Abstract
Perifer arteriell sykdom (PAD) er en ledende årsak til kardiovaskulær morbiditet og mortalitet i utviklede land, og dyremodeller som pålitelig reprodusere menneskelig sykdom er nødvendig å utvikle nye behandlingsformer for denne sykdommen. Musen bakben ischemi-modellen har vært mye brukt for dette formål, men det standard praksis å indusere akutt iskemi i bena ved ligering av arteria femoralis kan resultere i betydelig vevsnekrose, noe som påvirker undersøkere evne til å studere de vaskulære og skjelettmuskelvevet respons på ischemi . En alternativ tilnærming til lårarterien ligering er den gradvise induksjon av lårarterie okklusjon ved bruk av ameroid constrictors. Når den plasseres rundt lårarterien i samme eller forskjellige steder som områder av lårarterie ligering, disse enhetene okkluderer arterien i løpet av 1 - 3 dager, noe som resulterer i mer gradvis, subakutt iskemi. Dette resulterer i mindre betydelig skjelettmuskulatur vevsnekrose, wjør kan nærmere etterligne svarene sett i menneskelig PAD. Fordi genetisk bakgrunn påvirker utfall i både akutte og subakutte ischemi modeller, vurdering av musestamme som studeres er viktig i å velge den beste modellen. Dette notatet beskriver riktig prosedyre og anatomisk plassering av ligaturer eller ameroid slanger på musen lårarterie å indusere subakutt eller akutt bakben iskemi i mus.
Introduction
Perifer arteriell sykdom (PAD) er en ledende årsak til kardiovaskulær morbiditet og mortalitet i utviklede land 1. PAD resultater fra aterosklerotisk obstruksjon av perifere arterier som fører til lem iskemi med påfølgende anstrengelse eller hvilesmerter og av og til ikke-healing sår og koldbrann som nødvendig lem amputasjon. Terapi rettet mot PAD er først og fremst rettet mot endovaskulær to eller kirurgisk revaskularisering 3, som i hovedsak ingen effektive medisinske behandlingsformer finnes fire.
Dessverre er revaskularisering ofte av begrenset nytte, som bypass grafts har høye feilrater (opp til 50% innen 5 år) 5 som er verre i enkelte populasjoner (f.eks røykere, kvinner, ikke-saphenous vene grafts) 6,7. Endovaskulær tilnærminger, slik som angioplastikk og stenting, blir også svekket av høye restenose priser (i overkant av 50% i løpet av ett år), Igen jegn femoropoplitiale sykdom 8, selv om bruken av medikamentavgi ballonger og stenter har bedret resultatene noe 9-11. For å kunne utvikle nye behandlinger for PAD er det viktig å utvikle dyremodeller som pålitelig reprodusere sykdom hos mennesker.
Til dags dato, den vanligste modellen av PAD er bakben iskemi modell (HLI), som oftest utført på mus 12,13. I sin mest vanlige manifestering, innebærer modellen kirurgiske ligering av den proksimale og distale femorale arterien og dens mellomliggende sidegrener, etterfulgt av fjerning av beholderen, noe som resulterer i tilstopping av blodstrøm og induksjon av akutt ischemi. HLI har blitt brukt primært for å studere angiogene og arteriogenisk responser i perifert lem muskelvev og effekten av ulike behandlingsformer (for eksempel narkotika, genet levering, stamceller) på disse svarene. Mer nylig har vår gruppe brukt denne modellen for å undersøke hvilken rolle skjelettmuskelceller in responsen på lem iskemi og effekter av genetiske forskjeller på resultatene 14.
Den HLI Modellen har mulig vår nåværende forståelse at de vaskulære og muskel respons på ischemi er avhengig av genetikk (dvs. innavlet stamme) 15, alder 16, og nærvær eller fravær av andre sykdommer eller tilstander som er relevante for aterosklerose, inkludert diabetes mellitus 17 og hyperkolesterolemi 18. Men en viktig svakhet ved tradisjonelle HLI modellen er at det er en modell av akutt ischemi 12,13, mens human PAD fører til kronisk iskemi som et resultat av den gradvise utvikling av okklusive aterosklerotiske lesjoner i perifere arterier.
I et forsøk på å omgå denne svakheten, Tang og kolleger opprinnelig utviklet en rottemodell med gradvis femoral arteriell okklusjon hjelp ameroid constrictors 19, og den samme gruppen senere developed en lignende mus modell 20. Ameroid constrictors ble beskrevet innledningsvis i 1950 i en hundemodell av kronisk myokardiskemi 21,22. Disse enhetene har en ytre metallhylse som omslutter et indre lag av et hygroskopisk materiale, vanligvis kasein, og når den er plassert rundt en arterie de induserer gradvis kar okklusjon etter hvert som de absorberer fuktighet fra det omgivende vev. I deres modifisering av modellen, Yang et al., Som er lagt inn slanger på både den proksimale og distale femorale arterien på steder som er analoge med de kirurgiske ligerings-områder, og de ligert sidegrenene av den femorale arterie, som i den tradisjonelle modellen. Sammenlignet med akutt HLI, ameroid constrictor iskemi resulterte i lavere uttrykk av inflammatoriske og skjærspenningsavhengig gener, lavere blodstrøm utvinning 4 - 5 uker postoperativt, og mindre muskel nekrose 20. Basert på disse observasjonene ble det følt at gradvis arteriell okklusjon kan gi en modell av PAD mer relevant for sykdom hos mennesker.
Spesielt, i den opprinnelige meldingen, effekter av ameroid konstriktor-indusert ischemi ble undersøkt bare i C57BL / 6-mus 19, som er forholdsvis resistente overfor ischemi-indusert muskelnekrose 15. Vi har nylig modifisert gradvis ischemi-modellen videre utforsket og dens virkninger på mer iskemi-følsomme BALB / c musestamme 23. I den første manifestasjon av modellen som er lagt vi slanger på både proksimale og distale lårarterie men forlot alle sidegrener intakt. I en andre, mildere modifikasjon som er lagt vi en enkelt konstriktor bare på den proksimale lårarterie og igjen venstre alle side greiner av arterien intakt. I begge modifikasjoner av denne modellen, har vi funnet at BALB / c-mus, men ikke C57BL / 6 mus, viste signifikant muskelnekrose tross for å ha lignende blodstrøm og vaskulær tetthet. I likhet med vår tidligere studie 14, disse funnene viste at lem muskelskaden ikke utelukkende påvirkes av blodstrøm, men er delvis avhengig av genetisk bakgrunn. Videre fant vi at lem blodstrømmen falt til sitt laveste nivå innen 3 dager, og dermed modellen ser ut til å være mer en av "subakutt" snarere enn gradvis lem iskemi.
Basert på disse tidligere studier synes det klart at en enkelt metode for å indusere bakben iskemi ikke kan være egnet i alle tilfeller. Fordi en rekke forhold (for eksempel genetiske forskjeller og nærvær eller fravær av ko-morbide tilstander) påvirker både vaskulære og skjelettmuskel-spesifikke responser, kan forskere det være nødvendig å modifisere den kroniske karakter og / eller alvorligheten av bakben iskemi å best passer deres formål. Videre er tidligere beskrivelser av modellen vanligvis manglet egnede anatomiske landemerker for å lette pålitelig inter-undersøker reproduserbarhet av teknikken. I denne utredningen, metoder for å indusere enten akutt eller subakutt bakben iskemi i muser beskrevet, og presise anatomiske landemerker er gitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til protokoll godkjent av Duke Institutional Animal Care og bruk komité. Hannmus ble anvendt i denne studien, selv om begge kjønn kan anvendes som indikert for den vitenskapelige formål med studien.
1. Hårfjerning
- Forut for induksjon av anestesi, setter opp et område pre-kirurgisk preparat som består av en overdekket varmepute innstilt på 37 ° C og en nosecone port er koblet til kontinuerlig strøm av isofluran.
- Plasser musen i anestesi induksjon kammer. Sett O 2 flow meter til 1 l / min og isofluran til 1-3%.
MERK: Anestesi er vanligvis indusert i en 25 g mus med 2% isofluran. - Sjekk musens stimulus respons ved å riste kammeret og observere en mangel på en rettende refleks.
- Skyll kammer med O 2 for å fjerne isofluran før åpning. Raskt flytte musen til varme pannonse og koble den til isofluran via nosecone.
- Juster isofluran til 1,5%. Sjekk stimulus respons ved pedal refleks (tå klype).
- Påfør ophthalmic smøremiddel rikelig til begge øynene for å unngå uttørking under operasjonen.
- Barbere håret fra begge bakbena med en liten elektrisk trimmer. Hold huden stram mens barbering for å unngå Skjærende smerter i huden.
- Påfør forvarmet hårfjerning krem og la sitte i 1 min. Tørk forsiktig bort ved hjelp av en fuktet kompress.
- For kirurgisk prosedyre på et senere tidspunkt, slå av isofluran og beveg musen til et tomt papir håndkle-lined utvinning bur for å sikre at musen ikke aspirer buret senger. Overvåk dyret før det er i stand til å opprettholde sternal recumbency. Ellers flytte musen til operasjonsbordet.
MERK: hårfjerning prosessen kan irritere huden og påvirke perfusjonsmålinger. Det anbefales å vente 1 - 2 dager etter fjerning av dyrets hår før performing en pre-kirurgisk perfusjon scan eller utføre kirurgi.
2. Pre-kirurgisk Forberedelse
- Bruk følgende verktøy under denne prosedyren; små rette kirurgiske saks, 2 fin-tipped vinklede tang, små Græfe tang, nål driver tang, 3 haker, små våren saks, og fin-tipped bomullspinner.
- Sterilisere alle verktøyene ved hjelp av en autoklav før initiering av operasjonen. Bruk en hot-perle sterilisator før og mellom hver kirurgisk prosedyre, for inntil 5 dyr. Steriliser flere kirurgiske verktøy pakker for operasjoner av grupper større enn fem.
- Forbered en steril kirurgiske feltet består av en overbygd varmepute og en isofluran port. Utføre alt arbeid under en 10 stereo disseksjon mikroskop.
- Bedøve og forberede mus som beskrevet i trinn 1.1 til 1.5.
- Kontroller at musen er fullt bedøvet og fyll i liggende stilling på kirurgisk bordet. Fest begge beina ved hjelp av kirurgisk tape. </ Li>
- Hvis du bruker et temperaturkontrollert varmepute, feste temperaturføler og fest den til bunnen av den kirurgiske plattformen ved hjelp av kirurgisk tape for å sikre at det ikke vil være et uhell trukket ut under prosedyren.
- Rengjør snittet området ved hjelp av tre vekslende povidonjodid og alkohol våtservietter. Dekk dyret med en steril kirurgisk drapere og skjære et hull for å avdekke innsnitt området.
3. Induksjon av ischemi
- Bruke en skalpell til å foreta en innledende snitt langs midten av den mediale lår, løper fra kneet mot magen, og forlenge snittet til omtrent 1 cm med fin saks (figur 1A).
Figur 1. operasjonsstedet og vaskulær anatomiske landemerker for Mouse bakben iskemi Surgery. (A) Ekstern visning avden bakben av en mus i liggende stilling. Det skraverte linjen viser snittet området du skal utføre de bakben iskemi prosedyrer. (B) Utsikt over proksimale musen bakben blodkar. Den proksimale ende av den femorale arterie (FA) oppstår fra under inguinal ligament (IL). Den distale ende av FA plassert ved dets gaffeldeling inn i popliteal arterien (PA) og saphena-arterie (SA). De viktigste underordnede arterier av av FA er de laterale cirkumfleks lårarterie (LCFA), den proksimale kaudal lårarterie (PCFA), og den overfladiske epigastriske kaudale arterie (SCEA). Lårvenen (FV) går ved siden av FA, og venøse grener kan sees parallelt med de store arterielle grener. Stjerner (*) betegne de proksimale og distale områder for plassering av ameroid constrictors eller ligaturer, avhengig av om subakutt eller akutt iskemi blir indusert. Vennligst click her for å se en større versjon av dette tallet.
- Bruk pinsett, åpne snittet og utsette membranen som dekker lyske fettvev (IFT).
- Ved hjelp av lukket-tang, Pierce gjennom membranen inn avstanden mellom IFT og magen. Løsne forsiktig press på pinsett til å skille IFT fra magemusklene, utsette neurovascular bunt under. Observer proksimale og overfladiske Caudal grener som viktige anatomiske landemerker (Figur 1b).
- Sett inn en retractor og trekk abdominal vev proksimalt for å avsløre den proksimale ameroid constrictor eller ligation område, like proksimalt for den laterale cirkumfleks lårarterie (figur 1B). Den laterale cirkumfleks arterie ligger ca 5 mm proksimalt for den proksimale og overfladiske Caudal arterier.
- Sett to haker inn i den distale del av snittet, en medial og en lateral, for å trekke den IFT distalt frakirurgiske området for å utvide operasjonsområdet.
- Bruk to fin pinsett for å fjerne det ytterste membranen som dekker neurovascular bunten. Sett forsiktig den ene halvdelen av fin pinsett spissen mellom venen og arterien, skyve tang spissen under membranen som binder dem sammen. Lukk tang og forsiktig rive bort membranen.
- Sett tuppen av en lukket tang mellom venen og arterien og skape et gap mellom dem ved å slippe press på tang. Gjenta denne teknikken for å skape et gap mellom arterien og nerve.
- For subakutt lem iskemi, plassere en ameroid constrictor på den proksimale lårarterie (figur 2).
- For å installere den proksimale ameroid constrictor, skyver spissen av en pinsett under lårarterie å isolere den fra neurovascular bunten. Bruk et annet sett av angled- tang til å gripe kanten av constrictor og veilede den under femoral arterien.
- Lå lårarterie inn i smye i constrictor. Gjenta for distal constrictor, posisjonering det umiddelbart proksimalt til forgreningen av femoral arterien i popliteal arterien og saphenous arterie (figur 2).
Figur 2. Plassering av Ameroid constrictors og ligaturer. (A) Eksempel på to ameroid constrictors plassert på lårarterie å indusere subakutt bakben iskemi. Den proksimale konstriktor er plassert proksimalt til den laterale cirkumfleks lårarterie (LCFA). Den distale constrictor er plassert proksimalt til forgreningen av popliteal (PA) og saphenous arterier (SA). Constrictors monteres med åpningen vendt opp for å sikre arterien er riktig innstilt i constrictor. (B) Eksempel på ligaturer av lårarterie å indusere akutt bakben iskemi. Ligatures (gule piler) er plassert slik at de flankerer plasseringen av stramme i panel (B), og lårarterien er transektert mellom hvert sett av to ligaturer (skjult). Bar, 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- For akutt lem iskemi, ligate og skjære over proksimale lårarterie.
- Til tvers lårarterien, tråden 7 - O sutur under arterien proksimalt til posisjonen av den proksimale konstriktor (se trinn 3.7) og ligere. Binde en ligatur andre omtrent 1 mm distalt til den første.
- Bruk våren saks til å skjære over såre mellom de to ligaturer. For den distale arteriell tran, gjenta disse trinnene, plassere to ligaturer ca 1 mm fra hverandre, bare proksimale til forgreningen av femoral arterien i popliteal arterien og saphenous arterie, men at de er distal til den overfladiske caudal epigastriske arterie (se figur 1)
- Lukk snittet ved hjelp avbrutt fem - O Vicryl sting.
4. perfusjonsbilleddannelse
- Flytt musen til en 37 ° C oppvarming puten satt under laser doppler perfusjon imager (LDPI) og koble til via en nosecone til isofluran kilden. Hvis ingen temperaturovervåking er tilgjengelige, gi 5 min for musen til å varme opp til 37 ° C.
- Slå på imager og starte bilde fange programvare.
- Klikk på 'nye singel Bilde' ikonet for å åpne 'Scanner Setup vinduet. Sett "Scan Size" til "Large" og "Scan Speed" til "4 ms / pixel". Sett skanneområdet ved å endre x og y-verdier under "Scan Area (enheter) 'ruten.
- Klikk på "Video og Avstand fanen for å se video feed, og ordne musen til å passe inn i skanneområdet angitt med et rødt omriss. Klikk "Auto Avstand" for å kalibrereavstanden fra laseren til individet. Klikk Neste for å åpne 'emne Detaljer-vinduet.
- Skriv inn emneinformasjon og eventuelle relevante kommentarer. Klikk på "Neste" -knappen for å gå videre til skannevinduet.
- Klikk "Start Measurement" -knappen for å åpne 'Bekreft eller Styr Scan Avstand' dialog. Klikk på OK for å bekrefte skanning avstand. Observer skanneprosessen begynne og kjøre i 4-8 minutter, avhengig av størrelsen på skanneområdet.
- Etter at skanningen er fullført, observere "Lagre som" -vinduet. Gi navn til filen og lagre den.
- Slå av isofluran og beveg musen til et tomt utvinning bur og overvåke inntil dyret er i stand til å opprettholde sternal recumbency. Plasser aldri en mus komme seg etter narkose i et bur med andre mus.
- Åpne bildeanalyse programvare. Klikk på "Open" -ikonet og bla til og åpne bildefilen for analyse. På filvinduet, observere forandring,foto, og fargebilder av musen.
- For å markere regionen av interesse (ROI) på flux bilde, klikker du på "Vis Rois 'ikon. Neste klikk på "Legg til Polygon" -knappen og dra markøren rundt ikke-kirurgisk lem å trekke avkastningen. Høyreklikk for å lukke figuren. Velg "Legg til Polygon 'igjen og tegne en matchende ROI rundt kirurgisk lem.
- Klikk på "Statistikk" ikonet for å åpne 'Bilde ROIs Statistikk resultater (PU) vinduet. Observer prosent forskjell i forandring i "Flux% kolonnen.
MERK: Første ROI trukket vil tjene som referanse.
MERK: Før hver påfølgende perfusjon scan følger du fremgangsmåten i punkt 1 for å bedøve mus og i trinn 4.1 til 4.11 til bilde dyret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Riktig identifisering av musen bakben blodkar er avgjørende for å sikre reproduserbarhet av teknikkene for å indusere både subakutt og akutt bakben iskemi, som beskrevet her. I tillegg til den iboende variasjon i dyrestudier, kan andre faktorer introdusere variasjoner i laser Doppler perfusjonsbilleddannelse (LDPI), inkludert type anestesi, posisjonen til dyret (liggende vs. tilbøyelige), og kroppstemperatur (se figur 3). I tillegg subakutt bakben ischemi-modellen er avhengig av kvaliteten av de ameroid stramme, som kan variere mye i løpet av en gitt batch (se figur 4). Hver av disse problemene kan ha betydelige virkninger på kvantifisering av strømningen målt ved LDPI og er diskutert i mer detalj nedenfor.
Etter plassering av ameroid constrictors i subakutt bakben iskemi modell eller ligationog transeksjon av femoral arterien i den akutte bakben ischemia modell, bør LDPI bilder tas umiddelbart postoperativt mens dyret fremdeles er bedøvet for å demonstrere virkningene av kirurgi og å etablere en grunnlinje post-operative nivået av perfusjon (figur 5). Kvantifisering av perfusjon utføres ved å trekke en region av interesse (ROI) rundt iskemisk bakben og en sammenlignbar ROI rundt den ikke-iskemiske bakben. Perfusjon er oftest uttrykt som et forhold mellom perfusjon i den iskemiske lemmer som i den ikke-iskemiske lem, og endring i dette forhold måles over tid. Vi har funnet at avbildnings mus i liggende stilling gir mindre variasjon på grunn av dyr bevegelse og endring i posisjon av føttene fra ett tidspunkt til det neste. Videre perfusjon i den øvre del av låret tendens til å være mer variabel når musene er i liggende stilling. En fullstendig tap av bakben perfusjonen bør observeres etter induksjon av akutt lemischemi, mens bare en mild reduksjon i perfusjon er vanligvis observert etter plassering av ameroid constrictors i subakutt modell (Figur 5). I noen tilfeller har vi observert rask constrictor okklusjon med resulterende dramatisk tap av perfusjon umiddelbart postoperativt.
Figur 3. Variasjon i perfusjonsbilleddannelse Basert på bakben posisjon og kroppstemperatur. Laser Doppler-perfusjon bilder av en enkelt BALB / c-mus, bedøvet med 1,5% isofluran og skannes både i liggende og utsatt posisjon ved 35 ° C, 37 ° C, og 38 ° C. Med isoflurananestesi, dyrets bakbena tendens til å bevege seg med respirasjon, noe som resulterer i en gjenstand (horisontale linjer) som er observert med større frekvens på ryggen i forhold til utsatt bilder. I liggende stilling, er det mye enklere å reprodusere den nøyaktige vinkelav føttene, slik at kvantifisering av perfusjon over tid mer presis. Perfusjon er vesentlig redusert som kroppstemperaturen synker under 37 ° C, mens bildene er mettet ved høyere temperaturer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Variasjon av kommersielt tilgjengelig Ameroid slanger (A) Et eksempel på en ideell 0,25 mm indre diameter (tohodet pil) constrictor med samme sporet form og kasein tykkelse (B - D).. Eksempler på sporet form variasjon. Slots kan noen ganger vise en 'd' form (B og C) eller en "b" -form (D). I disse tilfellene er det kasein nokså jevnt fordelt, og sporene er dypt nok hoLD arterien. (E) Et eksempel på en ujevn tykkelse kasein. Dette konstriktor ville bli forkastet. (F) Et eksempel på en spalte som er for grunt til å holde arterien på plass under sammensnøring. Dette constrictor vil også bli forkastet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. perfusjon bilder umiddelbart etter Induksjon av subakutt eller akutt bakben iskemi. Representative perfusjon bilder i både liggende og utsatt posisjon av BALB / c mus som har gjennomgått plassering av to ameroid constrictors på venstre lårarterie å indusere subakutt bakben iskemi eller plassering av to ligaturer og tran av venstre lårarterie å indusere akutt bakben iskemi. Merk at perfusion er redusert, men fortsatt påvisbar etter ameroid constrictor plassering, mens egentlig ingen flyt oppdages umiddelbart etter dobbel ligation / tran av femoral arterien. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kanskje den mest utfordrende trinnet i denne fremgangsmåten er separering av lårarterien fra den femorale vene. Jo større diameter og tynnere vegger fra den femorale vene i forhold til de av arterien øke dens mottakelighet for punktering og river under kirurgisk manipulasjon. Sannsynligheten for å forstyrre venen kan reduseres ved å holde såret fuktig ved hjelp av en steril vattpinne fuktet med PBS. Det er også viktig å sikre at alle tang er skjerpet, justert, og uten pauser for å tillate nøyaktig manipulering av fartøy og omgivende vev. I det tilfelle at blødningen forekommer, påføre trykk til området med steril kompress inntil blødningen er stoppet. Detaljerte kirurgiske notater bør opprettholdes for hvert dyr, som det kan oppfattes som 'mindre' blødninger kan representere en utilsiktet mer alvorlig iskemisk skade på lang sikt. For data konsistens, operasjoner som involverer ingen venøs eller sikkerhet arteriell blødninging hendelser er avgjørende.
En begrensning ved denne teknikken er at alvorlighetsgraden og / eller inntreden av ischemi (i subakutt ameroid konstriktor-modell) kan variere innen vide grenser avhengig av flere faktorer. Den proksimale constrictor / ligation området vil avgjøre hvor mange sivile arterier er berørt av induksjon av iskemi. Forlater pante grener intakt reduserer alvorligheten av skaden, selv om det som nevnt, i visse sammenhenger, dvs. i dyr av visse genetiske bakgrunn til og med mildere kan subakutt ischemi føre til betydelige vevsnekrose 23. Videre vil tilsetning av en andre, distal konstriktor eller ligatur redusere perfusjon i både akutt og subakutt modell 23. Noen forskere har bundet eller brukt en elektrokauterisering å ablate sikkerhet grener av den laterale cirkumfleks arterie, den proksimale hale lårarterie, og den overfladiske hale magesekkens arterien 24. Dette resulterer i mer alvorlig iskemi ennd kan indusere større muskelskader, selv om dette også er avhengig av genetisk bakgrunn. Det er viktig å merke seg at elektrokauterisering kan være mer sannsynlig å føre til skade på omliggende vev og bør derfor brukes med forsiktighet.
I lys av disse variablene, er det avgjørende at vaskulær anatomi er nøyaktig identifisert før du velger stedet for okklusjon. Kochi et al. 25 merket en markant mangel på konsensus blant mange rapporter om navnene og plasseringen av blodårer i mus bakben, og de har gitt en svært detaljert beskrivelse av den arterielle anatomi som vi mener er en viktig guide for alle å gjennomføre dette prosedyre. En tidligere publisering i tidsskriftet demonstrerte teknikken for å indusere akutt ischemi 13, men i denne rapporten de vaskulære anatomiske landemerker ikke var godt definert. Et viktig mål med denne rapporten var å gi en forbedret visuell representasjon of disse landemerker i tillegg til å demonstrere en modifikasjon av den teknikk som ved hjelp av subakutt ischemi.
En ytterligere begrensning av denne tilnærmingen er at utbruddet av iskemi i subakutt ischemi-modellen er en funksjon av kvaliteten på ameroid stramme at en bruker. Vi har funnet at kommersielle slanger kan variere i dybden og formen på deres indre sporet (figur 4). Dersom spalten er for grunt arterien kan ekstruderes ved sammensnøring. Constrictors med sprukket kasein eller misdannede sporene skal kastes. I tillegg kan inkonsekvent fordeling av kasein i konstriktor resultere i hurtigere forekomst av okklusjon. Størrelsen og alder av mus er en annen viktig faktor å vurdere, som fartøystørrelser i "voksen" mus kan variere betydelig mellom 8 og 30 ukers alder. Dette er spesielt viktig når du bruker flere uavhengige kohorter av mus til å generere datasett, som tilsynelatende small aldersgrupper (for eksempel 10 - 16 uker) kan føre til inkonsistente priser av okklusjon og alvorlighetsgraden av iskemisk lem skader.
Kvantifisering av laser Doppler perfusjonsbilleddannelse kan også variere sterkt, avhengig av dyrets kroppstemperatur og posisjon (figur 4), så vel som anestesimiddel som anvendes. Det er avgjørende at musen opprettholde en 37 ° C kroppstemperaturen under perfusjonsbilleddannende. Hvis temperaturen er høyere enn 37 ° C perfusjon bildet vil bli mettet. Hvis temperaturen er under 36 ° C perfusjon signalet kan være for svakt. Det er også viktig å holde begge bena så symmetrisk som mulig for å oppnå en nøyaktig perfusjon forhold (perfusjon i den iskemiske lemmer i forhold til det i den ikke-iskemiske lem). Selv om mus blir ofte avbildes mens ligge liggende, kan symmetri være vanskeligere å opprettholde i denne stilling. Videre variasjon i blodstrømmen i den overlegne del av bildefeltet, dvs. den proximal lår, kan bidra til variasjon i kvantifisering. I tillegg anestesi med isofluran ofte resulterer i økt brystet bevegelse, som i sin tur bevirker bevegelse av bena og variasjon i signalet som oppnås ved LDPI. Vi har funnet at å plassere dyrene i liggende stilling gir mer støtte for bena, noe som gir enklere posisjonering og sterkt redusert bevegelse, noe som resulterer i mer reproduserbar kvantifisering av lem perfusjon (figur 5). Videre letter utsatt posisjon mer konsistent vedlikehold av 37 ° C temperatur i de skannede lemmer, som også forbedrer reproduserbarhet for kvantifisering (figur 5). Sammenlignet med isofluran, mus bedøvet med ketamin skjerm redusert brystet bevegelse, noe som gjør liggende bilde mindre variabel. Imidlertid vil ketamin også øke anestesi induksjon og utvinning tid, noe som resulterer i betydelig øket absolutte verdier perfusjon 16. Hver kombinasjon av kroppsstilling og ANESThetic Midlet kan skape et tydelig bilde perfusjon verdi, og således er det viktig å bruke et konsistent teknikk for hver av disse metodene på tvers av alle etterfølgende perfusjonsmålinger.
Det er viktig å erkjenne flere andre begrensninger av denne teknikk. Fordi modellen blir ofte utført i mus uten samtidige sykdommer, så som fedme, hyperlipidemi, aterosklerose, diabetes mellitus, eller andre faktorer som disponerer for vaskulær sykdom, vil induksjon av ischemi aldri helt gjen patologi kliniske PAD. Som nevnt, har effekten av akutt ischemi er vurdert i alderen, diabetes, og hyperkolesterolemi mus, og i fremtiden vil det være nyttig å fastslå effekten av disse komorbide tilstander på svar på subakutt lem iskemi. Videre, på grunn PAD er en kronisk sykdom, selv subakutt lem-ischemi er en ufullkommen modell av den kliniske situasjon. Derfor vil det være viktig å fortsette å utvikle modeller somresultere i ekte kronisk lem iskemi og å teste dem i forbindelse med modeller av kardiovaskulære risikofaktorer. En teknisk begrensning av laser Doppler avbildingsmodalitet uavhengig av dyremodellen som brukes er at den måler blodstrømningshastighet og ikke absolutte vevsperfusjon, derfor kan den brukes bare for å sammenligne relative endringer i blodstrømmen i et gitt dyr. Spesielt, vil iskemi som fører lem tap resulterer i et redusert perfusjon forhold uavhengig av endringer i blodstrømmen 23.
Oppsummert gir vi detaljerte fremgangsmåter for å indusere akutt og subakutt bakben ischemi i mus med det formål å analysere effekter på skjelettmuskulatur og vaskulær remodellering. Spesiell oppmerksomhet er gitt til identifisering av kritiske vaskulære landemerker for å lette nøyaktig intra- og inter-operatør reproduserbarhet av modellen. Videreutvikling av den teknikk som kan til slutt føre til utvikling av en kronisk iskemi modell som nøyaktigly replikerer patogenesen av klinisk PAD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Dumoxel |
| Dumont Style 5 Mini Forceps | Fine Science Tools | 11200-14 | Inox |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| 7 - 0 Silk Suture | Sharpoint | DA-2527N | |
| 5 - 0 Coated Vicryl Suture | Ethicon | J463G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Artifical Tears Ointment | Rugby Laboratories | 0536-6550-91 | |
| Surgical Tape | 3M | 1530-0 | |
| Fine Cotton Swabs | Contec | SC-4 | |
| Temperature Controller | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Ameroid Constrictors | Research Instruments SW | MMC-0.25 x 1.00-SS | |
| Hot Bead Sterilizer | |||
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | ||
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 10010-023 | |
| Moor LDPI | Moor Instruments | moorLDI2 | |
| moorLDI Measurement software | Moor Instruments | v. 6.0 | |
| Hair Removal Cream | Nair |
References
- Criqui, M. H., Aboyans, V. Epidemiology of peripheral artery disease. Circ. Res. 116, 1509-1526 (2015).
- Thukkani, A. K., Kinlay, S. Endovascular intervention for peripheral artery disease. Circ. Res. 116, 1599-1613 (2015).
- Vartanian, S. M., Conte, M. S. Surgical intervention for peripheral arterial disease. Circ. Res. 116, 1614-1628 (2015).
- Bonaca, M. P., Creager, M. A. Pharmacological treatment and current management of peripheral artery disease. Circ. Res. 116, 1579-1598 (2015).
- Conte, M. S., et al. Design and rationale of the PREVENT III clinical trial: edifoligide for the prevention of infrainguinal vein graft failure. Vasc Endovascular Surg. 39, 15-23 (2005).
- Pomposelli, F. B., et al. A decade of experience with dorsalis pedis artery bypass: analysis of outcome in more than 1000 cases. J. Vasc. Surg. 37, 307-315 (2003).
- Willigendael, E. M., et al. Smoking and the patency of lower extremity bypass grafts: a meta-analysis. J. Vasc. Surg. 42, 67-74 (2005).
- Schillinger, M., et al. Balloon angioplasty versus implantation of nitinol stents in the superficial femoral artery. N. Engl. J. Med. 354, 1879-1888 (2006).
- Marmagkiolis, K., et al. 12-month primary patency rates of contemporary endovascular device therapy for femoro-popliteal occlusive disease in 6,024 patients: beyond balloon angioplasty. Catheter. Cardiovasc. Interv. 84, 555-564 (2014).
- Rosenfield, K., et al. Trial of a Paclitaxel-Coated Balloon for Femoropopliteal Artery Disease. N. Engl. J. Med. 373, 145-153 (2015).
- Tepe, G., et al. Drug-coated balloon versus standard percutaneous transluminal angioplasty for the treatment of superficial femoral and popliteal peripheral artery disease: 12-month results from the IN.PACT SFA randomized trial. Circulation. 131, 495-502 (2015).
- Couffinhal, T., et al. Mouse model of angiogenesis. Am. J. Pathol. 152, 1667-1679 (1998).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. J Vis Exp. , (2009).
- McClung, J. M., et al. Skeletal muscle-specific genetic determinants contribute to the differential strain-dependent effects of hindlimb ischemia in mice. Am. J. Pathol. 180, 2156-2169 (2012).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
- Rivard, A., et al. Age-dependent impairment of angiogenesis. Circulation. 99, 111-120 (1999).
- Hazarika, S., et al. Impaired angiogenesis after hindlimb ischemia in type 2 diabetes mellitus: differential regulation of vascular endothelial growth factor receptor 1 and soluble vascular endothelial growth factor receptor 1. Circ. Res. 101, 948-956 (2007).
- Couffinhal, T., et al. Impaired collateral vessel development associated with reduced expression of vascular endothelial growth factor in ApoE-/- mice. Circulation. 99, 3188-3198 (1999).
- Tang, G. L., Chang, D. S., Sarkar, R., Wang, R., Messina, L. M. The effect of gradual or acute arterial occlusion on skeletal muscle blood flow, arteriogenesis, and inflammation in rat hindlimb ischemia. J. Vasc. Surg. 41, 312-320 (2005).
- Yang, Y., et al. Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse. J. Vasc. Surg. 48, 1546-1558 (2008).
- Litvak, J., Siderides, L. E., Vineberg, A. M. The experimental production of coronary artery insufficiency and occlusion. Am. Heart J. 53, 505-518 (1957).
- Bredee, J. J. An improved ameroid constrictor. Preliminary communication. J. Surg. Res. 9, 107-112 (1969).
- McClung, J. M., et al. Subacute limb ischemia induces skeletal muscle injury in genetically susceptible mice independent of vascular density. J. Vasc. Surg. , (2015).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 40, 796-803 (2010).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: functional role in the design and understanding of ischemia models. PloS one. 8, e84047 (2013).
