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Medicine

एक humanized माउस जिगर की पीढ़ी मानव यकृत स्टेम कोशिकाओं का उपयोग

Published: August 29, 2016 doi: 10.3791/54167
Automatic Translation
*1, *1,2,3, 1
1Department of Regenerative Medicine, Graduate School of Medicine, Yokohama City University, 2Department of Advanced Gastroenterological Surgical Science and Technology, Faculty of Medicine, University of Tsukuba, 3Regenerative Medicine Research Center, Jiangsu University Hospital
* These authors contributed equally

Protocol

सभी पशु प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं योकोहामा सिटी विश्वविद्यालय के पशु संरक्षण के दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया।

1. तीव्र जिगर चोट माउस मॉडल की पीढ़ी

  1. एक 1 मिलीग्राम / एमएल डीटी शेयर समाधान बनाने के लिए 1 मिलीग्राम डिप्थीरिया विष (डीटी) से (0.85% NaCl समाधान की 100 मिलीलीटर में 0.6 ग्राम फिनोल) phenolized 0.85% सोडियम क्लोराइड समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें। नोट: 1 मिलीग्राम की एकाग्रता में डीटी / एमएल 3 डिग्री सेल्सियस से 8 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 2 साल के लिए भंडारित किया जा सकता है।
  2. क्रमानुसार phenolized 0.85% NaCl समाधान में 0.3 माइक्रोग्राम / एमएल डीटी के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल डीटी शेयर समाधान पतला और काम कर रहे एक समाधान के रूप में 0.3 माइक्रोग्राम / एमएल डीटी समाधान के एक विभाज्य तैयार करते हैं। नोट: यह काम समाधान हौसले से तैयार किया जाना चाहिए।
  3. एक sublethal खुराक (~ 50% मारक) का उपयोग कर प्रयोगों का संचालन करने के लिए, 8 सप्ताह पुराने चूहों डीटी के एक 1.5 माइक्रोग्राम / किग्रा खुराक प्रशासन।
    1. पृष्ठीय लेटना में माउस धारण करके डीटी की intraperitoneal इंजेक्शन प्रदर्शन और needl डालनेघुटनों के मोड़ नीचे ई, छोड़ दिया है या midline के अधिकार। मूत्राशय के प्रवेश को रोकने के लिए midline से बचें। कोण सुई से शरीर के लिए लगभग 45 डिग्री।
    2. एक इंसुलिन सिरिंज का प्रयोग, माउस वजन के 20 ग्राम प्रति हौसले से तैयार 0.3 माइक्रोग्राम / एमएल डीटी के 100 μl के साथ चूहों इंजेक्षन। उदाहरण के लिए, एक 18 ग्राम माउस 0.3 माइक्रोग्राम / एमएल डीटी समाधान के 90 μl प्राप्त करना चाहिए।
  4. 48 घंटा के बाद डीटी इंजेक्शन में, माउस रक्त वाहिकाओं को चौड़ा करने के लिए लगभग 10 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एक restrainer में रखने और माउस पूंछ वार्मिंग से पूंछ नस से खून इकट्ठा। फिर, एक तेज छुरी ब्लेड के साथ नोक से पूंछ 2 सेमी में 1 एमएम निक बनाने के लिए और एक microcapillary ट्यूब के साथ रक्त इकट्ठा।
    1. 5 मिनट के लिए 1,500 XG पर रक्त युक्त microcapillary ट्यूब अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला और सेल गोली को अलग करके सीरम इकट्ठा।
  5. गया / AST- पर पतला 1:20 माउस सीरम के पिपेट 50 μlPIII स्लाइड। 650 एनएम पर प्रतिक्रिया उत्पाद (नीले रंग की डाई) के absorbance के उपाय एक बहु प्रयोजन स्वचालित सूखी रसायन विज्ञान निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार विश्लेषक का उपयोग।
    नोट: aspartate aminotransferase (एएसटी) के पढ़ने के लिए बाहर / glutamic ओक्सैलोएसिटिक transaminase (गया) गतिविधि स्वचालित रूप से प्रदर्शित किया जाता है। 2 दिनों के बाद डीटी इंजेक्शन, चूहों का लगभग 60% के बीच 12,000 एएसटी मूल्यों का प्रदर्शन किया - 16,000 आइयू / एल और तीव्र जिगर की क्षति से पीड़ित हो जाता था। इन चूहों को एक नया पिंजरे को हस्तांतरित और सेल प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं के रूप में इस्तेमाल किया गया।

