Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

подтипов Published: October 30, 2016 doi: 10.3791/54165
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institut für Medizinische Mikrobiologie, Universitätsmedizin Göttingen

Summary

Масс - спектрометрии на основе phyloproteomics (MSPP) использовали для типа коллекцию Campylobacter jejuni SSP. Doylei изолирует на уровне штамма по сравнению с мультилокальному ввода последовательности (MLST).

Abstract

MALDI-TOF MS дает возможность различать некоторые бактерии не только на виды и подвиды уровне, но даже ниже, на уровне штамма. Аллельные изоформы ионов детектируемых биомаркеров в результате изолят конкретных массовых сдвигов. Масс-спектрометрия на основе phyloproteomics (MSPP) представляет собой метод роман, который сочетает в себе масс-спектрометрического детектируемых биомаркеров массы в схеме, что позволяет сделать вывод о phyloproteomic отношений из изолята конкретных массовых сдвигов по сравнению с геном секвенировали эталонного штамма. Выведенные аминокислотные последовательности затем используются для расчета дендрограммы МОЗН на основе.

Здесь мы опишем рабочий процесс MSPP, набрав Campylobacter jejuni SSP. Doylei изолята коллекцию из семи штаммов. Все семь штаммов были человеческого происхождения и мультилокальному последовательность ввода (MLST) продемонстрировали свое генетическое разнообразие. МОЗН-типирование привело к семи различных типов последовательностей МОЗН, достаточно отражая их PHYlogenetic отношения.

C. jejuni подвид. doylei схема МОЗН включает в себя 14 различных ионов биомаркеров, в основном рибосомных белков в диапазоне масс от 2 до 11 кДа. МОЗН может в принципе быть адаптированы к другим методом масс-спектрометрического платформы с расширенным диапазоном масс-. Таким образом, этот метод имеет потенциал, чтобы стать полезным инструментом для измерения уровня деформации микробного набора текста.

Introduction

В течение последнего десятилетия, время пролета масс - спектрометрии матричной лазерной десорбцией ионизации (MALDI-TOF MS) выдвигала быть высоко оценен стандартным методом микробного рода и видовой идентификации в клинической микробиологии 1, 2. идентификация видов основан на регистрации небольших белковых отпечатков пальцев интактных клеток или клеточных лизатов. Типичный диапазон массы для масс-спектрометра, используемого в обычной клинической микробиологии является 2-20 кД. Кроме того, в результате чего спектры могут быть использованы для различения деформаций на ниже видов и ниже подвида уровня 3. Ранние пионерские исследования выявили специфические ионы биомаркеров для конкретной подгруппы штаммов в Campylobacter jejuni 4 Clostridium несговорчивый 5, сальмонелла энтерика подвид. enterica серовар Typhi 6, стафилококк 7 - 9, и Escherichia палочка 10 - 12.

Сочетание нескольких переменных масс биомаркеров, соответствующих аллельных изоформ дает возможность для более глубокого подтипов. Ранее мы успешно реализовали метод для преобразования этих вариаций массовых профилей в значимых и воспроизводимых phyloproteomic отношений , называемых массовых phyloproteomics основе спектрометрия (MSPP) на C. jejuni подвид. Коллекция jejuni изолят 13. МОЗН может быть использован масс-спектрометрический, эквивалентную последовательности ДНК методов подтипов, основанных как последовательности мультилокусная ввода (MLST).

Виды Campylobacter являются основной причиной бактериального гастроэнтерита во всем мире 14, 15. Как следствие Кампилобактериоз Постинфекционный осложнением, а именно, синдром Гийена - Барре, реактивный артрит и воспалительное заболевание кишечника может возникнуть 16. Основными источниками инфекции являютсязараженного мяса скота из курицы, индейки, свиней, крупного рогатого скота, овец и уток, молока и поверхностных вод 15, 17. Поэтому регулярные эпидемиологические исследования наблюдения в контексте безопасности пищевых продуктов необходимы. MLST является "золотым стандартом" в молекулярное типирование для Campylobacter видов 18. Поскольку Сангер-секвенирования на основе метода MLST является трудоемким, требует много времени и относительно дорогой, MLST набрав ограничивается относительно небольшими изолят когорты. Таким образом, существует потребность в более дешевых и быстрых методов подтипов. Эта потребность может быть выполнено с помощью методов масс-спектрометрических как MSPP.

Эта статья представляет собой подробный протокол для MSPP-ввода с помощью набора Campylobacter jejuni подвида. Doylei изоляты и сравнение его потенциал с MLST.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовьте безопасное рабочее место, рассматривая условия биобезопасности

  1. Знакомиться с лабораторными и правил техники безопасности, которые имеют отношение к работе с микроорганизмами. Большинство патогенных микроорганизмов человека должны быть обработаны на уровне биологической безопасности 2 условия , но некоторые, такие как сальмонелла энтерика серовара Typhi, требуют уровень биологической безопасности 3. Информация об уровне обработки каждого патогена могут быть доступны на www.cdc.gov/biosafety~~pobj.
  2. Независимо от биологической опасности классификации конкретного микроорганизма, рассматривать все материалы, которые вступали в контакт с инфекционным агентом, так как инфекционные отходы, которые должны быть автоклавного перед их утилизацией. Уважайте региональные правила техники безопасности для опасных материалов и биологических веществ. Убедитесь в том, что подходящие контейнеры для немедленного и надлежащего удаления потенциально загрязненных материалов (биологических опасностей) доступны.
  3. Убедитесь в том, что стерильные инструменты (прививочные петли), растворы и питательные среды (Чашки с агаром) доступны перед началом бактериальной культуры.
  4. Мойте руки с антисептическим мылом и теплой водой сразу после работы с инфекционными микроорганизмами.

2. Выберите Reference и Коллекция изолятов

  1. Выбрать и получить один стандартный референсный геном-секвенировали выделения наряду с последовательностями кодированного протеома, в идеале в формате FASTA. Если несколько штаммов геном-секвенирован доступны, включают их в анализе.
    Примечание: Эта изолят / эти изоляты будут в дальнейшем использоваться для прогнозирования идентичности масс-пиков, наблюдаемых в масс-спектрометрии (смотри раздел 7).
  2. Выбрать и получить различные потенциально разнообразных изолятов таким образом, чтобы они покрывали филогении видов или подвидов интерес.
    Примечание: Эти изоляты будут в дальнейшем использоваться для демонстрации изменчивости биомаркеров в популяции (см раздел 8).
  3. Убедитесь в том, что вся коллекция и ссылка изолят (ы) проPerly набран соответствующим золотым стандартом для данного конкретного организма 18 - 20.
    Примечание: Это может включать в себя множество (суб) методов -typing, но, скорее всего, прибегают к MLST, который до сих пор является стандартным способом, чтобы продемонстрировать генетическое разнообразие большинства видов микроорганизмов.
  4. Для того, чтобы сделать вывод о филогении в пределах коллекции, вычислить phylogram из данных , набрав, например, с помощью метода невзвешенное пара группы с среднеарифметического (UPGMA) в MEGA6 программного обеспечения для данных MLST 21. Для получения данных MLST, а также обратиться к базе данных MLST и назначить типы последовательностей и соответствующих клоновых комплексов 22.
    Примечание: Это будет в дальнейшем использоваться для анализа конгруэнтности MSPP с помощью метода стандартных тренажерах ранее золота (смотри раздел 9).

3. Подготовить MALDI визирную пластину

ВНИМАНИЕ: ТФК является сильной кислотой. Неправильное использование ТФК несет риск тяжелых ожогов кожи, повреждения глаз и сильное раздражение Oе верхних дыхательных путей при вдыхании. Поэтому строгие меры безопасности должны соблюдаться и надлежащего средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая защитные очки, щитки, соответствующие перчатки, ботинки, или даже полный защитный костюм необходим, при обращении с ТФК. Возможное воздействие ТФК должно контролироваться путем обработки вещества при адекватной вентиляции с эффективной системой вытяжной вентиляции. В случае недостаточной вентиляции необходимо использовать респиратор с одобренным фильтром. Кроме того, ТФК является вредным для водных организмов с долгосрочными последствиями. Любой выпуск ТФК в сточных водах в окружающую среду следует избегать.

Примечание: Перед тем как пятнистость образцы на MALDI в мишень, очистить мишень тщательно, если пластина была использована ранее.

  1. Приготовьте 100 мл 70% -ного водного раствора этанола с использованием 30 мл деионизированной воды и 70 мл чистого этанола.
  2. Подготовьте 250 мкл 80% -ного водного раствора трифторуксусной кислоты в растворе (ТФК), путем смешивания 50мкл деионизованной воды и 200 мкл 100% ТФУ в реакционной трубе и встряхивая пробирку в течение 1 мин.
  3. Почистите MALDI мишень, поместив его в стеклянную посуду и погружением его в 70% водном растворе этанола в течение приблизительно 5 мин при комнатной температуре.
  4. Ополосните цель под горячей водой.
  5. С помощью бумажной салфетки, вытирать визирной интенсивно с 70% -ным водным раствором этанола, чтобы удалить все предыдущие образцы и другие потенциальные мусора.
  6. Если требуется дополнительная очистка, промыть под струей горячей воды в то время как вытирая бумажной салфеткой.
  7. Удалите остатки и потенциально невидимые, загрязняющие вещества, покрывая поверхность мишени тонким слоем 80% -ным водным раствором TFA (~ 100 мкл на 96 мест) и обтирать все целевые позиции чистой бумажной салфеткой.
  8. Наконец, промойте цель, чтобы удалить кислоту, вытереть насухо бумажной салфеткой, и оставьте его в течение по крайней мере 15 мин при комнатной температуре для испарения остаточной жидкости.

4. Получение45; Циано-4-гидрокси-коричной кислоты Матричный раствор, содержащий внутренний калибрующего

  1. Приготовьте насыщенный раствор матрицы путем растворения 10 мг альфа-циано-4-гидрокси-коричной кислоты (HCCA) в 1 мл смеси 50% ацетонитрила, 47,5% воды и 2,5% TFA. Остаточный нерастворенный HCCA останется, если раствор насыщен.
  2. Добавить рекомбинантный человеческий инсулин как внутренний калибрующего. Для этого, подготовить маточного раствора до конечной концентрации 10 пг / мкл в 50% -ном водном ацетонитриле, аликвоты и хранят при -20 ° C для дальнейшего использования.

5. MALDI-TOF масс-спектрометрии

Примечание: необходимо использовать условия культивирования специфических для организмов, представляющих интерес. Образцы для MALDI-TOF MS могут быть получены либо путем подготовки мазка или экстракции, в зависимости от организма (смотри раздел 8.4.1). В то время как способ экстракции кислоты этанол-муравьиной обеспечивает достаточную дезактивацию болезнетворных микроорганизмов, препарат мазок должен быть выполнен в соответствии с Suffциент условия биобезопасности по мере необходимости (смотри главу 1). Как правило, нет никакого риска инфекции после применения матрицы, но для конкретных патогенов необходимы специальные протоколы инактивацию. Так, например , MALDI-TOF MS видов Nocardia требует предварительного лизис бактерий в кипящей воде, последующим осаждением этанолом белков 23. EI Khéchine и др. разработана процедура инактивации микобактерий, нагревая колонии бактерий при температуре 95 ° С в течение 1 ч в завинчивающейся крышкой пробирки , содержащие воду и 0,5% Tween 20 24.

  1. Мазок Подготовка
    1. Распространение Pinhead размера количество бактериальной колонии непосредственно на положении пластины MALDI мишени ( «спот»).
    2. Перекрытие каждого пятна с 1 мкл ГКЦА регулярной матрицы или матрицы, содержащей внутреннюю калибрующего и оставляют кристаллизоваться при комнатной температуре. Для определения точной массы пика калибровки, наложения управления зрВЗ с 1 мкл Test Standard и 1 мкл матрицы ГКЦА, содержащей внутреннюю калибрующего.
      Примечание: Здесь, как Test Standard экстракт кишечной палочки DH5 альфа используется , что демонстрирует характерный белок отпечатка пальца в MALDI-TOF MS. Он шипами его с двумя белками, которые расширяют верхний предел обнаруживаемого диапазона масс.
  2. Добыча Метод
    1. Урожай приблизительно пять колоний из агаровой пластины культуры с петлей модифицирования и тщательно приостановить в 300 мкл дважды дистиллированной воды в 1,5 мл реакционной трубки. Добавить 900 мкл абсолютного этанола и тщательно перемешать повторным пипетированием, пока бактериальные колонии не будут полностью приостановлены.
      Примечание: На этом этапе можно и хорошо установлено для хранения образцов при -20 ° С. Кроме того, инактивация патогенных микроорганизмов может быть проверена путем полосатость 1-10 мкл экстракта на подходящую агаром после инкубации при оптимальных условиях роста. Успешный вАктивация обозначается отсутствие роста микробов.
    2. Центрифуга образца при 13000 х г в течение 1 мин, отбросить супернатант, и высушить осадок при комнатной температуре в течение 10 минут. Ресуспендируют осадок тщательно с помощью пипетки вверх и вниз в 50 мкл 70% -ной муравьиной кислоты.
    3. Добавить 50 мкл ацетонитрила и перемешивают. Удалите мусор с помощью центрифугирования при 13000 х г в течение 2 мин. Передача 1 мкл супернатанта на позиции образца на MALDI мишени пластины и оставить сохнуть в течение 5 мин при комнатной температуре.
    4. Перекрытие каждого пятна с 1 мкл матрицы ГКЦА, содержащей внутреннюю калибрующего и оставляют кристаллизоваться при комнатной температуре.
  3. Запись масс-спектров
    Примечание: Пик-выбирая из масс-спектров производится с использованием стандартных процедур рекомендуется (Centroid алгоритм; Отношение сигнал / шум:. 2; относительна интенсивность Порог: 2%; ширина пика 3 м / г, базовый вычитание: TopHat)
    1. Откалибровать прибор согласно protoc фабрикантовол.
    2. Для каждого пятна, собрать 600 спектров в 100 выстрелов шагов.
      1. Перейдите на вкладку "AutoXecute" конфигурации программного обеспечения масс-спектрометра. Откройте "метод" левой кнопкой мыши на кнопке "метод" и выбор метода , например, "MBT_AutoX" из выпадающего меню.
      2. Щелкните левой кнопкой мыши на кнопку "Редактировать ..." справа от меню "метод", чтобы открыть "AutoXecute Method Editor". Перейдите на вкладку "Накопительный". Установите "SUM UP" значение "600" и "удовлетворительные снимки в" _X_ "Ступени выстрел" значение "100".
  4. Внутренний Spectrum Процедура калибровки
    Примечание: ошибки измерения минуту присущи масс-спектрометрии. В зависимости от периодического использования прибора, температуры прибора и повторной калибровки, полученные значения измерений могут отличаться между экспериментами. После предварительной калибровки прибора измерения и после калибровочного измерения спектра к внутреннему калибрующего является наиболее точным способом обеспечения сопоставимости между спектра.
    1. Выполните следующие действия для каждой калибровки списка пиков:
      1. Запустить браузер спектра (например, flexAnalysis и открытый спектр:. Меню "Файл" → "Открыть ...")
      2. Создание списка контроля массы с пиком калибрующего: меню "Метод" → "Open ...".
      3. Выберите метод: MBT_Standard.FAMSMethod → ​​"Открыть".
      4. Edit List Mass Control: Снимите все Calibrants.
      5. Добавить пик калибрующего в нижней части: Пик этикетки: "Insulin_HIStag [M + H] + _ ср"; m_z: "5808,29"; Допуск [м.д.]: "50"; Проверьте калибрующего флажок.
      6. Сохранить как, например, "MSPP список калибрующего".
    2. Для каждого спектра, выберите калибрующего пик из списка, нажмите кнопку "Автоматическое Assign" и нажмите "Ok".
ove_title "> 6. Проверьте процедуру внутренней калибровки

  1. Экспериментально определить точное значение массы калибровочного пика.
    1. Подготовьте два пятна с 1 мкл Test Standard каждый (этап 5.1.1). Перекрытие сначала с 1 мкл регулярной матрицы HCCA, второй с 1 мкл калибрующего-матрицы с шипами.
    2. Получение масс-спектров от каждого пятна (раздел 5.3), и внутренне откалибровать к пикам Стандарт испытаний (раздел 5.4).
    3. Перекрытие обоих спектров, открыв их с браузером спектра (например, flexAnalysis и открытый спектр: меню "Файл" → "Открыть ...") и нахождение пика при ожидаемой массе (инсулин м / г = 5,808.29), которые должны присутствовать в калибрующего-спектр с шипами, но не в спектре, полученном с обычной матрицей.
  2. Убедитесь, что калибрующего Пик не закрывала любым другим биомаркером Организме интересов.
    1. Приготовьте два пятна (раздел 5.1) с опорным напряжением и Овеrlay сначала с 1 мкл регулярной матрицы, второй с 1 мкл калибрующего-матрицы с шипами.
    2. Приобретать масс - спектры с обеих точек (раздел 5.3) и наложения полученных спектров, открыв их с браузером спектра (например, flexAnalysis и открытый спектр: меню "Файл" → "Открыть ..."). Убедитесь в том, что пик калибрующего отчетливо виден в спектре, полученном с игольчатым матрицей и не загораживали другим смежным сигналом. Если это не так, то выбрать другой калибрующего для данного конкретного организма.
      Примечание: Использование пичковый внутреннего калибрующего значительно повышает точность для определения вариаций биомаркеров масс. С помощью этого метода, расщепление масс вплоть до 1 Da может быть обнаружен. В качестве альтернативы, также инвариантные массы, происходящие из организмов, могут быть использованы в качестве calibrants. Тем не менее, по определению, весь организм полученные массы должны рассматриваться как потенциально переменной, если не доказано иное.

  1. Измерьте масс-спектр эталонного штамма, с помощью матрицы подсыпали внутреннего калибрующего.
    1. Распространение Pinhead размера количество бактериальной колонии (раздел 5.1) или 1 мкл бактериального экстракта белка (раздел 5.2) непосредственно на позицию пластины MALDI мишени ( «спот»).
    2. Перекрытие каждого пятна с 1 мкл матрицы ГКЦА, содержащей внутреннюю калибрующего и оставить целевую пластину кристаллизоваться при комнатной температуре (раздел 5.1.2 / 5.2.4).
    3. Запись масс-спектры опорного напряжения (раздел 5.3).
  2. Внутренне калибровки эталонного спектра к калибрующего массы (здесь: инсулин при т / г = 5,806.29), а затем предварительно процесс в зависимости от исходного вычитания (TopHat) и сглаживания (параметры: SavitzkyGolay, ширина: 2 м / г, 10 циклов).
    1. Запустите браузер спектра (например, flexAnalysis и открытый спектр: меню "Файл" → "Открыть ...; ").
    2. Выберите метод: ниспадающее меню "Метод" → "Открыть ...", щелкните левой кнопкой мыши метод выбора, например, "MBT_Standard.FAMSMethod" → "Открыть".
    3. Калибровка спектра, выбрав "Внутренний ..." из выпадающего меню "Калибровка". Откроется окно списка пик калибрующего (ы) (раздел 5.4). Щелкните левой кнопкой мыши на пик калибрующего (инсулин) → Щелчок левой кнопкой мыши "OK". Выберите "спектры Process" из выпадающего меню "Process".
    4. Для базового вычитания активации спектра в списке спектра на правой стороне. Выберите "Отнимите Масс-спектр Базовый уровень" из выпадающего меню "Process".
    5. Для сглаживания спектра, активировать спектр в списке спектра на правой стороне. Выберите "Smooth Масс-спектр Базовый уровень" из выпадающего меню "Process".
  3. Из секвенирование генома данных эталонного штамма, вычислить theoreticaл одноизотопные молекулярный вес каждого из кодируемых белков, переводя последовательность ДНК в соответствующей аминокислотной последовательности с помощью редактора выравнивания последовательностей. Скопируйте и вставьте эту последовательность белка в поле ввода на портале ExPASy биоинформатики ресурсов (http://web.expasy.org/compute_pi/~~HEAD=pobj). и нажмите кнопку "Нажмите здесь", чтобы вычислить Pí / Mw. В случае С. jejuni подвид. doylei вычислить массу 14 детектируемых биомаркеров.
  4. Скопировать результаты в таблицу, с одной колонке, содержащей идентификатор гена и следующего молекулярного веса. Сортировка строк по вычисленной молекулярной массы с целью облегчения поиска в масс. Примечание: Другие столбцы не являются обязательными; функциональная аннотация может быть особенно полезным в дальнейшем для интерпретации.
  5. Вставьте второй столбец в таблицу для молекулярного веса де-methioninated форме, путем вычитания 135 Da из моноизотопном молекулярной массы. Примечание: Это происходит потому, что некоторые белки претерпевают посттрансляционной модификации путем протеолитического удаления терминальный метионин N.
  6. Назначают каждого основного измеренное биомаркеров массы к расчетным массам от эталонного штамма путем поиска измеренной массы из таблицы генома , полученного выше (таблица 1).
  7. Если ионы биомаркеров не могут быть отнесены к прогнозируемым генных продуктов, рассмотреть другие посттрансляционные модификации (метилирование, ацетилирование, пренилирование и т.д., см http://www.abrf.org/delta-mass для компиляции модификаций и связанных с ней массовых изменений ). Для любого другого известного посттрансляционной модификации, которая часто наблюдается в организмах интерес добавить еще один столбец в таблицу и пересчитывать молекулярный вес, аналогичный способу де-methioninated форме.
  8. Настройка на другую вкладку с электронными таблицами, а также запись для каждого биомаркера ионов массы и идентификатора в отдельном столбце таблицы.

8. Оценка биомаркером Изменчивостьв популяции

  1. Откалибруйте масс-спектры, полученные из коллекции штаммов, как это было сделано для эталонного штамма (ов) (раздел 5.4.2).
  2. Определение вариантных биомаркеров в масс-спектрах. Вариантом масса характеризуется отсутствием массы, известной из эталонного спектра и появления новой массы не присутствует в ссылке. Разность масс должна соответствовать одному обмена аминокислот (таблица 2), или их комбинации.
  3. На одном из изолята на строку, записывать измеренные массы для каждого биомаркера и предсказанным изоформы в соответствующих столбцах таблицы.
    Примечание: В редких случаях , некоторые массовые сдвиги могут быть связаны с несколькими различными биржами аминокислот, например, как, N обмениваются D и Q обмениваются E, и наоборот, приводят к массовому смещению 0,985 Da (таблица 2). Эта внутренняя проблема не может быть решена с помощью масс-спектрометрии в одиночку. Таким образом, различные изоформы на уровне последовательности белка, имеющего ту же массудолжны рассматриваться в качестве одного типа MSPP. Параллельный Sanger секвенирование определенных генов ионных биомаркеров подтвердили , что эта проблема не произошло в то время как МОЗН-набрав C. jejuni подвид. doylei изолировать коллекцию , используемую в данном исследовании.
  4. Подтвердите новые типы МОЗН с помощью ПЦР-амплификации и секвенирования соответствующих генов биомаркеров. В свою очередь, это также служит подтверждением того, что личность биомаркером было правильно настроено.
    1. Культура бактериальных изолятов при оптимальных условиях роста. Культура C. jejuni SSP. doylei штаммы на Колумбийский агар с добавлением 5% овечьей крови при 37 ° С в условиях микроаэрофилии (5% O 2, 10% СО 2, 85% N 2). Выдержите в течение ок 48 ч. Используйте отдельный агаризованной для каждого изолята, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
    2. Извлечение геномной ДНК из бактериальных изолятов с использованием соответствующего набора для экстракции ДНК / автоматизированное оборудование в соответствии с инструкциями изготовителя.
      3. <LI> Amplify соответствующие гены биомаркеров с использованием праймеров , перечисленных в таблице 3 Выполните все реакции ПЦР при следующих условиях:. денатурации при 94 ° С в течение 30 секунд; отжиг при 55 ° С в течение 30 сек; Относительное удлинение при 72 ° С в течение 30 сек.
    3. Определение последовательности ДНК каждого ампликона Сангером секвенирования с использованием соответствующего количества геномной ДНК (обычно 600-700 нг ДНК достаточна при концентрации около 100 нг / мкл) и один из праймеров для амплификации (как правило, это делается использование поставщика услуг).
  5. В отдельной таблице (см таблицу 4), записать выведенная последовательность белка для каждого нового изоформы с помощью соответствующего инструмента перевода (например, Transseq: http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/~~HEAD=dobj) 25.

9. Вычислить филогению МОЗН основе и сравнения с золотого стандарта

  1. Соединить конкретные последовательности биомаркером аминокислот, принадлежащих к ттипа он МОЗН изолятов в одну непрерывную последовательность с использованием редактора выравнивания последовательностей, таких как BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html~~HEAD=pobj) 26 или биомаркеров таблицы.
  2. Вычислить филогению путем кластеризации , как это сделано для золотого стандарта типов данных, например, UPGMA кластеризация 21.
  3. Сравните филогению МОЗН основе к полученному с золотым стандартом 4, 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ранее мы успешно установили схему MSPP для C. jejuni подвид. jejuni 13. Здесь мы стремились распространить метод на родственный подвида C. jejuni подвид. doylei. В этой конкретной обстановке, семь С. jejuni подвид. doylei изоляты были приобретены у бельгийской коллекции микроорганизмов / Лаборатория микробиологии UGent BCCM / LMG Генте, Бельгия. Все семь изолятов, используемые для нашего анализа были человеческого происхождения. Геном-секвенировали штамм АТСС 49349 (LMG 8843), первоначально выделенный из фекалий 2-летнего австралийского ребенка с диареей служил в качестве ссылки. Из коллекции, шесть дополнительных штаммов были доступны: LMG 9143, LMG 9243 и LMG 9255 изолирован от фекалий детей, страдающих диареей и проживающих в Брюсселе, Бельгия; LMG 7790 (АТСС 49350), выделенный из образца биопсии желудка индивидуума из Германии; и LMG 8870 (НКТЦ A613 / 87), а также LMG 8871 (НКТЦ A603 / 87), оба выделенных из различных образцов крови, взятых из южноафриканских детей.

Все C. jejuni SSP. doylei изоляты хранили при -80 ° С , поскольку запасы Cryobank, свеже размороженных для каждого анализа и культивируемых с использованием агар база Columbia с добавлением 5% овечьей крови , и инкубации в течение 48 ч при 37 ° С в условиях микроаэрофилии (5% O 2, 10% СО 2, 85% N 2).

В отличие от создания техники MSPP для C. jejuni подвид. jejuni 13 не удалось основать метод на базе изоформы , полученной из большого собрания последовательности. Только один C. jejuni подвид. doylei запись была сделана в базе данных rMLST, и это соответствует эталонного штамма C. jejuni подвид. doylei АТСС 49349 27. Таким образом, каждый из биоМаркер сдвиг массы обнаружен в сравнении с напрягать C. jejuni подвид. doylei ATCC 49349 была новая запись в базе данных изоформ и должна быть подтверждена Sanger секвенирования.

Для анализа разнообразие полученной С. jejuni подвид. doylei изоляты, MLST проводили и MLST основе UPGMA-дендрограммы включая семь исследовали С. jejuni подвид. doylei изоляты и C. jejuni подвид. jejuni штамм 81-176 в качестве внешней группы вычисляется (Рисунок 1). Каждый C. jejuni подвид. doylei изолят принадлежал к другому типу MLST последовательности, попадая в двух подкластеров. Штамм LMG7790 имел самый длинный филогенетическое расстояние по сравнению с оставшейся C. jejuni подвид. doylei изоляты.

Записываемый справочник масс - спектр MALDI-TOF С. jejuni подвид. doylei (рис 2).

В коллекции, различные изоформы были обнаружены для L32-M, L33, гипотетического белка , кодируемого ГИ | 152939117, S20-M, и S15-M (рисунок 3). Остальные массы , присвоенные ионов биомаркеров были неизменными в тестируемом C. jejuni подвид. doylei изоляты. Замещение аминокислоты , соответствующей массе сдвигов были идентифицированы с помощью ПЦР-амплификации и Sanger последовательности конкретного гена с использованием праймеров , перечисленных в таблице 3. В таблице 4 приведены аминокислотные последовательности всех ионов биомаркеров включены в схему MSPP, а также обнаруженные аллельных изоформ.

МОЗН основе phyloproteomic UPGMA-дерево (рис 4) была рассчитана на то же семь C. jejuni подвид. doylei изоляты и C. jejuni подвид. jejuni штамм 81-176 как аутгруппе с использованием каскадных аминокислотные последовательности всех ионов 14 биомаркеров в порядке их молекулярного веса в эталонного штамма. Каждый изолят представляет собой индивидуальный тип МОЗН-последовательности. Хотя полученные phyloproteomic отношения не были полностью идентичны с теми , полученными MLST, на C. jejuni подвид. doylei изолятов снова расположены в двух подкластеров. Первый подкластер был сформирован LMG 8843, LMG 8870 и LMG 9243, второй по LMG 9255, LMG 9143, LMG 8871 и LMG 7790. Как видно с MLST-анализа, выделения LMG7790 показал самый длинный phyloproteomic расстояние в MSPP- анализ.

Рисунок 1
Рисунок 1: MLST-баСЕПГ филогенетическое дерево UPGMA. Balanced MLST основе UPGMA-дендрограммы построены из семи С. jejuni подвид. doylei изоляты и C. jejuni подвид. jejuni штамм 81-176. Штамм Цветовой код: LMG 8843 (черный), LMG 8870 (серый), LMG 9243 (синий), LMG 9255 (бирюзовый), LMG 9143 (зеленый), и LMG 8871 (розовый), LMG 7790 (желтый), и 81- 176 (белый). Тип MLST-последовательность задается за именем каждого изолята. Каждый C. jejuni подвид. doylei изолируют принадлежит к другому типу MLST последовательности. Ось Х указывает на рычажной расстояния. Штамм LMG 7790 показывает самую длинную филогенетическое расстояние по сравнению с остальными шестью изолятов. Штаммы LMG 8843, LMG 8870 и LMG 9243, а также LMG 9255, LMG 9143 и LMG 8871 образуют два различных подкластеров внутри C. jejuni подвид. doylei кластера. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Ориентировочное назначение геномных коррелятах C. jejuni подвид. doylei АТСС 49349 (LMG 8843) для наблюдаемых биомаркеров масс. , на основе вычисленной массы (средний изотопный состав) прогнозируемых ORF , из всей последовательности генома C. jejuni подвид. doylei штамм АТСС 49349, биомаркеров массы были отнесены к соответствующим кодирующей белок последовательности. Тем не менее, в пределах диапазона измерений, биомаркера массы к субъединицами рибосом L31 (MW = 7315 Да), S17 (ММ = 9549 Да) и S18 (MW = 10285 Да), а также их де-methioninated изоформы (врезке м / г = 7,000-7,200 Да) не может быть однозначно присвоен. Поэтому, L31, S17, и S18 , не были включены в C. jejuni подвид. doylei схему MSPP. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Конкретные биомаркером массовые пики C. jejuni подвид. doylei схему MSPP. В каждой панели масс - спектры всех семи испытания C. . jejuni подвид doylei изоляты (код цвета , как на рисунке 1) , соответствующие конкретным типам МОЗН были наложены , чтобы указать биомаркером массовые сдвиги вследствие аллельных изоформ: (A) L36 + H +; (В) L34 + Н +; (С) L32-М + Н +; (D +; (Е) S14-М + Н +; (F) , L29 + Н +, L28-М + Н +, и L35-М + Н +; (G) , L24-М + Н +; (H) ГИ | 152939117 + H +; (I) , L27-М + Н +; (J) , S20-М + Н +; (K) , S15-М + Н +; (L) , S19-М + Н +; (М) интенсивная масса заслоняя переменный потенциал пика биомаркером рибосомного белка S18; (N) , S20-М + 2H +; (O) L15-M + 2H +; X-оси: масса [Да] · заряд-1 соотношение, масштаб 200 Da. Y-оси: интенсивность [произвольных единицах], спектры были настроены индивидуально к сопоставимому уровню шума для лучшей визуализации пиков малой интенсивности. "-М" После того, как имя рибосомной субъединицы указывает де-methioninated изоформы. Пожалуйста , нажмите еее, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рис . 4: МОЗН основе phyloproteomic UPGMA дерево Изображенный phyloproteomic UPGMA дерево включает в себя тот же семь C. jejuni подвид. doylei изоляты и C. jejuni подвид. jejuni штамм 81-176 , как на рисунке 1. Цветным пятно (код цвета , как на рисунке 1) указывает на каждый штамм. Для лучшего сравнения изоляты расположены в порядке ввода, который был получен заказ из дерева MLST основе. Ось ниже дендрограммы указывает на рычажной расстояния. Хотя полученные phyloproteomic отношения не полностью идентичны филогенетического MLST на основе дерева, глобальная картина сравнима. Население делится на две группы: три изолирует LMG 8843, LMG 8870 и LMG 9243 образуют один Clustэ-э, в то время как LMG 9255, LMG 9143, LMG 8871 и LMG 7790 образуют второй кластер. В рамках этого кластера LMG 7790 показывает самый длинный phyloproteomic расстояние по сравнению с субкластер образованной LMG 9255, LMG 9143 и LMG 8871. В этом подкластер LMG 9143 переключает позицию по отношению к LMG 9255. Тем не менее, даже при использовании MSPP-метод каждого изолята представляет индивидуальный тип MSSP-последовательность. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1: Расчетные массы всех аннотированных ORF , в С. jejuni подвид. doylei ATCC 49349 штамма. Список всех рассчитанных моноизотопных молекулярных масс каждого белка , закодированных в C. jejuni подвид. doylei ATCC 49349 генома. ExPASy биоинформатики ресурсов Портал был использован для расчета конкретных молекулярных масс. Колонка В список methioninated изоформ, тогда как столбец С списке, то де-methioninated изоформ. Биомаркеров массы включены в C. jejuni подвид. doylei схема МОЗН выделены красным цветом. Примечание: биомаркером белок L36 не аннотированный в последовательности генома C. jejuni подвид. doylei ATCC49349. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

Таблица 2:. Массовые изменения , вызванные изменениями аминокислот из оди- ОНП все потенциальные полиморфизмы единичные нуклеотидные были проверены на предмет полученного обмена аминокислоты с использованием стандартного генетического кода. Все молчащие мутации были отброшены, и несинонимичными мутации скомпилирован вместе с RESUlting изменения массы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

Таблица 3: олигонуклеотидные праймеры , используемые для секвенирования C. jejuni подвид. doylei гены , включенные в MSPP-схеме Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

Таблица 4: Обзор всех изоформ , включенных в C. jejuni подвид. doylei MSPP-схемы. В этой таблице перечислены все ионы биомаркеров включены в C. jejuni подвид. doylei MSPP подкожногема. Последовательность аминокислот эталонного штамма АТСС 49349 дается полностью. Для получения более выявляемых изоформ, только специфические аминокислотные замены перечислены. Нумерация аминокислот всегда включает в себя запуск метионин; если масс-спектрометрии указывает на его отсутствие, написано в скобках (M). Для каждой изоформы молекулярной массы, разность масс для эталонного штамма ATCC 49349 изоформы и частоту в пределах изоформы набора данных указывается. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Самым важным шагом в создании схемы MSPP является однозначная генетическая определение биомаркеров ионных идентичностей. Если это не представляется возможным идентифицировать биомаркеров , несомненно, то его следует исключить из схемы 13.

C. jejuni подвид. doylei схема включает в себя 14 различных ионов биомаркеров. Эти 5 меньше по сравнению с C. jejuni подвид. Схема jejuni МОЗН 13 .Наиболее существенная разница между выявляемой C. jejuni подвид. jejuni и C. jejuni SSP. doylei биомаркеров был посттрансляционная Удаление амино-концевого метионина в случае L31 (-m) и L35 (-m) 13.

Как показано на тестируемой C. jejuni подвид. doylei изолировать коллекцию, МОЗН был в состоянии различить все семь различных типов последовательностей MLST. Это означает, что каждый изолят испытания принадлежал к определенному MSPP sequтип ENCE. Кроме того, МОЗН позволяет подвид дифференциацию между C. jejuni подвид. jejuni и C. jejuni подвид. doylei.

В общем, потенциал для различения изолятов на уровне ниже штамма MSPP ниже, по сравнению с методами на основе последовательности ДНК, как MLST. Предполагая , хорошо изученного базу данных изоформ, то подтипы бактериальных изолятов гораздо быстрее и гораздо дешевле по сравнению с методами секвенирования ДНК 4, 13.

Самое большое преимущество MSPP по сравнению с иерархическими методами кластеризации ICMS-спектров , таких как с использованием анализа главных компонент (PCA) 4, 10, 28 или анализа UPGMA математической матрицы , что результаты сравнения бинарного пика совпадения профилей 29, 30 является его высокая внутренняя воспроизводимости. В то время как различные культурные условия, такие как иной КУЛЬТУРАэлектронные средства массовой информации, различные агара заряды, разные температуры инкубации, а также различные инкубационные периоды оказывают существенное влияние на phyloproteomic отношения , рассчитанные PCA, они не влияют на МОЗН выведенные отношения 6, 13. Основной причиной такой высокой воспроизводимости является независимость интенсивности пика и масс - спектра качества в целом 13. Если МОЗН отношение пика в спектре масс изолята не может быть идентифицирован, несомненно, необходимо записать масс-спектр индивидуального изолята снова.

Метод МОЗН может быть адаптирован, в принципе, к каждому микробных видов. В частности, подтипы клинических соответствующих видов микроорганизмов , таких как Clostridium несговорчивый, кишечная палочка, стафилококк и сальмонелла энтерика SSP. Enterica являются потенциальные будущие приложения. Если выражение вирулентных факторов или генов резистентности коррелирует с Phyloproteomic отношения, МОЗН может стать инновационным инструментом в рутинной клинической диагностике. Число обнаруживаемыми пиками и тем самым число ионов биомаркеров , включенных в схему MSPP потенциально может быть увеличена за счет использования специфической экстракции и / или протоколов лизиса, особенно в случае грибов 31.

Недавно используемые методы MALDI-TOF могут в основном только обнаружить весьма обильные рибосомных белков. Эти чрезвычайно обильные белки мешают почти во всех других небольших белков, таких как факторы вирулентности в масс-спектре. Более мелкие белки могут быть обнаружены с помощью ссылки ESI-TOF-MS (электрораспыление времени ионизация полета масс - спектрометрии) и ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) 32. Тем не менее, в настоящее время этот метод является слишком трудовых и временных затрат, чтобы охарактеризовать крупные изолят когорты.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acetonitrile Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany 34967
Autoflex III TOF/TOF 200 system Bruker Daltonics, Bremen, Germany GT02554 G201 Mass spectrometer
bacterial test standard BTS Bruker Daltonics, Bremen, Germany 604537
BioTools 3.2 SR1 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 263564 Software Package
Bruker IVD Bakterial Test Standard Bruker Daltonics, Bremen, Germany 8290190 5 tubes
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG8843 ATCC 49349;IMVS 1141;NCTC 11951;strain 093
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG9143 Goossens Z90
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG7790 ATCC 49350;CCUG 18265;Kasper 71;LMG 8219;NCTC 11847
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG9243 Goossens N130
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG8871 NCTC A603/87
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG9255 Goossens B538
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG8870 NCTC A613/87
Columbia agar base  Merck, Darmstadt, Germany 1.10455 .0500 500 g
Compass for FlexSeries 1.2 SR1 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 251419 Software Package
defibrinated sheep blood  Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Germany SR0051
ethanol Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany 02854 Fluka
formic acid Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany F0507
HCCA matrix Bruker Daltonics, Bremen, Germany 604531
Kimwipes paper tissue Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany Z188956
MALDI Biotyper 2.0 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 259935 Software Package
Mast Cryobank vials Mast Diagnostica, Reinfeld, Germany CRYO/B
MSP 96 polished steel target Bruker Daltonics, Bremen, Germany 224989
QIAamp DNA Mini Kit  Qiagen, Hilden, Germany 51304
recombinant human insulin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany I2643
trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany T6508
water, molecular biology-grade Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany W4502

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  2. Bader, O. MALDI-TOF-MS-based species identification and typing approaches in medical mycology. Proteomics. 13 (5), 788-799 (2013).
  3. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
  4. Zautner, A. E., et al. Discrimination of multilocus sequence typing-based Campylobacter jejuni subgroups by MALDI-TOF mass spectrometry. BMC Microbiol. 13, 247 (2013).
  5. Reil, M., et al. Recognition of Clostridium difficile PCR-ribotypes 001, 027 and 126/078 using an extended MALDI-TOF MS system. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 30 (11), 1431-1436 (2011).
  6. Kuhns, M., Zautner, A. E., et al. Rapid discrimination of Salmonella enterica serovar Typhi from other serovars by MALDI-TOF mass spectrometry. PLoS One. 7 (6), e40004 (2012).
  7. Wolters, M., et al. MALDI-TOF MS fingerprinting allows for discrimination of major methicillin-resistant Staphylococcus aureus lineages. Int J Med Microbiol. 301 (1), 64-68 (2011).
  8. Josten, M., et al. Analysis of the matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrum of Staphylococcus aureus identifies mutations that allow differentiation of the main clonal lineages. J Clin Microbiol. 51 (6), 1809-1817 (2013).
  9. Lu, J. J., Tsai, F. J., Ho, C. M., Liu, Y. C., Chen, C. J. Peptide biomarker discovery for identification of methicillin-resistant and vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strains by MALDI-TOF. Anal Chem. 84 (13), 5685-5692 (2012).
  10. Novais, A., et al. MALDI-TOF mass spectrometry as a tool for the discrimination of high-risk Escherichia coli clones from phylogenetic groups B2 (ST131) and D (ST69, ST405, ST393). Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2014).
  11. Matsumura, Y., et al. Detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia coli ST131 and ST405 clonal groups by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 52 (4), 1034-1040 (2014).
  12. Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF Mass Spectrometry Strain Typing during a Large Outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), e101924 (2014).
  13. Zautner, A. E., Masanta, W. O., Weig, M., Groß, U., Bader, O. Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP): A novel microbial typing Method. Scientific Reports. 5, (2015).
  14. The global view of campylobacteriosis. WHO. World Health Organisation (WHO), , Available from: http://www.who.int/foodsafety/publications/campylobacteriosis/en/ (2013).
  15. Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
  16. Zautner, A. E., et al. Seroprevalence of campylobacteriosis and relevant post-infectious sequelae. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (6), 1019-1027 (2014).
  17. Zautner, A. E., Herrmann, S., Groß, U. Campylobacter jejuni - The Search for virulence-associated factors. Archiv Fur Lebensmittelhygiene. 61 (3), 91-101 (2010).
  18. Dingle, K. E., et al. Multilocus sequence typing system for Campylobacter jejuni. J Clin Microbiol. 39 (1), 14-23 (2001).
  19. Dingle, K. E., et al. Molecular characterization of Campylobacter jejuni clones: a basis for epidemiologic investigation. Emerg Infect Dis. 8 (9), 949-955 (2002).
  20. Cody, A. J., et al. Real-time genomic epidemiological evaluation of human Campylobacter isolates by use of whole-genome multilocus sequence typing. J Clin Microbiol. 51 (8), 2526-2534 (2013).
  21. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol Biol Evol. 30 (12), 2725-2729 (2013).
  22. Jolley, K. A., Chan, M. S., Maiden, M. C. mlstdbNet - distributed multi-locus sequence typing (MLST) databases. BMC Bioinformatics. 5, 86 (2004).
  23. Verroken, A., et al. Evaluation of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry for Identification of Nocardia Species. J Clinl Microbiol. 48 (11), 4015-4021 (2010).
  24. El Khéchine, A., Couderc, C., Flaudrops, C., Raoult, D., Drancourt, M. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry Identification of Mycobacteria in Routine Clinical Practice. PLoS ONE. 6 (9), e24720 (2011).
  25. Goujon, M., et al. A new bioinformatics analysis tools framework at EMBL-EBI. Nucleic Acids Research. 38, Web Server issue 695-699 (2010).
  26. Hall, T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series. 41, 95-98 (1999).
  27. Jolley, K. A., et al. Ribosomal multilocus sequence typing: universal characterization of bacteria from domain to strain. Microbiology. 158, 1005-1015 (2012).
  28. Suarez, S., et al. Ribosomal proteins as biomarkers for bacterial identification by mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. J Microbiol Methods. 94 (3), 390-396 (2013).
  29. Teramoto, K., et al. Phylogenetic classification of Pseudomonas putida strains by MALDI-MS using ribosomal subunit proteins as biomarkers. Anal Chem. 79 (22), 8712-8719 (2007).
  30. Teramoto, K., Kitagawa, W., Sato, H., Torimura, M., Tamura, T., Tao, H. Phylogenetic analysis of Rhodococcus erythropolis based on the variation of ribosomal proteins as observed by matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry without using genome information. J Biosci Bioeng. 108 (4), 348-353 (2009).
  31. Bernhard, M., Weig, M., Zautner, A. E., Gross, U., Bader, O. Yeast on-target lysis (YOTL), a procedure for making auxiliary mass spectrum data sets for clinical routine identification of yeasts. J Clin Microbiol. 52 (12), 4163-4167 (2014).
  32. Stark, T., et al. Mass spectrometric profiling of Bacillus cereus strains and quantitation of the emetic toxin cereulide by means of stable isotope dilution analysis and HEp-2 bioassay. Anal Bioanal Chem. 405 (1), 191-201 (2012).

Tags

Генетика выпуск 116 MALDI-TOF ниже видов дифференциации phyloproteomics ICMS, МОЗН микробиология
подтипов<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Подвид.<em&gt; doylei</em&gt; Изолятов Использование PhyloProteomics Масс-спектрометрия на основе (MSPP)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zautner, A. E., Lugert, R., Masanta, … More

Zautner, A. E., Lugert, R., Masanta, W. O., Weig, M., Groß, U., Bader, O. Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP). J. Vis. Exp. (116), e54165, doi:10.3791/54165 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter