Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

İnsan Karaciğer Kök Hücreler kullanma Insanlaşmış Fare Karaciğer Üretimi

Published: August 29, 2016 doi: 10.3791/54167
* These authors contributed equally

Protocol

Tüm hayvan deney prosedürleri Yokohama City Üniversitesi Hayvanları Koruma düzenlemelerine göre yapılmıştır.

Akut Karaciğer Hasarı Fare Modeli 1. Nesil

  1. 1 mg / ml'lik DT stok çözelti yapmak için, 1 mg difteri toksini (DT) ila (% 0.85 NaCI çözeltisi, 100 ml 0.6 g fenol) phenolized% 0.85 NaCl çözeltisi 1 ml. Not: 1 mg bir konsantrasyonda DT / ml 3 ° C ila 8 ° C 'de yaklaşık 2 yıl boyunca saklanabilir.
  2. Seri olarak phenolized% 0.85 NaCl çözeltisi içinde 0.3 ug / ml DT 1 mg / ml stok çözelti DT seyreltilmesi ve çalışan bir çözelti olarak 0,3 ug / ml DT çözeltisinin bir bölümü hazırlanır. Not: Bu çalışma çözeltisi taze hazırlanmış olmalıdır.
  3. Bir öldürücü doz (~% 50 öldürücü) kullanarak deneyler, 8 haftalık bir farelere DT 1.5 mikrogram / kg dozunu.
    1. sırt yatma fare tutarak DT intraperitoneal gerçekleştirin ve needl eklemekdiz viraj aşağıdaki e, sola veya orta hatta doğru. mesane nüfuz etmesini önlemek için orta hat kaçının. Açı vücuda iğne yaklaşık 45 ° 'dir.
    2. bir insülin şırıngası kullanılarak, fare ağırlığının her 20 gramı başına taze hazırlanmış 0.3 ug / ml DT 100 ul fare enjekte edilir. Örneğin, bir 18-G fare 0.3 ug / ml DT çözeltisi 90 ul almalıdır.
  4. 48 saat sonra DT enjeksiyon, kan damarlarını genişletmek için yaklaşık 10 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde, fare kuyruk süzgeç fare yerleştirilmesi ve ısıtarak kuyruk damarından kan toplamak. Sonra, keskin bir neşter bıçağı ile ucundan kuyruk 2 cm 1 mm nick yapmak ve bir microcapillary tüp kan toplamak.
    1. 5 dakika boyunca 1,500 x g hızında kan içeren Mikro kapiller tüp Santrifüj ve süpernatan ve hücre topağı ayırarak serum toplanır.
  5. 1:20 seyreltilmiştir fare serumu pipetle 50 ul GOT / AST üzerinePIII slaytlar. üreticinin protokolüne göre bir çok-amaçlı otomatik kuru bir kimyasal analizör kullanılarak 650 nm'de reaksiyon ürünü (mavi boya) absorbansı ölçülür.
    NOT: aspartat aminotransferaz (AST) okuma-out / glutamik okzalasetik transaminaz (GOT) faaliyet otomatik olarak görüntülenir. 16,000 IU / L ve akut karaciğer hasarı muzdarip kabul edildi - 2 gün DT enjeksiyon, farelerin yaklaşık% 60 12.000 arasında AST değerleri sergiledi sonrası. Bu fareler, yeni bir kafesine aktarılır ve hücre transplantasyon olarak kullanılmıştır.

İnsan Karaciğer Kök Hücre 2. Hazırlık

  1. Bir CDCP1 + CD90 + CD66- ICSI'nin elde etmek CDCP1, CD90 ve CD66 hücre antijenleri kullanılarak bir hücre sıralayıcı ile insan birincil cenin karaciğer hücreleri insan karaciğer kök hücreleri izole, daha sonra kolajen IV kaplı kültür kaplarına izole hücre popülasyonunu tohum, daha önce 15 bildirilmiştir. Bir embriyonik insan primer cenin karaciğer hücreleri kullanarakhaftalarda 14 ve 18 yaş arası.
  2. Kültür ortamı aspire, 100 mm kültür tabaklarında 90% izdiham 10 ml PBS ile hücreleri yıkayın ve sonra PBS kaldırmak -% 80 kadar kültürlü insan karaciğer kök hücreleri toplayın. 37 ° C'de 5 dakika boyunca 2 mi% 0.05 tripsin / EDTA solüsyonu ile hücreler tripsinize. Not: Hücre farklılaşması farelerde çoğalma yeteneği etkileyebilir çünkü% 90 daha izdiham hücreler, hücre transplantasyonu için uygun değildir.
  3. mikroskop altında hücre dağılım durumunu izlemek. Hücreler kayan veya serbestçe akan gibi göründüğünde,% 10 FBS ihtiva eden DMEM / F12 8 ml ekleyerek ile enzimatik sindirme dur.
  4. yavaş yavaş 10 ml serolojik pipet kullanarak hücrelerin askıya alma ve 15 ml konik bir tüp içine hücreleri aktarın. 100 x g'de 5 dakika 4 ° C'de hücreler santrifüj.
  5. Dikkatle% 10 FBS içeren 10 ml DMEM / F12 hücre pelletini ve bir mikroskop sayma odacığı kullanılarak hücre sayısı belirlenir.
  6. Her fare için PBS alikotları 50 ul başına 1.0 x 10 6 hücre içine hücreleri bölün ve transplantasyon kadar buz üzerinde saklayın.

İnsan Karaciğer Kök Hücre 3. intrasplenik Nakli

  1. 37 ° C elektrikli ısıtma yastığı temiz bir kafes yerleştirin.
  2. meme altına yerleştirerek - (min başına oksijen 2 L% 1.5 (hacim / hacim) 1) fare kullanılarak izofluran inhalasyon anestezisi. Alternatif olarak, izofluran ile ıslatılmış gazlı bez içeren tüpler kullanın.
    1. Fare hafifçe arka Kapkaççı kısma anestezi olduğundan emin olun. Bir diz refleksi elicited ise, geri odasında fare yerleştirin. anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem kullanın.
  3. Elektrik kesme makineleri kullanılarak cerrahi siteyi Tıraş ve (hacim / hacim) etanol ve povidon-iyot sterilize etmek için% 70 uygulanır. Sonra bir kesi üzerinde izledi sadece kaburga kaburga sınırında aşağıda soldan içinde 1 cm cilt kesisi, yapmakkarın duvarı yanı sıra periton.
  4. Dikkatle dalak maruz kalmaktadır. Doğrudan her fare dalak içine 50 ul PBS içinde 1.0 x 10 6 insan karaciğer kök hücreleri enjekte etmek için bir 32-G 1/2-inç iğne ile 100 ul mikroenjeksiyon şırınga kullanın. enjeksiyon için 5 ° açıyla iğne eğin.
    1. enjeksiyon derinliği dalak yarısından daha az kalınlık olduğundan emin olun. iğne bir ucunda (kafa) de dalak girmek ve diğer ucunda (kuyruk) hücreleri yatırmanız gerekmektedir.
  5. enjeksiyonu takiben hücrelerin sızmasını önlemek için, yavaşça 2 dakika süreyle bir parmağınızı kullanarak baskı uygulamak ve daha sonra iğne çıkarılır.
  6. geri fare vücuda dalak yerleştirin ve kas ve cilt için normal çalışma dikiş ile boşluğu kapatın.
  7. Hemen transplantasyonundan sonra 37 ° C önceden ısıtılmış bir kafes içine fareler aktarın. Fareyi sağlamak için, rahat nefes kafeste yan fare yerleştirmek yapabiliyorkafes yatak ve ameliyat sitede arasındaki teması işeme.
  8. Anestezi sütür kapalı kalmasını sağlamak için kapalı giyer ve fareler koşulları ameliyat öncesi dönene kadar fareler izleyin.
  9. fareler sağlamak, normal içme suyu ve gıda ile sağlanır. 1 saat sonra, hayvan merkezi fare oda kafes dönüş ve günlük fareler izler.

4. Tespit Nakledilen İnsan Karaciğer Fare Karaciğer, Hücre-Türetilmiş hepatositlerde Kök

Not: Aşağıdaki işlemler için, servikal dislokasyon tarafından takip ketamin ve ksilizin aşırı dozda kullanan tüm hayvanları euthanize.

  1. 4 at - 6 hafta, transplantasyon sonrası fareler euthanize ve aynı zamanda kutis kesme ve fasya cerrahi makas kullanarak karın boşluğuna açın.
  2. , Periton üzerinde bağ dokusu teşrih bir serpme olarak makas kullanılarak ve Peritoneal açmak için linea alba boyunca periton kestikavite.
  3. , Forseps ile sternum kaldırın diyafram delinme ve servikal kuşak boyunca yukarı sternum her tarafında kesti.
  4. Karaciğerin göğüs tarafında vena kava Sever ve anterior yönde karaciğer yoluyla yemek borusu çekin. karaciğer kaldırmak için diyafram çıkarın.
    Not: makas uçları altında göğüs organlara zarar vermemek için yukarı çekti tutmak için dikkatli olun. Timus bazen sternum dorsal tarafına tutunacak bir eğilimi vardır ve bu özenle kaçınılmalıdır.
  5. Bir kolu olarak diyafram kullanarak, karın boşluğundan dışarı karaciğer çekerek başlayın. İç vena kava yerinde karaciğer tutan olacaktır. İç vena kava kesti; erken sağ adrenal kurtarmak için dikkatli olun.
    Not: Fareler bir medyan lobun oluşan dört loblu karaciğer, sol lob, sağ lob ve kaudat lobu var. Safra kesesi küçük bifurkasyonunda askıya alınırmedyan lobu.
  6. kavşaklarda birbirinden lobları ayırın ve üreticinin protokolüne uygun olarak uygun kesme ısısı (OCT), bileşik bunları yerleştirin. kriyostat metal ızgaralar karaciğer doku içeren OCT dondurun.
  7. -18 ° C'de bir Kriyostat kullanarak 5-mikron kalınlığında örnek bölümleri kesmek ve RT mikroskop slaytlar onları monte edin. -80 ° C de stok saklayın. Hematoksilin ve eosin (H & E) ile, daha önce rapor edilen prosedürlere 16'ya göre immünofloresan boyama için slaytlar hazırlayın.

5. İnsan Albumin salgısını Algılama ve Kimerik Oranı Hesaplama

  1. İnsan karaciğer sulandırma ölçmek için, serum ve üretici talimatlarına göre bir insan albümini ELISA kiti kullanılarak insan albümini ELISA'yı gerçekleştirmek.
  2. tam hümanize karaciğerde gerçek zamanlı ifade düzeylerinin PCR analizi insanlaştırılmış karaciğer kimerik oranını hesaplar. göreceli eski belirleyininsan, fare çapraz aktine insana özgü aktin pression seviyesi oranı (oran 1) ve insan-fare çapraz aktin fare özgü aktin oranı (oran 2). Kimerik hız oranı 1 / olarak (oran 1 + oranı 2) hesaplanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Alb-Treck / SCID fareleri hepatositler bir albümin promotörü kontrolü altında insan DT reseptörü, HB-EGF genini ifade DT tatbikat 12, aşağıdaki sitotoksik etki gösterir. Karaciğer hasarı üzerine DT tedavinin etkilerini değerlendirmek için, 1,5 mikrogram / kg DT dozları 8 haftalık Alb-Treck / SCID farelere enjekte edildi ve karaciğer 48 saat sonrası DT yönetimindeki patolojik değişiklikler histolojik olarak değerlendirildi. (Değil DT ile muamele edilmiş), kontrol fareleri ile karşılaştırıldığında, DT-ile tedavi edilmiş farelerde serum AST aktiviteli tıkanıklığı için bir düzeltme gösteren bir dağınık bir mimari hepatik sergilemiştir. Buna ek olarak, DT-tedavi edilmiş farelerin hepatositler arada koyu çekirdeğinin (muhtemelen apoptotik hepatositler) ile birden çok derin lekeli asidofilik sitoplazmik kusurları vardı; diğer bazı hepatositler Şekil 1 (korunmuş veya çok az veya hiç portal ven iltihabı karanlık çekirdekleri ile bir vakuolize sitoplazma sergiledi çıktı 12 kullanılarak üretilebilir olduğunu gösterdi önceki çalışmanın sonuçları ile uyumludur.

İnsan HpSCs nitro kültür uzun bir dönem için kullanılan ve bazı ALB ve daha az CK19 pozitif hücreleriyle olan homojen hücre morfolojisi sergileyen edilebilir. 6 hafta fare karaciğerinde içine nakli sonrası at, insan HpSCs mikroskop altında temel incelemeye tabi ve histolojik olarak değerlendirildi; İnsan HpSCs orijinal fare hepatositler (Şekil 2) değiştirerek karaciğer yapısını yeniden var gözlendi. Makroskobik olarak, 4 gün insan HpSC nakli, tekdüze tespit edildi karaciğer etrafında dağıtıldı küçük insan karaciğer kümeleri sonrası; 45 gün sonrası transplantasyon de, bu büyük kümeler (Şekil 3) içine çoğaldı. Kiminsan hepatositlerde ile yeniden le fare karaciğeri "insanlaşmış karaciğerler." tayin edildi Bu sonuçlar, insan HpSC transplantasyonu geçiren ölümcül fulminan hepatik yetersizliği olan farelere, normal fare karaciğerinde gözlenenlere benzer karaciğer yapılarına sahip olabileceğini göstermektedir.

Farelere transplante edilen olgunlaşmamış insan hepatositleri farklılaşması için potansiyele sahip olduğunu ve in vivo olarak işlev görebilir olmadığını test öncesinde, fare karaciğerinde insan hepatosit varlığı ilk immünohistokimyasal analiz, yaklaşık 6 hafta sonra, insan HpSC nakli ile teyit edilmiştir. % 60, insan hücreleri oluşumunu farelerin karaciğer kesitleri bu özel ve özgün kontrol fareleri karaciğerler oysa pozitif eş boyanmış insan çekirdekleri ve insan sitokeratin 8/18 olan (CK8 / 18) antikorlar, donör hücreden türetilmiş insan hepatositleri ihtiva ettiği bulundu bu belirteçlerin negatif (Şekil 4).

in vivo hücre farklılaşmasının derecesini değerlendirmek için, insan albumin (ALB) ve insan sitokeratin 19 (CK19) ifadesi immünohistokimyasal değerlendirildi. İnsan HpSC türetilmiş insan hepatositler iyi fare karaciğerinde ayırt edildi ve insan ALB ifadesini regüle sergiledi. ALB-pozitif insan ve CK19-negatif hepatositler olumlu insan ALB ile boyanmış eş ve CK19 hepatositlerin ve cholangiocytes (Şekil 5) içine ayrımında bipotential yeteneği sergiledi hücreler ise, fonksiyonel hepatositler benziyordu. Tüm insan HpSC türetilmiş insancıllaştırılmış karaciğer lobları analiz etmek için kullanılan büyük ölçekli tarama yöntemi koloni gösteren, çok sayıda yuvarlak ve net insan çekirdekleri ve CK8 / 18 ifadesi (Şekil 6) ile karaciğer lobu çevreleyen koloni gibi kümelenmelerin varlığını ortaya insanlaştırılmış karaciğer insan HpSCs yeteneği oluşturulması. repopulation seviyesi% 90 kadar ulaştıBir ay transplantasyon sonrası (Şekil 7A) ve insan albümini sekresyonu insan HpSCs başarıyla Alb-Treck / SCID fare karaciğer sulandırmak olabilir belirten depolanmışsa farenin karaciğerlerinden (Şekil 7B) 'de tespit edilmiştir. Bu sonuçlar, insan HpSCs hatalı fare karaciğer fonksiyonlarının kurtarma yanıt olarak in vivo fonksiyonel hepatositlere farklılaşması için potansiyele sahip olduğunu göstermektedir.

Şekil 1
Şekil 1. Karaciğer Hasarı. Difteri Toksin (DT) Enjeksiyon sonrasında Alb-Treck / SCID (Toksin Reseptör aracılığı Hücre Nakavt) Fare oluşuyor olmadan ve 48 saat sonra DT yönetimi ile fare karaciğerinde Histoloji (hematoksilen-eozin boyama). DT doz: 1.5 mg / kg,, normal karaciğer (sol panel) serum AST aktivite: 30 lU / L'dir; DT ile muamele edilmiş karaciğer AST aktivitesi (sağ panel): 15000IU / L. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2. Akut Karaciğer Yetmezliği Alb-Treck / SCID Fare içine İnsan Karaciğer Kök Hücre Nakli. 6 hafta insan HpSCs sahip insana karaciğerinin makroskopik görünümü (sol panel) ve histolojik analizi (hematoksilen-eozin boyama, sağ panel) nakli sonrası . m, fare karaciğer bölgesi; h insan donör insan bölgeyi hücre kökenli. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3, <br /> Şekil 3. Yeşil Floresan Protein ile Etiketli İnsan Karaciğer Kök Hücre Elde Edilen Insanlaşmış karaciğerinin makroskopik Analizi. Karaciğer yapısı 4 gün (sol panel) ve 45 gün Yüksek büyütme görüntüleri (sağ panel) insan hepatik saplı aşağıdaki nakli hücreler (HpSCs). İnsan karaciğer kök hücreleri (HpSCs) bir lentivirüs vektör kullanılarak gelişmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) ile işaretlendi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4. Karakterizasyonu İnsan Karaciğer anti-insan CK8 / 18 (yeşil) antijeni ve anti-h ile boyanmış insan hepatosit arasında ayrım Hücre-Türetilmiş / SCID Fare Alb-Treck İnsan hepatositlerin. Immünohistokimyasal analizi Kök 6 hafta insan karaciğer kök hücre kaynaklı hümanize karaciğerlerinde Uman nükleer antijen (aqua mavi) nakli sonrası. m, fare karaciğer bölgesi; H, insan donör insan karaciğer bölge, hücre-türevi. İnsan karaciğer bölgesi vs fare karaciğer bölgesini: Beyaz çizgi kesik. Çekirdekler 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (mavi) ile zıt. Ölçek çubukları 100 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
6 hafta nakli sonrası en Alb-Treck / SCID Fare. Immünohistokimyasal insancıllaştırılmış karaciğerinde Şekil 5. İnsan Karaciğer Kök Hücreleri Farklılaşma HpSC türetilmiş karaciğerlerinde insan albumini ve insan CK19 analizleri. Çekirdekler 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (mavi) ile zıt. Ölçek çubukları 100 mikron =.jove.com/files/ftp_upload/54167/54167fig5large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
İnsan karaciğer kök hücrelerinden elde edilen Çoklu büyük kümeler 6 haftada karaciğer lobları tespit edilmiştir Hücre-Türetilmiş Hücreler Alb-Treck içinde Insanlaşmış karaciğerler ile / SCID Fare Mevcut Stem. İnsan Karaciğer Şekil 6. Çoklu Kümeleri için immünohistokimyasal analizi ile transplantasyon sonrası insan CK8 / 18 (yeşil) ve insan çekirdekleri (aqua mavi). Ölçek çubukları 1,000 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7,
Şekil 7. hümanizeAlb-Treck / SCID Fare Karaciğer Repopulation Oranı ve İnsan Albümin salgılanması. (A) insan karaciğer kök hücre nakli sonrası fareler 1 ay / SCID Alb-Treck Kimerik hızı; verileri (n = 12) ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. Mann-Whitney testi: p <Sham ve insan HpSCs için 0.0005 (b) insan albümin algılama fare serasında verici hücre transplantasyonunun ardından bir ay.. Veri = ortalama ± SEM (n = 5). Mann-Whitney testi: p = Sham ve insan HpSCs için 0.0313. ND: saptanamayan; Sham: PBS ile nakledilen fareler; HpSCTx. İnsan HpSCs ile nakledilen fareler bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Son çalışmalar, fare karaciğer yetişkin hepatositlerin ve proliferatif hepatik kök hücreleri 17 de dahil olmak üzere insan hepatositleri ile yeniden yerleştirilmesi göstermiştir. Bu repopulated karaciğer ilaç metabolizması test ve ilaç keşfi ve geliştirilmesi için 18 klinik öncesi deneysel model olarak kullanılmıştır; Buna ek olarak, hücre olgunlaşması ve farklılaşması 19 için bir in vivo ortamda sağladı. Bu çalışmanın temel amacı ilaç metabolizması faaliyetlerinin edinimi için, insan olgunlaşmamış hepatosit çoğalmasını, olgunlaşma ve farklılaşma izin veren bir roman karaciğer hastalığı fare modeli oluşturmak oldu.

intrasplenik nakli elbette yoğun olarak araştırılmıştır. sıçan ve farelerin dalak içine nakledilen hücrelerin kendi ortalama ömrü boyunca hayatta. intrasplenik transplantasyon protokole özgü araştırma soruları araştıran çok yararlı olduğu kanıtlanmıştır;Birçok laboratuarlar dünya çapında çünkü gelişmiş fareler hayatta kalma ve karaciğer rejenerasyonu karaciğer hücre transplantasyonu için son derece güvenilir ve tekrarlanabilir bir model olarak bu protokolü kullanmaya çalışmışlardır. implante hücrelerin çoğunluğu portal dalları tıkamak için karaciğer transloke çünkü Ancak, dalak hamuru içine hücreleri implante bir risk oluşturmaktadır. Bu tıkanıklık geçici olabilir ve karaciğer hasarına önceden var olan durumlarda, sağlıklı bir karaciğer ortamını etkileyen olmayabilir olsa da, bu prosedür daha karaciğer fonksiyon azaltmak ve portal hipertansiyon artırmak ve de olumsuz hücre engraftman etkileyebilir olabilir. başarıyla intrasplenik nakli kullanarak hepatosit nakli uygulanmış olmasına rağmen, çeşitli konularda daha fazla çalışma, potansiyel yeni hücre kaynaklarının özellikle konusunu garanti. intrasplenik hepatosit transplantasyonu yaparken Dahası, hücre yükleme limiti kesinlikle potansiyel rahatsızlık önlemek için takip edilmelidirkalan karaciğer mikrosirkülasyon. DT reseptör heparin bağlayıcı EGF-benzeri büyüme faktörü (HB-EGF ön-maddesi) 20 bir zara-sabitlenmiş form olarak tanımlanmıştır. Bu DT 21 bağlanmaz Fare ve sıçanlarda toksin reseptörlerinin, HB-EGF öncüler olarak insanlar ve maymunlar, bağlama DT ve fonksiyonu olarak toksin duyarlı hayvanlardan elde edilen, HB-EGF öncüleri, ise. Transgenik Alb-Treck / SCID fare modeli karaciğer hücre özel albümini promoterinin kontrolü altında insan HB-EGF-benzeri reseptörler; DT uygulanmasından sonra, bu fareler verici hücre ikamet ve proliferasyonu için alan temin bağlı Hepatositlerin koşullu ablasyon fulminan karaciğer yetmezliği geliştirme. Onların ilaç metabolizması fonksiyonlarını düşmekte da olgunlaşmamış bir faz İnsan hepatositleri, bunların klinik öncesi uygulamalar 22 sınırlayan, in vitro olarak geniş bir çoğalma kapasitesine sahip olduğu bilinmektedir. tra takiben elde edilen histolojik ve immünohistokimyasal bulgularölümcül fulminan karaciğer yetmezliği olan Alb-Treck / SCID farelere insan HpSCs bir nsplantation insan HpSCs genişletmek ve hasarlı fare karaciğer yapıları sulandırmak olabilir belirtti; Bazı farelerde repopulation oranı yaklaşık% 100 idi.

Deneylerde, insan HpSC nakli fare hayatta kalmasını sağladı ve fare serası 16, insan Alb artan salgılanmasında sonuçlanmıştır. Bu hücreler de olgunlaştı ve in vivo farklılaşmış ve insan HpSC türetilmiş insancıllaştırılmış bir farenin karaciğeri olgun ve işlevsel "insan organları" benzer ve ilaç geliştirme potansiyel uygulamalara sahip olduğunu belirten insan ilaç metabolizması faaliyetlerini sergiledi. Bu sonuçlar ayrıca Alb-Treck / SCID fare insanlaşmış karaciğer üretimi için ideal bir model olduğunu onaylayın. insan hepatik kök hücre türetilmiş insancıllaştırılmış karaciğer üretimi için ideal bir model olarak Alb-Treck / SCID farelerinin hedefleri ve avantajlarına rağmen, bunlar, bir tek dezavantajı sahiptirler; zaman insan reklamULT hepatositler DT, tek bir doz ile tedavi edilen üç Alb-Treck / SCID farelere transplante edildi, herhangi bir insanlaştırılmış karaciğerleri yetişkin insan hepatositleri çoğalma kapasitesi olmayan ve bunun sebebi muhtemelen oluşturulmuştur. DT Ek dozları insan yetişkin hepatosit sonrası nakli uygulanabilir olamaz; Beyaz-Treck / SCID fareleri hepatositlerde DT reseptörü (, HB-EGF) bu yana, albümin promotörü kontrolü altındadır, fare karaciğerinde nakledilen insan yetişkin hepatositlerin yok edecek ek DT tedavisi.

Bildiğimiz kadarıyla, bu olgunlaşmamış insan hücrelerinden bir hümanize karaciğer üretmek için ilk modeldir. Hücre bağlama oranı transplantasyon sonrası alıcı mikro-çevre (örneğin, hepatik niş) ve olgunlaşmamış ve proliferatif ve ayırıcı özelliği vs olgun donör hücre özellikleri, etkilenir. kök hücre transplantasyonu ile Alb-Treck / SCID birleştiren insan nesil için optimize koşulları ve avantajlar sağlayacakized karaciğerler. Bu, aynı zamanda, fetal karaciğer hücreleri ve potansiyel olarak IP ve nakli için güçlü bir araç oluşturmaktadır çünkü önce DT tedavisine hepatik hücreler ES türevi, Alb-Treck / SCID hayvanların sağlıklı bir halde muhafaza edilir, karaciğer hasarı, herhangi bir indüklenebilir gelin ve fareler böbrek hasarı olmadan normal doğurmak. Bunun aksine, uPA / SCID fareleri, yüksek neonatal mortaliteyi sergilerler ve üremek için zordur. Ayrıca, hayvanlarda ürokinaz aşırı ekspresyonu şiddetli kanama ve böbrek hasarına yol açabilir ve böylece hücre nakli için bir fırsat sınırlı pencere olduğunu sütten önce; Alb-Treck / SCID her yaşta hücre transplantasyonu için kullanılabilir.

insanlaştırılmış karaciğer fare başarılı nesil aşağıdaki kritik adımları gerektirir: 1) Karaciğer hasarı genellikle öldürücü doz,% 50) kullanılarak (alt öldürücü seviyelere sınırlı olmalıdır; 2) İnsan primer fetal karaciğer hücreleri% 90 daha büyük olan bir alt konfluent olarak muhafaza edilmelidir;3) Hücre kaçak sonrası intrasplenik transplantasyon önlenmeli; ve 4) bir fare serumunda insan albumini seviyesi düzenli aralıklarla kontrol edilmelidir. insanlaşmış fare karaciğer nesil sürecine dahil kritik faktörler kapsamlı bir anlayış başka modifikasyonlar veya sıçan ya da diğer hayvanlar kullanarak yeni gelişmelere katkıda bulunuyor olabilir. Olası uyarlamalar şunlardır: İnsan nefron, bunların ataları gelişim ve bakım incelenmesi ve kanal hücreleri ve fare vücut üç boyutlu yapılara insan nefron kendini düzenlemesi toplamak için böbrek hasarı indüksiyonu; doğrudan yeniden programlanması, iPS veya ES hücrelerinden türetilmiş pankreas kök / progenitör hücreler kullanılarak pankreas adacık hasarın tamirinin incelenmesi. proses modifikasyonların örnekleri şunları içerir: yerleşik hücrelerle donör hücrelerin rekabet kolaylaştırmak için retrorsine, streptozotosin ya da sisplatin gibi toksinler veya kimyasallar ile doku ya da organ hasarı kontrol edilmesi; kaçınmaBu şekilde elde edilen hücreler, ES veya iPS- olarak alıcı hücrelerin, değiştirilmesini teşvik donör hücrelerin proliferatif kapasitesinin arttırılması için ayırıcı veya azaltarak proliferasyonu; Uygun bir nakil siteleri seçerek ve entopic transplantasyonu ve ektopik nakli için mezenter ve renal kapsül için portal veya kuyruk ven kullanılarak, örneğin, verimli nakli sağlamak için hücre infüzyonu kontrol etmek; doku veya alfa fetoprotein veya transferrin olarak kök / progenitör veya olgunlaşmamış hücrelerin nakli ve kanser hücresi izleme organı salgılanan proteinler temsilcisi, ifadesi aracılığıyla değiştirme durumunu izlemeye.

olgun hepatositlerin farklılaşma sağlayan yararlı bir ortam sağlamak Özet olarak, Alb-Treck / SCID fareleri, insan hepatik kök hücre transplantasyonu için uygun bir model oluşturur. Bu yeni model, muazzam uygulamalı bir potansiyele sahip sadece insan hepatositleri b ex vivo artışı içinut ayrıca karaciğer toksisitesi ve metabolizması için ilaç ekranlar ve test aday tedavi edici ilaçlar için. Buna ek olarak, bu sonuçlar, insan karaciğer hücre nakli için bu tekniğin klinik başvurunun incelenmesi, gelecekteki çalışmaların ilerlemesi yardımcı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human albumin Sigma A6684 Mouse
Human CK19 Dako M088801 Mouse
Human nuclei Millipore MAB1281 Mouse
Human CK8/18 Progen GP11 Guinea pig
CDCP1 Biolegend 324006 Mouse
CD90 BD 559869 Mouse
CD66 BD 551479 Mouse
GOT/AST-PIII Fujifilm 14A2X10004000009
DMEM/F-12 Gibco 11320-033
FBS Biowest S1520
0.05% Trypsin-EDTA  Gibco 25300-054
Diphtheria Toxin Sigma D0564-1MG
Human Albumin ELISA Kit Bethyl Laboratories E88-129
Syringe (1 ml) Terumo SS-01T
32G 1/2" needle TSK PRE-32013
O.C.T.Compound(118 ml) Sakura Finetek Japan 4583
MoFlo high-speed cell sorter Beckman Coulter B25982
DRI-CHEM 7000 Fujifilm 14B2X10002000046

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Muruganandan, S., Sinal, C. Mice as clinically relevant models for the study of cytochrome P450-dependent metabolism. Clin. Pharmacol. Ther. 83, 818-828 (2008).
  2. Nishimura, T., et al. Using chimeric mice with humanized livers to predict human drug metabolism and a drug-drug interaction. J. Pharmacol. Exp. Ther. 344, 388-396 (2013).
  3. Suemizu, H., et al. Establishment of a humanized model of liver using NOD/Shi-scid IL2Rgnull mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377, 248-252 (2008).
  4. Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am. J. Pathol. 165, 901-912 (2004).
  5. Hasegawa, M., et al. The reconstituted 'humanized liver'in TK-NOG mice is mature and functional. Biochem. Biophys. Res. Commun. 405, 405-410 (2011).
  6. Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah−/−/Rag2−/−/Il2rg−/− mice. Nat. Biotechnol. 25, 903-910 (2007).
  7. Rhim, J. A., Sandgren, E. P., Degen, J. L., Palmiter, R. D., Brinster, R. L. Replacement of diseased mouse liver by hepatic cell transplantation. Science. 263, 1149-1152 (1994).
  8. Haridass, D., et al. Repopulation efficiencies of adult hepatocytes, fetal liver progenitor cells, and embryonic stem cell-derived hepatic cells in albumin-promoter-enhancer urokinase-type plasminogen activator mice. Am. J. Pathol. 175, 1483-1492 (2009).
  9. Sharma, A. D., et al. Murine embryonic stem cell-derived hepatic progenitor cells engraft in recipient livers with limited capacity of liver tissue formation. Cell. Transplant. 17, 313-323 (2008).
  10. Peltz, G. Can 'humanized' mice improve drug development in the 21st century. Trends Pharmacol. Sci. 34, 255-260 (2013).
  11. Zhu, S., et al. Mouse liver repopulation with hepatocytes generated from human fibroblasts. Nature. 508, 93-97 (2014).
  12. Saito, M., et al. Diphtheria toxin receptor-mediated conditional and targeted cell ablation in transgenic mice. Nat. Biotechnol. 19, 746-750 (2001).
  13. Ishii, T., et al. Transplantation of embryonic stem cell-derived endodermal cells into mice with induced lethal liver damage. Stem Cells. 25, 3252-3260 (2007).
  14. Machimoto, T., et al. Improvement of the survival rate by fetal liver cell transplantation in a mice lethal liver failure model. Transplantation. 84, 1233-1239 (2007).
  15. Taniguchi, H., Zheng, Y. -W. Human hepatic stem cell, method for preparation of the same, method for induction of differentiation of the same, and method for utilization of the same. Japan Patent. , 5822287 (2015).
  16. Zhang, R. -R., et al. Human hepatic stem cells transplanted into a fulminant hepatic failure Alb-TRECK/SCID mouse model exhibit liver reconstitution and drug metabolism capabilities. Stem Cell Res. Ther. 6, 1-12 (2015).
  17. Strom, S. C., Davila, J., Grompe, M. Chimeric Mice with Humanized Liver: Tools for the Study of Drug Metabolism, Excretion, and Toxicity. Hepatocytes. , Methods in Molecular Biology; 640. Springer. 491-509 (2010).
  18. Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharm. Sin. B. 2, 549-561 (2012).
  19. Nowak, G., et al. Identification of expandable human hepatic progenitors which differentiate into mature hepatic cells in vivo. Gut. 54, 972-979 (2005).
  20. Naglich, J. G., Metherall, J. E., Russell, D. W., Eidels, L. Expression cloning of a diphtheria toxin receptor: identity with a heparin-binding EGF-like growth factor precursor. Cell. 69, 1051-1061 (1992).
  21. Mitamura, T., Higashiyama, S., Taniguchi, N., Klagsbrun, M., Mekada, E. Diphtheria toxin binds to the epidermal growth factor (EGF)-like domain of human heparin-binding EGF-like growth factor/diphtheria toxin receptor and inhibits specifically its mitogenic activity. J. Biol. Chem. 270, 1015-1019 (1995).
  22. Liu, Y., Yang, R., He, Z., Gao, W. -Q. Generation of functional organs from stem cells. Cell Regener. 2, 1 (2013).

Tags

Tıp Sayı 114 fulminan karaciğer yetmezliği organ nakli difteri toksini insanlaşmış karaciğer Treck / SCID fareleri intrasplenik nakli insan hepatositler olgunlaşmamış fetal karaciğer hücreleri karaciğer kök hücreler kök hücre biyolojisi albümin
İnsan Karaciğer Kök Hücreler kullanma Insanlaşmış Fare Karaciğer Üretimi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, R. R., Zheng, Y. W.,More

Zhang, R. R., Zheng, Y. W., Taniguchi, H. Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells. J. Vis. Exp. (114), e54167, doi:10.3791/54167 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter