Protocol
כל הפרוצדורות בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות צער בעלי חיים של אוניברסיטת העיר יוקוהמה.
1. דור של במודל העכבר הפגיע בכבד החריף
- הוסף 1 מ"ל של תמיסת 0.85% NaCl phenolized (פנול 0.6 גרם ב 100 מ"ל של תמיסת 0.85% NaCl) עד 1 רעלן דיפתריה מ"ג (DT) כדי להפוך פתרון מניות 1 מ"ג / מ"ל DT. הערה: DT בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל ניתן לאחסן כ 2 שנים 3 מעלות צלזיוס עד 8 מעלות צלזיוס.
- סדרתי לדלל את פתרון מניות 1 מ"ג / מיליליטר DT 0.3 מיקרוגרם / מיליליטר DT בתמיסת phenolized 0.85% NaCl ולהכין aliquot של פתרון DT 0.3 מיקרוגרם / מיליליטר כפתרון עבודה. הערה: הפתרון עובד זה אמור להיות מוכן טרי.
- כדי לערוך ניסויים שימוש במינון sublethal (~ 50 הקטלניות%), לנהל עכברים 8 שבועות בן מנה 1.5 מיקרוגרם / ק"ג של DT.
- בצע זריקה intraperitoneal של DT ידי החזקת העכבר שכיבה על הגב והכנס את needlה להלן העיקול של הברכיים, שמאלה או ימינה של קו האמצע. הימנע קו האמצע כדי למנוע חדירה של שלפוחית השתן. זווית את המחט על כ 45 מעלות לגוף.
- באמצעות מזרק אינסולין, להזריק עכברים עם 100 μl של המוכן טרי 0.3 מיקרוגרם / מ"ל DT לכל 20 גרם של משקל העכבר. לדוגמה, עכבר 18 גרם צריך לקבל 90 μl של פתרון DT 0.3 מיקרוגרם / מ"ל.
- בשעה 48 הזרקת שעות שלאחר DT, לאסוף דם מווריד הזנב על ידי הצבת העכבר בתוך עוצר ומחמם הזנב העכבר באמבט המים 37 מעלות צלזיוס למשך כ 10 דקות כדי להרחיב את כלי הדם. לאחר מכן, לבצע ניק 1-מ"מ ס"מ הזנב 2 מהקצה עם להב אזמל חד לאסוף את הדם עם צינור microcapillary.
- צנטריפוגה צינור microcapillary המכיל את הדם ב 1500 XG במשך 5 דקות לאסוף את הסרום על ידי הפרדת גלולת supernatant ותא.
- פיפטה 50 μl של 1:20 סרום עכבר מדולל על GOT / AST-PIII מחליק. מדוד את הספיגה של מוצר התגובה (צבע כחול) ב 650 ננומטר באמצעות נתח רב תכליתי אוטומטית יבשה-כימיה על פי הפרוטוקול של היצרן.
הערה: מתוך לקריאה של aminotransferase aspartate (AST) / transaminase oxaloacetic גלוטמית (GOT) פעילות מוצגת באופן אוטומטי. 2 ימים שלאחר DT זריקה, כ -60% מהעכברים הציג ערכים AST בין 12,000 - 16,000 IU / L ונחשבו סובל מנזק כבד חריפה. עכברים אלו הועברו לכלוב חדש ומשומש כמקבל השתלה תאית.
2. הכנה בתאי גזע אנושית כבדיה
- לבודד תאי גזע בכבד אדם מתאי כבד עוברי עיקרי אדם עם סדרן תא באמצעות CDCP1, CD90, ו אנטיגנים תא CD66 להשיג subpopulation CDCP1 + CD90 + CD66-, אז זרע אוכלוסיית התאים המבודדת על קולגן תרבות מנות IV-מצופות, כפי שדווח בעבר 15. השתמש בתאים בכבד עובר עיקריים אדם של עובריגיל בין שבועות 14 ו -18.
- אסוף בתאי גזע כבד אנושיים תרבותיים עד 80% - מפגש 90% על תרבות מנות 100 מ"מימ, לשאוב את מדיום התרבות, לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר PBS, ולאחר מכן להסיר את PBS. Trypsinize את התאים עם פתרון 0.05% טריפסין / EDTA 2 מ"ל במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הערה: תאים בבית יותר מ 90 מפגש% אינם מתאימים השתלת תאים מאז התמיינות תאים עשויה להשפיע יכולת השגשוג שלהם בעכברים.
- לפקח על מצב של פיזור התאים תחת מיקרוסקופ. כאשר התאים מופיעים בריחוף או לזרום בחופשיות, לעצור את העיכול אנזימטי על ידי הוספת 8 מיליליטר של DMEM / F12 המכיל 10% FBS.
- להשעות את התאים לאט בעזרת פיפטה סרולוגיות 10 מ"ל ולהעביר את התאים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה התאים למשך 5 דקות ב 100 XG ו -4 מעלות צלזיוס.
- בזהירות resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל DMEM / F12 המכיל 10% FBS ולקבוע מספרים סלולריים באמצעות תא ספירה מיקרוסקופ.
- מחלקים את התאים לתוך 1.0 x 10 6 תאים לכל 50 μl של aliquots PBS עבור כל עכבר הפרט ולאחסן על הקרח עד להשתלה.
3. השתלת Intrasplenic של תאי גזע אנושי כבדיה
- מניחים לכלוב נקי על כרית חימום חשמלי 37 ° C.
- להרדים את שאיפת isoflurane באמצעות העכבר (1 - 1.5% (כרך / כרך) ב 2 ליטר של חמצן לדקה) על ידי הצבתו מתחת זרבובית. לחלופין, השתמש צינורות המכילים גזה ספוגה isoflurane.
- ודא כי העכבר הוא מורדם על ידי צובט את השודד האחורי בקלילות. אם אידיוט ברך מתקבל, למקם את העכבר בחזרה לתא. השתמש במשחת וטרינר על העיניים כדי למנוע יובש לאחר הרדמה.
- לגלח את האתר כירורגית באמצעות קוצץ חשמלי ולהחיל 70% (כרך / כרך) אתנול povidone יוד לעקר. ואז לעשות חתך בעור 1-ס"מ בכנף שמאל ממש מתחת לגבול costal של הצלעות, ואחריו חתך עלדופן הבטן, כמו גם את הצפק.
- בזהירות לחשוף את הטחול. השתמש במזרק microinjection 100 μl עם מחט 32-G 1/2-inch להזריק ישירות 1.0 x 10 6 בתאי גזע בכבד האדם 50 μl PBS לתוך הטחול של כל עכבר. הטה את המחט בזווית 5 מעלות להזרקה.
- ודא כי ועומק הזרקה הוא פחות ממחצית עובי של הטחול. המחט צריכה להיכנס הטחול בקצה אחד (ראש) וכן להפקיד את התאים בקצה השני (הזנב).
- כדי למנוע דליפה של התאים לאחר ההזרקה, להפעיל לחץ בעדינות בעזרת האצבע למשך 2 דקות ולאחר מכן להסיר את המחט.
- מניח את הטחול בחזרה לתוך גוף העכבר ולסגור את החלל עם תפר ריצה נורמלי השרירים והעור.
- מעבירים את העכברים לכלוב מחומם מראש 37 ° C מיד לאחר ההשתלה. כדי להבטיח את העכבר הוא מסוגל לנשום בנוחות, הצב את העכבר על צדו בכלוב,רקת קשר בין מצעי כלוב באתר של ניתוח.
- צג העכברים עד ההרדמה פגה כדי להבטיח את התפרים נשארים סגורות העכברים לחזור טרום ניתוח תנאים.
- ודא העכברים מסופקים עם מים ומזון שתייה רגילים. אחרי השעה 1, להחזיר את הכלוב לחדר העכבר של מרכז בעלי החיים לפקח על העכברים יומיים.
4. איתור של מושתלי האדם כבדית גזע hepatocytes נגזר-Cell בכבד העכבר
הערה: ההליכים הבאים, להרדים כל בעלי החיים באמצעות מנת יתר של קטמין ו xylazine ואחריו נקע בצוואר הרחם.
- ב 4 - 6 שבועות לפרסם ההשתלה, להרדים את העכברים ולפתוח את חלל הבטן על ידי חיתוך cutis בו זמנית fascia באמצעות מספריים כירורגיות.
- לנתח את רקמת החיבור מעל הצפק, באמצעות מספריים כמו מפזר, וחתך את הצפק לאורך alba Linea כדי לפתוח את הצפקחָלָל.
- הרם את החזה עם מלקחיים, לנקב את הסרעפת, ולחתוך בכל צד של עצם החזה עד דרך אבנט צוואר הרחם.
- לנתק את הווריד הנבוב בצד החזה של הכבד ולמשוך הוושט דרך הכבד לכיוון הקדמי. הסר את הסרעפת על מנת להסיר את הכבד.
הערה: הקפד לשמור את קצות מספריים הצביע כלפי מעלה על מנת למנוע כל נזק לאיברים החזה מתחת. התימוס יש נטייה להיצמד מדי פעם בצד הגבי של החזה וזה יש להימנע בזהירות. - באמצעות הסרעפת כידית, מתחיל ללחוץ על הכבד מתוך חלל הבטן. הווריד הנבוב הפנים יקיים כבד במקום. חותכים את הווריד הנבוב פנים; להיזהר שלא לשחרר את הכליה התקינה בטרם עת.
הערה: יש עכברים כבדים ארבעה אונות מורכב אונת חציון, באונה שמאלית, אונה ימנית, ואונת caudate. את כיס המרה מושעה ב הסתעפות קטנה שלאונת החציון. - הפרד את האונות אחד מהשני בצומת והטמעת אותם בטמפרטורת חיתוך אופטימלי מתחמת (אוקטובר) על פי הפרוטוקול של היצרן. Freeze ב- OCT המכיל את רקמת הכבד של רשתות מתכת על cryostat.
- חותכים חלקים מדגם בעובי של 5 מיקרומטר באמצעות cryostat ב C -18 ° ולעגן אותם בשקופיות מיקרוסקופ RT. אחסן את המניה ב -80 ° C. הכן את השקופיות עבור hematoxylin ו eosin (H & E) מכתים immunofluorescence פי נהלים שדווח בעבר 16.
5. איתור של הפרשת אלבומין אדם חישוב שיעור Chimeric
- כדי למדוד כינון מחדש כבד אנושי, לבצע אלבומין האנושי ELISA שימוש בסרום וערכת ELISA אדם אלבומין פי הוראות היצרן.
- חשב את שיעור כימרי הכבד האנושי על ידי בזמן אמת ניתוח PCR של רמות ביטוי בכבד השלם-אנושי. קבע את האקס יחסיתpression יחס רמה תקטין אדם ספציפי כדי יקטין צלב אדם ועכבר (1 יחס) והיחס של אקטין ספציפי בעכבר כדי יקטין צלב אדם ועכבר (יחס 2). שיעור כימרי מחושב כיחס 1 / (יחס 1 + יחס 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alb-TRECK / hepatocytes עכברי SCID המבטא את גן HB-EGF קולטן DT אדם בשליטת אמרגן אלבומין ולהציג השפעות ציטוטוקסיות הבאים DT ממשל 12. כדי להעריך את ההשפעות של טיפול DT על פגיעה בכבד, מינונים DT של 1.5 מיקרוגרם / ק"ג הוזרקו בן 8 שבועות Alb-TRECK / SCID עכברים ואת שינויים פתולוגיים בממשל הכבד 48 שעות שלאחר DT הוערכו היסטולוגית. לעומת עכברי שליטה (שלא טופלו ב- DT), העכברים שטופלו DT הציגו ארכיטקטורה כבדה מאורגנת מראה תיקון עבור גודש עם פעילות AST אצלה עלתה. בנוסף, hepatocytes של עכברי DT שטופל היה מרובה, צבעוני מאוד תכלילים ציטופלסמית אסידופילוס יחד עם גרעינים כהים (כנראה hepatocytes אפופטוטיים); כמה hepatocytes השני נראה נשמר או הציג הציטופלסמה vacuolated עם גרעינים כהים עם מעט או ללא דלקת וריד שער (איור 1 12.
ניתן להשתמש HpSCs אדם לטווח ארוך culturing במבחנה להפגין מורפולוגיה תאים אחידה עם כמה ALB ופחות תאי CK19 חיובי. לאחר 6 שבועות לפרסם השתלה לתוך כבדי העכבר, HpSCs האדם היו נתוני בדיקה בסיסית תחת מיקרוסקופ ומוערכת היסטולוגית; HpSCs אדם נצפה להיות מחדש את המבנה הכבד על ידי החלפת hepatocytes העכבר המקורי (איור 2). Macroscopically, ב 4 ימים שלאחר השתלת אדם HpSC, אשכולות כבד אנושיים קטנים שהיו מפוזר באופן אחיד סביב הכבד אותרו; ב השתלת 45 ימים, אלה שהתרבו לאשכול גדול (איור 3). מי כבדי עכבר le מחדש עם hepatocytes האדם יועדו "כבדים אנושיים." תוצאות אלו מצביעות כי עכברים עם כשל מוחלט של תפקוד כבד קטלני לעבור השתלת HpSC אדם עשויים להפגין מבנים כבדים דומים לאלו שנצפו כבדי עכבר רגילים.
לפני הבדיקה אם hepatocytes האדם לא הבוגר הושתל בעכברים היה פוטנציאל בידול יכול לתפקד vivo, בנוכחות hepatocytes האדם כבד עכבר אושרה לראשונה על ידי ניתוח immunohistochemical בכ 6 שבועות לאחר אדם השתלת HpSC. סעיפים כבדים מעכברים עם ואכלוס תא אנושי 60% באופן ספציפי ושיתוף מוכתם חיובי עם גרעיני אדם cytokeratin אדם 8/18 (CK8 / 18) נוגדנים נמצאו מכילים hepatocytes אדם תורם תאים שמקורם, ואילו כבדי עכברי שליטה המקורית היו שלילי עבור סמנים אלה (איור 4).
תחת = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> כדי להעריך את מידת התמיינות תאי in vivo, הביטוי של אלבומין אנושי (ALB) והאנושי cytokeratin 19 (CK19) הוערך immunohistochemically. HpSC נגזר אדם hepatocytes אדם הובדל היטב את כבדי העכבר הציג שהוגבר ביטוי ALB אדם. האדם ALB-חיובי CK19 שלילי hepatocytes דמה hepatocytes תפקודית, בעוד שתאי וששיתוף מוכתם חיובית עם ALB האדם CK19 הציג יכולת bipotential להבחנה לתוך hepatocytes ו cholangiocytes (איור 5). שיטת סריקה בקנה מידה גדולה להשתמש כדי לנתח את כל האונה של הכבד האנושית האדם HpSC הנגזרות חשפה את נוכחותם של סיבוב מספר ואשכולות דמוי מושבה שמסביב האונות בכבדות עם גרעיני אדם ברורים CK8 / 18 ביטוי (איור 6), מה שמדגים את colony- להרכיב יכולת של HpSCs האדם הכבד האנושי. הרמה והאכלוס הגיעה עד 90%כחודש לאחר ההשתלה (איור 7 א) והפרשת אלבומין אנושית זוהו כבד העכברים אוכלסו מחדש (איור 7), המציין כי HpSCs אדם יכול בהצלחה מחדש את כבד עכבר Alb-TRECK / SCID. תוצאות אלו מראות כי HpSCs אדם יש פוטנציאל גבוה בידול לתוך hepatocytes התפקודית in vivo בתגובת הצלת פונקציות כבד עכבר פגומות.
נזק כבד באיור 1. מתרחשת Alb-TRECK / SCID (רעלן קולטן בתיווך התא נוק) עכברים בעקבות רעלן דיפתריה (DT) הזרקה. היסטולוגיה (מכתים hematoxylin-eosin) של כבדי העכבר בלי ועם הממשל DT לאחר 48 שעות. DT מינון: 1.5 מיקרוגרם / ק"ג, AST בסרום פעילות התקינה של הכבד (פאנל משמאל): 30 IU / L; AST בסרום הפעילות של הכבד DT שטופלו (פאנל מימין): 15000IU / L. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
השתלת איור 2. של תאי גזע אנושי כבדיה לתוך Alb-TRECK / עכברי SCID עם תפקודי כבד כישלון. נוף מאקרוסקופיים (פנל משמאל) וניתוח היסטולוגית (מכתים hematoxylin-eosin, פנל מימין) של כבדים אנושיים עם HpSCs האדם ב -6 שבועות לפרסם השתלה . מ ', באזור כבד עכבר; h, תורם אנושי תא הנגזרות באזור אנושי. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
<br /> איור 3. ניתוח מקרוסקופית של מואנש כבד שמקורם בתאי גזע כבדית אדם שכותרתו עם חלבון פלואורסצנטי ירוק. תמונות גדלות גבוהה של המבנה הכבד 4 ימים (פנל משמאל) ו -45 ימים (פנל מימין) לאחר השתלה עם גזע כבד אנושי תאים (HpSCs). תאי גזע בכבד אדם (HpSCs) תויגו עם חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) באמצעות וקטור lentivirus. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
אפיון איור 4. האדם כבדית גזע hepatocytes האדם תאים שמקורם ב Alb-TRECK / עכברים SCID. ניתוח immunohistochemical הבחנה בין hepatocytes אדם מוכתם אנטיגן אנטי אנושי CK8 / 18 (ירוק) ואנטי-h אנטיגן הגרעיני באומן (אקווה כחול) כבדים אנושיים תאים שמקורם גזע אנושיים כבד לאחר 6 שבועות לפרסם השתלה. מ ', באזור כבד עכבר; h, תורם אנושי תא הנגזרות באזור כבד אנושי. לבן קו מקווקו: אזור כבד עכבר לעומת באזור כבד האנושי. גרעינים היו counterstained עם 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (כחול). ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
בידול איור 5. בתאי גזע אנושי כבדיה ב מואנש הכבד של Alb-TRECK / עכברי SCID. Immunohistochemical מנתח של אלבומין אנושי CK19 אדם כבד נגזרות HpSC ב -6 שבועות לפרסם השתלה. גרעינים היו counterstained עם 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (כחול). ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר.jove.com/files/ftp_upload/54167/54167fig5large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. אשכולות מרובים של כבדית אדם בתאי גזע תאים שמקורם נמצאים Alb-TRECK / SCID עכברים עם מואנש כבד. אשכולות גדולים מרובים שמקורם בתאי גזע כבד אנושיים זוהו באונות הכבדה לאחר 6 שבועות לפרסם השתלה ידי ניתוח immunohistochemical עבור CK8 / 18 (ירוק) אדם וגרעיני אדם (אקווה כחולים). ברי סולם = 1,000 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7. אנושידרג כבד Repopulation אנוש הפרשת אלבומין Alb-TRECK / עכברי SCID. (א) שיעור Chimeric ב Alb-TRECK / SCID חודש עכברי 1 בעקבות השתלת תאי גזע אנושית כבדה; הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM (n = 12). מאן-ויטני מבחן: P <0.0005 עבור Sham ו HpSCs אדם (B) איתור של אלבומין אנושי עכבר סר חודש לאחר השתלת תאי תורם.. = נתונים ממוצעים ± SEM (n = 5). מאן-ויטני מבחן: P = 0.0313 עבור Sham ו HpSCs האדם. ND: לגילוי; עכברים מושתלים עם PBS;: Sham HpSCTx:. עכברים מושתלים עם HpSCs האנושי אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי הכבד העכבר ניתן אוכלס מחדש עם hepatocytes אדם, כולל hepatocytes מבוגר בתאי גזע בכבד שגשוג 17. כבדי אוכלס מחדש אלה שימשו דגמים ניסיוניים פרה-קליניים עבור בדיקות סמים מטבוליזם גילוי ופיתוח תרופות 18; בנוסף, סיפקו להם בסביבה vivo עבור התבגרות התא והבחנה 19. המטרה הראשית של המחקר הנוכחי הייתה ליצור מודל עכבר מחלת כבד רומן שאפשר התפשטות hepatocyte בשלה אדם, התבגרות, והבחנה, לרכישת פעילות חילוף חומרי סמים.
הקורס של השתלת intrasplenic נחקר בהרחבה. התאים המושתלים לתוך הטחול של חולדות ועכברים לשרוד לאורך תוחלת החיים הממוצעת שלהם. פרוטוקול ההשתלה intrasplenic הוכיח להיות שימושי מאוד בחקירת שאלות מחקר ספציפיות;במעבדות רבות ברחבי העולם ניסו לנצל בפרוטוקול זה כמודל לשחזור ואמין מאוד עבור השתלת תאי כבד בגלל התחדשות הישרדות וכבד עכברים המשופרת. עם זאת, השתלת תאים לתוך עיסת הטחול מהווה סיכון, שכן רוב התאים המושתלים יהיה translocate אל הכבד שבו הם יכולים לחסום סניפים פורטל. למרות חסימה זו יכולה להיות זמנית ולא תמיד מצליחים להשפיע על הסביבה כבד בריא, במקרים של preexisting נזק לכבד, הליך זה יכול לצמצם עוד יותר את תפקוד הכבד ולהגדיל יתר לחץ דם שערי ועשוי גם להשפיע לרעה engraftment התא. אמנם יש לנו מיושם בהצלחה השתלת hepatocyte באמצעות השתלת intrasplenic, כמה בעיות להצדיק מחקר נוסף, במיוחד בנושא של מקורות תא פוטנציאליים חדשים. יתר על כן, בעת ביצוע השתלת hepatocyte intrasplenic, מגבלת טעינת התא חייב להיות מלווה בקפדנות כדי למנוע הפרעה פוטנציאלית על ידישריד מיקרו בכבד. קולטן DT זוהה כצורה מעוגנת בממברנה של גורם גדילת EGF הדמוי מחייב הפרין (מבשר HB-EGF) 20. בעוד מבשרי HB-EGF שמקורם בבעלי חיים רעלן רגיש, כגון בני אדם וקופים, לאגד DT ותפקוד כקולטנים רעלן, מבשרי HB-EGF מעכברים וחולדות לא להיקשר DT 21. מודל העכבר המהונדס Alb-TRECK / SCID מבטא קולטנים אדם HB-EGF הדמויים תחת השליטה של מקדם אלבומין בכבד תא ספציפי; בעקבות הממשל של DT, עכברים אלה לפתח אי ספיקה מוחלטת של תפקוד כבד בשל אבלציה המותנה של hepatocytes, מתן מקום תושבות ובחלוקה של תאים תורמים. Hepatocytes אדם, אפילו בשלב בוגר, ידועים בעלי יכולת שגשוג נרחב במבחנה, אם כי הם מאבדים פונקציות מטבוליזם התרופה שלהם, הגבלת 22 יישומים פרה-קליניים שלהם. ממצאים היסטולוגית ו immunohistochemical שהושגו בעקבות transplantation של HpSCs האדם לתוך Alb-TRECK / SCID עכברים עם כשל מוחלט של תפקודי כבד קטלני עולה כי HpSCs אדם יכול להרחיב ולגבש מחדש את המבנים בכבד עכבר פגום; השיעור והאכלוס בעכברים כמה היה קרוב ל -100%.
בניסויים שלנו, השתלת HpSC אדם מקדמת הישרדות עכבר הביאה הפרשה מוגברת של ALB אדם לעכבר סר 16. תאים אלה התבגרו גם בדיל in vivo והציגו פעילויות מטבוליזם תרופת אדם, המציין כי כבדי עכברים אנושיים HpSC נגזרת אדם דומים להתבגר "איברים אנושיים" פונקציונליים יש יישומים פוטנציאליים בפיתוח תרופות. תוצאות אלו להמשיך לאשר כי Alb-TRECK / SCID העכבר הוא מודל אידיאלי עבור הדור כבד אנושי. למרות הסיכויים ויתרונות של Alb-TRECK / עכברי SCID כמודל אידיאלי עבור דור כבד אנושי תאים שמקורם גזע אנושי כבד, יש להם חסרון אחד ייחודי; כאשר מודעת אדםult hepatocytes הושתל בשלושה Alb-TRECK / עכברי SCID שטופלו במינון יחיד של DT, לא כבדים אנושי נוצרו, ואולי בגלל hepatocytes אדם הבוגר חסר יכולת שגשוג. מינונים נוספים של DT לא יכול להינתן ההשתלה של hepatocyte אדם בוגר; מאז הקולטן DT (HB-EGF) ב hepatocytes עכברים Alb-TRECK / SCID הוא תחת שליטה של האמרגן אלבומין, טיפול DT נוסף יהרוס את hepatocytes אדם בוגר המושתלים בכבד העכבר.
למיטב ידיעתנו, זהו הדגם הראשון כדי ליצור כבד אנושי מתאי אדם לא בוגרים. Cell החלפת שיעור השתלות פוסט מושפעת הסביבה-מיקרו הנמען (למשל, נישה בכבד) ומאפיינים תא התורם, כגון בוגרת לעומת בשלה שגשוג ויכולת ההפרש. שילוב Alb-TRECK / SCID עם השתלת תאי גזע יספק תנאים אופטימיזציה ויתרונות עבור הדור של האדםכבדי ized. זה גם מהווה כלי רב עצמה עבור השתלה של תאים בכבד עובר ואפשרות וכן שב"ס או ES שמקורם בתאים כבדים מאז לפני טיפול DT, חי Alb-TRECK / SCID נשמרות במצב בריא, ניזק לכבד הוא מושרה בכל נקודת, והעכברים להתרבות בדרך כלל ללא נזק כלייתי. לעומת זאת, uPA / עכברי SCID להפגין תמותה בילוד גבוהה וקשים להתרבות. יתר על כן, ביטוי יתר של האוריקינאז בחיות יכול לגרום לדימום חמור ופגיעה כלייתית ולכן יש חלון הזדמנויות מוגבל להשתלה התא לפני הגמילה; Alb-TRECK / SCID יכול לשמש השתלה תאית בכל גיל.
הדור המוצלח של עכבר כבד אנושי דורש את השלבים הקריטיים הבאים: 1) פגיע בכבד צריך להיות מוגבל ברמות תת-קטלניות (בדרך כלל על ידי שימוש המנה הקטלנית, 50%); 2) התאים בכבד העובר האנושיים הראשוניים צריכים להישמר סטטוס תת ומחוברות לא יותר מ -90%;3) כתיבת הודעת Cell דליפת השתלת intrasplenic יש למנוע; ו -4) רמות אלבומין אנושי עכבר סרה צריך להיות פיקוח במרווחי זמן קבועים. הבנה מקיפה של הגורמים הקריטיים המעורבים בתהליך של דור כבד עכבר אנושי עשויה לתרום שינויים נוספים או פיתוחים חדשים ניצול חולדות או בעלי חיים אחרים. עיבודים אפשריים כוללים: האינדוקציה של פגיעת כלייתית לבחינת פיתוח ותיקון עם nephrons אדם, האבות שלהם, ואת איסוף תאי צינור ואת ההרכבה העצמית של nephrons אדם לשלושה מבנים מימדי בגוף העכבר; לומד את התיקון מעווה איון בלבלב באמצעות תאי גזע / ובתאי לבלב נגזרו לתכנות מחדש באופן ישיר, שב"ס, או בתאי גזע עובריים. דוגמאות של שינויים בתהליך כוללות: שליטת רקמות או פציעת איבר עם רעלים או חומרים כימיים כגון retrorsine, streptozotocin, או ציספלטין כדי להקל על התחרות של תאי תורם עם תאים פרטיים; הימנעותהפרש או התפשטות יורדת כדי לשפר את יכולת השגשוג של התאים התורמים, ובכך לקדם את החלפת תאי נמען, כגון ES או iPS- תאים שמקורם; בחירת אתרי השתלה מתאימה ושליטת עירוי תא על מנת להבטיח השתלה יעילה, למשל, באמצעות וריד השער או זנב להשתלת entopic ואת לפדר ואת הקפסולה כליות להשתלה אקטופי; ניטור החלפת מעמד דרך הביטוי של רקמות או נציג חלבונים המופרשים איברים של גזע / ובתאים או התחקות תאים להשתלה וסרטן תא בוגר, כגון חלבון עוברי או transferrin.
לסיכום, Alb-TRECK / עכברי SCID מהווים מודל מתאים השתלת תאי גזע אנושית כבדה, כפי שהם מספקים סביבה מועילה המאפשרת בידול לתוך hepatocytes הבוגרת. יש מודל הרומן הזה פוטנציאל יישומים עצום, לא רק להרחבת vivo לשעבר של ב hepatocytes אדםut גם עבור מסכי סמים ומועמד בדיקת תרופות טיפוליות לרעילויות כבדות וחילוף חומרים. בנוסף, תוצאות אלה תסייענה בקידום מחקרים העתידיים בחינת היישום הקליני של טכניקה זו על השתלת תאי כבד אנושית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human albumin | Sigma | A6684 | Mouse |
| Human CK19 | Dako | M088801 | Mouse |
| Human nuclei | Millipore | MAB1281 | Mouse |
| Human CK8/18 | Progen | GP11 | Guinea pig |
| CDCP1 | Biolegend | 324006 | Mouse |
| CD90 | BD | 559869 | Mouse |
| CD66 | BD | 551479 | Mouse |
| GOT/AST-PIII | Fujifilm | 14A2X10004000009 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320-033 | |
| FBS | Biowest | S1520 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Diphtheria Toxin | Sigma | D0564-1MG | |
| Human Albumin ELISA Kit | Bethyl Laboratories | E88-129 | |
| Syringe (1 ml) | Terumo | SS-01T | |
| 32G 1/2" needle | TSK | PRE-32013 | |
| O.C.T.Compound(118 ml) | Sakura Finetek Japan | 4583 | |
| MoFlo high-speed cell sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| DRI-CHEM 7000 | Fujifilm | 14B2X10002000046 |
References
- Muruganandan, S., Sinal, C. Mice as clinically relevant models for the study of cytochrome P450-dependent metabolism. Clin. Pharmacol. Ther. 83, 818-828 (2008).
- Nishimura, T., et al. Using chimeric mice with humanized livers to predict human drug metabolism and a drug-drug interaction. J. Pharmacol. Exp. Ther. 344, 388-396 (2013).
- Suemizu, H., et al. Establishment of a humanized model of liver using NOD/Shi-scid IL2Rgnull mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377, 248-252 (2008).
- Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am. J. Pathol. 165, 901-912 (2004).
- Hasegawa, M., et al. The reconstituted 'humanized liver'in TK-NOG mice is mature and functional. Biochem. Biophys. Res. Commun. 405, 405-410 (2011).
- Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah−/−/Rag2−/−/Il2rg−/− mice. Nat. Biotechnol. 25, 903-910 (2007).
- Rhim, J. A., Sandgren, E. P., Degen, J. L., Palmiter, R. D., Brinster, R. L. Replacement of diseased mouse liver by hepatic cell transplantation. Science. 263, 1149-1152 (1994).
- Haridass, D., et al. Repopulation efficiencies of adult hepatocytes, fetal liver progenitor cells, and embryonic stem cell-derived hepatic cells in albumin-promoter-enhancer urokinase-type plasminogen activator mice. Am. J. Pathol. 175, 1483-1492 (2009).
- Sharma, A. D., et al. Murine embryonic stem cell-derived hepatic progenitor cells engraft in recipient livers with limited capacity of liver tissue formation. Cell. Transplant. 17, 313-323 (2008).
- Peltz, G. Can 'humanized' mice improve drug development in the 21st century. Trends Pharmacol. Sci. 34, 255-260 (2013).
- Zhu, S., et al. Mouse liver repopulation with hepatocytes generated from human fibroblasts. Nature. 508, 93-97 (2014).
- Saito, M., et al. Diphtheria toxin receptor-mediated conditional and targeted cell ablation in transgenic mice. Nat. Biotechnol. 19, 746-750 (2001).
- Ishii, T., et al. Transplantation of embryonic stem cell-derived endodermal cells into mice with induced lethal liver damage. Stem Cells. 25, 3252-3260 (2007).
- Machimoto, T., et al. Improvement of the survival rate by fetal liver cell transplantation in a mice lethal liver failure model. Transplantation. 84, 1233-1239 (2007).
- Taniguchi, H., Zheng, Y. -W. Human hepatic stem cell, method for preparation of the same, method for induction of differentiation of the same, and method for utilization of the same. Japan Patent. , 5822287 (2015).
- Zhang, R. -R., et al. Human hepatic stem cells transplanted into a fulminant hepatic failure Alb-TRECK/SCID mouse model exhibit liver reconstitution and drug metabolism capabilities. Stem Cell Res. Ther. 6, 1-12 (2015).
- Strom, S. C., Davila, J., Grompe, M. Chimeric Mice with Humanized Liver: Tools for the Study of Drug Metabolism, Excretion, and Toxicity. Hepatocytes. , Methods in Molecular Biology; 640. Springer. 491-509 (2010).
- Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharm. Sin. B. 2, 549-561 (2012).
- Nowak, G., et al. Identification of expandable human hepatic progenitors which differentiate into mature hepatic cells in vivo. Gut. 54, 972-979 (2005).
- Naglich, J. G., Metherall, J. E., Russell, D. W., Eidels, L. Expression cloning of a diphtheria toxin receptor: identity with a heparin-binding EGF-like growth factor precursor. Cell. 69, 1051-1061 (1992).
- Mitamura, T., Higashiyama, S., Taniguchi, N., Klagsbrun, M., Mekada, E. Diphtheria toxin binds to the epidermal growth factor (EGF)-like domain of human heparin-binding EGF-like growth factor/diphtheria toxin receptor and inhibits specifically its mitogenic activity. J. Biol. Chem. 270, 1015-1019 (1995).
- Liu, Y., Yang, R., He, Z., Gao, W. -Q. Generation of functional organs from stem cells. Cell Regener. 2, 1 (2013).