2. मानव यकृत स्टेम सेल की तैयारी

  1. एक CDCP1 + CD90 + CD66- उप-जनसंख्या प्राप्त करने के लिए CDCP1, CD90, और CD66 सेल एंटीजन का उपयोग कर एक सेल सॉर्टर के साथ मानव प्राथमिक भ्रूण जिगर की कोशिकाओं से मानव यकृत स्टेम कोशिकाओं को अलग, तो कोलेजन चतुर्थ लेपित संस्कृति व्यंजन पर पृथक सेल की आबादी के बीज, के रूप में पहले 15 की सूचना दी। एक भ्रूण के मानव प्राथमिक भ्रूण जिगर की कोशिकाओं का प्रयोग करेंसप्ताह 14 और 18 के बीच की उम्र।
  2. मानव यकृत स्टेम कोशिकाओं को 80% से सुसंस्कृत लीजिए - 100 मिमी संस्कृति बर्तन पर 90% संगम, संस्कृति के माध्यम aspirate, 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें, और फिर पीबीएस को हटा दें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2 मिलीलीटर 0.05% trypsin / EDTA समाधान के साथ कोशिकाओं Trypsinize। नोट: के बाद से सेल भेदभाव चूहों में उनकी proliferative क्षमता को प्रभावित कर सकते 90% से अधिक संगम पर कोशिकाओं सेल प्रत्यारोपण के लिए उपयुक्त नहीं हैं।
  3. एक खुर्दबीन के नीचे सेल फैलाव की स्थिति की निगरानी। कोशिकाओं अस्थायी या स्वतंत्र रूप से बहने जा करने के लिए दिखाई देते हैं, DMEM / F12 10% FBS युक्त के 8 मिलीलीटर जोड़कर enzymatic पाचन बंद करो।
  4. धीरे-धीरे एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कोशिकाओं को निलंबित और एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं को हस्तांतरण। 100 XG पर 5 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र।
  5. ध्यान से 10 मिलीलीटर DMEM / F12 10% FBS युक्त में सेल गोली resuspend और एक माइक्रोस्कोप की गिनती कक्ष का उपयोग सेल नंबर का निर्धारण।
  6. 1.0 x 10 6 प्रत्येक व्यक्ति के माउस के लिए पीबीएस aliquots के 50 μl प्रति कोशिकाओं में कोशिकाओं के विभाजन और प्रत्यारोपण जब तक बर्फ पर दुकान।

3. मानव यकृत स्टेम कोशिकाओं का प्रत्यारोपण Intrasplenic

  1. एक 37 डिग्री सेल्सियस ताप विद्युत पैड पर एक साफ पिंजरे रखें।
  2. यह नोक के नीचे रखकर - (1.5% (/ खंड खंड) प्रति मिनट ऑक्सीजन के 2 एल में 1) माउस का उपयोग isoflurane साँस लेना anesthetize। वैकल्पिक रूप से, isoflurane से लथपथ धुंध युक्त ट्यूबों का उपयोग करें।
    1. सुनिश्चित करें कि माउस हल्के से पीछे लुटेरा pinching द्वारा anesthetized है। एक घुटने झटका हासिल है, तो माउस कक्ष में वापस जगह है। जबकि संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम का प्रयोग करें।
  3. बिजली क़ैंची का उपयोग शल्य साइट दाढ़ी और 70% लागू (/ खंड खंड) इथेनॉल और povidone आयोडीन बाँझ। तो बस पसलियों के तटीय सीमा से नीचे बायीं ओर में एक 1 सेमी त्वचा चीरा, पर एक चीरा द्वारा पीछा करनापेट की दीवार, साथ ही पेरिटोनियम।
  4. ध्यान से तिल्ली का पर्दाफाश। एक 32-जी 1/2 इंच सुई के साथ एक 100 μl microinjection सिरिंज का उपयोग सीधे एक माउस की तिल्ली में 50 μl पीबीएस में 1.0 x 10 6 मानव यकृत स्टेम कोशिकाओं इंजेक्षन करने के लिए। इंजेक्शन के लिए एक 5 डिग्री कोण पर सुई झुकाएँ।
    1. सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन की गहराई कम से कम आधा तिल्ली की मोटाई है। सुई एक छोर (सिर) पर तिल्ली दर्ज करें और दूसरे छोर (पूंछ) में कोशिकाओं को जमा करना चाहिए।
  5. निम्नलिखित इंजेक्शन कोशिकाओं के रिसाव को रोकने के लिए, धीरे 2 मिनट के लिए एक उंगली का उपयोग दबाव लागू करते हैं और उसके बाद सुई को हटा दें।
  6. तिल्ली माउस शरीर में वापस प्लेस और मांसलता और त्वचा के लिए एक सामान्य चल रहा है सीवन के साथ गुहा को बंद करें।
  7. एक 37 डिग्री सेल्सियस पूर्व गर्म पिंजरे में चूहों हस्तांतरण तुरंत प्रत्यारोपण के बाद। माउस यह सुनिश्चित करने के लिए, आराम से सांस ले पिंजरे में अपने पक्ष पर माउस जगह करने में सक्षम है एकपिंजरे बिस्तर और सर्जरी की साइट के बीच संपर्क voiding।
  8. चूहों पर नजर रखने के लिए जब तक संज्ञाहरण बंद पहनता है सुनिश्चित करने के लिए बंद कर दिया टांके बने हुए हैं और चूहों पूर्व सर्जरी की स्थिति में लौटने।
  9. चूहों सुनिश्चित सामान्य पीने के पानी और भोजन के साथ प्रदान की जाती हैं। 1 घंटे के बाद, पशु केंद्र के माउस के कमरे में पिंजरे लौटने और दैनिक चूहों की निगरानी।

4. प्रत्यारोपित की जांच मानव यकृत स्टेम माउस जिगर में सेल व्युत्पन्न Hepatocytes

नोट: निम्न कार्यविधियों के लिए, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद ketamine और xylazine की अधिक मात्रा का उपयोग करते हुए सभी जानवरों euthanize।

  1. 4 - 6 सप्ताह के प्रत्यारोपण के बाद, चूहों euthanize और इसके साथ ही चर्म काटने और प्रावरणी शल्य कैंची का उपयोग करके उदर गुहा खुला।
  2. पेरिटोनियम ऊपर संयोजी ऊतक काटना, एक स्प्रेडर के रूप में कैंची का उपयोग, और पेरिटोनियल खोलने के लिए LINEA अल्बा के साथ पेरिटोनियम कटौतीगुहा।
  3. संदंश के साथ उरोस्थि लिफ्ट, डायाफ्राम पंचर, और उरोस्थि के प्रत्येक पक्ष के माध्यम से ग्रीवा करधनी के माध्यम से काट दिया।
  4. जिगर के वक्ष तरफ रग कावा तोड़ और पूर्वकाल दिशा में जिगर के माध्यम से घेघा खींच। जिगर को दूर करने के क्रम में डायाफ्राम निकालें।
    नोट: कैंची के सुझावों के क्रम में वक्ष अंगों के नीचे करने के लिए किसी भी क्षति को रोकने के लिए ऊपर की ओर इशारा रखने के लिए सावधान रहें। थाइमस एक प्रवृत्ति कभी कभी उरोस्थि के पृष्ठीय पक्ष से जुड़े हुए है और इस ध्यान से परहेज किया जाना चाहिए।
  5. एक संभाल के रूप में डायाफ्राम का उपयोग करना, उदर गुहा के बाहर जिगर खींच शुरू करते हैं। आंतरिक रग कावा जगह में जिगर धारण किया जाएगा। आंतरिक रग कावा कट; सावधान समय से पहले ही सही अधिवृक्क आजाद कराने के लिए नहीं हो।
    नोट: चूहे एक चार lobed एक मंझला पालि से मिलकर जिगर, छोड़ दिया पालि, सही पालि, और पूंछवाला लोब है। पित्ताशय की छोटी बंटवारे में निलंबित कर दिया गया हैमंझला पालि।
  6. जंक्शनों पर एक दूसरे से अलग पालियों और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार इष्टतम काटने तापमान (अक्टूबर) परिसर में उन्हें एम्बेड। अक्टूबर cryostat पर धातु ग्रिड में जिगर ऊतक युक्त रुक।
  7. -18 डिग्री सेल्सियस पर 5 माइक्रोन मोटी नमूना एक cryostat का उपयोग कर वर्गों में कटौती और आरटी खुर्दबीन स्लाइड पर उन्हें माउंट। -80 डिग्री सेल्सियस पर शेयर की दुकान। Hematoxylin और eosin (एच एंड ई) और पहले से सूचना दी प्रक्रियाओं 16 के अनुसार immunofluorescence धुंधला के लिए स्लाइड तैयार करें।

5. मानव Albumin स्राव की जांच और chimeric दर की गणना

  1. मानव यकृत पुनर्गठन मापने के लिए, सीरम और निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक मानव एल्बुमिन एलिसा किट का उपयोग मानव एल्बुमिन एलिसा प्रदर्शन करते हैं।
  2. पूरे humanized जिगर में अभिव्यक्ति के स्तर की पीसीआर विश्लेषण वास्तविक समय से humanized जिगर कैमेरिक दर की गणना। रिश्तेदार पूर्व निर्धारित बनाने के लिएमानव-माउस पार actin के लिए मानव विशिष्ट actin की अभिव्यक्ति के स्तर का अनुपात (अनुपात 1) और मानव-माउस पार actin करने के लिए माउस-विशिष्ट actin के अनुपात (अनुपात 2)। कैमेरिक दर अनुपात 1 / के रूप में (अनुपात 1 + 2 के अनुपात) गणना की जाती है।

