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Genetics

subtipificación de Published: October 30, 2016 doi: 10.3791/54165
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institut für Medizinische Mikrobiologie, Universitätsmedizin Göttingen

Summary

Se utilizó phyloproteomics basados en espectrometría de masas (MSPP) para escribir una colección de Campylobacter jejuni ssp. Doylei aislamientos a nivel de cepa en comparación con la tipificación de secuencia de multilocus (MLST).

Abstract

MALDI-TOF MS ofrece la posibilidad de diferenciar algunas bacterias no sólo a nivel de especies y subespecies, sino incluso por debajo, a nivel de cepa. isoformas alélicas de los iones detectables de biomarcadores resultan en desplazamientos en masa aislante específica. phyloproteomics de masas basado en la espectrometría (MSPP) es una nueva técnica que combina las masas de espectrometría de masas de biomarcadores detectables en un esquema que permite la deducción de las relaciones phyloproteomic de los cambios de masa específica del aislante en comparación con un genoma secuenciado cepa de referencia. Las secuencias de aminoácidos deducidas se utilizan entonces para calcular dendrogramas basados ​​en MSPP.

A continuación se describe el flujo de trabajo del MSPP escribiendo un ssp Campylobacter jejuni. Doylei colección aislado de siete cepas. Todos los siete cepas eran de origen humano y la secuencia de multilocus (MLST) demostrado su diversidad genética. MSPP tipificación resultó en siete diferentes tipos de secuencias del MSPP, lo que refleja suficientemente su grafíalas relaciones logenetic.

El C. jejuni ssp. doylei esquema MSPP incluye 14 diferentes iones de biomarcadores, proteínas ribosomales en su mayoría en el rango de masa de 2 a 11 kDa. MSPP puede, en principio, ser adaptado a otras plataformas de espectrometría de masa con un rango de masa extendida. Por lo tanto, esta técnica tiene el potencial de convertirse en una herramienta útil para la tipificación microbiana nivel de cepa.

Introduction

Durante la última década, láser asistida por matriz de desorción ionización de espectrometría de masas de tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS) ha avanzado a ser un método estándar de gran valor para el género microbiano y la identificación de las especies en microbiología clínica 1, 2. La identificación de especies se basa en el registro de huellas digitales pequeñas proteínas de las células intactas o lisados ​​celulares. El rango de masa típica de un espectrómetro de masas utilizado en microbiología clínica habitual es de 2-20 kDa. Además, el espectro resultante se puede utilizar para discriminar las cepas en las siguientes especies y de nivel 3 por debajo de la subespecie. Los primeros estudios pioneros han identificado iones de biomarcadores específicos para un subgrupo particular de las cepas de Campylobacter jejuni en 4, Clostridium difficile 5, Salmonella enterica ssp. enterica serovar Typhi 6, Staphylococcus aureus 7-9, y EScherichia coli 10 - 12.

La combinación de varias masas de biomarcadores variables correspondientes a las isoformas alélicas ofrece la opción para los subtipos más profundo. Anteriormente, hemos implementado con éxito un método para convertir estas variaciones en los perfiles de masas en relaciones significativas y reproducibles phyloproteomic llamados phyloproteomics basados espectrometría de masas (MSPP) en un C. ssp jejuni. colección aislado jejuni 13. MSPP se puede utilizar una de espectrometría de masa equivalente a las técnicas de subtipificación basada en la secuencia de ADN como la secuencia de mecanografía multilocus (MLST).

Especies de Campylobacter son la principal causa de gastroenteritis bacteriana en todo el mundo 14, 15. Como consecuencia de la campilobacteriosis sequela post-infecciosa, a saber, el Síndrome de Guillain Barré, artritis reactiva y enfermedad inflamatoria intestinal puede surgir 16. Las principales fuentes de infección sonla carne de ganado contaminado de pollo, pavo, cerdos, vacas, ovejas y patos, la leche y la superficie del agua 15, 17. Por lo tanto, los estudios de vigilancia epidemiológica regulares en el contexto de la seguridad alimentaria son necesarias. MLST es el "patrón oro" en la tipificación molecular de especies de Campylobacter 18. Debido a que el método de Sanger de secuenciación basada MLST es un trabajo intensivo, que consume tiempo y es relativamente caro, MLST datos está restringido a cohortes relativamente pequeñas aisladas. Por lo tanto, hay una necesidad de métodos de subtipificación más baratos y más rápidos. Esta necesidad podría satisfacerse mediante métodos de espectrometría de masas como MSPP.

En este trabajo se presenta un protocolo detallado para MSPP tipificación usando una colección de Campylobacter jejuni ssp. Doylei aislamientos y la comparación de su potencial con MLST.

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Protocol

1. Preparar un lugar de trabajo seguro, considerando bioseguridad Condiciones

  1. Familiarizarse con los reglamentos de laboratorio y de seguridad que son de relevancia para el trabajo con microorganismos. La mayoría de los microorganismos patógenos humanos deben ser manejados a nivel de bioseguridad 2 condiciones, pero algunos, como la Salmonella enterica serovar Typhi, requieren de bioseguridad de nivel 3. La información sobre el nivel de manejo de cada patógeno se puede acceder en www.cdc.gov/biosafety.
  2. Independientemente de la clasificación de riesgo biológico de microorganismos específicos, considerar todos los materiales que estuvieron en contacto con el agente infeccioso como desechos infecciosos que deben esterilizarse en autoclave antes de ser desechados. Respetar las normas de seguridad regionales para materiales peligrosos y sustancias biológicas. Evitar que los contenedores apropiados para su eliminación inmediata y adecuada de los materiales potencialmente contaminados (riesgos biológicos) están disponibles.
  3. Garantizar que los instrumentos estériles (bucles de inoculación), soluciones y medios de cultivo (placas de agar) están disponibles antes de comenzar el cultivo bacteriano.
  4. Lávese las manos con agua tibia y jabón antiséptico inmediatamente después de manipular los microorganismos infecciosos.

2. Selección de referencia y aislamientos Collection

  1. Seleccionar y obtener una referencia del genoma secuenciado estándar aislar junto con las secuencias de la proteoma codificada, idealmente en formato FASTA. Si más cepas genoma secuenciado están disponibles, incluirlos en el análisis.
    Nota: Este aislado / estas cepas más adelante se puede utilizar para predecir la identidad de los picos de masa observadas en la espectrometría de masas (ver sección 7).
  2. Seleccionar y obtener una variedad de potencialmente diversos aislados de tal manera que cubren la filogenia de las especies o subespecies de interés.
    Nota: Estos aislados más tarde se utilizarán para demostrar la variabilidad de los biomarcadores en la población (ver sección 8).
  3. Asegúrese de que toda la colección y aislado (s) de referencia están a favorperly tecleado por el respectivo estándar de oro para este organismo en particular 18 - 20.
    Nota: Esto puede incluir una variedad de métodos (sub) -typing, pero es probable que recurrir a MLST, que todavía es el método estándar para demostrar la diversidad genética de la mayoría de especies microbianas.
  4. Para inferir la filogenia dentro de la colección, calcular un phylogram a partir de los datos de la clasificación, por ejemplo, mediante el método del grupo de pares no ponderados con la media aritmética (UPGMA) en el software MEGA6 para los datos MLST 21. Para los datos MLST, también consultar una base de datos MLST y asignar tipos de secuencias y los respectivos complejos clonales 22.
    Nota: Esto más tarde se utilizó para analizar la congruencia de MSPP con el método de tipificación estándar de oro antes (véase la sección 9).

3. Preparar una placa MALDI objetivo

PRECAUCIÓN: TFA es un ácido fuerte. El uso inapropiado de TFA conlleva el riesgo de quemaduras graves en la piel, lesiones oculares y severa irritación of el tracto respiratorio superior si se inhala. Por lo tanto, las medidas de seguridad estrictas deben ser respetados y se necesita equipo adecuado de protección personal (PPE), incluyendo gafas de seguridad, protectores faciales, guantes, botas adecuadas, o incluso un traje de protección completa, mientras que el manejo de TFA. La posible exposición a TFA debe ser controlado por manipulación de la sustancia en virtud de una ventilación adecuada con un sistema de ventilación eficaz. En caso de ventilación insuficiente, se debe utilizar un respirador aprobado de filtro. Además, TFA es perjudicial para los organismos acuáticos, con efectos nocivos duraderos. Cualquier liberación de TFA en las aguas residuales al medio ambiente debe ser evitada.

Nota: Antes de la detección de las muestras sobre una diana de MALDI, limpiar la placa del objetivo a fondo si la placa se utilizó anteriormente.

  1. Preparar la solución de etanol acuoso 100 ml 70% utilizando 30 ml de agua desionizada y 70 ml de etanol puro.
  2. Preparar 250 l de un ácido trifluoroacético acuoso al 80% de solución (TFA) mediante la mezcla de 50l de agua desionizada y 200 l 100% de TFA en un tubo de reacción y vórtex el tubo durante 1 min.
  3. Limpiar la diana de MALDI poniéndolo en un plato de vidrio y sumergiendo en etanol acuoso al 70% durante aproximadamente 5 min a temperatura ambiente.
  4. Enjuague el objetivo bajo el agua caliente.
  5. El uso de un pañuelo de papel, limpie la placa del objetivo intensamente con una solución acuosa de etanol al 70% para eliminar todas las muestras anteriores y otros desechos potencial.
  6. Si se requiere más limpieza, enjuague con agua caliente mientras se limpiaba con un pañuelo de papel.
  7. Eliminar los contaminantes residuales, y potencialmente invisibles,, cubriendo la superficie objetivo con una capa delgada de 80% de TFA acuoso (~ 100 l por 96 puntos) y limpiando todas las posiciones de destino limpias con un pañuelo de papel.
  8. Por último, enjuagar el objetivo de eliminar el ácido, séquelo utilizando un pañuelo de papel, y se deja durante al menos 15 minutos a temperatura ambiente para evaporar el líquido residual.

4. Preparación de una45; Ciano-4-hidroxi-cinámico solución de matriz ácido que contiene un calibrante interno

  1. Preparar una solución de matriz saturada por disolución de 10 mg α-ciano-4-hidroxi-ácido cinámico (HCCA) en 1 ml de una mezcla de 50% de acetonitrilo, 47,5% de agua, y 2,5% de TFA. Residual no disuelta HCCA permanecerá si se satura la solución.
  2. Añadir la insulina humana recombinante como un calibrador interno. Para ello, preparar una solución madre a una concentración final de 10 pg / l en acetonitrilo acuoso al 50%, alícuota y se almacena a -20 ° C para su uso posterior.

5. MALDI-TOF espectrometría de masas

Nota: se deben utilizar condiciones de cultivo específicas para los organismos de interés. Las muestras para MALDI-TOF MS se pueden preparar ya sea por la preparación de frotis o de extracción, dependiendo del organismo (ver sección 8.4.1). Mientras que el método de extracción de etanol-ácido fórmico proporciona la inactivación suficiente de agentes patógenos, la preparación de frotis tiene que ser realizada bajo suffcientes condiciones de bioseguridad según sea necesario (ver sección 1). Por lo general, no hay riesgo de infección después de la aplicación de la matriz, pero para patógenos específicos se requieren protocolos de inactivación específicos. Así, por ejemplo MALDI-TOF MS de las especies de Nocardia requiere lisis anterior de las bacterias en agua hirviendo, seguido de precipitación con etanol de las proteínas 23. EI Khéchine et al. desarrollado un procedimiento para la inactivación de las micobacterias, el calentamiento de las colonias de bacterias a 95 ° C durante 1 hr en tubos con tapón de rosca que contienen agua y 0,5% de Tween 20 24.

  1. Preparación de frotis
    1. Extender una cantidad tamaño de un alfiler de una colonia bacteriana directamente en una posición de la placa diana MALDI ( 'spot').
    2. Superposición de cada mancha con 1 l de HCCA matriz regular o matriz que contiene el compuesto de calibración interna y dejar cristalizar a temperatura ambiente. Para la determinación de la masa exacta del pico de calibración, control de superponer un spot con 1 l de prueba estándar y 1 l de matriz de HCCA que contiene el compuesto de calibración interna.
      Nota: Aquí, como norma de prueba un extracto de Escherichia coli DH5a se utiliza una huella digital que demuestra la proteína característica de MALDI-TOF MS. Se disparó con dos proteínas que amplían el límite superior del rango de masa detectable.
  2. método de extracción
    1. Cosecha aproximadamente cinco colonias de un cultivo en placa de agar con un asa de siembra y suspender a fondo en 300 l de agua doblemente destilada en un tubo de reacción de 1,5 ml. Añadir 900 l de etanol absoluto y se mezcla a fondo por pipeteo repetido hasta que las colonias de bacterias suspendidas por completo.
      Nota: En este paso es posible y bien establecido para almacenar las muestras a -20 ° C. Además, la inactivación de patógenos puede ser probada por rayas 1-10 l del extracto en una placa de agar adecuado después de la incubación en condiciones óptimas de crecimiento. Exitoso enla activación se indica por la ausencia de crecimiento microbiano.
    2. Centrifugar la muestra a 13.000 xg durante 1 min, descartar el sobrenadante y secar el pellet a temperatura ambiente durante 10 minutos. Resuspender el precipitado a fondo por la pipeta hacia arriba y hacia abajo en 50 l de ácido fórmico al 70%.
    3. Añadir 50 l de acetonitrilo y mezclar. Eliminar los residuos por centrifugación a 13.000 xg durante 2 min. Transferencia de 1 l de sobrenadante sobre una posición de la muestra en una placa MALDI objetivo y dejar secar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    4. Superposición de cada mancha con 1 l de matriz de HCCA que contiene el compuesto de calibración interna y dejar cristalizar a temperatura ambiente.
  3. Grabación de espectros de masas
    Nota: Pico-picking de los espectros de masas se realiza utilizando los procedimientos estándar recomendada (algoritmo de centroide; S / N ratio:. 2; rel umbral Intensidad: 2%; anchura del pico 3 m / z, resta la línea de base: TopHat)
    1. Calibrar el instrumento según protoc de los fabricantesol.
    2. Para cada punto, se reúnen 600 espectros en 100 tiros pasos.
      1. Ir a la pestaña "AutoXecute" del software de configuración del espectrómetro de masas. Abra el "método" de izquierda-clic en el botón "Method" y eligiendo el método por ejemplo, "MBT_AutoX" en el menú desplegable.
      2. Haga clic izquierdo en el botón "Editar ..." derecha del menú "método" para abrir el "Editor de métodos de AutoXecute". Ir a la pestaña "acumulación". Ajuste el "Sumar" valor a "600" y los "disparos satisfactorios en" valor "pasos _x_ tiro" a "100".
  4. Procedimiento de calibración interna del espectro
    Nota: Los errores de medición Minuto son inherentes a la espectrometría de masas. Dependiendo del uso del instrumento intermitente, temperatura del instrumento y re-calibración, los valores de medición obtenidos pueden variar entre los experimentos. Después de la calibración del instrumento antes de la medición y después de la medición de calibración de espectro a un compuesto de calibración interna es la forma más precisa para asegurar la comparabilidad entre espectro.
    1. Realice los siguientes procedimientos para cada pico de la lista de calibración:
      1. Iniciar el navegador espectro (por ejemplo, flexAnalysis y espectro abierto:. Menú "Archivo" → "Abrir ...")
      2. Crear una lista de control de masas con el pico calibrante: menú "Método" → "Abrir ...".
      3. Elija el método: MBT_Standard.FAMSMethod → ​​"Abrir".
      4. Editar lista de control de masas: Desmarcar todos calibradores.
      5. Añadir pico calibrante en la parte inferior: Etiqueta Pico: "Insulin_HIStag [M + H] + _ promedio"; m_z: "5808,29"; Tolerancia [ppm]: "50"; Marque la casilla calibrante.
      6. Guardar como, por ejemplo, "MSPP lista de calibrador".
    2. Para cada espectro, elegir el pico de compuesto de calibración de la lista, haga clic en "Asignar automática" y pulse "OK".
ove_title "> 6. Verificar el procedimiento de calibración interna

  1. Determinar experimentalmente la masa exacta del pico de calibración.
    1. Preparar dos puntos con 1 l de prueba estándar cada uno (paso 5.1.1). Superponer la primera con 1 l de matriz regular de HCCA, la segunda con 1 l de calibrador de matriz-enriquecida.
    2. Obtener los espectros de masas de cada punto (sección 5.3), e internamente la calibración de los picos del patrón de prueba (sección 5.4).
    3. Superponer ambos espectros mediante su apertura con el navegador del espectro (por ejemplo, flexAnalysis y espectro abierto: el menú "Archivo" → "Abrir ...") y encontrar el pico a la masa esperada (insulina m / z = 5,808.29), que debe estar presente en el espectro calibrante-enriquecida, pero no en el espectro obtenido con la matriz regular.
  2. Compruebe que el calibrante pico no es oscurecida por cualquier otro biomarcador del organismo de interés.
    1. Preparar dos puntos (sección 5.1) con la cepa de referencia y overlay el primero con 1 l matriz regular, el segundo con 1 l de calibrador de matriz-enriquecida.
    2. Adquirir los espectros de masas de los dos puntos (sección 5.3) y la superposición de los espectros resultantes mediante su apertura con el navegador del espectro (por ejemplo, flexAnalysis y abierto espectro: "Archivo" → "Abrir ..."). Asegúrese de que el pico de calibrante es claramente visible en el espectro obtenido con la matriz de punta y que no quede oculta por otra señal adyacente. Si este no es el caso, elegir otro calibrante para este organismo particular.
      Nota: El uso de un compuesto de calibración interna de pinchos aumenta significativamente la precisión para determinar las variaciones de masas de biomarcadores. Usando este método, las diferencias de masa de hasta 1 Da pueden ser detectados. Alternativamente, también masas invariantes procedentes de los organismos pueden ser utilizados como calibradores. Sin embargo, por definición, todas las masas de organismos derivados deben considerarse potencialmente variables, a menos que se demuestre lo contrario.

  1. Medir el espectro de masas de la cepa de referencia, con matriz en claveteado con el calibrante interno.
    1. Extender una cantidad tamaño de un alfiler de una colonia bacteriana (sección 5.1) o 1 l de extracto de proteína bacteriana (sección 5.2) directamente en una posición de la placa diana MALDI ( 'spot').
    2. Superponer cada punto con 1 l de matriz HCCA que contiene el compuesto de calibración interna y salir de la tablilla de puntería para cristalizar a temperatura ambiente (sección 5.1.2 / 5.2.4).
    3. Los espectros de masas registro de la cepa de referencia (sección 5.3).
  2. Internamente calibrar el espectro de referencia a la masa calibrante (aquí: la insulina a m / z = 5,806.29), y posteriormente pre-proceso por sustracción de línea de base (TopHat) y suavizado (parámetros: SavitzkyGolay; anchura: 2 m / z, 10 ciclos).
    1. Iniciar el navegador espectro (por ejemplo, flexAnalysis y abierto espectro: "Archivo" → "Abrir ...; ").
    2. Elija el método: desplegable "Método" menú → "Abrir ...", haga clic izquierdo el método de elección, por ejemplo, "MBT_Standard.FAMSMethod" → "Abrir".
    3. Calibrar espectro eligiendo "interna ..." en el menú desplegable "Calibrar". Una ventana se abre mostrando el pico de calibrador (s) (sección 5.4). Haga clic izquierdo en el pico de calibrador (insulina) → Haga clic izquierdo en "OK". Elija "espectros de proceso" en el menú desplegable "Proceso".
    4. Por sustracción de línea de base activar el espectro en la lista de espectro en el lado derecho. Elija "Restar Espectro de masas de referencia" en el menú desplegable "Proceso".
    5. Para suavizar el espectro, activar el espectro en la lista de espectro en el lado derecho. Seleccione la opción "Smooth Espectro de masas de referencia" en el menú desplegable "Proceso".
  3. De los datos de secuenciación del genoma de la cepa de referencia, calcular el theoretical monoisotopic peso molecular de cada una de las proteínas codificadas por la traducción de la secuencia de ADN en la secuencia de aminoácidos correspondiente usando un editor de alineación de secuencias. Copiar y pegar esta secuencia de la proteína en la casilla correspondiente en el Portal de Recursos ExPASy Bioinformática (http://web.expasy.org/compute_pi/). y pulse "Haga clic aquí" para calcular pi / Mw. En el caso de C. jejuni ssp. doylei calcular la masa de 14 biomarcadores detectables.
  4. Copiar los resultados en una hoja de cálculo, con una columna que contiene el identificador de genes y el siguiente el peso molecular. Ordenar las filas de peso molecular calculado para facilitar las operaciones de búsqueda más fácil de las masas. Nota: Otras columnas son opcionales; anotación funcional puede ser especialmente útil en el futuro para la interpretación.
  5. Inserte una segunda columna en la hoja de cálculo para el peso molecular de la forma de-methioninated, restando 135 Da a partir del peso molecular monoisotópico. Nota: Esto se debe a que algunas proteínas sufren de posttranslacional modificación de la eliminación proteolítica de la metionina N-terminal.
  6. Asignar a cada gran masa de biomarcadores medido a las masas calculadas a partir de la cepa de referencia buscando los medios de medida a partir de la tabla genoma preparado anteriormente (Tabla 1).
  7. Si los iones de biomarcadores no se pueden asignar a los productos de genes predichos, considerar otras modificaciones postraduccionales (metilación, acetilación, prenilación, etc., véase http://www.abrf.org/delta-mass para una compilación de las modificaciones y los cambios de masa asociados ). Para cualquier otra modificación postraduccional conocida que se observa con frecuencia en los organismos de interés añadir otra columna a la tabla y volver a calcular el peso molecular análoga al proceso para la forma de-methioninated.
  8. Configurar otra pestaña de la hoja, y registrar para cada biomarcador de iones de la masa y el identificador en una columna de tabla separada.

8. Evaluar la variabilidad de biomarcadoresen la Población

  1. Calibrar los espectros de masas obtenidos de la colección de aislamientos, como se hizo para la cepa (s) de referencia (sección 5.4.2).
  2. Identificar biomarcadores variantes en los espectros de masas. Una masa variante se caracteriza por la ausencia de una masa conocida a partir del espectro de referencia y el aspecto de una novela de masa no está presente en la referencia. La diferencia de masa debe ajustarse a un único intercambio de aminoácidos (Tabla 2), o una combinación de los mismos.
  3. En un aislado por fila, se registra la masa medida para cada biomarcador y la isoforma predicho en las respectivas columnas de la tabla.
    Nota: En raras ocasiones, algunos cambios de masa pueden ser atribuibles a varios intercambios de aminoácidos diferentes, por ejemplo, ambos, N intercambiado por D y Q intercambió por E, y viceversa, dan como resultado un desplazamiento de masa de 0.985 Da (Tabla 2). Este problema intrínseco no se puede resolver por espectrometría de masas sola. Por lo tanto, diferentes isoformas en el nivel de secuencia de proteína que tiene la misma masadeben ser considerados como un solo tipo MSPP. Paralelo secuenciación de Sanger de los genes de iones de biomarcadores particulares confirmó que este problema no se produjo mientras MSPP-escribiendo el C. jejuni ssp. doylei aislar colección utilizado en este estudio.
  4. Confirmar nuevos tipos MSPP por PCR-amplificación y secuenciación de los genes respectivos biomarcadores. A su vez, esto también sirve como confirmación de que la identidad de biomarcadores se ha asignado correctamente.
    1. bacteriana Cultura aísla en condiciones óptimas de crecimiento. C. Cultura jejuni ssp. doylei cepas en agar Columbia suplementado con sangre de carnero al 5% a 37 ° C bajo condiciones microaerophilic (5% de O2, CO2 al 10%, el 85% de N2). Incubar durante aprox 48 hr. Utilice una placa de agar por separado para cada aislamiento para evitar la contaminación cruzada.
    2. Extraer el ADN genómico de las cepas bacterianas usando una maquinaria kit de extracción de ADN apropiada / automatizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      3. <li> amplificar los genes respectivos de biomarcadores usando los cebadores listados en la Tabla 3 Realizar todas las reacciones de PCR en las siguientes condiciones:. desnaturalización a 94 ° C durante 30 s; recocido a 55 ° C durante 30 s; elongación a 72 ° C durante 30 seg.
    3. Determinar la secuencia de ADN de cada amplicón mediante secuenciación de Sanger utilizando una cantidad apropiada de ADN genómico (por lo general 600 a 700 ng de ADN es suficiente a una concentración de ca. 100 ng / l) y uno de los cebadores de amplificación (por lo general esto se realiza el uso de un proveedor de servicios).
  5. En una tabla separada (ver Tabla 4), grabar la secuencia de la proteína deducida para cada nueva isoforma mediante el uso de una herramienta de traducción apropiada (por ejemplo, Transseq: http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/) 25.

9. Calcular una filogenia basada en el MSPP y comparar con el patrón oro

  1. Concatenan las secuencias de aminoácidos de biomarcadores particulares pertenecientes a tTipo de él MSPP de los aislamientos en una secuencia continua utilizando un editor de alineamiento de secuencias, como Bioedit (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html) 26 o la hoja de cálculo de biomarcadores.
  2. Calcular la filogenia por la agrupación como se hizo para la escritura de datos de patrón oro, por ejemplo, la agrupación UPGMA 21.
  3. Comparar la filogenia basada en MSPP a la obtenida con el estándar de oro 4, 13.

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Representative Results

Anteriormente, hemos establecido con éxito un esquema de MSPP para C. ssp jejuni. jejuni 13. En este caso, el objetivo fue extender el método a la hermana subespecie C. ssp jejuni. doylei. En esta configuración específica, siete C. jejuni ssp. doylei los aislados fueron adquiridos de la colección belga de microorganismos / Laboratorio de Microbiología UGent BCCM / LMG Gante, Bélgica. Todos los siete aislamientos utilizados para nuestro análisis eran de origen humano. La cepa del genoma secuenciado ATCC 49349 (LMG 8843), originalmente aislado de heces de un niño australiano de 2 años de edad con diarrea sirvió de referencia. De la colección, seis cepas adicionales estaban disponibles: LMG 9143, LMG 9243, y LMG 9255 aisladas de heces de niños que padecen diarrea y viven en Bruselas, Bélgica; LMG 7790 (ATCC 49350) aislada de una muestra de biopsia gástrica de un individuo de Alemania; y LMG 8870 (NCTC A613 / 87), así como LMG 8871 (NCTC A603 / 87), tanto de forma aislada a partir de diferentes muestras de sangre extraídas de los niños sudafricanos.

Todo C. jejuni ssp. doylei aislamientos fueron almacenadas a -80 ° C como acciones Cryobank, recién descongelados para cada análisis y cultivadas mediante el uso de base de agar Columbia suplementado con sangre de carnero al 5% y la incubación durante 48 horas a 37 ° C bajo condiciones microaerophilic (5% O 2, 10% de CO 2, el 85% de N2).

En contraste con el establecimiento de la técnica MSPP para C. jejuni ssp. jejuni 13 que no era posible basar el método en una base de datos isoforma derivado de una secuencia más grande colección. Sólo un único C. jejuni ssp. doylei entrada estaba presente en la base de datos rMLST, y esto correspondió a la cepa de referencia C. jejuni ssp. doylei ATCC 49349 27. Por lo tanto, cada uno de biodesplazamiento de masa marcador detectado en comparación con la cepa C. jejuni ssp. doylei ATCC 49349 fue una nueva entrada en la base de datos isoforma y necesitaba ser confirmado mediante secuenciación de Sanger.

Para el análisis de la diversidad de la C. obtenida jejuni ssp. doylei aislamientos, MLST se realizó y un UPGMA-dendrograma basado en MLST incluyendo los siete examinó C. jejuni ssp. doylei aislamientos y C. jejuni ssp. jejuni cepa 81-176 calculada como el grupo afuera (Figura 1). Cada C. jejuni ssp. doylei aislado pertenecía a un tipo diferente MLST-secuencia, cayendo en dos subgrupos. Strain LMG7790 tenía la distancia filogenética más largo en comparación con el restante C. jejuni ssp. doylei aislamientos.

El espectro de masa de referencia registrable MALDI-TOF de C. ssp jejuni. doylei (Figura 2).

Dentro de la colección, se detectaron diferentes isoformas de L32-M, L33, la hipotética proteína codificada por gi | 152939117, S20-M, y S15-M (Figura 3). El resto de masas asignadas a los iones de biomarcadores eran invariable en el C. probado jejuni ssp. doylei aislamientos. La sustitución de aminoácidos que corresponde a los cambios de masa han sido identificados por PCR-amplificación y secuenciación Sanger del gen particular usando los cebadores listados en la Tabla 3. Tabla 4 se enumeran las secuencias de aminoácidos de todos los iones de biomarcadores incluyen en el esquema MSPP así como las isoformas alélicas detectadas.

Un UPGMA- phyloproteomic basada en MSPPárbol (figura 4) se calculó para los mismos siete C. jejuni ssp. doylei aislamientos y C. ssp jejuni. jejuni cepa 81-176 como el grupo afuera usando las secuencias de aminoácidos concatenados de los 14 iones de biomarcadores en función de su peso molecular en la cepa de referencia. Cada aislado representaba un tipo de MSPP-secuencia individual. Aunque las relaciones phyloproteomic obtenidos no eran completamente idénticos a los obtenidos por MLST, la C. jejuni ssp. doylei aislados de nuevo dispuesta en dos subgrupos. La primera subcluster se formó por LMG 8843, LMG 8870, y LMG 9243, el segundo por LMG 9255, LMG 9143, LMG 8871 y LMG 7790. Como se ha visto con el MLST-análisis, aislar LMG7790 mostraron la distancia más larga en el phyloproteomic MSPP- análisis.

Figura 1
Figura 1: MLST-based filogenético UPGMA-árbol. Balanced UPGMA-dendrograma basado en MLST construido a partir de siete C. jejuni ssp. doylei aislamientos y C. ssp jejuni. jejuni cepa 81-176. código de color de la tensión: LMG 8843 (negro), LMG 8870 (gris), LMG 9243 (azul), LMG 9255 (turquesa), LMG 9143 (verde), y LMG 8871 (rosa), LMG 7790 (amarillo), y 81- 176 (blanco). El tipo MLST-secuencia se da detrás del nombre de cada aislado. Cada C. jejuni ssp. doylei aislar pertenece a un tipo diferente MLST-secuencia. El eje X indica las distancias de vinculación. Strain LMG 7790 muestra la distancia filogenética más larga en comparación con los seis aislamientos restantes. Las cepas LMG 8843, LMG 8870, y LMG 9243, así como LMG 9255, LMG 9143, y LMG 8871 forman dos subgrupos diferentes dentro de la C. jejuni ssp. doylei clúster. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Asignación provisional de correlaciones genómicas de C. jejuni ssp. doylei ATCC 49349 (LMG 8843) a las masas de biomarcadores observados. Sobre la base de las masas calculadas (composición isotópica promedio) de ORFs predichos a partir de toda la secuencia del genoma de C. jejuni ssp. doylei cepa ATCC 49349, las masas de biomarcadores fueron asignados a la proteína correspondiente secuencias de codificación. Sin embargo, dentro del rango de medición, las masas de biomarcadores para los L31 subunidades ribosomales (MW = 7315 Da), S17 (MW = 9549 Da), y S18 (PM = 10.285 Da), así como sus isoformas de-methioninated (recuadro m / z = 7,000-7,200 Da) no pudo ser asignado de forma inequívoca. Por lo tanto, L31, S17, y S18 no se incluyeron en la C. jejuni ssp. doylei esquema de MSPP. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: picos de masa de biomarcadores específicos de la C. jejuni ssp. doylei esquema de MSPP. En cada panel de los espectros de masas de los siete probados C. . jejuni ssp doylei aislamientos (código de color como en la figura 1) correspondientes a los tipos MSPP particulares se han superpuesto para indicar los cambios de masa biomarcador debido a isoformas alélicas: (A) L36 + H +; (B) L34 + H +; (C) L32-M + H +; (D +; H + (E) S14-M +; (F) L29 + H +, L28-M + H +, y L35-M + H +; (G) L24-M + H +; (H) gi | 152939117 + H +; (I) L27-M + H +; H + (J) S20-M +; (K) S15-M + H +; (L) S19-M + H +; (M) una masa intensa oscureciendo variable de pico de potencial biomarcador de proteína ribosomal S18; (N) S20-M + 2H +; (O) L15-M + 2 H +; X-Ejes: masa [Da] ·-1 cargo proporción, escala de 200 Da. Y-ejes: Intensidad [unidades arbitrarias], los espectros se ajustan individualmente a un nivel de ruido comparable para una mejor visualización de los picos de baja intensidad. "-M" Después del nombre de una subunidad ribosomal indica la isoforma de-methioninated. Por favor, haga clic en ellae para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4:. A base de MSPP phyloproteomic UPGMA-árbol UPGMA El phyloproteomic-árbol representado incluye los mismos siete C. jejuni ssp. doylei aislamientos y C. jejuni ssp. cepa jejuni 81-176 como en la Figura 1. A (código de color como en la figura 1) mancha de color indica cada cepa. Para una mejor comparación de los aislamientos están dispuestas en orden de entrada, que era el orden obtenido del árbol a base de MLST. El eje debajo del dendrograma indica las distancias de vinculación. Aunque las relaciones phyloproteomic obtenidos no son totalmente idénticos al árbol basado en MLST filogenético, la imagen global es comparable. La población se divide en dos grupos: los tres aislamientos LMG 8843, LMG 8870, y LMG 9243 forma una CLUSTer, mientras LMG 9255, LMG 9143, LMG 8871 y 7790 LMG forman un segundo grupo. Dentro de este grupo de LMG 7790 muestra la distancia phyloproteomic más largo en comparación con el subgrupo formado por LMG 9255, LMG 9143, y LMG 8871. Dentro de este LMG subcluster 9143 interruptores de posición en relación con LMG 9255. Sin embargo, incluso utilizando el método MSPP-cada aislamiento representa MSSP un tipo de secuencia individual. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Calculado masas de todos los ORFs anotado de la C. jejuni ssp. doylei ATCC 49349 cepa. Lista de todos los pesos moleculares calculados monoisotopic de cada proteína codificada en el C. ssp jejuni. doylei ATCC 49349 genoma. El portal de recursos del ExPASy Bioinformática se utilizó para el cálculo de las masas moleculares particulares. Columna B se enumeran las isoformas methioninated mientras que la columna C se enumeran las isoformas de-methioninated. Masas de biomarcadores incluyen en la C. jejuni ssp. doylei esquema MSPP están resaltados en rojo. Nota: La proteína L36 biomarcador no está anotado en la secuencia del genoma de C. jejuni ssp. doylei ATCC49349. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla 2:. Cambios de masa inducidas por cambios de aminoácidos debido a SNPs individuales Todos los polimorfismos de un solo nucleótido potenciales se comprobaron para el intercambio de aminoácido resultante utilizando el código genético estándar. Todas las mutaciones silenciosas fueron descartados, y las mutaciones no sinónimas compilados junto con el resulting cambio de masa. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla 3: Los cebadores de oligonucleótidos utilizados para la secuenciación de la C. jejuni ssp. doylei genes incluidos en el MSPP-esquema Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla 4: Resumen de todas las isoformas incluido en el C. jejuni ssp. doylei MSPP-esquema. Esta tabla se enumeran todos los iones de biomarcadores incluyen en la C. ssp jejuni. doylei MSPP scheme. La secuencia de aminoácidos de la cepa de referencia ATCC 49349 se da por completo. Para más isoformas detectables, se enumeran las sustituciones de aminoácidos específicos solamente. La numeración de los aminoácidos siempre incluye la puesta en metionina; si la espectrometría de masas indica su ausencia, se escribe en soportes (M). Para cada masa molecular isoforma, diferencia de masa para hacer referencia a la cepa ATCC 49349 isoformas y frecuencia dentro del conjunto de datos isoforma se indica. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

El paso más crítico en el establecimiento de un régimen de MSPP es la determinación genética inequívoca de las identidades de iones de biomarcadores. Si no es posible identificar un biomarcador, sin duda, entonces debe ser excluido del régimen 13.

El C. ssp. doylei esquema jejuni incluye 14 diferentes iones de biomarcadores. Estos son 5 menos en comparación con la C. jejuni ssp. esquema de jejuni MSPP 13 .La diferencia más significativa entre el detectable C. jejuni ssp. jejuni y C. jejuni ssp. doylei biomarcadores fue la eliminación postraduccional de la metionina amino-terminal en caso de L31 (-M) y L35 (-M) 13.

Como se muestra en la C. probado jejuni ssp. doylei aislar colección, MSPP fue capaz de discriminar los siete tipos de secuencias diferentes MLST. Esto significa que cada aislado probado pertenecía a una lentej específica MSPPTipo cia. Además, permite MSPP subespecie diferenciación entre C. jejuni ssp. jejuni y C. ssp jejuni. doylei.

En general, el potencial de discriminar los aislados en el nivel por debajo de la cepa por Ministerio de Salud es menor en comparación con ADN secuencia basada en métodos como MLST. Suponiendo una base de datos isoforma bien establecida, la subtipificación de las cepas bacterianas es mucho más rápido y mucho más barato en comparación con los métodos de secuenciación de ADN 4, 13.

La mayor ventaja de MSPP en comparación con los métodos de agrupamiento jerárquico de ICMS-espectros como el uso del análisis de componentes principales (PCA) 4, 10, 28 o el análisis UPGMA de la matriz matemática que resulta de la comparación de coincidencia de pico binario perfiles 29, 30 es su alta reproducibilidad intrínseca. Mientras que diferentes condiciones culturales, como diferentes culturmedios de comunicación e, diferentes cargas de agar, diferente temperatura de incubación, y los diferentes períodos de incubación afectan significativamente las relaciones phyloproteomic calculados por PCA, que no afectan a las relaciones MSPP deducidas 6, 13. La razón principal de esto es la alta reproducibilidad independencia de la intensidad del pico y la calidad espectro de masas en general 13. Si un pico correspondiente MSPP en el espectro de masas de un aislado no se puede identificar sin lugar a dudas, es necesario registrar el espectro de masas del aislado individuo de nuevo.

El método se puede adaptar MSPP, en principio, a todas las especies microbianas. Especialmente, la subtipificación de especies microbianas relevantes clínicos como Clostridium difficile, Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Salmonella enterica ssp. Enterica son posibles aplicaciones futuras. Si la expresión de factores de virulencia o genes de resistencia se correlaciona con la phylrelación oproteomic, MSPP puede convertirse en una herramienta innovadora en el diagnóstico clínico de rutina. El número de picos detectables y así el número de iones de biomarcadores incluidos en el esquema MSPP potencialmente se podría aumentar mediante el uso de extracción específica y / o protocolos de lisis, especialmente en el caso de los hongos 31.

Las técnicas de MALDI-TOF usadas recientemente pueden detectar principalmente sólo los muy abundantes proteínas ribosomales. Estas proteínas muy abundantes interfieren con casi todos los demás proteínas más pequeñas, tales como factores de virulencia en el espectro de masas. Proteínas más pequeñas podrían ser detectados mediante la vinculación de ESI-TOF-EM (tiempo de ionización de vuelo espectrometría de masas) y HPLC (cromatografía líquida de alta resolución) 32. Sin embargo, en la actualidad este método es demasiado trabajo y costoso para caracterizar las cohortes más grandes del aislante.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
acetonitrile Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany 34967
Autoflex III TOF/TOF 200 system Bruker Daltonics, Bremen, Germany GT02554 G201 Mass spectrometer
bacterial test standard BTS Bruker Daltonics, Bremen, Germany 604537
BioTools 3.2 SR1 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 263564 Software Package
Bruker IVD Bakterial Test Standard Bruker Daltonics, Bremen, Germany 8290190 5 tubes
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG8843 ATCC 49349;IMVS 1141;NCTC 11951;strain 093
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG9143 Goossens Z90
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG7790 ATCC 49350;CCUG 18265;Kasper 71;LMG 8219;NCTC 11847
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG9243 Goossens N130
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG8871 NCTC A603/87
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG9255 Goossens B538
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG8870 NCTC A613/87
Columbia agar base  Merck, Darmstadt, Germany 1.10455 .0500 500 g
Compass for FlexSeries 1.2 SR1 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 251419 Software Package
defibrinated sheep blood  Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Germany SR0051
ethanol Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany 02854 Fluka
formic acid Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany F0507
HCCA matrix Bruker Daltonics, Bremen, Germany 604531
Kimwipes paper tissue Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany Z188956
MALDI Biotyper 2.0 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 259935 Software Package
Mast Cryobank vials Mast Diagnostica, Reinfeld, Germany CRYO/B
MSP 96 polished steel target Bruker Daltonics, Bremen, Germany 224989
QIAamp DNA Mini Kit  Qiagen, Hilden, Germany 51304
recombinant human insulin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany I2643
trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany T6508
water, molecular biology-grade Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany W4502

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References

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Genética No. 116 MALDI-TOF por debajo de la diferenciación de especies phyloproteomics ICMS, MSPP microbiología
subtipificación de<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; El uso de aislamientos PhyloProteomics basados ​​en espectrometría de masas (MSPP)
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