Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

طرق الحادة وتحت الحادة الفئران Hindlimb نقص التروية

Published: June 21, 2016 doi: 10.3791/54166
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Division of Cardiology, Department of Medicine, Duke University Medical Center

Abstract

مرض الشريان المحيطي (PAD) هو السبب الرئيسي لاعتلال القلب والأوعية الدموية والوفيات في البلدان المتقدمة، والنماذج الحيوانية التي تتكاثر بشكل موثوق الأمراض التي تصيب البشر وتكون ضرورية لتطوير علاجات جديدة لهذا المرض. وقد استخدم نموذج الفأر hindlimb نقص التروية على نطاق واسع لهذا الغرض، ولكن الممارسة القياسية على إحداث نقص تروية الأطراف الحادة التي ربط الشريان الفخذي يمكن أن يؤدي إلى نخر الأنسجة كبير، المساومة على قدرة الباحثين على دراسة استجابات الأوعية الدموية والأنسجة العضلية الهيكلية لنقص التروية . نهج بديل لعملية ربط الشريان الفخذي هو تحريض التدريجي انسداد الشريان الفخذي من خلال استخدام العضلات القابضة ameroid. عند وضعه حول الشريان الفخذي في المواقع نفسها أو مختلفة مثل مواقع ربط الشريان الفخذي، وهذه الأجهزة تسد الشريان خلال 1-3 أيام، مما أدى في أكثر تدرجا، نقص التروية تحت الحاد. هذه النتائج في أقل كبير الهيكل العظمي نخر الأنسجة العضلية، ثهيك قد تحاكي بشكل وثيق الردود ينظر في PAD البشري. بسبب تأثيرات الخلفية الوراثية الحصائل في كل من النماذج نقص التروية الحادة وتحت الحادة، النظر في سلالة الماوس قيد الدرس المهم في اختيار النموذج الأفضل. وتصف هذه الورقة الإجراء المناسب ووضع التشريحي للالأربطة أو العضلات القابضة ameroid على الشريان الفخذي الماوس للحث تحت الحاد أو نقص التروية hindlimb الحاد في الماوس.

Introduction

مرض الشريان المحيطي (PAD) هو السبب الرئيسي للوفيات والأمراض القلبية الوعائية في البلدان المتقدمة 1. النتائج PAD من انسداد تصلب الشرايين الشرايين الطرفية الذي يؤدي إلى نقص تروية الأطراف مع الألم الجهدي أو الراحة الناتجة وأحيانا الغير قابلة للشفاء القرحة والغرغرينا التي تستلزم بتر الأطراف. وتوجه العلاجات التي تستهدف في المقام الأول PAD نحو اللف 2 أو إعادة التوعي الجراحية 3، كما في الأساس ليست علاجات طبية فعالة توجد 4.

للأسف، عودة التوعي غالبا ما تكون ذات فائدة محدودة، والطعوم تجاوز معدلات فشل عالية (تصل إلى 50٪ خلال 5 سنوات) 5 التي هي أسوأ في بعض المجموعات السكانية (على سبيل المثال، المدخنين، والنساء، ترقيع الوريد الصافن غير) 6،7. النهج اللف، مثل قسطرة والدعامات، وتتأثر أيضا بنسب عودة التضيق العالية (اكثر من 50٪ في غضون سنة 1)، ولا سيما البرامج طن فخذي مأبضي مرض 8، على الرغم من أن استخدام المناطيد يبلغ حجمه المخدرات والدعامات تحسنت النتائج إلى حد ما 11/09. من أجل تطوير علاجات جديدة لPAD من الضروري تطوير النماذج الحيوانية التي تتكاثر بشكل موثوق الأمراض التي تصيب البشر.

حتى الآن، والنموذج الأكثر شيوعا من PAD هو النموذج hindlimb نقص التروية (HLI)، والتي في معظم الأحيان تؤدى في الفئران 12،13. في المظهر الأكثر شيوعا لها، ينطوي على نموذج الربط الجراحي للشريان الفخذي الداني والقاصي والتدخل-فروع جانبها يتبعه استئصال السفينة، مما أدى إلى انسداد تدفق الدم وتحريض نقص التروية أطرافهم الحاد. وقد استخدم HLI في المقام الأول لدراسة الردود عائية وarteriogenic في الطرفية الأنسجة أطرافه العضلية وآثار العلاجات المختلفة (على سبيل المثال، والمخدرات، والتسليم الجينات، الخلايا الجذعية) على هذه الردود. وفي الآونة الأخيرة، استخدمت مجموعتنا هذا النموذج لدراسة دور خلايا عضلات الهيكل العظمي طن ردا على أطرافهم نقص التروية وآثار الاختلافات الوراثية على النتائج 14.

وقد يسر نموذج HLI فهمنا الحالي أن ردود الأوعية الدموية والعضلات لنقص التروية تعتمد على الوراثة (أي سلالة الفطرية) 15، 16 عاما، ووجود أو عدم وجود أمراض أخرى أو الظروف ذات الصلة إلى تصلب الشرايين، بما في ذلك داء السكري 17 و ارتفاع الكولسترول 18. ومع ذلك، ثمة ضعف هام من طراز HLI التقليدي هو أنه نموذج للطرف نقص التروية الحاد 12،13، في حين PAD البشري يسبب نقص التروية المزمن نتيجة التطور التدريجي للآفات تصلب الشرايين انسداد في الشرايين الطرفية.

