L24-M + H +; (H) j | 152939117 + H +; (I) L27-M + H +; (J) S20-M + H +; (K) S15-M + H +; (L) S19-M + H +; (M) en intens masse skjule variabel potensiell biomarkør toppen av ribosomalt protein S18; (N) S20-M + 2H +; (O) L15-M + 2H +; X-Akser: masse [Da] · kostnad-en-forhold, skala 200 Da. Y-akser: intensitet [vilkårlige enheter],-spektra ble individuelt justert til et sammenlignbart støynivå for bedre visualisering av lav intensitet topper. "-M" Etter navnet på en ribosomal subenheten indikerer de-methioninated isoform. Vennligst klikk here for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4:. MSPP baserte phyloproteomic UPGMA-tree avbildet phyloproteomic UPGMA-treet inneholder samme syv C. jejuni ssp. doylei isolater og C. jejuni ssp. jejuni stamme 81-176 som i figur 1. En farget flekk (fargekode som i fig 1) viser hver stamme. For bedre sammenligning isolatene er anordnet i inngangs orden, som var i størrelsesorden oppnådd fra MLST baserte treet. Aksen under dendrogram indikerer ledd avstander. Selv om de oppnådde phyloproteomic relasjoner er ikke helt identisk med fylogenetisk MLST baserte treet, er det globale bildet sammenlignbare. Befolkningen deler seg i to grupper: de tre isolerer LMG 8843, LMG 8870, og LMG 9243 danner en clusteh, mens LMG 9255, LMG 9143, LMG 8871 og LMG 7790 danner en andre klynge. Innenfor denne gruppen LMG 7790 viser den lengste phyloproteomic avstand enn den subcluster dannet av LMG 9255, LMG 9143, og LMG 8871. Innenfor denne subcluster LMG 9143 skifter stilling i forhold til LMG 9255. Men selv ved bruk av MSPP-metoden hvert isolat representerer en individuell MSSP-sekvens type. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1: Beregnet masser av alle kommenterte ORF av C. jejuni ssp. doylei ATCC 49349 belastning. Liste over alle beregnede monoisotopic molekylvekt av hvert protein kodet i C. jejuni ssp. doylei ATCC 49349 genom. Den ExPASy Bioinformatikk Resource Portal ble brukt for beregning av de spesielle molekylmasser. Kolonne B viser methioninated isoformene mens kolonne C viser de de-methioninated isoformer. Biomarkør masser som inngår i C. jejuni ssp. doylei MSPP ordningen er uthevet i rødt. Merk: biomarkør protein L36 er ikke kommentert i genomsekvens av C. jejuni ssp. doylei ATCC49349. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tabell 2:. Masse endringer indusert av aminosyre-endringer på grunn av enkelt SNP'er Alle potensielle enkelt-nukleotid polymorfismer ble sjekket for den resulterende aminosyre-utvekslingen ved hjelp av standard genetiske kode. Alle tause mutasjoner ble forkastet, og nonsynonymous mutasjoner utarbeidet sammen med resulting masseendringer. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tabell 3: Oligonukleotid-primerne anvendt for sekvensering av C. jejuni ssp. doylei gener som inngår i MSPP-ordningen Klikk her for å laste ned denne filen.

Tabell 4: Oversikt over alle isoformer som inngår i C. jejuni ssp. doylei MSPP-ordningen. Denne tabellen viser alle biomarkør ioner inkludert i C. jejuni ssp. doylei MSPP scheme. Aminosyresekvensen av referanse stamme ATCC 49349 er gitt helt. For ytterligere påvisbare isoformer, er bare bestemte aminosyresubstitusjoner oppført. Aminosyren nummerering inkluderer alltid start-metionin; hvis massespektrometri viser sitt fravær, er det skrevet i parentes (M). For hver isoform molekylvekt, til massen forskjell referere stamme ATCC 49349 isoformer og frekvens i isoform datasettet er angitt. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den mest kritiske trinnet i opprettelsen av en MSPP ordningen er utvetydig genetisk bestemmelse av biomarkør ion identiteter. Hvis det ikke er mulig å identifisere en biomarkør utvilsomt, så det bør være utelukket fra ordningen 13.

Den C. jejuni ssp. doylei Ordningen omfatter 14 ulike biomarkører ioner. Dette er fem færre enn i C. jejuni ssp. jejuni MSPP ordningen 13 sikret viktigste forskjellen mellom påvisbare C. jejuni ssp. jejuni og C. jejuni ssp. doylei biomarkører var den posttranslasjonelle fjerning av den amino-terminale metionin i tilfelle av L31 (-M) og L35 (-M) 13.

Som vist i det testede C. jejuni ssp. doylei isolere samling, MSPP var i stand til å diskriminere alle sju forskjellige MLST sekvenstyper. Dette betyr at hver testet for å isolere tilhørte en spesifikk MSPP sequhet type. I tillegg gir MSPP underarter differensiering mellom C. jejuni ssp. jejuni og C. jejuni ssp. doylei.

Generelt potensiale til å diskriminere isolater ved under-strekknivå ved MSPP er lavere sammenlignet med DNA-sekvens-baserte metoder som MLST. Forutsatt en veletablert isoform database, inndeling i undergrupper av bakterielle isolater er mye raskere og mye billigere sammenlignet med DNA-sekvenseringsmetoder 4, 13.

Den største fordelen med MSPP i forhold til hierarkiske clustering metoder for ICMS-spektra som bruker prinsipal komponent analyse (PCA) 4, 10, 28 eller UPGMA analyse av matematiske matrise som resulterer i sammenligningen av binære topp matching profiler 29, 30 er den høye iboende reproduserbarhet. Mens ulike kulturelle forhold som for eksempel ulike culture media, ulike agar avgifter, annen inkubasjon temperatur og ulike inkubasjonsperioder betydelig innvirkning på phyloproteomic relasjoner beregnet ved PCA, har de ikke påvirker MSPP utledet relasjoner 6, 13. Hovedårsaken til dette høy reproduserbarhet er uavhengigheten av peak intensitet og massespekteret kvalitet generelt 13. Hvis en MSPP relevant topp i massespektrumet av et isolat ikke kan identifiseres utvilsomt, er det nødvendig å registrere massespektrum av den enkelte isolatet på nytt.

Den MSPP Fremgangsmåten kan tilpasses i prinsippet til alle mikrobielle arter. Spesielt den inndeling i undergrupper av kliniske relevante mikrobielle arter som Clostridium difficile, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, og Salmonella ente ssp. Ente er potensielle fremtidige søknader. Hvis uttrykket av virulensfaktorer eller resistensgener korrelerer med Phyloproteomic forhold, kan MSPP bli et innovativt verktøy i rutinemessige kliniske diagnostikk. Antallet detekterbare topper og følgelig antall biomarkør ioner som inngår i MSPP ordningen potensielt kan økes ved å bruke spesifikke ekstraksjon og / eller oppløsnings protokoller, spesielt i tilfelle av sopp 31.

De nylig brukte MALDI-TOF teknikker kan i hovedsak oppdage bare de svært rike ribosomale proteiner. Disse svært rikelig proteinene interferere med nesten alle andre mindre proteiner, slik som virulens faktorer i massespektrum. Mindre proteiner kan påvises ved å koble ESI-TOF-MS (elektrospray ionisering flukttid massespektrometri) og HPLC (høyytelses væskekromatografi) 32. Foreløpig er det imidlertid denne metoden er for arbeid og kostnader krevende å karakterisere større isolere kohorter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acetonitrile Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany 34967
Autoflex III TOF/TOF 200 system Bruker Daltonics, Bremen, Germany GT02554 G201 Mass spectrometer
bacterial test standard BTS Bruker Daltonics, Bremen, Germany 604537
BioTools 3.2 SR1 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 263564 Software Package
Bruker IVD Bakterial Test Standard Bruker Daltonics, Bremen, Germany 8290190 5 tubes
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG8843 ATCC 49349;IMVS 1141;NCTC 11951;strain 093
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG9143 Goossens Z90
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG7790 ATCC 49350;CCUG 18265;Kasper 71;LMG 8219;NCTC 11847
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG9243 Goossens N130
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG8871 NCTC A603/87
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG9255 Goossens B538
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG8870 NCTC A613/87
Columbia agar base  Merck, Darmstadt, Germany 1.10455 .0500 500 g
Compass for FlexSeries 1.2 SR1 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 251419 Software Package
defibrinated sheep blood  Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Germany SR0051
ethanol Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany 02854 Fluka
formic acid Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany F0507
HCCA matrix Bruker Daltonics, Bremen, Germany 604531
Kimwipes paper tissue Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany Z188956
MALDI Biotyper 2.0 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 259935 Software Package
Mast Cryobank vials Mast Diagnostica, Reinfeld, Germany CRYO/B
MSP 96 polished steel target Bruker Daltonics, Bremen, Germany 224989
QIAamp DNA Mini Kit  Qiagen, Hilden, Germany 51304
recombinant human insulin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany I2643
trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany T6508
water, molecular biology-grade Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany W4502

