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Medicine

Méthodes de aiguë et subaiguë murin Ischémie membres postérieurs

Published: June 21, 2016 doi: 10.3791/54166

Abstract

La maladie artérielle périphérique (MAP) est une cause majeure de morbidité cardiovasculaire et de mortalité dans les pays développés, et les modèles animaux qui reproduisent de manière fiable la maladie humaine sont nécessaires pour développer de nouvelles thérapies pour cette maladie. Le modèle hindlimb de la souris d'ischémie a été largement utilisé à cette fin, mais la pratique courante d'induire une ischémie des membres aiguë par ligature de l'artère fémorale peut entraîner une nécrose tissulaire importante, ce qui compromet la capacité des chercheurs à étudier les vasculaires et les tissus des muscles squelettiques des réponses à l'ischémie . Une approche alternative à la ligature de l'artère fémorale est l'induction d'une occlusion progressive de l'artère fémorale à l'aide d'améroïde constricteurs. Lorsqu'il est placé autour de l'artère fémorale, identiques ou différents emplacements que les sites de ligature de l'artère fémorale, ces dispositifs occlure l'artère au-dessus de 1 - 3 jours, soit plus progressive, la panencéphalite ischémie. Cela se traduit par une nécrose osseuse moins importante du tissu musculaire, wUEL peut imiter de plus près les réponses observées chez PAD humaine. Parce génétiques influences de fond les résultats dans les deux modèles d'ischémie aiguë et subaiguë, l'examen de la souche de souris à l'étude est important dans le choix du meilleur modèle. Cet article décrit la procédure appropriée et le placement anatomique des ligatures ou constricteurs améroïde sur l'artère fémorale de la souris pour induire subaiguë ou hindlimb ischémie aiguë chez la souris.

Introduction

La maladie artérielle périphérique (MAP) est une cause majeure de morbidité et de mortalité cardiovasculaire dans les pays développés 1. Résultats de la PAD de obstruction athéroscléreuse des artères périphériques qui conduit à une ischémie des membres avec la douleur exertional ou de repos résultante et parfois des ulcères et des gangrènes qui nécessitent l'amputation des membres non-guérison. Les thérapies ciblant PAD sont dirigés principalement vers endovasculaire 2 ou revascularisation chirurgicale 3, comme essentiellement aucun traitement médical efficaces existent 4.

Malheureusement, la revascularisation est souvent d' un intérêt limité, comme les greffes de dérivation ont des taux d'échec élevés (jusqu'à 50% dans les 5 ans) 5 qui sont pires dans certaines populations (par exemple, les fumeurs, les femmes, les greffes de veine non-saphènes) 6,7. des approches endovasculaires, telles que l'angioplastie et la pose de stents, sont également compromis par les taux de resténose élevés (supérieurs à 50% à moins de 1 an), i particularyn fémoropoplité maladie 8, bien que l'utilisation de ballons et stents à élution médicamenteuse est quelque peu améliorée 9-11 résultats. Afin de développer de nouveaux traitements pour PAD, il est essentiel de développer des modèles animaux qui reproduisent de manière fiable la maladie humaine.

À ce jour, le modèle le plus commun de PAD est le modèle d'ischémie des membres postérieurs (HLI), qui est le plus souvent réalisée chez des souris 12,13. Dans sa manifestation la plus fréquente, le modèle implique la ligature chirurgicale de l'artère fémorale proximale et distale, et ses branches latérales intermédiaires suivie de l'excision du récipient, ce qui entraîne une occlusion de la circulation sanguine et l'induction d'une ischémie aiguë. HLI a été utilisé principalement pour étudier les réponses angiogéniques et artériogénique dans le tissu musculaire des membres périphériques et les effets de divers traitements (par exemple, les médicaments, la délivrance de gènes, les cellules souches) sur ces réponses. Plus récemment, notre groupe a utilisé ce modèle pour examiner le rôle des cellules musculaires squelettiques in la réponse à une ischémie des membres et les effets des différences génétiques sur les résultats 14.

Le modèle de HLI a facilité notre compréhension actuelle que les vasculaires et musculaires réponses à l' ischémie dépendent de la génétique ( par exemple, la souche consanguine) 15, 16 ans, et la présence ou l' absence d'autres maladies ou conditions pertinentes à l' athérosclérose, y compris le diabète sucré 17 et hypercholesterolemia 18. Cependant, une faiblesse importante du modèle traditionnel HLI est qu'il est un modèle d'ischémie des membres aiguë 12,13, alors que PAD humaine provoque une ischémie chronique à la suite de la mise en place progressive des lésions athérosclérotiques occlusifs dans les artères périphériques.

Dans une tentative de contourner cette faiblesse, Tang et ses collègues d' abord mis au point un modèle de rat de progressive occlusion artérielle fémorale en utilisant constricteurs améroïde 19, et le même groupe a ensuite developed un modèle de souris similaire 20. Constricteurs améroïde ont été décrits initialement dans les années 1950 dans un modèle canin d'ischémie chronique du myocarde 21,22. Ces dispositifs présentent un manchon métallique extérieur recouvrant une couche interne d'un matériau hygroscopique, le plus souvent la caséine, et lorsqu'il est placé autour de l'artère, ils induisent une occlusion progressive des vaisseaux car ils absorbent l'humidité à partir des tissus environnants. Dans leur modification du modèle, Yang et al. , Placé constricteurs à la fois l' extrémité proximale et l' artère fémorale distale au niveau de sites analogues aux sites de ligature chirurgicale, et on ligature les branches latérales de l'artère fémorale, comme dans le modèle traditionnel. Par rapport à HLI aiguë, améroïde ischémie constrictor-conduit à une plus faible expression des gènes de stress dépendant inflammatoires et de cisaillement, inférieure récupération de flux sanguin 4 - 5 semaines après l'opération, et moins nécrose musculaire 20. Sur la base de ces observations, il a été estimé que l'occlusion artérielle progressive pourrait fournir un modèle de PAD plus pertinent pour la maladie humaine.

Notamment, dans le rapport initial, les effets de améroïde ischémie constrictor été examinés uniquement dans C57BL / 6 19, qui sont relativement résistants à l' ischémie induite par nécrose musculaire 15. Nous avons récemment modifié le modèle d'ischémie progressive plus loin et exploré ses effets dans l'ischémie-sensibles BALB / c souche plus de la souris 23. Dans la première manifestation du modèle, nous avons placé constricteurs à la fois proximale et distale artère fémorale, mais toutes les branches latérales laissées intactes. Dans une seconde, modification plus doux, nous avons placé un seul constrictor seulement sur l'artère fémorale proximale et encore tous les secondaires Braches de l'artère laissé intact. Dans les deux modifications de ce modèle, nous avons constaté que souris BALB / c, mais pas C57BL / 6 souris, affiche significative nécrose musculaire malgré le flux sanguin similaire et la densité vasculaire. Semblable à notre étude précédente 14, ces résultats ont démontré que le membre musculaireblessure est non seulement influencée par le flux sanguin, mais elle est en partie dépendante de fond génétique. De plus, nous avons constaté que la circulation sanguine des membres est tombé à son nadir dans les 3 jours, donc le modèle semble être plus une «subaiguë» plutôt que progressive ischémie des membres.

Sur la base de ces études antérieures, il semble clair qu'une seule méthode pour induire une ischémie hindlimb peut ne pas convenir dans tous les cas. Parce que une variété de conditions (par exemple, les différences génétiques et de la présence ou l' absence de conditions de co-morbidité) influencent à la fois vasculaire et des réponses spécifiques du muscle squelettique, les enquêteurs peut juger nécessaire de modifier la chronicité et / ou la gravité de hindlimb ischémie au mieux répondre à leurs besoins. En outre, les descriptions antérieures du modèle généralement manquaient de repères anatomiques appropriés pour faciliter la reproductibilité fiable inter-investigateur de la technique. Dans cet article, les méthodes pour induire soit aiguë ou subaiguë hindlimb ischémie chez la sourissont décrits, et des repères anatomiques précis sont fournis.

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Protocol

Toutes les expériences animales ont été effectuées selon le protocole approuvé par le Comité des soins et l'utilisation des animaux institutionnels Duke. Des souris mâles ont été utilisées dans cette étude, bien que ce soit le sexe peut être utilisé comme il est indiqué dans le but scientifique de l'étude.

1. Épilation

  1. Avant l'induction de l'anesthésie, mettre en place une zone de préparation pré-chirurgicale constituée d'un coussin chauffant couvert réglé à 37 ° C et un port nosecone connecté à flux continu de l'isoflurane.
  2. Placer la souris dans la chambre d'induction d'anesthésie. Réglez le débitmètre O 2 à 1 L / min et isoflurane 1 - 3%.
    REMARQUE: L' anesthésie est induite en général dans un 25 g de souris avec 2% d' isoflurane.
  3. Vérifiez la réponse du stimulus de la souris en secouant délicatement la chambre et en observant l'absence d'un réflexe de redressement.
  4. Purger la chambre avec O 2 pour effacer l'isoflurane avant l'ouverture. Déplacez rapidement la souris pour le chauffage pannonce et le connecter à isoflurane via le nosecone.
  5. Réglez le isoflurane à 1,5%. Vérifiez la réponse du stimulus par la pédale réflexe (pincement de l'orteil).
  6. Appliquer du lubrifiant ophtalmique généreusement sur les deux yeux pour éviter le séchage pendant la chirurgie.
  7. Raser les cheveux des deux membres postérieurs en utilisant une petite tondeuse électrique. Tenir la peau tendue pendant le rasage pour éviter lacérer la peau.
  8. Appliquer préchauffée crème d'épilation et laisser reposer pendant 1 min. Essuyez délicatement en utilisant un tampon de gaze humidifiée.
  9. Pour intervention chirurgicale à un moment plus tard, éteignez l'isoflurane et déplacez la souris à un vide papier essuie-tout rétablissement cage pour assurer la souris ne pas aspirer la litière de la cage. Surveiller l'animal jusqu'à ce qu'il soit en mesure de maintenir décubitus sternale. Sinon, déplacez la souris à la table chirurgicale.
    NOTE: Le processus d'épilation peut irriter la peau et affecter les mesures de perfusion. Il est recommandé d'attendre 1 - 2 jours après avoir enlevé les cheveux de l'animal avant performing une scintigraphie de perfusion pré-chirurgicale ou d'effectuer une intervention chirurgicale.

Préparation 2. Pré-chirurgical

  1. Utilisez les outils suivants au cours de cette procédure; petits ciseaux chirurgicaux droites, 2 pinces inclinées à pointe fine, petites pinces Graefe, pinces de pilote d'aiguilles, 3 écarteurs, petits ciseaux à ressort, et tampons de coton à pointe fine.
  2. Stériliser tous les outils en utilisant un autoclave avant le début de la chirurgie. Utilisez un stérilisateur à chaud perles avant et entre chaque intervention chirurgicale, pour un maximum de 5 animaux. Stériliser paquets supplémentaires d'outils chirurgicaux pour les chirurgies de groupes de plus de 5.
  3. Préparer un champ opératoire stérile constitué d'un coussin chauffant et un orifice recouvert isoflurane. Effectuer tous les travaux sous un microscope de dissection 10 stéréo.
  4. Anesthetize et préparer la souris comme décrit dans les étapes 1.1 à 1.5.
  5. Vérifiez que la souris est complètement sous sédation et placer dans une position couchée sur la table chirurgicale. Fixer les deux jambes à l'aide de ruban adhésif chirurgical. </ Li>
  6. Si vous utilisez un coussin chauffant à température contrôlée, fixez la sonde de température et de le fixer à la base de la plate-forme chirurgicale en utilisant du ruban chirurgical pour assurer qu'il ne sera pas accidentellement tiré pendant la procédure.
  7. Nettoyer le site d'incision en utilisant 3 alternance povidone-iode et d'alcool lingettes. Couvrir l'animal avec un drap chirurgical stérile et découper un trou pour exposer le site d'incision.

3. Induction de Limb Ischémie

  1. Utiliser un scalpel pour faire une incision le long du centre initial de la cuisse médiale, courant à partir du genou vers l'abdomen, et d' allonger l'incision jusqu'à environ 1 cm avec des ciseaux fins (figure 1A).

Figure 1
Figure 1. Site chirurgical et vasculaires anatomiques Repères pour la chirurgie de la souris Ischémie membres postérieurs. (A) Vue extérieure dela patte arrière d'une souris dans la position couchée sur le dos. La ligne hachurée indique le site d'incision pour effectuer correctement les procédures hindlimb d'ischémie. (B) Vue de l' extrémité proximale de la souris hindlimb vascularisation. L'extrémité proximale de l'artère fémorale (FA) provient de dessous du ligament inguinal (IL). L'extrémité distale de la FA se trouve dans sa bifurcation de l'artère poplitée (PA) et l'artère saphène (SA). Les principales artères collatérales hors de la FA sont l'artère fémorale latérale circonflexe (LCFA), l'artère fémorale caudale proximale (PCFA), et l'artère épigastrique caudale superficielle (SCEA). La veine fémorale (FV) fonctionne à côté de la FA, et les branches veineuses peut être vu parallèlement aux grandes branches artérielles. Les astérisques (*) désignent les sites proximale et distale pour le placement des constricteurs ou ligatures améroïde, selon que subaiguë ou une ischémie aiguë seront induites. S'il vous plaît click ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. En utilisant des pinces, ouvrir l'incision et exposer la membrane recouvrant le tissu adipeux inguinal (IFT).
  2. Utilisation de forceps fermées, percer à travers la membrane dans la séparation entre l'IFT et l'abdomen. relâcher doucement la pression sur la pince pour séparer le IFT des muscles abdominaux, ce qui expose le faisceau neuro-vasculaire au-dessous. Observer proximale et branches caudales superficielles comme repères anatomiques importants (figure 1B).
  3. Insérez un écarteur et tirer le tissu abdominal proximalement pour exposer le constrictor améroïde ou ligature place proximale, juste en amont de l'artère fémorale circonflexe latérale (figure 1B). L'artère circonflexe latérale se trouve à environ 5 mm proximale à l'extrémité proximale et des artères caudales superficielles.
    1. Insérez deux écarteurs dans la partie distale de l'incision, une médiane et un latéral, pour tirer le IFT distalement loin de lasite chirurgical pour élargir le champ opératoire.
  4. Utilisez deux pinces fines pour enlever la membrane la plus extérieure couvrant le faisceau neurovasculaire. Insérez délicatement la moitié de la pointe des pinces fines entre la veine et l'artère, en glissant la pointe de la pince sous la membrane qui les lie. Fermez la pince et déchirer doucement la membrane.
  5. Insérez l'extrémité d'une pince fermée entre la veine et l'artère et de créer un espace entre eux en relâchant la pression sur la pince. Répétez cette technique pour créer un écart entre l'artère et le nerf.
  6. Pour subaiguë ischémie des membres, placez un constrictor améroïde sur l'artère fémorale proximale (Figure 2).
    1. Pour installer le améroïde constrictor proximal, faites glisser la pointe d'une pince dans l'artère fémorale pour l'isoler du faisceau neurovasculaire. Utilisez un deuxième jeu de pinces cornière- pour saisir le bord de la constrictor et le guider dans l'artère fémorale.
    2. Couchez l'artère fémorale dans les sbeaucoup dans le constrictor. Répéter pour constricteur distale, positionnant immédiatement proximale par rapport à la bifurcation de l'artère fémorale à l'artère poplitée et l' artère saphène (figure 2).

Figure 2
Figure 2. Placement de AMEROID constricteurs et ligatures. (A) Exemple de deux constricteurs améroïde placés sur l'artère fémorale pour induire subaiguë hindlimb ischémie. La constrictor proximale est placée juste en amont de l'artère fémorale circonflexe latérale (LCFA). Le constrictor distal est placé juste en amont de la bifurcation de la poplitée (PA) et les artères saphènes (SA). Constricteurs sont installés avec la fente orientée vers le haut pour assurer l'artère est correctement définie dans le constrictor. (B) Exemple de ligatures de l'artère fémorale pour induire une ischémie aiguë des membres postérieurs. Ligatures (flèches jaunes) sont placés de telle sorte qu'ils flanquent la position des constricteurs dans le panneau (B), et l'artère fémorale est sectionnés entre chaque série de deux ligatures (astérisques). Bar, 1 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Pour le membre ischémie aiguë, ligaturer et sectionner l'artère fémorale proximale.
    1. Pour sectionner l'artère fémorale, le fil 7 - O suture sous l'artère juste en amont de la position de la constrictor proximale (voir étape 3.7) et ligaturer. Attacher une deuxième ligature environ 1 mm distal par rapport à la première.
    2. Utilisez des ciseaux à ressort pour sectionner l'artère entre les deux ligatures. Pour la transsection artérielle distale, répéter ces étapes, en plaçant deux ligatures d'environ 1 mm, juste en amont de la bifurcation de l'artère fémorale à l'artère poplitée et l'artère saphène, mais d'assurer qu'ils sont distale par rapport à la Caud superficielleal artère épigastrique (voir Figure 1)
  2. Fermer l'incision à l'aide interrompue 5 - sutures vicryl O.

4. Perfusion Imaging

  1. Déplacez la souris à un 37 ° C pad chauffant réglé sous l'imageur laser doppler de perfusion (LDPI) et se connecter via un nosecone à la source isoflurane. Si aucun contrôle de la température est disponible, laisser 5 min pour la souris se réchauffer à 37 ° C.
  2. Allumez l'imageur et de lancer le logiciel de capture d'image.
  3. Cliquez sur l'icône 'Nouveau single de l'image' pour ouvrir la fenêtre «Configuration du scanner». Réglez le "Format de numérisation» à «Grand» et «Vitesse de numérisation» à «4 ms / pixel. Réglez la zone de balayage en changeant les valeurs de x et y sous la 'zone de numérisation (unités)' volet.
  4. Cliquez sur l'onglet 'Vidéo et à distance »pour afficher le flux vidéo, et d'organiser la souris pour entrer dans la zone de numérisation indiquée par un contour rouge. Cliquez sur "Auto Distance" pour calibrerla distance du laser à la matière. Cliquez sur 'Suivant' pour ouvrir la fenêtre 'Sujet Détails de.
  5. Entrez les informations sujet et des commentaires pertinents. Cliquez sur le bouton «Suivant» pour passer à la fenêtre de numérisation.
  6. Cliquez sur le bouton «Démarrer la mesure 'pour ouvrir le' Confirmer ou Numériser Distance Override 'dialogue. Cliquez sur 'OK' pour confirmer la distance de balayage. Observer le processus de numérisation commence et fonctionner pendant 4-8 min en fonction de la taille de la zone de numérisation.
  7. Après la numérisation est terminée, observez la fenêtre "Enregistrer sous. Nommez le fichier et enregistrez-le.
  8. Coupez l'isoflurane et déplacer la souris pour une reprise cage vide et surveiller jusqu'à ce que l'animal est capable de maintenir décubitus sternale. Ne placez jamais une souris récupération de l'anesthésie dans une cage avec les autres souris.
  9. Ouvrez le logiciel d'analyse d'image. Cliquez sur l'icône 'Ouvrir' et rechercher et ouvrir le fichier d'image pour l'analyse. Dans la fenêtre de fichier, observer le flux,photo, images en couleur et de la souris.
  10. Pour marquer la région d'intérêt (ROI) sur l'image de flux, cliquez sur l'icône «Afficher ROIs». Ensuite, cliquez sur le bouton «Ajouter Polygon» et faites glisser le curseur autour du membre non-chirurgicale pour dessiner le retour sur investissement. Faites un clic droit pour fermer la forme. Sélectionnez 'Ajouter Polygon' à nouveau et tirer un retour sur investissement correspondant autour du membre chirurgical.
  11. Cliquez sur l'icône 'Statistiques pour ouvrir le' image Résultats ROIs statistique (PU) 'fenêtre. Observez la différence pour cent de flux dans la colonne «Flux de% '.
    NOTE: La première ROI tirée servira de référence.
    NOTE: Avant chaque scintigraphie de perfusion ultérieure suivre les étapes décrites dans la section 1 pour anesthésier la souris et dans les étapes 4.1 à 4.11 à l' image de l'animal.

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Representative Results

Une bonne identification de la vascularisation des membres postérieurs de la souris est essentielle pour assurer la reproductibilité des techniques pour induire la fois subaiguë et hindlimb ischémie aiguë, comme décrit ici. En plus de la variation inhérente dans les études animales, d' autres facteurs peuvent introduire la variabilité laser Doppler imagerie de perfusion (LDPI), y compris le type d'anesthésie, la position de l'animal (contre supination sujettes), et la température du corps (voir Figure 3). En outre, le hindlimb modèle d'ischémie subaiguë dépend de la qualité des constricteurs améroïde, qui peuvent varier considérablement à l' intérieur d' un lot donné (voir la figure 4). Chacune de ces questions peut avoir des effets importants sur la quantification du débit mesuré par LDPI et sont discutés plus en détail ci-dessous.

Après le placement des constricteurs améroïde dans le modèle d'ischémie des membres postérieurs subaiguë ou une ligatureet transection de l'artère fémorale dans le modèle hindlimb d'ischémie aiguë, images LDPI doit être obtenue immédiatement après l'opération alors que l'animal est encore anesthésiée pour démontrer les effets de la chirurgie et d' établir un niveau post-opératoire de base de la perfusion (Figure 5). La quantification de la perfusion est réalisée en établissant une région d'intérêt (ROI) autour du membre postérieur ischémique et d'un retour sur investissement comparable autour du membre postérieur non ischémique. Perfusion est le plus souvent exprimée par un rapport de la perfusion dans le membre ischémique à celle de la branche non ischémique et les variations de ce taux sont mesurés au cours du temps. Nous avons trouvé que les souris d'imagerie dans les résultats de position sujettes à moins de variabilité due au mouvement des animaux et des changements dans le positionnement des pieds d'un point de temps à l'autre. De plus, la perfusion de la cuisse supérieure a tendance à être plus variables lorsque les souris sont dans la position couchée. Une perte complète de perfusion hindlimb devrait être observée après l'induction de la branche aiguël' ischémie, alors que seule une légère diminution de la perfusion est typiquement observée après le placement des constricteurs améroïde dans le modèle subaiguë (figure 5). Dans certains cas, nous avons observé une occlusion constrictor rapide avec une perte dramatique résultant de la perfusion immédiatement post-opératoire.

Figure 3
Figure 3. Variation en Perfusion Imaging Basé sur membres postérieurs Position et la température corporelle. Laser Doppler images de perfusion d'une seule souris BALB / c, anesthésiés avec 1,5% d' isoflurane et scanné à la fois la position couchée et sujette à 35 ° C, 37 ° C, et 38 ° C. Sous anesthésie à l'isoflurane, les pattes arrière de l'animal ont tendance à se déplacer par la respiration, ce qui entraîne un artefact (lignes horizontales) qui sont observées avec une fréquence accrue en position couchée par rapport aux images exposées. Dans la position couchée, il est beaucoup plus facile de reproduire l'angle précisdes pieds, ce qui rend la quantification de la perfusion dans le temps plus précis. Perfusion est sensiblement réduite lorsque la température du corps descend en dessous de 37 ° C, alors que les images sont saturées à des températures plus élevées. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Variabilité du commerce Disponible AMEROID constricteurs (A) Un exemple de 0,25 mm de diamètre interne (double flèche) constrictor idéal avec une forme de fente uniforme et l' épaisseur de la caséine (B - D).. Des exemples de variation de forme de fente. Des fentes peuvent parfois afficher une forme «d» (B et C) ou une forme 'b' (D). Dans ces cas, la caséine est assez uniformément répartie et les fentes sont assez profondes hold l'artère. (E) Un exemple d' une épaisseur de caséine inégale. Ce constrictor serait jeté. (F) Un exemple d'une fente qui est trop peu profonde pour maintenir l'artère en place pendant la constriction. Cette constrictor serait également être mis au rebut. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Perfusion Images immédiatement après l' induction de subaiguë ou aiguë membres postérieurs Ischémie. Images de perfusion représentatifs tant dans la position couchée et sujette de souris BALB / c qui ont subi le placement de deux constricteurs améroïde sur l'artère fémorale gauche pour induire subaiguë hindlimb ischémie ou de placement de deux ligatures et transection de l'artère fémorale gauche pour induire une ischémie aiguë des membres postérieurs. On notera que perfusion est réduite , mais encore détectable après le placement de constrictor améroïde, alors que pratiquement aucun écoulement est détecté immédiatement après une double ligature / transection de l'artère fémorale. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Peut-être l'étape la plus difficile dans ce procédé est la séparation de l'artère fémorale dans la veine fémorale. Le plus grand diamètre et des parois minces de la veine fémorale par rapport à celles de l'artère augmente sa sensibilité à la perforation et à la déchirure lors d'une manipulation chirurgicale. La probabilité d'une perturbation de la veine peut être réduit en gardant la plaie humide à l'aide d'un écouvillon stérile humidifié avec du PBS. Il est également important de veiller à ce que toutes les pinces sont aiguisés, alignés, et sans pauses afin de permettre une manipulation précise des vaisseaux et les tissus environnants. Dans le cas où le saignement ne se produit, appliquer une pression sur la zone avec de la gaze stérile jusqu'à ce que le saignement a cessé. notes chirurgicales détaillées devraient être maintenues pour chaque animal, que ce qui peut être perçu comme événements hémorragiques «mineurs» peut représenter une lésion ischémique involontairement plus grave à long terme. Pour la cohérence des données, les chirurgies impliquant aucune hémorragie artérielle ou veineuse collatéraleévénements ING sont cruciales.

Une limitation de cette technique est que la gravité et / ou l'apparition d'une ischémie (dans le modèle améroïde constricteur subaiguë) peuvent varier largement en fonction de plusieurs facteurs. Le constrictor / site de ligature proximale déterminera combien artères collatérales sont affectés par l'induction d'une ischémie. Laissant branches collatérales intactes diminue la gravité de la blessure, mais comme il est indiqué, dans certains contextes, à savoir, chez les animaux de certains milieux génétiques même plus doux, subaiguë ischémie peut provoquer une nécrose tissulaire substantielle 23. En outre, l'addition d'une seconde, constricteur distale ou ligature va diminuer la perfusion à la fois dans le modèle aiguë et subaiguë 23. Certains chercheurs ont ligaturé ou utilisé une électrocoagulation pour ablater branches collatérales de l'artère latérale circonflexe, l'artère fémorale caudale proximale, et l'artère épigastrique superficielle caudale 24. Cela se traduit par une ischémie plus sévère unnd peut induire une plus grande blessure musculaire, même si cela dépend aussi de fond génétique. Il est important de noter que l'électrocoagulation peut être plus susceptible de causer des blessures aux tissus environnants et doit donc être utilisé avec prudence.

À la lumière de ces variables, il est essentiel que l'anatomie vasculaire est précisément identifié avant de choisir le site de l'occlusion. Kochi et al. 25 a noté un manque marqué d' un consensus entre les nombreux rapports concernant les noms et emplacements des vaisseaux sanguins dans le hindlimb de la souris, et ils ont fourni une description très détaillée de l'anatomie artérielle que nous croyons est un guide essentiel pour quiconque d' entreprendre cette procédure. Une publication antérieure dans cette revue a démontré la technique pour induire une ischémie des membres actifs 13, cependant dans ce rapport les repères anatomiques vasculaires ne sont pas bien définies. Un objectif important de ce rapport était de fournir une représentation visuelle améliorée of ces points de repère, en plus de la démonstration d'une modification de la technique en utilisant une ischémie des membres subaiguë.

Une limitation supplémentaire de cette approche est que le début de l'ischémie dans le modèle d'ischémie subaiguë est une fonction de la qualité des constricteurs améroïde que l'on utilise. Nous avons constaté que constricteurs commerciales peuvent varier dans la profondeur et la forme de leur fente interne (Figure 4). Si l'emplacement est trop peu profonde de l'artère peut être extrudée pendant la constriction. Constricteurs avec la caséine fissurés ou fentes malformés doivent être jetés. En outre, la distribution inégale de la caséine dans le constrictor peut entraîner des taux accélérés de l'occlusion. La taille et l'âge des souris est un autre facteur essentiel à considérer, comme la taille des navires chez des souris «adulte» peut varier considérablement entre les âges de 8 et 30 semaines d'âge. Ceci est particulièrement important lors de l'utilisation de multiples cohortes indépendantes de souris pour générer des ensembles de données, comme apparemment Smalgammes l ' âge (par exemple, 10 - 16 semaines) peuvent entraîner des taux incompatibles de l' occlusion et la gravité des blessures des membres ischémiques.

La quantification de la perfusion par laser Doppler imagerie peut également varier largement en fonction de la température corporelle et de la position de l'animal (figure 4), ainsi que l'agent anesthésique utilisé. Il est crucial que la souris maintenir un C la température du corps à 37 ° lors de l'imagerie de perfusion. Si la température est supérieure à 37 ° C, l'image de la perfusion sera saturé. Si la température est inférieure à 36 ° C le signal de perfusion peut être trop faible. Il est également important de maintenir les deux jambes aussi symétrique que possible afin d'obtenir un rapport précis de perfusion (perfusion dans le membre ischémique par rapport à celle de la branche non ischémique). Bien que les souris sont souvent imagées alors couché sur le dos, la symétrie peut être plus difficile à maintenir dans cette position. Par ailleurs, la variation du flux sanguin dans la partie supérieure du domaine de l' imagerie, à savoir la proximal cuisse, peut contribuer à la variabilité de la quantification. En outre, l'anesthésie avec de l'isoflurane se traduit souvent par une augmentation mouvement de la poitrine, ce qui provoque à son tour le mouvement des jambes et de la variabilité dans le signal obtenu par LDPI. Nous avons découvert que placer les animaux en position couchée donne plus d' appui au niveau des membres, ce qui permet un positionnement plus facile et de mouvement considérablement réduit, ce qui se traduit par une quantification plus reproductible de perfusion du membre (figure 5). En outre, la position couchée facilite l' entretien plus uniforme de 37 ° C la température dans les branches balayées, ce qui améliore également la reproductibilité de quantification (figure 5). Par rapport à l'isoflurane, les souris anesthésiés avec affichage de la kétamine ont diminué mouvement de la poitrine, ce qui rend l'imagerie en décubitus moins variable. Cependant, la kétamine permettra également d' augmenter l' induction anesthésique et le temps de récupération, entraînant une augmentation significative perfusion absolue des valeurs 16. Chaque combinaison de position du corps et anestl'agent hetic peut créer une valeur d'image de perfusion distincte, il est donc important d'utiliser une technique cohérente pour chacune de ces méthodes dans l'ensemble des mesures de perfusion ultérieures.

Il est important de reconnaître plusieurs autres limites de cette technique. Parce que le modèle est souvent réalisée chez des souris sans comorbidités telles que l'obésité, l'hyperlipidémie, l'athérosclérose, le diabète sucré, ou d'autres facteurs qui prédisposent à une maladie vasculaire, l'induction d'une ischémie des membres ne sera jamais parfaitement reproduire la pathologie du PAD clinique. Comme indiqué, les effets de la branche ischémie aiguë ont été évalués chez les souris âgées, diabétiques, et hypercholestérolémiques, et dans l'avenir, il sera utile de déterminer les effets de ces maladies concomitantes sur les réponses à subaiguë ischémie des membres. De plus, parce que PAD est une maladie chronique, même subaiguë ischémie des membres est un modèle imparfait du scénario clinique. Par conséquent, il sera important de continuer à développer des modèlesentraîner une véritable ischémie chronique et de les tester en conjonction avec des modèles de facteurs de risque cardiovasculaires. Une limitation technique du laser à effet Doppler modalité d'imagerie quel que soit le modèle animal utilisé est qu'il mesure la vitesse d'écoulement du sang et non absolue de la perfusion tissulaire, par conséquent, il ne peut être utilisé que pour comparer les changements relatifs de l'écoulement sanguin dans un animal donné. Notamment, l' ischémie qui provoque la perte des membres se traduira par un taux de perfusion réduit indépendamment des changements dans la circulation sanguine 23.

En résumé, nous fournissons des méthodes détaillées pour induire aiguë et subaiguë membre postérieur ischémie chez les souris dans le but d'effets sur les muscles squelettiques et le remodelage vasculaire analyse. Une attention particulière est accordée à l'identification des repères vasculaires critiques pour faciliter intra- précise et inter-opérateur reproductibilité du modèle. Le perfectionnement de la technique peut éventuellement conduire à l'élaboration d'un modèle d'ischémie chronique qui précisely réplique la pathogenèse du PAD clinique.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35 Dumoxel
Dumont Style 5 Mini Forceps Fine Science Tools 11200-14 Inox
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08
7 - 0 Silk Suture Sharpoint DA-2527N
5 - 0 Coated Vicryl Suture Ethicon J463G
Graefe Forceps Fine Science Tools 11053-10
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03
Artifical Tears Ointment Rugby Laboratories 0536-6550-91
Surgical Tape 3M 1530-0
Fine Cotton Swabs Contec SC-4
Temperature Controller Physitemp TCAT-2DF
Ameroid Constrictors Research Instruments SW MMC-0.25 x 1.00-SS
Hot Bead Sterilizer
Deltaphase Isothermal Pad Braintree Scientific 39DP
Needle Driver Fine Science Tools
Phosphate Buffered Saline  Gibco 10010-023
Moor LDPI Moor Instruments moorLDI2
moorLDI Measurement software Moor Instruments v. 6.0
Hair Removal Cream Nair

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References

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Médecine numéro 112 Ischémie maladie artérielle périphérique l'angiogenèse régénération du muscle squelettique l'athérosclérose la chirurgie vasculaire hindlimb de la souris constrictor améroïde
Méthodes de aiguë et subaiguë murin Ischémie membres postérieurs
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Padgett, M. E., McCord, T. J.,More

Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia. J. Vis. Exp. (112), e54166, doi:10.3791/54166 (2016).

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