في محاولة للتحايل على هذا الضعف، تانغ وزملاؤه ضعت في البداية نموذج الفئران من تدريجي انسداد الشرايين الفخذ باستخدام العضلات القابضة ameroid 19، ونفس المجموعة الرابعة في وقت لاحقeveloped نموذج الفأر مماثل 20. وقد وصفت العضلات القابضة Ameroid في البداية في 1950s في نموذج الكلاب نقص تروية عضلة القلب المزمن 21،22. هذه الأجهزة لديها كم المعادن الخارجي يغلف طبقة داخلية من مادة استرطابي، عادة الكازين، وعند وضعه حول الشريان أنها تحفز انسداد الأوعية تدريجيا كما أنها تمتص الرطوبة من الأنسجة المحيطة بها. في تعديلها من طراز يانغ وآخرون. وضعت العضلات القابضة في كل من الداني والقاصي الشريان الفخذي في مواقع مشابهة لمواقع ربط الجراحية، وأنها ligated فروع الجانب من الشريان الفخذي، كما هو الحال في النموذج التقليدي. مقارنة مع HLI حاد، أدى ameroid نقص التروية الناجم عن انقباض في أقل تعبير عن الجينات الالتهابية والقص التي تعتمد على الضغط، انخفاض انتعاش تدفق الدم 4-5 أسابيع بعد الجراحة، وأقل نخر العضلات 20. وبناء على هذه الملاحظات، رئي أن انسداد الشرايين تدريجيا قد تقدم نموذجا للPم أكثر أهمية إلى الأمراض التي تصيب البشر.

والجدير بالذكر، في التقرير الأصلي، تم فحص آثار ameroid نقص التروية الناجم عن المضيقة فقط في C57BL / 6 الفئران 19، والتي هي مقاومة نسبيا لالناجم عن نقص التروية العضلات نخر 15. ونحن مؤخرا تعديل نموذج نقص التروية التدريجي أبعد من ذلك واستكشاف آثاره في أكثر-نقص التروية عرضة BALB / ج الماوس سلالة 23. في أول مظهر من مظاهر هذا النموذج، وضعنا العضلات القابضة في كل من الداني والقاصي شريان الفخذ لكنه ترك كل فروع جانبية سليمة. في الثاني، وتعديل أكثر اعتدالا، وضعنا المضيقة واحدة فقط على الشريان الفخذي الداني، ومرة ​​أخرى ترك كل الرياحات الجانب من الشريان سليمة. في كل التعديلات من هذا النموذج، وجدنا أن الفئران BALB / ج، ولكن ليس C57BL / 6 الفئران، عرض نخر عضلة كبيرة على الرغم من وجود تدفق الدم مماثلة وكثافة الأوعية الدموية. على غرار الدراسة السابقة لدينا 14، وأظهرت هذه النتائج أن عضلات الطرفلا يتأثر إصابة فقط من تدفق الدم، ولكن هو في جزء منه يعتمد على الخلفية الوراثية. وعلاوة على ذلك، وجدنا أن تدفق الدم أطرافهم انخفض إلى الحضيض في غضون 3 أيام، وبالتالي فإن النموذج يبدو أكثر واحد من "تحت الحاد 'بدلا من تدريجي نقص تروية الأطراف.

وبناء على هذه الدراسات السابقة، يبدو واضحا أن أسلوب واحد لإحداث hindlimb نقص التروية قد لا تكون مناسبة في جميع الحالات. بسبب مجموعة متنوعة من الظروف (على سبيل المثال، والاختلافات الوراثية وجود أو عدم وجود شروط المشارك المهووسين) تأثير كل من الأوعية الدموية والعضلات الردود محددة الهيكل العظمي، قد المحققين تجد أنه من الضروري تعديل الإزمان و / أو شدة نقص التروية hindlimb إلى الأفضل تناسب أغراضهم. وعلاوة على ذلك، والأوصاف السابقة من طراز تفتقر عادة المعالم التشريحية المناسبة لتسهيل موثوق استنساخ بين محقق من هذه التقنية. في هذه الورقة، وأساليب لإحداث إما حاد أو تحت الحاد نقص التروية hindlimb في الماوستم وصفها، وتقدم المعالم التشريحية الدقيقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد أجريت التجارب على الحيوانات فقط وفقا لبروتوكول افقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي ديوك. استخدمت الفئران الذكور في هذه الدراسة، على الرغم من أن كلا الجنسين يمكن أن تستخدم على النحو المشار إليه لغرض العلمي للدراسة.

1. إزالة الشعر

  1. قبل التخدير، وإنشاء منطقة إعداد ما قبل العمليات الجراحية التي تتكون من وسادة التدفئة مغطاة وضعت في 37 درجة مئوية ومنفذ الرؤوس متصلة التدفق المستمر للالأيزوفلورين.
  2. ضع الماوس في غرفة التخدير تحريض. ضبط تدفق متر O 2-1 لتر / دقيقة والأيزوفلورين إلى 1-3٪.
    وبفعل التخدير عادة في 25 غ الماوس مع 2٪ الأيزوفلورين: ملاحظة.
  3. تحقق استجابة التحفيز الماوس، هزاز بلطف الغرفة ومراقبة عدم وجود رد فعل المقوم.
  4. مسح الغرفة مع O 2 لمسح الأيزوفلورين قبل الافتتاح. التحرك بسرعة الماوس إلى التدفئة صإعلان وتوصيله إلى الأيزوفلورين عبر الرؤوس.
  5. ضبط الأيزوفلورين إلى 1.5٪. تحقق من استجابة التحفيز عن طريق دواسة المنعكس (قرصة أخمص قدميه).
  6. تطبيق مواد التشحيم العيون بحرية لكلتا العينين لتجنب جفاف أثناء الجراحة.
  7. حلق الشعر من كل أطرافه الخلفية باستخدام الانتهازي الكهربائية الصغيرة. عقد الجلد مشدود في حين حلق لتجنب يمزق الجلد.
  8. تطبيق قبل تحسنت كريم إزالة الشعر وترك الجلوس لمدة 1 دقيقة. يمسح برفق بعيدا باستخدام شاش مبلل.
  9. لعملية جراحية في وقت لاحق، وإيقاف الأيزوفلورين وتحريك الماوس إلى ورقة فارغة مبطنة منشفة الانتعاش قفص لضمان الماوس لا نضح الفراش القفص. مراقبة الحيوانات حتى أنها قادرة على الحفاظ على الاستلقاء القصية. خلاف ذلك، حرك الماوس إلى طاولة الجراحة.
    ملاحظة: عملية إزالة الشعر يمكن أن تحدث تهيجا في الجلد وتؤثر على القياسات نضح. فمن المستحسن الانتظار 1-2 أيام بعد إزالة الشعر الحيوان قبل عerforming مسح التروية قبل الجراحة أو إجراء العمليات الجراحية.

إعداد 2. قبل الجراحة

  1. استخدام الأدوات التالية أثناء هذا الإجراء. مقص صغير مستقيم الجراحية، 2 مقلوب غرامة ملقط الزاوية، ملقط غريف صغيرة، ملقط سائق إبرة، 3 مبعدات، مقص الربيع الصغيرة، ومسحات القطن يميل غرامة.
  2. تعقيم جميع الأدوات باستخدام الأوتوكلاف قبل الشروع في عملية جراحية. استخدام معقم الساخنة حبة قبل وبين كل إجراء العمليات الجراحية، لمدة تصل إلى 5 الحيوانات. تعقيم الحزم أداة جراحية أخرى لعملية جراحية لمجموعات أكبر من 5.
  3. إعداد الجراحي الميداني معقم يتكون من وسادة التدفئة تغطيتها ومنفذ الأيزوفلورين. أداء جميع الأعمال تحت 10 ستيريو تشريح المجهر.
  4. تخدير وإعداد الماوس كما هو موضح في الخطوات 1،1-1،5.
  5. تأكد من أن الفأر هو مخدرا بالكامل ووضع في موقف ضعيف على طاولة الجراحة. تأمين ساقيه باستخدام الشريط الجراحية. </ لى>
  6. في حالة استخدام وسادة التدفئة التحكم في درجة حرارته، ونعلق على التحقيق في درجة الحرارة وثبته على قاعدة من منصة الجراحية باستخدام الشريط الجراحية للتأكد من أنه لن يتم سحبها عن طريق الخطأ من خلال هذا الإجراء.
  7. تنظيف الموقع شق باستخدام 3 بالتناوب بوفيدون اليود والكحول مناديل. تغطية حيوان مع ثنى الجراحية المعقمة وقطع حفرة لفضح موقع شق.

3. الحث بالطرف نقص التروية

  1. استخدام مشرط لجعل شق الأولي على طول وسط الفخذ وسطي، ويمتد من الركبة نحو البطن، وإطالة شق إلى حوالي 1 سم مع مقص غرامة (الشكل 1A).

شكل 1
الشكل 1. الموقع الجراحي والأوعية الدموية تشريحية معالم لجراحة ماوس Hindlimb نقص التروية. (A) عرض الخارجي لوhindlimb من الماوس في موقف ضعيف. خط تحاك يشير إلى موقع شق لتنفيذ الإجراءات hindlimb نقص التروية بشكل صحيح. (ب) عرض للالداني الأوعية الدموية الماوس hindlimb. نهاية القريبة من الشريان الفخذي (FA) تنشأ من تحت الرباط الإربي (IL). يقع النهاية البعيدة من اتحاد كرة القدم في التشعب لها في شريان باطن الركبة (PA) والشريان الصافن (SA). الشرايين الضمانات الرئيسية الخروج من اتحاد كرة القدم هي الجانبي الشريان المنعطف الفخذي (LCFA)، والداني الذيلية الشريان الفخذي (PCFA)، وسطحية الشريان الشرسوفي الذيلية (SCEA). الوريد الفخذي (اناث) يعمل المجاور لاتحاد كرة القدم، وفروع وريدية يمكن رؤية موازية لفروع الشرايين الرئيسية. النجمة (*) للدلالة على الداني والقاصي مواقع لوضع العضلات القابضة ameroid أو الأربطة، وهذا يتوقف على ما إذا كان تحت الحاد أو نقص التروية الحاد سوف يكون ذلك حافزا. الرجاء المبادرة القطريةCK هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. باستخدام ملقط، فتح شق وفضح الغشاء الذي يغطي أنسجة الدهون الأربية (IFT).
  2. باستخدام ملقط مغلقة، بيرس من خلال الغشاء في الفصل بين IFT والبطن. الافراج عن الضغط بلطف على ملقط لفصل IFT من عضلات البطن، وفضح حزمة وعائية عصبية تحتها. مراقبة القريبة وفروع الذيلية سطحية كما المعالم التشريحية الهامة (الشكل 1B).
  3. إدراج ضام وسحب الأنسجة البطن قريب لفضح الداني ameroid المضيقة أو ربط الموقع، فقط الأقرب إلى جانبي الشريان الفخذي المنعطف (الشكل 1B). الشريان المنعطف الجانبي يكمن حوالي 5 ملم الأقرب إلى الداني والشرايين الذيلية سطحية.
    1. إدراج اثنين من أكثر مبعدات في الجزء الأعلى من شق، وسطي واحد واحد الجانبي، لسحب IFT بشكل أقصى بعيدا عنموقع الجراحية لتوسيع مجال العمليات الجراحية.
  4. استخدام اثنين من ملقط غرامة لإزالة الغشاء الأبعد تغطي حزمة وعائية عصبية. إدراج بلطف نصف من طرف ملقط غرامة بين الوريد والشرايين، وانزلاق غيض ملقط تحت الغشاء الذي يربطهم معا. إغلاق ملقط والمسيل للدموع بلطف بعيدا الغشاء.
  5. إدراج غيض من ملقط مغلقة بين الوريد والشريان وخلق فجوة بينهما عن طريق الإفراج عن الضغط على ملقط. كرر هذه التقنية لخلق فجوة بين الشريان والعصب.
  6. لتحت الحاد أطرافهم نقص التروية، وضع المضيقة ameroid على الشريان الفخذي القريبة (الشكل 2).
    1. لتثبيت المضيقة ameroid الداني، حرك غيض من ملقط تحت الشريان الفخذي إلى عزلها عن حزمة وعائية عصبية. استخدام مجموعة ثانية من ملقط angled- إلى قبضة حافة المضيقة وتوجيهها تحت الشريان الفخذي.
    2. وضع الشريان الفخذي في الصورةالكثير في المضيقة. كرر لالمضيقة البعيدة، وتحديد المواقع القريبة على الفور إلى التشعب من الشريان الفخذي في شريان باطن الركبة والشريان الصافن (الشكل 2).

الشكل 2
الشكل 2. تنسيب من Ameroid العضلات القابضة والحروف المركبة. (أ) مثال اثنين من العضلات القابضة ameroid وضعت على الشريان الفخذي للحث تحت الحاد hindlimb نقص التروية. يتم وضع المضيقة الأقرب فقط الداني إلى الشريان الفخذي المنعطف الجانبي (LCFA). يتم وضع المضيقة البعيدة فقط الأقرب إلى التشعب من مأبضي (PA) والشرايين الصافن (SA). يتم تثبيت العضلات القابضة مع تعيين فتحة مواجهة لضمان الشريان بشكل صحيح داخل المضيقة. (ب) مثال على الحروف المركبة من الشريان الفخذي للحث على نقص التروية hindlimb الحاد. Ligaturيتم وضع العناوين (الأسهم الصفراء) بحيث أنها تطويق موقف العضلات القابضة في لوحة (B)، ومقطوع الشريان الفخذي بين كل مجموعة من اثنين من الأربطة (النجمة). بار، 1 ملم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. لنقص تروية الأطراف الحادة، ligate والقطع الشريان الفخذي الداني.
    1. إلى القطع الشريان الفخذي، موضوع 7 - O خياطة تحت الشريان فقط الداني إلى موقف المضيقة الداني (انظر الخطوة 3.7) وligate. ربط ربطة الثاني حوالي 1 مم القاصي إلى الأول.
    2. استخدام مقص الربيع إلى القطع الشريان بين الحروف المركبة اثنين. لtransection الشرايين البعيدة، كرر هذه الخطوات، ووضع اثنين من الأربطة وحوالي 1 ملم بعيدا، فقط الأقرب إلى التشعب من الشريان الفخذي في شريان باطن الركبة والشريان الصافن ولكن التأكد من أنها البعيدة إلى caud سطحيةآل الشريان الشرسوفي (انظر الشكل 1)
  2. إغلاق شق باستخدام توقف 5 - يا الغرز vicryl.

4. الإرواء التصوير

  1. تحريك الماوس إلى 37 درجة مئوية وسادة التدفئة وضع تحت تصوير دوبلر الليزر نضح (LDPI) والاتصال عبر الرؤوس إلى مصدر الأيزوفلورين. إذا لم يكن هناك رصد لدرجات الحرارة هو متاح، والسماح 5 دقائق للماوس لتدفئة تصل إلى 37 درجة مئوية.
  2. بدوره على تصوير وإطلاق برنامج التقاط الصور.
  3. انقر على أيقونة "جديدة واحدة صورة" لفتح نافذة "إعداد الماسح". مجموعة 'مسح الحجم "إلى" كبير "و" سرعة المسح الضوئي' إلى '4 مللي / بكسل. ضبط منطقة المسح الضوئي عن طريق تغيير قيم x و y تحت "مسح المنطقة (وحدة)" الجزء.
  4. انقر فوق علامة التبويب "فيديو وبعد" لعرض الفيديو تغذية، وترتيب الماوس لتناسب منطقة المسح الضوئي يدل على مخطط الحمراء. انقر على "القطر السيارات" لمعايرةالمسافة من الليزر لهذا الموضوع. انقر على "التالي" لفتح نافذة "تفاصيل الموضوع.
  5. أدخل المعلومات تخضع وأي تعليقات ذات الصلة. انقر فوق الزر "التالي" للانتقال إلى إطار المسح.
  6. انقر على زر "البدء القياس" لفتح "تأكيد أو تجاوز المسح بعد" الحوار. انقر فوق "موافق" لتأكيد مسافة المسح الضوئي. مراقبة عملية المسح تبدأ وتشغيل عن 4-8 دقائق اعتمادا على حجم منطقة المسح الضوئي.
  7. بعد مسح كامل، نلاحظ نافذة "حفظ باسم". اسم الملف وحفظه.
  8. اغلاق الأيزوفلورين وتحريك الماوس إلى قفص الانتعاش فارغة، ورصد حتى يكون قادرا على الحفاظ على الاستلقاء القصية الحيوان. لا تضع الماوس يتعافى من التخدير في قفص مع الفئران الأخرى.
  9. فتح برنامج تحليل الصور. انقر على أيقونة 'فتح' وتصفح لوفتح ملف الصورة لتحليلها. في إطار ملف، ومراقبة تدفق،الصورة، والصور الملونة من الفأرة.
  10. بمناسبة المنطقة ذات الاهتمام (ROI) على الصورة التمويه، انقر على أيقونة "مشاهدة رويس". التالي انقر على زر "إضافة مضلع 'واسحب المؤشر حول الطرف غير الجراحية لرسم العائد على الاستثمار. انقر بزر الماوس الأيمن لإغلاق الشكل. اختر 'إضافة مضلع "مرة أخرى ورسم العائد على الاستثمار المطابقة حول أطرافهم الجراحي.
  11. فوق رمز "الإحصائيات" لفتح "صورة نتائج رويس الإحصاء (PU)" نافذة. لاحظ الفرق في المئة في حالة تغير مستمر في العمود 'الجريان٪'.
    ملاحظة: العائد على الاستثمار الأول رسمها سيكون بمثابة المرجع.
    ملاحظة: قبل كل فحص نضح لاحقة اتباع الخطوات الموضحة في القسم 1 لتخدير الماوس وفي الخطوات 4،1-4،11 لصورة الحيوان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

التحديد السليم من الأوعية الدموية الماوس hindlimb أمر بالغ الأهمية لضمان استنساخ تقنيات لإحداث كلا تحت الحاد ونقص التروية hindlimb الحاد، كما هو موضح هنا. بالإضافة إلى الاختلاف الكامن في الدراسات الحيوانية، يمكن لعوامل أخرى إدخال التغير في الليزر دوبلر نضح التصوير (LDPI)، بما في ذلك نوع من التخدير، والموقف من الحيوانات (مقابل ضعيف عرضة)، ودرجة حرارة الجسم (انظر الشكل 3). وبالإضافة إلى ذلك، وتحت الحاد hindlimb نموذج نقص التروية يعتمد على نوعية العضلات القابضة ameroid، والتي يمكن أن تختلف على نطاق واسع ضمن دفعة معين (انظر الشكل 4). كل من هذه القضايا يمكن أن يكون لها آثار كبيرة على الكميات تدفق يقاس LDPI وتمت مناقشتها في مزيد من التفاصيل أدناه.

وبعد وضع العضلات القابضة ameroid في نموذج نقص التروية تحت الحاد hindlimb أو ربطوtransection من الشريان الفخذي في نموذج hindlimb نقص التروية الحاد، ينبغي الحصول على الصور LDPI فورا بعد العملية في حين لا يزال تخدير الحيوان لإثبات آثار الجراحة وتحديد مستوى خط الأساس بعد العمليات الجراحية من نضح (الشكل 5). يتم تنفيذ الكميات من نضح عن طريق رسم المنطقة ذات الاهتمام (ROI) حول hindlimb الدماغية والعائد على الاستثمار مقارنة حول hindlimb غير الدماغية. وأعرب عن نضح الأكثر شيوعا كنسبة من نضح في الطرف الدماغية لأنه في أطرافه غير الدماغية، ويتم قياس التغيرات في هذه النسبة مع مرور الوقت. لقد وجدنا أن الفئران التصوير في نتائج ضعية الرقود في أقل تغيرا بسبب حركة الحيوان والتغييرات في المواقع القدمين من نقطة زمنية واحدة إلى أخرى. وعلاوة على ذلك، نضح في أعلى الفخذ يميل إلى أن يكون أكثر متغير عند الفئران هي في موقف ضعيف. يجب أن لوحظ فقدان كامل للنضح hindlimb بعد تحريض الطرف الحادنقص التروية، في حين سوى انخفاض طفيف في نضح عادة ما يلاحظ بعد وضع العضلات القابضة ameroid في نموذج تحت الحاد (الشكل 5). في بعض الحالات، لاحظنا المضيقة انسداد السريع مع خسارة هائلة الناتجة من نضح مباشرة بعد العملية.

الشكل (3)
الشكل 3. الاختلاف في الإرواء التصوير بناء على Hindlimb الوظيفة ودرجة حرارة الجسم. الليزر دوبلر الصور نضح من واحد BALB / ج الماوس، تخدير مع 1.5٪ الأيزوفلورين وفحصها في كل موقف ضعيف وعرضة في 35 درجة مئوية، 37 درجة مئوية، و 38 درجة مئوية. مع التخدير الأيزوفلورين، تميل hindlimbs الحيوان للتحرك مع التنفس، مما أدى إلى قطعة أثرية (خطوط أفقية) التي لوحظت مع أكبر تردد على مستلق مقارنة الصور عرضة. في وضعية الانبطاح، انه من الاسهل بكثير لإنتاج زاوية دقيقةمن القدمين، مما يجعل تقدير حجم نضح مع مرور الوقت أكثر دقة. يتم تقليل التروية بشكل كبير حيث تنخفض درجة حرارة الجسم أقل من 37 درجة مئوية، في حين أن المشبعة الصور عند ارتفاع درجات الحرارة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. تباين تجاريا متاح Ameroid العضلات القابضة (A) مثال 0.25 مم القطر الداخلي (السهم برأسين) المضيقة مثالية مع شكل فتحة موحد وسمك الكازين (B - D). أمثلة على اختلاف شكل الفتحة. وقد تعرض فتحات أحيانا 'د' الشكل (B و C) أو "ب" شكل (D). في هذه الحالات، وإلى حد ما بالتساوي توزيع الكازين وفتحات عميقة بما فيه الكفاية حودينار الشريان. (E) مثال سمك الكازين متفاوتة. سيتم تجاهل هذا المضيقة. (F) مثال على الفتحة التي هي ضحلة جدا لعقد الشريان في مكان أثناء انقباض. هذا المضيقة كما سيتم التخلص منها. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. الإرواء الصور مباشرة بعد تحريض تحت الحادة أو الحاد Hindlimb نقص التروية. التمثيلية الصور نضح في كل موقف ضعيف وعرضة للBALB / ج الفئران التي خضعت لوضع اثنين من العضلات القابضة ameroid على الشريان الفخذي الأيسر للحث تحت الحاد hindlimb نقص التروية أو التنسيب اثنين من الأربطة وtransection من الشريان الفخذي الأيسر للحث على نقص التروية hindlimb الحاد. لاحظ أن perfusioيتم تخفيض ن ولكن لا يزال يمكن كشفها بعد وضع المضيقة ameroid، في حين تم الكشف في الأساس ليست تدفق على الفور بعد ربط مزدوج / transection من الشريان الفخذي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ولعل الخطوة الأكثر تحديا في هذا الإجراء هو الفصل بين الشريان الفخذي من الوريد الفخذي. قطر أكبر وأرق الجدران من الوريد الفخذي مقارنة مع أولئك الشريان زيادة قابليته للثقب وتمزق خلال التلاعب الجراحية. احتمال تعطيل الوريد يمكن الحد من الحفاظ على رطوبة الجرح باستخدام مسحة معقمة مبلل مع برنامج تلفزيوني. ومن المهم أيضا التأكد من أن جميع ملقط وشحذ، والانحياز، وخالية من فواصل من أجل السماح للتلاعب دقيق للسفن والأنسجة المحيطة بها. في حال أن النزيف لم يحدث، والضغط على المنطقة بشاش معقم حتى توقف النزيف. ينبغي الحفاظ على الملاحظات جراحية مفصلة لكل حيوان، وما يمكن أن ينظر إليها على أنها 'الثانوية' نزيف أحداث قد تمثل الإصابة الدماغية عن غير قصد أشد في المدى الطويل. لتناسق البيانات، والعمليات الجراحية التي تنطوي على أي الوريدي أو جانبية تنزف الشرايينجي أحداث حاسمة.

وجود قيود على هذا الأسلوب هو أن شدة و / أو ظهور نقص التروية (في تحت الحاد ameroid نموذج المضيقة) يمكن أن تختلف على نطاق واسع اعتمادا على عدة عوامل. سوف المضيقة الموقع / ربط الداني تحديد كيفية تأثر العديد من الشرايين ضمانات من تحريض نقص التروية. ترك الفروع الجانبية سليمة يقلل من شدة الإصابة، على الرغم من أن كما لوحظ، في سياقات معينة، أي في الحيوانات من بعض خلفيات وراثية حتى أكثر اعتدالا، يمكن تحت الحاد نقص التروية يسبب نخر الأنسجة كبيرة 23. وعلاوة على ذلك، فإن إضافة ثانية، المضيقة البعيدة أو ضمد نقصان التروية في كل نموذج الحاد وتحت الحاد 23. وقد ligated بعض المحققين أو استخدامها لكهربي لاجتثاث فروع ضمانات من الشريان الجانبي المنعطف، والقريبة الشريان الفخذي الذيلية، وسطحية الذيلية الشريان الشرسوفي 24. هذه النتائج في أكثر شدة نقص التروية لالثانية ربما تتسبب في المزيد من اصابة في العضلات، على الرغم من أن هذا يعتمد أيضا على خلفية وراثية. من المهم أن نلاحظ أن كهربي قد تكون أكثر عرضة لتؤدي إلى إصابة الأنسجة المحيطة بها، وبالتالي يجب أن تستخدم بحذر.

في ضوء هذه المتغيرات، فمن الأهمية بمكان أن تشريح الأوعية الدموية وحددت بدقة قبل اختيار موقع الانسداد. وأشار كوتشي وآخرون. 25 عدم وجود ملحوظ من توافق في الآراء بين العديد من التقارير بشأن أسماء وأماكن الأوعية الدموية في hindlimb الماوس، وكانوا قد قدموا وصفا تفصيليا دقيقا للتشريح الشرايين التي نعتقد أنها هي دليل لا غنى عنه لأي شخص القيام بهذا إجراء. تظاهر ما نشر في وقت سابق في هذه المجلة التقنية لإحداث حاد الطرف نقص التروية 13، ولكن في ذلك التقرير المعالم التشريحية الأوعية الدموية لم تكن واضحة المعالم. كان هدفا مهما من هذا التقرير إلى توفير تحسين البصري التمثيل سو تلك المعالم بالإضافة إلى يدل على تعديل هذه التقنية باستخدام تحت الحاد أطرافهم نقص التروية.

قيود إضافية لهذا النهج هو أن ظهور نقص التروية في نموذج تحت الحاد نقص التروية هو وظيفة نوعية العضلات القابضة ameroid يستخدم أحد. لقد وجدنا أن العضلات القابضة التجارية يمكن أن تختلف في العمق وشكل فتحة الداخلية (الشكل 4). إذا كانت فتحة ضحلة جدا يمكن مقذوف الشريان أثناء انقباض. يجب التخلص من العضلات القابضة مع الكازين متصدع أو فتحات تالف. بالإضافة إلى ذلك، التوزيع غير متناسقة من الكازين داخل المضيقة يمكن أن يؤدي إلى معدلات متسارعة من الانسداد. حجم وعمر الفئران هو عامل حاسم آخر للنظر، وأحجام السفن في الفئران "الكبار" قد تختلف اختلافا كبيرا تتراوح أعمارهم بين 8 و 30 أسابيع من العمر. هذا مهم بشكل خاص عند استخدام الأفواج مستقلة متعددة من الفئران لتوليد مجموعات البيانات، كما األصغر على ما يبدوالفئات العمرية ل (على سبيل المثال، 10 - 16 أسبوعا) قد يؤدي إلى معدلات غير متناسقة من انسداد وشدة الإصابة أطرافهم الدماغية.

الكمي لدوبلر الليزر التصوير نضح يمكن أيضا أن تختلف على نطاق واسع على درجة حرارة جسم الحيوان وموقف (الشكل 4)، وكذلك وكيل مخدر يستخدم. ومن الأهمية بمكان أن الماوس الحفاظ على 37 درجة مئوية درجة حرارة الجسم أثناء التصوير نضح. إذا كانت درجة الحرارة أكثر من 37 درجة مئوية وتكون مشبعة الصورة الارواء. إذا كانت درجة الحرارة أقل من 36 درجة مئوية إشارة نضح قد تكون ضعيفة للغاية. فمن المهم للحفاظ على ساقيه متناظرة قدر الإمكان للحصول على نسبة نضح دقيقة (نضح في الطرف الدماغية مقارنة بما كان عليه في الطرف غير الدماغية) أيضا. على الرغم من أن الفئران هي في كثير من الأحيان تصوير في حين يرقد مستلق، قد يكون التماثل الجهد للحفاظ على هذا الموقف. وعلاوة على ذلك، والتباين في تدفق الدم في الجزء العلوي من حقل التصوير، أي العلاقات العامةالفخذ oximal، يمكن أن تسهم في تقلب في الكميات. وبالإضافة إلى ذلك، التخدير مع isoflurane غالبا ما يؤدي إلى زيادة حركة الصدر، والذي بدوره يؤدي حركة الساق وتقلبه في إشارة التي حصل عليها LDPI. لقد وجدنا أن وضع الحيوانات في وضعية الانبطاح يعطي المزيد من الدعم للأطراف، مما يسمح لتسهيل تحديد المواقع وتقلص إلى حد كبير حركة، مما يؤدي إلى تقدير أكثر استنساخه التروية أطرافهم (الشكل 5). وعلاوة على ذلك، وضعية الانبطاح يسهل صيانة أكثر اتساقا من 37 درجة مئوية درجة الحرارة في الأطراف الممسوحة ضوئيا، مما يعزز أيضا استنساخ الكميات (الشكل 5). مقارنة الأيزوفلورين والفئران تخدير مع عرض الكيتامين انخفضت حركة الصدر، مما يجعل من التصوير ضعيف أقل متغير. ومع ذلك، فإن الكيتامين تزيد أيضا تحريض التخدير والوقت الانتعاش، مما أدى إلى زيادة كبيرة في نضح المطلق تقدر 16. كل مجموعة من وضع الجسم وanestوكيل hetic يمكن أن تخلق قيمة صورة نضح متميزة، وبالتالي فمن المهم استخدام تقنية متسقة لكل من هذه الأساليب في جميع القياسات نضح لاحقة.

ومن المهم أن ندرك العديد من القيود الأخرى لهذه التقنية. لأنه في كثير من الأحيان يتم تنفيذ هذا النموذج في الفئران دون أي أمراض المصاحبة، مثل السمنة، والدهون، وتصلب الشرايين، داء السكري، أو غيرها من العوامل التي تؤهب لأمراض الأوعية الدموية، وتحريض نقص التروية أطرافهم أبدا تكرار تماما أمراض PAD السريري. كما لوحظ، وقد تم تقييم آثار نقص تروية الأطراف الحادة في الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين السكري، ومفرط كوليستيرول الدم، وفي المستقبل سوف يكون مفيدا لتحديد آثار هذه الظروف المرضية على الردود على نقص التروية تحت الحاد أطرافهم. وعلاوة على ذلك، لأن PAD هو مرض مزمن، حتى تحت الحاد أطرافهم نقص التروية هو نموذج الكمال السيناريو السريري. ولذلك، سيكون من المهم الاستمرار في تطوير النماذج التييؤدي إلى نقص تروية الأطراف صحيح المزمن واختبارها جنبا إلى جنب مع نماذج من عوامل الخطر القلبية الوعائية. وجود قيود الفني للتصوير طريقة دوبلر الليزر بغض النظر عن النموذج الحيواني المستخدمة هو أنه يقيس سرعة تدفق الدم وليس مطلقا نضح الأنسجة، وبالتالي فإنه يمكن أن تستخدم فقط لمقارنة التغيرات النسبية في تدفق الدم داخل حيوان معين. والجدير بالذكر، أن نقص التروية الذي يسبب فقدان الأطراف يؤدي إلى انخفاض نسبة نضح بغض النظر عن التغيرات في تدفق الدم 23.

وخلاصة القول، ونحن نقدم طرق تفصيلية لإحداث الحاد وتحت الحاد نقص التروية هند أطرافهم في الفئران لغرض تحليل الآثار على الهيكل العظمي والعضلات والأوعية الدموية إعادة عرض. ويولى اهتمام خاص لتحديد معالم الأوعية الدموية البالغة الأهمية لتسهيل داخل الإقليم دقيقة وبين المشغل استنساخ النموذج. مزيد من الصقل للتقنية قد تؤدي في النهاية إلى تطوير نموذج نقص التروية المزمن الذي دقيقةلاي يعيد التسبب في PAD السريري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35 Dumoxel
Dumont Style 5 Mini Forceps Fine Science Tools 11200-14 Inox
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08
7 - 0 Silk Suture Sharpoint DA-2527N
5 - 0 Coated Vicryl Suture Ethicon J463G
Graefe Forceps Fine Science Tools 11053-10
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03
Artifical Tears Ointment Rugby Laboratories 0536-6550-91
Surgical Tape 3M 1530-0
Fine Cotton Swabs Contec SC-4
Temperature Controller Physitemp TCAT-2DF
Ameroid Constrictors Research Instruments SW MMC-0.25 x 1.00-SS
Hot Bead Sterilizer
Deltaphase Isothermal Pad Braintree Scientific 39DP
Needle Driver Fine Science Tools
Phosphate Buffered Saline  Gibco 10010-023
Moor LDPI Moor Instruments moorLDI2
moorLDI Measurement software Moor Instruments v. 6.0
Hair Removal Cream Nair

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Criqui, M. H., Aboyans, V. Epidemiology of peripheral artery disease. Circ. Res. 116, 1509-1526 (2015).
  2. Thukkani, A. K., Kinlay, S. Endovascular intervention for peripheral artery disease. Circ. Res. 116, 1599-1613 (2015).
  3. Vartanian, S. M., Conte, M. S. Surgical intervention for peripheral arterial disease. Circ. Res. 116, 1614-1628 (2015).
  4. Bonaca, M. P., Creager, M. A. Pharmacological treatment and current management of peripheral artery disease. Circ. Res. 116, 1579-1598 (2015).
  5. Conte, M. S., et al. Design and rationale of the PREVENT III clinical trial: edifoligide for the prevention of infrainguinal vein graft failure. Vasc Endovascular Surg. 39, 15-23 (2005).
  6. Pomposelli, F. B., et al. A decade of experience with dorsalis pedis artery bypass: analysis of outcome in more than 1000 cases. J. Vasc. Surg. 37, 307-315 (2003).
  7. Willigendael, E. M., et al. Smoking and the patency of lower extremity bypass grafts: a meta-analysis. J. Vasc. Surg. 42, 67-74 (2005).
  8. Schillinger, M., et al. Balloon angioplasty versus implantation of nitinol stents in the superficial femoral artery. N. Engl. J. Med. 354, 1879-1888 (2006).
  9. Marmagkiolis, K., et al. 12-month primary patency rates of contemporary endovascular device therapy for femoro-popliteal occlusive disease in 6,024 patients: beyond balloon angioplasty. Catheter. Cardiovasc. Interv. 84, 555-564 (2014).
  10. Rosenfield, K., et al. Trial of a Paclitaxel-Coated Balloon for Femoropopliteal Artery Disease. N. Engl. J. Med. 373, 145-153 (2015).
  11. Tepe, G., et al. Drug-coated balloon versus standard percutaneous transluminal angioplasty for the treatment of superficial femoral and popliteal peripheral artery disease: 12-month results from the IN.PACT SFA randomized trial. Circulation. 131, 495-502 (2015).
  12. Couffinhal, T., et al. Mouse model of angiogenesis. Am. J. Pathol. 152, 1667-1679 (1998).
  13. Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. J Vis Exp. , (2009).
  14. McClung, J. M., et al. Skeletal muscle-specific genetic determinants contribute to the differential strain-dependent effects of hindlimb ischemia in mice. Am. J. Pathol. 180, 2156-2169 (2012).
  15. Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
  16. Rivard, A., et al. Age-dependent impairment of angiogenesis. Circulation. 99, 111-120 (1999).
  17. Hazarika, S., et al. Impaired angiogenesis after hindlimb ischemia in type 2 diabetes mellitus: differential regulation of vascular endothelial growth factor receptor 1 and soluble vascular endothelial growth factor receptor 1. Circ. Res. 101, 948-956 (2007).
  18. Couffinhal, T., et al. Impaired collateral vessel development associated with reduced expression of vascular endothelial growth factor in ApoE-/- mice. Circulation. 99, 3188-3198 (1999).
  19. Tang, G. L., Chang, D. S., Sarkar, R., Wang, R., Messina, L. M. The effect of gradual or acute arterial occlusion on skeletal muscle blood flow, arteriogenesis, and inflammation in rat hindlimb ischemia. J. Vasc. Surg. 41, 312-320 (2005).
  20. Yang, Y., et al. Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse. J. Vasc. Surg. 48, 1546-1558 (2008).
  21. Litvak, J., Siderides, L. E., Vineberg, A. M. The experimental production of coronary artery insufficiency and occlusion. Am. Heart J. 53, 505-518 (1957).
  22. Bredee, J. J. An improved ameroid constrictor. Preliminary communication. J. Surg. Res. 9, 107-112 (1969).
  23. McClung, J. M., et al. Subacute limb ischemia induces skeletal muscle injury in genetically susceptible mice independent of vascular density. J. Vasc. Surg. , (2015).
  24. Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 40, 796-803 (2010).
  25. Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: functional role in the design and understanding of ischemia models. PloS one. 8, e84047 (2013).

Tags

الطب، العدد 112، نقص التروية، ومرض الشريان المحيطي، الأوعية الدموية، والهيكل العظمي تجديد العضلات، وتصلب الشرايين، جراحة الأوعية الدموية، hindlimb الماوس، المضيقة ameroid
طرق الحادة وتحت الحادة الفئران Hindlimb نقص التروية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Padgett, M. E., McCord, T. J.,… More

Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia. J. Vis. Exp. (112), e54166, doi:10.3791/54166 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter