Protocol
Alle Tierversuchsverfahren wurden nach den Tierschutzrichtlinien von Yokohama City University durchgeführt.
1. Erzeugung des akuten Leberschädigung Mausmodell
- 1 ml phenolisiert 0,85% NaCl-Lösung (0,6 g Phenol in 100 ml 0,85% NaCl-Lösung) auf 1 mg Diphtherietoxin (DT), um eine 1 mg / ml Stammlösung DT zu machen. Anmerkung: DT in einer Konzentration von 1 mg / ml für etwa 2 Jahre bei 3 ° C bis 8 ° C gelagert werden.
- Seriell verdünnt das 1 mg / ml Stammlösung DT bis 0,3 & mgr; g / ml in DT phenolisiert 0,85% NaCl-Lösung und ein Aliquot der 0,3 ug / ml DT Lösung als Arbeitslösung herzustellen. Hinweis: Diese Arbeitslösung sollte frisch zubereitet werden.
- Zur Durchführung der Versuche einer subletalen Dosis verwendet (~ 50% Letalität), verabreichen 8 Wochen alte Mäuse eine 1,5 & mgr; g / kg Dosis von DT.
- Führen Sie eine intraperitoneale Injektion von DT mit der Maus in Rückenlage halten und legen Sie die needle unterhalb der Biegung der Knie, links oder rechts von der Mittellinie. Vermeiden, dass die Mittellinie Eindringen der Blase zu verhindern. Winkel der Nadel bei etwa 45 ° an den Körper.
- Verwendung einer Insulinspritze, injizieren die Mäuse mit 100 ul frisch hergestellten 0,3 & mgr; g / ml DT pro 20 g Mausgewicht. Beispielsweise ein 18-g Maus sollte 90 & mgr; l der 0,3 & mgr; g / ml DT-Lösung erhalten.
- Bei 48 Stunden nach der DT-Injektion, sammeln Blut aus der Schwanzvene mit der Maus in einem Verzögerer platzieren und Erwärmung der Maus Schwanz in einem 37 ° C Wasserbad für ca. 10 min, die Blutgefäße zu erweitern. Dann machen Sie einen 1-mm-nick in den Schwanz 2 cm von der Spitze mit einem scharfen Skalpell und sammeln das Blut mit einem Mikrokapillarröhre.
- Zentrifugieren Sie die Mikrokapillarröhre das Blut bei 1.500 × g für 5 min enthält, und sammeln das Serum durch den Überstand und Zellpellet zu trennen.
- Pipettieren von 50 & mgr; l von 1:20 verdünnt Mausserum auf GOT / AST-PIII gleitet. Messen der Extinktion des Reaktionsprodukts (blauer Farbstoff) bei 650 nm eine Mehrzweck automatische Trockenchemie-Analysesystem unter Verwendung von nach dem Protokoll des Herstellers.
HINWEIS: Das Auslesen von Aspartat-Aminotransferase (AST) / Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) -Aktivität wird automatisch angezeigt. 2 Tage Post DT, bei ungefähr 60% der Mäuse AST-Werte zwischen 12.000 ausgestellt - 16.000 IE / l und wurden als von einer akuten Leberschäden zu leiden. Diese Mäuse wurden in einen neuen Käfig übertragen und als Zelltransplantat-Empfängern verwendet.
2. Herstellung von menschlichen Leberstammzellen
- Isolieren der menschlichen Leber Stammzellen aus menschlichen primären fötalen Leberzellen mit einem Zellsortierer mit den CDCP1, CD90 und CD66 Zell-Antigene eine CDCP1 + CD90 + CD66- Subpopulation zu erhalten, dann Samen der isolierten Zellpopulation auf Kollagen IV-beschichteten Kulturschalen, wie zuvor berichtet 15. Verwenden menschliche primäre fetale Leberzellen eines embryonalenAlter zwischen 14 und 18 Wochen.
- Sammeln der menschlichen Leber Stammzellen kultiviert auf 80% - 90% Konfluenz auf 100-mm-Kulturschalen, die das Kulturmedium anzusaugen, wasche die Zellen mit 10 ml PBS und anschließend die PBS zu entfernen. Trypsinize die Zellen mit 2 ml 0,05% Trypsin / EDTA-Lösung für 5 min bei 37 ° C. Anmerkung: Die Zellen mit mehr als 90% Konfluenz für die Zelltransplantation nicht geeignet sind, da die Zelldifferenzierung ihre Proliferationsfähigkeit bei Mäusen beeinflussen.
- Überwachen Sie den Status der Zelldispersion unter einem Mikroskop. Wenn die Zellen frei zu schweben oder fließenden erscheinen, durch Hinzufügen von 8 ml DMEM / F12, enthaltend 10% FBS, die enzymatische Verdauung zu stoppen.
- Suspend die Zellen langsam eine 10-ml serologische Pipette und übertragen Sie die Zellen in einen 15-ml konischen Röhrchen. Zentrifugation der Zellen 5 min bei 100 xg und 4 ° C.
- resuspendieren vorsichtig das Zellpellet in 10 ml DMEM / F12 10% FBS enthält, und zu bestimmen, die Zellzahlen ein Mikroskop Zählkammer verwenden.
- Teilen Sie die Zellen in 1,0 x 10 6 Zellen pro 50 ul PBS Aliquots für jede einzelne Maus und speichern auf Eis bis zur Transplantation.
3. intralienale Transplantation von menschlichen Leberstammzellen
- Einen sauberen Käfig auf einem 37 ° C elektrische Heizkissen.
- Anästhesieren der Maus Isofluran Inhalation (1 - 1,5% (vol / vol) in 2 l Sauerstoff pro min), indem sie unterhalb des Düsen platzieren. Alternativ können Sie Rohre Gaze mit Isofluran getränkt enthält.
- Stellen Sie sicher, dass die Maus leicht betäubt durch den hinteren Fußballen Kneifen. Wenn ein Kniereflex ausgelöst wird, legen Sie die Maus wieder in der Kammer. Verwenden Sie Tierarzt Salbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
- Rasur die Operationsstelle mit elektrischen Haarschneidemaschine und wenden 70% (vol / vol) Ethanol und Povidon-Iod zu sterilisieren. Dann machen Sie eine 1-cm Hautschnitt in der linken Flanke knapp unterhalb der Costal Grenze der Rippen, durch einen Einschnitt folgte aufdie Bauchdecke sowie das Peritoneum.
- aussetzen vorsichtig die Milz. Verwenden eine 100-ul Mikroinjektionsspritze mit einer 32-G 1/2-Zoll - Nadel zu injizieren direkt 1,0 x 10 6 menschliche Leberstammzellen in 50 & mgr; l PBS in die Milz jeder Maus. Kippen Sie die Nadel in einem Winkel von 5 ° zur Injektion.
- Stellen Sie sicher, dass die Tiefe der Injektion ist weniger als die Hälfte der Dicke der Milz. Die Nadel sollte die Milz an einem Ende (der Kopf) und deponieren die Zellen am anderen Ende (der Schwanz) eingeben.
- Um ein Auslaufen der Zellen verhindern Injektion folgende, leicht anzuwenden Druck einen Finger für 2 min und anschließend die Nadel entfernen.
- Legen Sie die Milz wieder in die Maus Körper und schließen Sie den Hohlraum mit einer normalen Lauf Naht für die Muskulatur und die Haut.
- Übertragen Sie die Mäuse in eine 37 ° C vorgewärmten Käfig unmittelbar nach der Transplantation. Um die Maus sorgen in der Lage, bequem zu atmen, legen Sie die Maus auf die Seite in den Käfig einMiktion Kontakt zwischen dem Käfig Betten und der Operationsstelle.
- Überwachen Sie die Mäuse, bis die Betäubung die Nähte zu gewährleisten nachlässt bleiben geschlossen und die Mäuse wieder in Vorchirurgischer Bedingungen.
- Sicherstellen, dass die Mäuse mit normalem Trinkwasser und Lebensmittel zur Verfügung gestellt. Nach 1 Stunde, bringen Sie den Käfig an der Maus Raum des Tieres Zentrum und die Mäuse täglich überwachen.
4. Nachweis von transplantierten menschlichen Leber-Zellen abgeleiteten Hepatozyten in der Mausleber Stem
Hinweis: Für die folgenden Verfahren, einschläfern alle Tiere eine Überdosis von Ketamin und Xylazin durch Genickbruch gefolgt werden.
- Bei 4 - 6 Wochen nach der Transplantation, einschläfern die Mäuse und öffnen Sie die Bauchhöhle, indem Sie gleichzeitig die Kutis Schneiden und Faszien mit chirurgische Scheren.
- Präparieren Sie das Bindegewebe über dem Peritoneum, mit der Schere als Spreizer, und schneiden Sie das Peritoneum entlang der linea alba die Peritonealdialyse zu öffnenHohlraum.
- Heben Sie das Brustbein mit einer Pinzette, die Membran durchstechen, und schneiden Sie durch jede Seite des Brustbeins nach oben durch den Gebärmutterhals-Gürtel.
- Sever die Hohlvene auf der Brustseite der Leber und ziehen Sie die Speiseröhre durch die Leber in der vorderen Richtung. Entfernen Sie die Membran, um die Leber zu entfernen.
Hinweis: Achten Sie darauf, die Spitzen der Schere zu halten nach oben gerichtet, um unter eine Beschädigung der Brustorgane zu verhindern. Der Thymus hat eine Tendenz, gelegentlich an der dorsalen Seite des Sternums klammern und diese sorgfältig vermieden werden müssen. - Verwendung der Membran als Griff, beginnen die Leber aus der Bauchhöhle herausziehen. Das Innere Hohlvene wird die Leber an Ort und Stelle zu halten. Schneiden Sie das Innere Hohlvene; nicht vorzeitig zu befreien, die rechte Neben vorsichtig sein.
Hinweis: Die Mäuse haben ein vier-lappigen Leber, bestehend aus einem Mittellappen, linken Lappen, rechten Lappen und den Lobus caudatus. Die Gallenblase ist in der kleinen Gabelung suspendiertendie Mittellappen. - Trennen Sie die Lappen voneinander an den Übergängen und betten sie in optimale Schnitttemperatur (OAT) Verbindung nach dem Protokoll des Herstellers. Frieren Sie das OAT das Lebergewebe in den Metallgittern auf dem Kryostaten enthält.
- Schneiden Sie 5 um dicke Probenabschnitte einen Kryostat bei -18 ° C unter Verwendung und montieren sie auf RT Mikroskop-Objektträger. Lagern Sie die Lager bei -80 ° C. Bereiten Sie die Folien für Hämatoxylin und Eosin (H & E) und Immunfluoreszenzanfärbung nach zuvor berichteten Verfahren 16.
5. Nachweis von Humanalbumin-Sekretion und Berechnung der Rate Chimäre
- Menschliche Leber Rekonstitution messen, führen Humanalbumin ELISA unter Verwendung von Serum und einer menschlichen Albumin-ELISA-Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
- Berechnen Sie die humanisierte Leber chimären Rate von real-time PCR-Analyse der Expressionsniveaus in der gesamten-humanisiert Leber. Zur Ermittlung der relativen expression Pegelverhältnis von human-spezifischen Aktin zu Mensch-Maus Quer Aktin (Verhältnis 1) und das Verhältnis von Maus-spezifischen Aktin an Mensch-Maus Quer Aktin (Verhältnis 2). Die chimären Rate wird als Verhältnis 1 / (Verhältnis 1 + Verhältnis 2) berechnet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alb-TRECK / SCID - Mäuse - Hepatozyten exprimieren das menschliche DT Rezeptor HB-EGF - Gen unter der Kontrolle eines Albumin - Promotor und nach Verabreichung DT 12 cytotoxische Effekte aufweisen. Um die Auswirkungen der DT-Behandlung auf eine Leberschädigung, DT-Dosen von 1,5 & mgr; g / kg zu bewerten, wurden in injizierten 8 Wochen alte Alb-TRECK / SCID-Mäuse und die pathologischen Veränderungen in der Leber 48 h nach Verabreichung DT wurden histologisch untersucht. Im Vergleich mit Kontrollmäusen (nicht mit DT behandelt), die DT-behandelten Mäuse zeigten eine desorganisierte Leber Architektur eine Korrektur für Staus mit erhöhten Serum-AST-Aktivität zeigt. Darüber hinaus hatte die Hepatozyten der DT-behandelten Mäusen mehrfach, tief stained acidophilen zytoplasmatische Einschlüsse zusammen mit dunklen Kerne (wahrscheinlich apoptotischen Hepatozyten); einige andere Hepatozyten erschien ein vakuolisiertes Zytoplasma mit dunklen Kernen mit wenig oder gar keine Pfortader Entzündung (Bild konserviert oder ausgestellt 1 12.
Menschliche HpSCs kann für langfristige in - vitro - Kultivierung und zeigen eine gleichmäßige Zellmorphologie mit einigen ALB und weniger CK19-positiven Zellen verwendet werden. Nach 6 Wochen Transplantation in die Mäuselebern zu veröffentlichen, wurden die menschlichen HpSCs zu grundlegenden Untersuchung unter dem Mikroskop unterzogen und histologisch untersucht; menschliche HpSCs wurden beobachtet , um die Leberstruktur rekonstituiert wurden von der ursprünglichen Maus - Hepatozyten (Figur 2) ersetzen. Makroskopisch bei 4 Tage nach der menschlichen HPSC Transplantation, kleine menschliche Leber Cluster, die gleichmäßig um die Leber verteilt wurden nachgewiesen wurden; 45 Tage nach der Transplantation, hatte diese in großen Clustern stark vermehrt (Abbildung 3). Werle Mäuselebern mit humanen Hepatozyten rekonstituiert wurden "humanisierte Lebern" bezeichnet. Diese Ergebnisse zeigen, dass Mäuse, die mit letalen fulminantem Leberversagen, die menschliche HPSC Transplantation unterziehen können Leber Strukturen ähnlich denen in normalen Mausleber beobachtet aufweisen.
Post menschlichen HPSC Transplantation vor der Prüfung , ob die unreifen humanen Hepatozyten in Mäuse transplantiert zur Differenzierung das Potential hatte , und in vivo funktionieren könnten, wurde das Vorhandensein von menschlichen Hepatozyten in Mäuselebern zuerst durch immunhistochemische Analyse auf ca. 6 Wochen bestätigt. Leberschnitte von Mäusen, die mit 60% humanen Zelle Neubesiedlung, die spezifisch und positiv Co-gefärbt mit menschlichen Kerne und menschlichen Cytokeratin 8/18 (CK8 / 18) Antikörper gefunden wurden Spender-Zellen abgeleiteten humanen Hepatozyten enthalten, während die ursprünglichen Kontrollmäuse Lebern waren negativ für diese Marker (Abbildung 4).
in vivo beurteilen zu können , die Expression von menschlichem Albumin (ALB) und Human Cytokeratin 19 (CK19) wurde immunhistochemisch untersucht. Menschliche HPSC abgeleiteten humanen Hepatozyten wurden gut in den Mäuselebern differenziert und zeigten menschliche ALB Ausdruck upregulated. Menschliche ALB-positive und CK19-negativ Hepatozyten ähnelte funktionellen Hepatozyten, während Zellen , die positiv mit der menschlichen ALB befleckten Co und CK19 Bipotential Fähigkeit zur Differenzierung in Hepatozyten und Cholangiozyten (Abbildung 5) ausgestellt. Eine groß angelegte Scan - Methode verwendet , um alle menschlichen HPSC abgeleiteten humanisierten Leberlappen zu analysieren , zeigte die Anwesenheit von mehreren runden und kolonie wie Cluster die Leberlappen mit klaren menschlichen Kerne und CK8 / 18 - Expression (Abbildung 6) umgibt, die Kolonie- demonstrieren Bildungsfähigkeit des menschlichen HpSCs in den humanisierten Lebern. Die Neubesiedlung Ebene bis zu 90% erreicht biseinen Monat nach der Transplantation (7A) und Humanalbumin - Sekretion wurde in den neu besiedelt Mäuse Lebern (7B) nachgewiesen, was darauf hinweist , dass die menschliche HpSCs erfolgreich die Alb-TRECK / SCID - Maus - Leber Rekonstitution konnte. Diese Ergebnisse zeigen , dass menschliche HpSCs hohe Potential zur Differenzierung in funktionelle Hepatozyten in vivo als Reaktion auf die Rettung des defekten Mausleberfunktionen.
Abbildung 1. Leberschaden Tritt in Alb-TRECK / SCID (Toxin - Rezeptor - vermittelte Zell Knockout) Mäusen nach Diphtherie - Toxin (DT) Injektion. Histologie (Hämatoxylin-Eosin - Färbung) von Mäuselebern ohne und mit DT Verabreichung nach 48 Stunden. DT Dosis: 1,5 ug / kg, Serum AST-Aktivität normaler Leber (links): 30 IU / L; Serum AST-Aktivität von DT-behandelten Leber (rechtes Bild): 15000IU / L. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Die Transplantation von menschlichen Leberstammzellen in Alb-TRECK / SCID - Mäusen mit fulminantem Leberversagen. Makroskopische Ansicht (links) und die histologische Analyse (Hämatoxylin-Eosin - Färbung, rechts) von humanisierten Lebern mit menschlichen HpSCs 6 Wochen nach der Transplantation . m, Maus Leberbereich; h, menschlichen Spender-Zellen abgeleiteten menschlichen Bereich. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
<br /> Abbildung 3. Die makroskopische Analyse von Humanized Lebern aus menschlichem Leberstammzellen Beschriftet mit Green Fluorescent Protein. Hoch Vergrößerung Bilder der Leberstruktur 4 Tage (linkes Bild) und 45 Tage (rechts) nach der Transplantation mit menschlichen Leberstamm Zellen (HpSCs). Menschliche Leberstammzellen (HpSCs) wurden mit Enhanced Green Fluorescent Protein markiert (EGFP) einen Lentivirusvektor verwenden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Charakterisierung der menschlichen Leber Stammzellen gewonnenen menschlichen Hepatozyten in Alb-TRECK / SCID - Mäusen. Immunhistochemische Analyse Unterscheidung zwischen humanen Hepatozyten mit anti-human CK8 / 18 (grün) Antigen und Anti-h Uman nuclear antigen (aqua blau) in der menschlichen Leber Stammzellen abgeleiteten humanisierten Lebern 6 Wochen nach der Transplantation. m, Maus Leberbereich; h, menschlichen Spender menschlichen Leberregion Zell-abgeleiteten. Weiß gestrichelte Linie: Mäuseleber Region vs. menschliche Leberbereich. Nuclei wurden mit 4 'gegengefärbt, 6-Diamidino-2-phenylindol (blau). Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. menschlichen Leber Stammzellen Differenzierung in Humanized Lebern von Alb-TRECK / SCID - Mäusen. Immunhistochemischen Analysen von Humanalbumin und Human CK19 in HPSC abgeleiteten Lebern 6 Wochen nach Transplantation. Nuclei wurden mit 4 'gegengefärbt, 6-Diamidino-2-phenylindol (blau). Maßstabsbalken = 100 & mgr; m.jove.com/files/ftp_upload/54167/54167fig5large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6. Mehrere Gruppen der menschlichen Leber Stammzellen gewonnenen Zellen vorhanden sind in Alb-TRECK / SCID - Mäusen mit Humanized Lebern. Mehrere große Cluster aus der menschlichen Leber - Stammzellen abgeleitet wurden in den Leberlappen nach 6 Wochen nach der Transplantation identifiziert durch immunhistochemische Analyse für Mensch CK8 / 18 (grün) und menschliche Zellkerne (aqua blau). Maßstabsbalken = 1000 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7. HumanizedLeber Repopulation Rate and Human Albuminsekretion in Alb-TRECK / SCID-Mäusen. (A) Chimäre Rate in Alb-TRECK / SCID - Mäuse von 1 Monat nach der menschlichen Leber Stammzelltransplantation; Daten werden als Mittelwert ± SEM (n = 12) dargestellt. Mann-Whitney - Test: p <0,0005 für Sham und menschlichen HpSCs (B) Nachweis von Humanalbumin in Maus - Seren einen Monat nach Spenderzell - Transplantation.. Daten = Mittelwert ± SEM (n = 5). Mann-Whitney-Test: P = 0,0313 für Sham und menschlichen HpSCs. ND: nicht nachweisbar; Sham: Mäuse, die mit PBS verpflanzt; HpSCTx. Mäuse transplantiert mit menschlichen HpSCs Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Jüngste Studien haben gezeigt , dass die Maus Leber kann mit humanen Hepatozyten neu besiedelt werden, einschließlich Erwachsenen Hepatozyten und proliferative hepatische Stammzellen 17. Diese repopulated Lebern wurden als präklinische Versuchsmodelle für Arzneimittelmetabolismus Test und Arzneimittelentdeckung und -entwicklung 18 verwendet wird ; Darüber hinaus haben sie eine in vivo Umgebung für die Zellreifung und Differenzierung 19 versehen. Das Hauptziel der vorliegenden Studie war es, eine neuartige Lebererkrankung Mausmodell zu erzeugen, die menschliche unreif Hepatozytenproliferation erlaubt, Reifung und Differenzierung, für den Erwerb von Arzneimittelmetabolismus-Aktivitäten.
Der Verlauf der intralienale Transplantation wurde ausgiebig untersucht. Die Zellen in der Milz von Ratten transplantiert und Mäuse überleben während ihrer durchschnittlichen Lebensdauer. Die intralienale Transplantation Protokoll hat bei der Untersuchung von spezifischen Forschungsfragen sehr nützlich erwiesen;vielen Laboratorien weltweit haben versucht, für Leberzelltransplantation dieses Protokoll als in hohem Maße reproduzierbar und zuverlässiges Modell zu verwenden, aufgrund der verbesserten Mäuse das Überleben und die Regeneration der Leber. Jedoch stellt ein Risiko Zellen in die Milzpulpa implantieren, da die Mehrzahl von implantierten Zellen in die Leber translozieren, wo sie Portal Zweige okkludieren kann. Auch wenn diese Okklusion vorübergehend sein kann und möglicherweise nicht eine gesunde Leber-Umgebung, in Fällen von bereits existierenden Leberschäden beeinflussen, könnte dieses Verfahren weitere Funktion der Leber und erhöhen portale Hypertension reduzieren und könnte sich auch negativ auf Zelle Verpflanzung beeinflussen. Obwohl wir erfolgreich Hepatozytentransplantation mit intralienale Transplantation angewendet haben, rechtfertigen einige Probleme eine weitere Studie, vor allem das Thema der möglichen neuen Zellquellen. Wenn darüber hinaus intralienale Hepatozytentransplantation durchführen, muss die Zelle Belastungsgrenze strikt befolgt werden, um mögliche Störungen zu verhindern, indemÜberbleibsel Lebermikrozirkulation. Der DT - Rezeptor wurde als membranverankerten Form des Heparin-bindenden EGF-ähnlichen Wachstumsfaktor (HB-EGF - Vorläufer) 20 identifiziert. Wohingegen HB-EGF - Vorläufer abgeleitet von Toxin empfindlichen Tieren, wie Menschen und Affen, bind DT und Funktion als Toxin - Rezeptoren, HB-EGF - Vorläufer von Mäusen und Ratten nicht binden DT 21. Transgene Alb-TRECK / SCID-Maus-Modell ausdrückt menschlichen HB-EGF-like-Rezeptoren unter der Kontrolle eines Leberzell-spezifischen Albuminpromotor; Nach der Verabreichung von DT, entwickeln diese Mäuse fulminantem Leberversagen aufgrund bedingten Ablation von Hepatozyten, Platz zum Spenderzelle Aufenthalts- und Proliferation. Humanen Hepatozyten, auch bei einem unreifen Phase, sind dafür bekannt, umfangreiche proliferative Kapazität in vitro besitzen, obwohl sie ihre Drogen - Stoffwechsel Funktionen verlieren, ihre präklinischen Anwendungen 22 zu begrenzen. Die histologische und immunhistochemische Befunde nach dem tra erhaltennsplantation menschlicher HpSCs in Alb-TRECK / SCID-Mäuse mit tödlichem fulminanten Leberversagen angegeben, dass die menschliche HpSCs könnten die beschädigten Mausleber Strukturen erweitern und Rekonstitution; die Neubesiedlung Rate in einigen Mäusen war nahezu 100%.
In unseren Experimenten gefördert menschlichen HPSC Transplantation das Überleben der Mäuse und führte zu einer erhöhten Sekretion von menschlichem ALB in Mausseren 16. Diese Zellen auch gereift und differenziert in vivo und menschlichen Stoffwechsel von Arzneimitteln Aktivitäten zeigten, was darauf hinweist , dass die menschliche HPSC abgeleiteten humanisierten Mäusen Lebern sind ähnlich zu reifen und funktional "menschliche Organe" und haben potenzielle Anwendungen in der Arzneimittelentwicklung. Diese Ergebnisse bestätigen ferner, dass die Alb-TRECK / SCID-Maus ist ein ideales Modell für humanisierte Leber Generation. Trotz der Aussichten und Vorteile von Alb-TRECK / SCID-Mäuse als ideales Modell für den menschlichen Leber Stammzellen abgeleiteten humanisierten Leber Generation besitzen sie einen eindeutigen Nachteil; wenn menschliche adult Hepatozyten wurden transplantierte in drei Alb-TRECK / SCID-Mäuse mit einer Einzeldosis von DT behandelt, keine humanisierten Lebern wurden erzeugt, möglicherweise weil humanen adulten Hepatocyten proliferative Kapazität fehlt. Zusätzliche Dosen von DT kann nicht nach der Transplantation von humanen adulten Hepatozyten verabreicht werden; da die DT-Rezeptor (HB-EGF) in Alb-TRECK / SCID-Mäuse-Hepatozyten unter der Kontrolle des Albumin-Promotor, zusätzliche DT Behandlung die transplantierten humanen adulten Hepatocyten in der Mäuseleber zerstören.
Nach bestem Wissen und Gewissen, dann ist dies das erste Modell eines humanisierten Leber aus unreifen menschlichen Zellen zu erzeugen. Zellersatzrate nach der Transplantation wird durch den Empfänger - Mikroumgebung (zB Lebernische) und Spenderzelleigenschaften, wie reife vs. unreif und proliferative und Differentialfähigkeit beeinflusst. Alb-TRECK / SCID mit Stammzelltransplantation kombiniert wird zur Erzeugung von menschlichen optimierten Bedingungen und Vorteile bietenized Lebern. Dies ist auch ein leistungsfähiges Werkzeug für die Transplantation von fötalen Leberzellen und möglicherweise sowie iPS oder darstellt, da der DT-Behandlung vor Leberzellen ES-derived, die Alb-TRECK / SCID Tiere in einem gesunden Zustand gehalten werden, ist Leberschäden induzierbaren bei jeder Punkt, und die Mäuse züchten normalerweise ohne Nierenschäden. Im Gegensatz dazu uPA / SCID-Mäuse zeigen eine hohe neonatale Mortalität und sind schwierig zu züchten. Des Weiteren stellt die Überexpression von Urokinase bei den Tieren zu schweren Blutungen und Nierenschäden führen kann und somit gibt es eine begrenzte Zeitfenster für Zelltransplantation vor der Entwöhnung; Alb-TRECK / SCID kann für Zelltransplantation in jedem Alter eingesetzt werden.
Die erfolgreiche Erzeugung eines humanisierten Leber Maus erfordert die folgenden kritischen Schritte: 1) Leberschäden sollten über die tödliche Dosis, 50%) (in der Regel auf subletale Ebenen begrenzt werden; 2) Die primären humanen fötalen Leberzellen sollten in einem subkonfluenten Zustand nicht mehr als 90% gehalten werden;3) Zellleck Post intralienale-Transplantation sollte verhindert werden; und 4) Die Mengen an Humanalbumin in Maus-Seren sollten in regelmäßigen Abständen überwacht werden. Ein umfassendes Verständnis der kritischen Faktoren in den Prozess der humanisierten Maus Leber Generation beteiligt sein könnten, um weitere Modifikationen oder Neuentwicklungen beitragen Ratten oder anderen Tieren verwendet wird. Mögliche Anpassungen sind: die Induktion von Nierenschädigung für mit menschlichen Nephronen Entwicklung und Reparatur der Prüfung, deren Vorläufern und Gangzellen und die Selbstorganisation des menschlichen Nephronen in dreidimensionale Strukturen in der Maus Körper zu sammeln; Untersuchung der Reparatur von Schäden islet in der Bauchspeicheldrüse von direkt umprogrammiert, IPS- oder ES-Zellen abgeleitet pankreatischen Stammzellen / Vorläuferzellen verwendet. Beispiele für Prozess Modifikationen umfassen: Steuern Gewebe oder Organverletzung mit Toxinen oder Chemikalien wie Retrorsin, Streptozotocin oder Cisplatin die Konkurrenz von Spenderzellen mit residenten Zellen zu erleichtern; VermeidungDifferential- oder abnehm Proliferation, um die proliferative Fähigkeit der Spenderzellen zu erhöhen, wodurch der Ersatz von Empfängerzellen, wie ES oder IPS- abgeleiteten Zellen zu fördern; ein geeignetes Transplantat der Auswahl von Standorten und Infusions Kontrolle der Zell effiziente Transplantation zu gewährleisten, beispielsweise das Portal oder Schwanzvene für entopic Transplantation und das Gekröse und Nierenkapsel für ektopische Transplantation verwendet wird; Überwachung über die Expression von Gewebe- oder Organ sekretierten Proteinen repräsentativ Stammzellen / Vorläuferzellen oder unreife Transplantation und Krebszellverfolgung, wie Alpha-Fetoprotein oder Transferrin Ersetzungsstatusbit.
Zusammengefasst Alb-TRECK / SCID-Mäuse bilden ein geeignetes Modell für die menschliche Transplantation Leberstammzelle, da sie eine günstige Umgebung schaffen, die für die Differenzierung in reife Hepatozyten ermöglicht. Dieses neue Modell verfügt über ein enormes Potenzial applicative, nicht nur für die ex vivo Expansion von humanen Hepatozyten but auch für Drogen-Bildschirme und Testkandidaten therapeutische Arzneimittel für Lebertoxizität und den Stoffwechsel. Darüber hinaus wird helfen, diese Ergebnisse in der Weiterentwicklung der zukünftigen Studien, die klinische Anwendung dieser Technik für die menschliche Leberzelltransplantation untersucht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human albumin | Sigma | A6684 | Mouse |
| Human CK19 | Dako | M088801 | Mouse |
| Human nuclei | Millipore | MAB1281 | Mouse |
| Human CK8/18 | Progen | GP11 | Guinea pig |
| CDCP1 | Biolegend | 324006 | Mouse |
| CD90 | BD | 559869 | Mouse |
| CD66 | BD | 551479 | Mouse |
| GOT/AST-PIII | Fujifilm | 14A2X10004000009 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320-033 | |
| FBS | Biowest | S1520 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Diphtheria Toxin | Sigma | D0564-1MG | |
| Human Albumin ELISA Kit | Bethyl Laboratories | E88-129 | |
| Syringe (1 ml) | Terumo | SS-01T | |
| 32G 1/2" needle | TSK | PRE-32013 | |
| O.C.T.Compound(118 ml) | Sakura Finetek Japan | 4583 | |
| MoFlo high-speed cell sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| DRI-CHEM 7000 | Fujifilm | 14B2X10002000046 |
References
- Muruganandan, S., Sinal, C. Mice as clinically relevant models for the study of cytochrome P450-dependent metabolism. Clin. Pharmacol. Ther. 83, 818-828 (2008).
- Nishimura, T., et al. Using chimeric mice with humanized livers to predict human drug metabolism and a drug-drug interaction. J. Pharmacol. Exp. Ther. 344, 388-396 (2013).
- Suemizu, H., et al. Establishment of a humanized model of liver using NOD/Shi-scid IL2Rgnull mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377, 248-252 (2008).
- Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am. J. Pathol. 165, 901-912 (2004).
- Hasegawa, M., et al. The reconstituted 'humanized liver'in TK-NOG mice is mature and functional. Biochem. Biophys. Res. Commun. 405, 405-410 (2011).
- Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah−/−/Rag2−/−/Il2rg−/− mice. Nat. Biotechnol. 25, 903-910 (2007).
- Rhim, J. A., Sandgren, E. P., Degen, J. L., Palmiter, R. D., Brinster, R. L. Replacement of diseased mouse liver by hepatic cell transplantation. Science. 263, 1149-1152 (1994).
- Haridass, D., et al. Repopulation efficiencies of adult hepatocytes, fetal liver progenitor cells, and embryonic stem cell-derived hepatic cells in albumin-promoter-enhancer urokinase-type plasminogen activator mice. Am. J. Pathol. 175, 1483-1492 (2009).
- Sharma, A. D., et al. Murine embryonic stem cell-derived hepatic progenitor cells engraft in recipient livers with limited capacity of liver tissue formation. Cell. Transplant. 17, 313-323 (2008).
- Peltz, G. Can 'humanized' mice improve drug development in the 21st century. Trends Pharmacol. Sci. 34, 255-260 (2013).
- Zhu, S., et al. Mouse liver repopulation with hepatocytes generated from human fibroblasts. Nature. 508, 93-97 (2014).
- Saito, M., et al. Diphtheria toxin receptor-mediated conditional and targeted cell ablation in transgenic mice. Nat. Biotechnol. 19, 746-750 (2001).
- Ishii, T., et al. Transplantation of embryonic stem cell-derived endodermal cells into mice with induced lethal liver damage. Stem Cells. 25, 3252-3260 (2007).
- Machimoto, T., et al. Improvement of the survival rate by fetal liver cell transplantation in a mice lethal liver failure model. Transplantation. 84, 1233-1239 (2007).
- Taniguchi, H., Zheng, Y. -W. Human hepatic stem cell, method for preparation of the same, method for induction of differentiation of the same, and method for utilization of the same. Japan Patent. , 5822287 (2015).
- Zhang, R. -R., et al. Human hepatic stem cells transplanted into a fulminant hepatic failure Alb-TRECK/SCID mouse model exhibit liver reconstitution and drug metabolism capabilities. Stem Cell Res. Ther. 6, 1-12 (2015).
- Strom, S. C., Davila, J., Grompe, M. Chimeric Mice with Humanized Liver: Tools for the Study of Drug Metabolism, Excretion, and Toxicity. Hepatocytes. , Methods in Molecular Biology; 640. Springer. 491-509 (2010).
- Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharm. Sin. B. 2, 549-561 (2012).
- Nowak, G., et al. Identification of expandable human hepatic progenitors which differentiate into mature hepatic cells in vivo. Gut. 54, 972-979 (2005).
- Naglich, J. G., Metherall, J. E., Russell, D. W., Eidels, L. Expression cloning of a diphtheria toxin receptor: identity with a heparin-binding EGF-like growth factor precursor. Cell. 69, 1051-1061 (1992).
- Mitamura, T., Higashiyama, S., Taniguchi, N., Klagsbrun, M., Mekada, E. Diphtheria toxin binds to the epidermal growth factor (EGF)-like domain of human heparin-binding EGF-like growth factor/diphtheria toxin receptor and inhibits specifically its mitogenic activity. J. Biol. Chem. 270, 1015-1019 (1995).
- Liu, Y., Yang, R., He, Z., Gao, W. -Q. Generation of functional organs from stem cells. Cell Regener. 2, 1 (2013).