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Representative Results

ALB-treck / SCID चूहों hepatocytes एक एल्बुमिन प्रमोटर के नियंत्रण के तहत मानव डीटी रिसेप्टर एचबी EGF जीन व्यक्त करने और डीटी प्रशासन 12 निम्नलिखित साइटोटोक्सिक प्रभाव दिखा रहे हैं। जिगर की चोट पर डीटी उपचार के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, 1.5 माइक्रोग्राम / किलो के डीटी खुराक 8 सप्ताह पुराने ALB-treck / SCID चूहों में इंजेक्शन थे और जिगर 48 घंटा के बाद डीटी प्रशासन में रोग परिवर्तन histologically का मूल्यांकन किया गया। चूहों पर नियंत्रण (डीटी साथ नहीं इलाज) के साथ तुलना में, डीटी इलाज चूहों में वृद्धि हुई सीरम एएसटी गतिविधि के साथ भीड़ के लिए एक सुधार दिखा एक बेतरतीब यकृत वास्तुकला का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, डीटी इलाज चूहों की hepatocytes एक साथ अंधेरा नाभिक (सबसे शायद apoptotic hepatocytes) के साथ एकाधिक, गहरा दाग acidophilic cytoplasmic समावेशन था; कुछ अन्य hepatocytes संरक्षित दिखाई दिया या बहुत कम या कोई पोर्टल शिरा सूजन के साथ अंधेरे नाभिक के साथ एक vacuolated कोशिका द्रव्य का प्रदर्शन (चित्रा 1 12 का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है सहमत हैं।

मानव hPSCs विट्रो संवर्धन में लंबी अवधि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और कुछ ALB और कम CK19 पॉजिटिव कोशिकाओं के साथ वर्दी सेल आकृति विज्ञान दिखा रहे हैं। 6 सप्ताह माउस यकृत प्रत्यारोपण में पोस्ट पर, मानव hPSCs एक खुर्दबीन के नीचे बुनियादी परीक्षा के अधीन है और मूल्यांकन histologically रहे थे; मानव hPSCs मूल माउस hepatocytes (चित्रा 2) की जगह से जिगर संरचना का पुनर्गठन किया है मनाया गया। Macroscopically, 4 दिन में मानव hPSC प्रत्यारोपण, छोटे मानव यकृत समूहों कि समान रूप से जिगर के आसपास वितरित किए गए पाया गया पोस्ट; 45 दिनों के बाद प्रत्यारोपण पर, इन बड़े समूहों (चित्रा 3) में प्रचूर मात्रा में था। कौनLe माउस मानव hepatocytes साथ पुनर्गठन यकृत में नामित किया गया "humanized यकृत।" इन परिणामों से संकेत मिलता है कि कि मानव hPSC प्रत्यारोपण से गुजरना घातक एकाएक बढ़ानेवाला जिगर की विफलता के साथ चूहों सामान्य माउस यकृत में मनाया उन लोगों के लिए इसी तरह जिगर संरचनाओं प्रदर्शन कर सकते हैं।

परीक्षण अपरिपक्व मानव चूहों में प्रत्यारोपित hepatocytes भेदभाव के लिए संभावित था और इन विवो में कार्य कर सकता है कि क्या करने से पहले, माउस यकृत में मानव hepatocytes की उपस्थिति पहले प्रतिरक्षाऊतकरसायन विश्लेषण पर लगभग 6 सप्ताह के बाद मानव hPSC प्रत्यारोपण द्वारा पुष्टि की गई। 60% मानव कोशिका repopulation के साथ चूहों से जिगर वर्गों है कि विशेष रूप से और सकारात्मक सह दाग मानव नाभिक और मानव cytokeratin 8/18 के साथ (CK8 / 18) एंटीबॉडी दाता सेल व्युत्पन्न मानव hepatocytes को रोकने के लिए है, जबकि मूल नियंत्रण चूहों यकृत थे पाए गए इन मार्करों के लिए नकारात्मक (चित्रा 4)।

विवो में सेल भेदभाव की डिग्री का आकलन करने के लिए, मानव एल्बुमिन (ALB) और मानव cytokeratin 19 (CK19) की अभिव्यक्ति immunohistochemically मूल्यांकन किया गया था। मानव hPSC व्युत्पन्न मानव hepatocytes अच्छी तरह से माउस यकृत में भेदभाव कर रहे थे और मानव ALB अभिव्यक्ति upregulated प्रदर्शन किया। मानव ALB-सकारात्मक और नकारात्मक CK19-hepatocytes कार्यात्मक hepatocytes मची, कोशिकाओं है कि सकारात्मक मानव ALB साथ सह दाग और CK19 hepatocytes और cholangiocytes (चित्रा 5) में फर्क के लिए bipotential क्षमता का प्रदर्शन किया है, जबकि। एक बड़े पैमाने पर स्कैनिंग सभी मानव hPSC व्युत्पन्न humanized जिगर पालियों विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया विधि, कई दौर और कॉलोनी की तरह स्पष्ट मानव नाभिक और CK8 / 18 अभिव्यक्ति (चित्रा 6) के साथ जिगर पालियों आसपास के समूहों की उपस्थिति का पता चला colony- का प्रदर्शन humanized यकृत में मानव hPSCs की क्षमता के गठन। repopulation स्तर 90% तक पहुँचएक महीने के बाद प्रत्यारोपण (चित्रा 7A) और मानव एल्बुमिन स्राव repopulated चूहों यकृत (चित्रा 7B) में पाया गया था, यह दर्शाता है कि मानव hPSCs सफलतापूर्वक ALB-treck / एस.सी.आई.डी माउस जिगर पुनर्गठित कर सकता है। ये परिणाम दिखाना है कि मानव hPSCs दोषपूर्ण माउस जिगर कार्यों के बचाव के जवाब में vivo में कार्यात्मक hepatocytes में भेदभाव के लिए उच्च क्षमता है।

आकृति 1
चित्रा 1. जिगर की क्षति ALB-treck / एस.सी.आई.डी (विष रिसेप्टर मध्यस्थता सेल नॉकआउट) चूहे के बाद डिप्थीरिया विष (डीटी) इंजेक्शन में होता है। बिना और 48 घंटे के बाद डीटी प्रशासन के साथ माउस यकृत के ऊतक विज्ञान (hematoxylin-eosin धुंधला)। डीटी खुराक: 1.5 माइक्रोग्राम / किलो, सामान्य जिगर (बाएं पैनल) के सीरम एएसटी गतिविधि: 30 आइयू / एल; डीटी इलाज जिगर के सीरम एएसटी गतिविधि (सही पैनल): 15000आइयू / एल। स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
एकाएक बढ़ानेवाला जिगर की विफलता के साथ ALB-treck / SCID चूहों में मानव यकृत स्टेम सेल की चित्रा 2. ट्रांसप्लांटेशन। (बाएं पैनल) मानव hPSCs साथ humanized यकृत के 6 सप्ताह में Macroscopic देखें और ऊतकीय विश्लेषण (hematoxylin-eosin धुंधला हो जाना, सही पैनल) पोस्ट प्रत्यारोपण । मी, माउस जिगर क्षेत्र; ज, मानव दाता मानव क्षेत्र सेल व्युत्पन्न। स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन <br /> चित्रा 3. Humanized यकृत मानव यकृत स्टेम हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल कोशिकाओं से व्युत्पन्न के macroscopic विश्लेषण। जिगर संरचना 4 दिन (बाएं पैनल) और 45 दिनों के उच्च बढ़ाई छवियों (सही पैनल) मानव यकृत स्टेम के साथ निम्न प्रत्यारोपण कोशिकाओं (hPSCs)। मानव यकृत स्टेम सेल (hPSCs) बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) एक lentivirus सदिश का उपयोग के साथ लेबल रहे थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4 की विशेषता मानव यकृत स्टेम सेल व्युत्पन्न ALB-treck में मानव Hepatocytes / SCID चूहों। Immunohistochemical विश्लेषण विरोधी मानव CK8 / 18 (हरा) प्रतिजन और विरोधी ज के साथ दाग मानव hepatocytes के बीच भेद उमान परमाणु प्रतिजन (एक्वा ब्लू) 6 सप्ताह में मानव यकृत स्टेम सेल व्युत्पन्न humanized यकृत प्रत्यारोपण में पोस्ट। मी, माउस जिगर क्षेत्र; ज, मानव दाता सेल व्युत्पन्न मानव यकृत क्षेत्र। बनाम मानव यकृत क्षेत्र माउस जिगर क्षेत्र: व्हाइट लाइन धराशायी। नाभिक 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (नीला) के साथ counterstained थे। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
6 सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण पर चित्रा 5. मानव यकृत स्टेम सेल ALB-treck / SCID चूहों। Immunohistochemical के humanized यकृत में भेदभाव मानव एल्बुमिन और hPSC व्युत्पन्न यकृत में मानव CK19 का विश्लेषण करती है। नाभिक 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (नीला) के साथ counterstained थे। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन।jove.com/files/ftp_upload/54167/54167fig5large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 मानव यकृत के एकाधिक क्लस्टर स्टेम सेल व्युत्पन्न कोशिकाओं ALB-treck में मौजूद हैं Humanized यकृत के साथ / SCID चूहों। कई बड़े मानव यकृत स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न समूहों 6 सप्ताह में जिगर पालियों में पहचान की गई लिए प्रतिरक्षाऊतकरसायन विश्लेषण द्वारा प्रत्यारोपण के पोस्ट मानव CK8 / 18 (हरा) और मानव नाभिक (एक्वा ब्लू)। स्केल सलाखों = 1,000 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7. Humanizedलिवर Repopulation दर और ALB-treck / SCID चूहों में मानव Albumin स्राव। (ए) ALB-treck / SCID चूहों 1 महीने मानव यकृत स्टेम सेल प्रत्यारोपण के बाद में chimeric दर; डेटा (एन = 12) ± SEM के मतलब के रूप में प्रस्तुत किया है। मान व्हिटनी परीक्षण: पी <शाम और मानव hPSCs के लिए 0.0005 (बी) मानव एल्बुमिन की जांच माउस सीरा में दाता कोशिका प्रत्यारोपण के बाद एक महीने के।। Data = मतलब ± SEM (एन = 5)। मान व्हिटनी परीक्षण: पी = शाम और मानव hPSCs के लिए .0313। एन डी: undetectable; शाम: चूहों पीबीएस के साथ प्रत्यारोपित; HpSCTx:। मानव hPSCs के साथ प्रतिरोपित चूहों यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हाल के अध्ययनों से पता चला है कि माउस जिगर वयस्क hepatocytes और proliferative यकृत स्टेम कोशिकाओं को 17 सहित मानव hepatocytes, साथ repopulated जा सकता है। ये repopulated यकृत दवा चयापचय परीक्षण और दवाओं की खोज और विकास के लिए 18 preclinical प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है; इसके अलावा, वे सेल परिपक्वता और भेदभाव 19 के लिए एक vivo वातावरण प्रदान की है। वर्तमान अध्ययन के प्रमुख उद्देश्य के लिए एक उपन्यास जिगर की बीमारी के माउस मॉडल है कि मानव अपरिपक्व hepatocyte प्रसार, परिपक्वता, और भेदभाव की अनुमति दी, दवा चयापचय गतिविधियों के अधिग्रहण के लिए उत्पन्न करने के लिए किया गया था।

intrasplenic प्रत्यारोपण के पाठ्यक्रम में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। चूहों और चूहों की तिल्ली में प्रत्यारोपित कोशिकाओं को अपनी औसत जीवन काल के दौरान जीवित रहते हैं। intrasplenic प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल विशिष्ट अनुसंधान सवालों की जांच में बहुत उपयोगी साबित हो गया है;कई प्रयोगशालाओं दुनिया भर में सुधार चूहों अस्तित्व और जिगर उत्थान की वजह से यकृत सेल प्रत्यारोपण के लिए एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय मॉडल के रूप में इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने का प्रयास किया है। हालांकि, प्लीहा लुगदी में कोशिकाओं दाखिल एक खतरा बना हुआ है, के बाद से प्रत्यारोपित कोशिकाओं के बहुमत जिगर जहां वे पोर्टल शाखाओं रोक देना कर सकते हैं सरकाना होगा। हालांकि इस रोड़ा अस्थायी हो सकता है और जिगर की क्षति preexisting के मामलों में एक स्वस्थ जिगर के वातावरण को प्रभावित नहीं हो सकता है, इस प्रक्रिया को आगे जिगर समारोह को कम करने और पोर्टल उच्च रक्तचाप बढ़ाने के लिए और भी नकारात्मक सेल engraftment प्रभावित हो सकता है हो सकता है। हालांकि हम सफलतापूर्वक intrasplenic प्रत्यारोपण का उपयोग कर hepatocyte प्रत्यारोपण के लिए आवेदन किया है, कई मुद्दों पर आगे के अध्ययन, विशेष रूप से संभावित नए सेल के सूत्रों के विषय वारंट। इसके अलावा, जब intrasplenic hepatocyte प्रत्यारोपण प्रदर्शन, सेल लोडिंग सीमा का सख्ती से आदेश द्वारा संभावित गड़बड़ी को रोकने के लिए पीछा किया जाना चाहिएबचे हुए यकृत microcirculation। डीटी रिसेप्टर हेपरिन बाध्यकारी EGF की तरह वृद्धि कारक (एचबी EGF अग्रदूत) 20 की एक झिल्ली लंगर फार्म के रूप में पहचान की गई है। एचबी-EGF इस तरह के मानव और बंदरों, बाँध डीटी और समारोह विष रिसेप्टर्स, चूहों और चूहों से एचबी EGF व्यापारियों डीटी 21 बाध्य नहीं कर के रूप में के रूप में विष के प्रति संवेदनशील पशुओं से प्राप्त व्यापारियों, जबकि। ट्रांसजेनिक ALB-treck / एस.सी.आई.डी माउस मॉडल एक जिगर सेल विशिष्ट एल्बुमिन प्रमोटर के नियंत्रण के तहत मानव एचबी EGF की तरह रिसेप्टर्स को व्यक्त करता है; डीटी के प्रशासन के बाद, इन चूहों hepatocytes की सशर्त पृथक के कारण एकाएक बढ़ानेवाला यकृत विफलता का विकास, दाता सेल निवास और प्रसार के लिए स्थान उपलब्ध कराने। मानव hepatocytes, यहां तक कि एक अपरिपक्व चरण में, उनके preclinical आवेदन पत्र 22 सीमित हालांकि वे उनकी दवा चयापचय कार्यों खो देते हैं, इन विट्रो में व्यापक proliferative क्षमता के अधिकारी करने के लिए जाना जाता है। प्राप्त histological और immunohistochemical निष्कर्षों टीआरए निम्नलिखितघातक एकाएक बढ़ानेवाला यकृत विफलता के साथ ALB-treck / SCID चूहों में मानव hPSCs की nsplantation संकेत दिया है कि मानव hPSCs का विस्तार करने और क्षतिग्रस्त माउस जिगर संरचनाओं को पुनर्गठित कर सकता है; कुछ चूहों में repopulation दर लगभग 100% थी।

हमारे प्रयोगों में, मानव hPSC प्रत्यारोपण माउस अस्तित्व को बढ़ावा दिया और माउस सीरा 16 में मानव ALB की वृद्धि स्राव में हुई। इन कोशिकाओं को भी परिपक्व और vivo में भेदभाव और मानव दवा चयापचय गतिविधियों का प्रदर्शन किया, यह दर्शाता है कि मानव hPSC व्युत्पन्न humanized चूहों यकृत परिपक्व और कार्यात्मक "मानव अंगों" के समान हैं और नशीली दवाओं के विकास में संभावित आवेदन किया है। इन परिणामों के आगे पुष्टि करते हैं कि ALB-treck / एस.सी.आई.डी माउस humanized जिगर पीढ़ी के लिए एक आदर्श मॉडल है। मानव यकृत स्टेम सेल व्युत्पन्न humanized जिगर पीढ़ी के लिए एक आदर्श मॉडल के रूप में संभावनाओं और ALB-treck / SCID चूहों के फायदे के बावजूद, वे एक अद्वितीय नुकसान के अधिकारी; जब मानव विज्ञापनULT hepatocytes तीन ALB-treck / डीटी एस.सी.आई.डी की एक खुराक के साथ इलाज चूहों में प्रत्यारोपित किया गया, कोई humanized यकृत उत्पन्न किया गया, संभवतः क्योंकि मानव वयस्क hepatocytes proliferative क्षमता की कमी है। डीटी की अतिरिक्त खुराक मानव वयस्क hepatocyte के पद प्रत्यारोपण प्रशासित नहीं किया जा सकता है; ALB-treck / SCID चूहों hepatocytes में डीटी रिसेप्टर (एचबी EGF) के बाद से एल्बुमिन प्रमोटर के नियंत्रण में है, अतिरिक्त डीटी उपचार माउस जिगर में प्रत्यारोपित मानव वयस्क hepatocytes नष्ट कर देगा।

हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, यह पहला मॉडल अपरिपक्व मानव कोशिकाओं से एक humanized जिगर उत्पन्न करने के लिए है। सेल प्रतिस्थापन दर के बाद प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ता सूक्ष्म वातावरण (जैसे, यकृत आला) और ऐसे बनाम अपरिपक्व और proliferative और अंतर क्षमता परिपक्व के रूप में दाता सेल गुण, से प्रभावित है। स्टेम सेल प्रत्यारोपण के साथ ALB-treck / एस.सी.आई.डी संयोजन अनुकूलित शर्तों और मानव की पीढ़ी के लिए लाभ प्रदान करेगाized यकृत। यह भी भ्रूण जिगर की कोशिकाओं और संभावित रूप में अच्छी तरह के रूप में आईपीएस या के प्रत्यारोपण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का गठन किया यकृत कोशिकाओं ते व्युत्पन्न के बाद से डीटी इलाज के लिए पहले, ALB-treck / एस.सी.आई.डी जानवरों एक स्वस्थ राज्य में रखा जाता है, जिगर की क्षति inducible पर किसी भी है बिंदु, और चूहों गुर्दे की क्षति के बिना सामान्य रूप से नस्ल। इसके विपरीत, संप्रग / SCID चूहों उच्च नवजात मृत्यु दर प्रदर्शन और प्रजनन के लिए मुश्किल हो जाता है। इसके अलावा, पशुओं में urokinase की overexpression गंभीर खून बह रहा है और गुर्दे की क्षति हो सकती है और इस तरह वहाँ सेल प्रत्यारोपण के लिए अवसर की एक खिड़की सीमित है प्रातः से पहले; ALB-treck / एस.सी.आई.डी किसी भी उम्र में कोशिका प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

एक humanized जिगर माउस के सफल पीढ़ी निम्नलिखित महत्वपूर्ण कदम की आवश्यकता है: 1) जिगर चोट (उप घातक स्तर तक ही सीमित होना चाहिए आमतौर पर घातक खुराक, 50%) का उपयोग करके; 2) मानव प्राथमिक भ्रूण जिगर की कोशिकाओं को कोई 90% से अधिक एक उप मिला हुआ स्थिति में बनाए रखा जाना चाहिए;3) सेल रिसाव पद intrasplenic प्रत्यारोपण रोका जाना चाहिए; और 4) माउस सीरा में मानव एल्बुमिन के स्तर को नियमित अंतराल पर निगरानी की जानी चाहिए। महत्वपूर्ण humanized माउस जिगर पीढ़ी की प्रक्रिया में शामिल कारकों की एक व्यापक समझ के आगे संशोधन या चूहों या अन्य जानवरों के उपयोग के नए विकास के लिए योगदान हो सकता है। संभव रूपांतरों में शामिल हैं: मानव नेफ्रॉन, उनके पूर्वज के साथ विकास और मरम्मत की जांच, और डक्ट कोशिकाओं और माउस के शरीर में तीन आयामी संरचना में मानव नेफ्रॉन की आत्म विधानसभा इकट्ठा करने के लिए गुर्दे की चोट की प्रेरण; अग्नाशय स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं सीधे reprogrammed, आईपीएस, या ते कोशिकाओं से व्युत्पन्न का उपयोग कर अग्न्याशय में आइलेट क्षति की मरम्मत का अध्ययन। प्रक्रिया संशोधनों के उदाहरण हैं: विषाक्त पदार्थों को या ऐसे retrorsine, streptozotocin, या सिस्पैटिन निवासी कोशिकाओं के साथ दाता कोशिकाओं की प्रतियोगिता की सुविधा के लिए के रूप में रसायनों के साथ ऊतक या अंग चोट को नियंत्रित; परहेजअंतर या आदेश, दाता कोशिकाओं के proliferative क्षमता को बढ़ाने के लिए इस प्रकार इस तरह तों या iPS- के रूप में प्राप्तकर्ता कोशिकाओं, के प्रतिस्थापन ली गई कोशिकाओं को बढ़ावा देने में कम प्रसार; एक उपयुक्त प्रत्यारोपण साइटों का चयन और सेल अर्क को नियंत्रित कुशल प्रत्यारोपण सुनिश्चित करने के लिए, उदाहरण के लिए, entopic प्रत्यारोपण और अन्त्रपेशी और अस्थानिक प्रत्यारोपण के लिए गुर्दे कैप्सूल के लिए पोर्टल या पूंछ नस का उपयोग; ऊतक या इस तरह के अल्फा भ्रूणप्रोटीन या transferrin के रूप में स्टेम / पूर्वज या अपरिपक्व कोशिकाओं के प्रत्यारोपण और कैंसर कोशिका ट्रेसिंग के अंग स्रावित प्रोटीन प्रतिनिधि, की अभिव्यक्ति के माध्यम से प्रतिस्थापन स्थिति की निगरानी।

सारांश में, ALB-treck / SCID चूहों, मानव यकृत स्टेम सेल प्रत्यारोपण के लिए एक उपयुक्त मॉडल गठन के रूप में वे एक लाभदायक वातावरण है कि परिपक्व hepatocytes में भेदभाव के लिए अनुमति देता है प्रदान करते हैं। इस उपन्यास मॉडल जबरदस्त अनुप्रयोगी क्षमता है, न केवल मानव hepatocytes ख के पूर्व vivo विस्तार के लिएकेन्द्र शासित प्रदेशों के भी जिगर विषाक्तता और चयापचय के लिए दवा स्क्रीन और परीक्षण उम्मीदवार चिकित्सीय दवाओं के लिए। इसके अलावा, इन परिणामों के भविष्य के मानव यकृत कोशिका प्रत्यारोपण के लिए इस तकनीक के नैदानिक ​​आवेदन की जांच के अध्ययन की उन्नति में सहायता करेगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human albumin Sigma A6684 Mouse
Human CK19 Dako M088801 Mouse
Human nuclei Millipore MAB1281 Mouse
Human CK8/18 Progen GP11 Guinea pig
CDCP1 Biolegend 324006 Mouse
CD90 BD 559869 Mouse
CD66 BD 551479 Mouse
GOT/AST-PIII Fujifilm 14A2X10004000009
DMEM/F-12 Gibco 11320-033
FBS Biowest S1520
0.05% Trypsin-EDTA  Gibco 25300-054
Diphtheria Toxin Sigma D0564-1MG
Human Albumin ELISA Kit Bethyl Laboratories E88-129
Syringe (1 ml) Terumo SS-01T
32G 1/2" needle TSK PRE-32013
O.C.T.Compound(118 ml) Sakura Finetek Japan 4583
MoFlo high-speed cell sorter Beckman Coulter B25982
DRI-CHEM 7000 Fujifilm 14B2X10002000046

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References

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चिकित्सा अंक 114 एकाएक बढ़ानेवाला जिगर की विफलता प्रत्यारोपण डिप्थीरिया विष humanized जिगर treck / SCID चूहों intrasplenic प्रत्यारोपण मानव hepatocytes अपरिपक्व भ्रूण जिगर की कोशिकाओं यकृत स्टेम कोशिकाओं कोशिका जीव विज्ञान स्टेम एल्बुमिन
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Zhang, R. R., Zheng, Y. W., Taniguchi, H. Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells. J. Vis. Exp. (114), e54167, doi:10.3791/54167 (2016).

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