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  2. Bader, O. MALDI-TOF-MS-based species identification and typing approaches in medical mycology. Proteomics. 13 (5), 788-799 (2013).
  3. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
  4. Zautner, A. E., et al. Discrimination of multilocus sequence typing-based Campylobacter jejuni subgroups by MALDI-TOF mass spectrometry. BMC Microbiol. 13, 247 (2013).
  5. Reil, M., et al. Recognition of Clostridium difficile PCR-ribotypes 001, 027 and 126/078 using an extended MALDI-TOF MS system. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 30 (11), 1431-1436 (2011).
  6. Kuhns, M., Zautner, A. E., et al. Rapid discrimination of Salmonella enterica serovar Typhi from other serovars by MALDI-TOF mass spectrometry. PLoS One. 7 (6), e40004 (2012).
  7. Wolters, M., et al. MALDI-TOF MS fingerprinting allows for discrimination of major methicillin-resistant Staphylococcus aureus lineages. Int J Med Microbiol. 301 (1), 64-68 (2011).
  8. Josten, M., et al. Analysis of the matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrum of Staphylococcus aureus identifies mutations that allow differentiation of the main clonal lineages. J Clin Microbiol. 51 (6), 1809-1817 (2013).
  9. Lu, J. J., Tsai, F. J., Ho, C. M., Liu, Y. C., Chen, C. J. Peptide biomarker discovery for identification of methicillin-resistant and vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strains by MALDI-TOF. Anal Chem. 84 (13), 5685-5692 (2012).
  10. Novais, A., et al. MALDI-TOF mass spectrometry as a tool for the discrimination of high-risk Escherichia coli clones from phylogenetic groups B2 (ST131) and D (ST69, ST405, ST393). Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2014).
  11. Matsumura, Y., et al. Detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia coli ST131 and ST405 clonal groups by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 52 (4), 1034-1040 (2014).
  12. Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF Mass Spectrometry Strain Typing during a Large Outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), e101924 (2014).
  13. Zautner, A. E., Masanta, W. O., Weig, M., Groß, U., Bader, O. Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP): A novel microbial typing Method. Scientific Reports. 5, (2015).
  14. The global view of campylobacteriosis. WHO. World Health Organisation (WHO), , Available from: http://www.who.int/foodsafety/publications/campylobacteriosis/en/ (2013).
  15. Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
  16. Zautner, A. E., et al. Seroprevalence of campylobacteriosis and relevant post-infectious sequelae. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (6), 1019-1027 (2014).
  17. Zautner, A. E., Herrmann, S., Groß, U. Campylobacter jejuni - The Search for virulence-associated factors. Archiv Fur Lebensmittelhygiene. 61 (3), 91-101 (2010).
  18. Dingle, K. E., et al. Multilocus sequence typing system for Campylobacter jejuni. J Clin Microbiol. 39 (1), 14-23 (2001).
  19. Dingle, K. E., et al. Molecular characterization of Campylobacter jejuni clones: a basis for epidemiologic investigation. Emerg Infect Dis. 8 (9), 949-955 (2002).
  20. Cody, A. J., et al. Real-time genomic epidemiological evaluation of human Campylobacter isolates by use of whole-genome multilocus sequence typing. J Clin Microbiol. 51 (8), 2526-2534 (2013).
  21. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol Biol Evol. 30 (12), 2725-2729 (2013).
  22. Jolley, K. A., Chan, M. S., Maiden, M. C. mlstdbNet - distributed multi-locus sequence typing (MLST) databases. BMC Bioinformatics. 5, 86 (2004).
  23. Verroken, A., et al. Evaluation of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry for Identification of Nocardia Species. J Clinl Microbiol. 48 (11), 4015-4021 (2010).
  24. El Khéchine, A., Couderc, C., Flaudrops, C., Raoult, D., Drancourt, M. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry Identification of Mycobacteria in Routine Clinical Practice. PLoS ONE. 6 (9), e24720 (2011).
  25. Goujon, M., et al. A new bioinformatics analysis tools framework at EMBL-EBI. Nucleic Acids Research. 38, Web Server issue 695-699 (2010).
  26. Hall, T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series. 41, 95-98 (1999).
  27. Jolley, K. A., et al. Ribosomal multilocus sequence typing: universal characterization of bacteria from domain to strain. Microbiology. 158, 1005-1015 (2012).
  28. Suarez, S., et al. Ribosomal proteins as biomarkers for bacterial identification by mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. J Microbiol Methods. 94 (3), 390-396 (2013).
  29. Teramoto, K., et al. Phylogenetic classification of Pseudomonas putida strains by MALDI-MS using ribosomal subunit proteins as biomarkers. Anal Chem. 79 (22), 8712-8719 (2007).
  30. Teramoto, K., Kitagawa, W., Sato, H., Torimura, M., Tamura, T., Tao, H. Phylogenetic analysis of Rhodococcus erythropolis based on the variation of ribosomal proteins as observed by matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry without using genome information. J Biosci Bioeng. 108 (4), 348-353 (2009).
  31. Bernhard, M., Weig, M., Zautner, A. E., Gross, U., Bader, O. Yeast on-target lysis (YOTL), a procedure for making auxiliary mass spectrum data sets for clinical routine identification of yeasts. J Clin Microbiol. 52 (12), 4163-4167 (2014).
  32. Stark, T., et al. Mass spectrometric profiling of Bacillus cereus strains and quantitation of the emetic toxin cereulide by means of stable isotope dilution analysis and HEp-2 bioassay. Anal Bioanal Chem. 405 (1), 191-201 (2012).

Tags

Genetikk MALDI-TOF under-arter differensiering phyloproteomics ICMS, MSPP mikrobiologi
inndeling i undergrupper av<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Isolater Bruke massespektrometri-baserte PhyloProteomics (MSPP)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zautner, A. E., Lugert, R., Masanta, … More

Zautner, A. E., Lugert, R., Masanta, W. O., Weig, M., Groß, U., Bader, O. Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP). J. Vis. Exp. (116), e54165, doi:10.3791/54165 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter