Protocol
모든 동물 실험 절차는 요코하마 시립 대학의 동물 보호 지침에 따라 수행 하였다.
급성 간 손상 마우스 모델 1 세대
- 1 ㎎ / ㎖ DT 원액을 1 mg을 디프테리아 독소 (DT) 내지 (0.85 % NaCl 용액 100 ㎖에 0.6 g의 페놀) phenolized 0.85 % NaCl 용액 1 ㎖를 추가한다. 주 : 1 밀리그램의 농도 DT는 / ㎖ 3 ° C ~ 8 ° C에서 약 2 년 동안 저장 될 수있다.
- 직렬 phenolized 0.85 % NaCl 용액에서 0.3 μg의 / ㎖ DT에 1 ㎎ / ㎖ DT 원액을 희석 작업 솔루션으로 0.3 μg의 / ㎖의 DT 용액의 분취 량을 준비합니다. 참고 :이 작업 솔루션은 새로 제조해야한다.
- 치사 용량 (~ 50 % 치사)를 사용하여 실험을 수행, 8 주령 생쥐에게 DT의 1.5 μg의 / kg 투여 량을 관리.
- 지느러미 드러 누움에 마우스를 잡고 DT의 복강 내 주사를 수행하고 needl를 삽입무릎의 굽힘 아래 전자는 왼쪽이나 정중선의 오른쪽. 방광의 침투를 방지하기 위해 중간 선을 피하십시오. 각도 몸에 바늘이 약 45 °.
- 인슐린 주사기를 이용하여 마우스의 체중 20g 당 0.3 μg의 새로 제조 / ㎖의 100 ㎕ DT와 마우스를 주입. 예를 들어, 18 g의 마우스는 0.3 μg의 / ㎖의 DT 솔루션의 90 μl를 받아야합니다.
- 48 시간 후 DT 주입에서는, 혈관을 팽창하기 위해 약 10 분 동안 37 ℃의 수욕 마우스 꼬리 제한 수단에 마우스를 위치시키고 가온하여 꼬리 정맥으로부터 혈액을 수집한다. 그런 다음, 날카로운 메스 블레이드와 함께 끝에서 꼬리 2cm에 1 mm 닉을하고 마이크로 캐 필러 튜브에 혈액을 수집합니다.
- 5 분 1,500 XG에서 혈액을 포함하는 마이크로 캐 필러 튜브를 원심 분리기와 뜨는 및 세포 펠렛을 분리하여 혈청을 수집합니다.
- 1시 20분 희석 마우스 혈청의 피펫 50 μL GOT / AST- 상PIII는 슬라이드. 제조사의 프로토콜에 따라 다목적 건조 화학 자동 분석기를 사용하여 650 nm에서의 반응 생성물 (청색 색소)의 흡광도를 측정한다.
참고 : 아스 파르 테이트 아미노 전이 효소 (AST)의 판독은 / 글루타민산 옥 살로 트랜스 아미나 제 (GOT) 활동이 자동으로 표시됩니다. 16,000 IU / L 급성 간 손상을 앓고있는 것으로 간주 하였다 - 이일은 DT가 주입, 쥐의 약 60 % 12,000 사이 AST 값을 나타내 게시합니다. 이러한 마우스는 새로운 케이지 전달 및 세포 이식을 사용 하였다.
인간의 간 줄기 세포의 2. 준비
- CDCP1 + CD90 + CD66- 아군를 얻을 CDCP1, CD90 및 CD66의 세포 항원을 이용한 셀 소터 인간 일차 태아 간세포에서 인간 간 줄기 세포를 분리 한 다음, 콜라겐 IV 코팅 된 배양 접시에 절연 세포군 시드, 앞서 15 일 보도했다. 배아의 인간의 기본 태아 간 세포를 사용하여주 14과 18 사이의 나이.
- 배양액을 흡인 100-mm 배양 접시에 90 % 합류 10 ml의 PBS로 세포를 세척 한 후 PBS를 제거 - 80 % 배양 된 간 줄기 세포를 수집한다. 37 ° C에서 5 분 동안 2 ml의 0.05 % 트립신 / EDTA 용액으로 세포를 Trypsinize. 주 : 세포 분화 쥐 그들의 증식 능력에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 90 % 이상의 세포가 합류 세포 이식에 적합하지 않다.
- 현미경 하에서 세포의 분산액의 상태를 모니터한다. 세포가 떠하거나 자유롭게 유동 할 때 나타나는 10 % FBS를 함유하는 DMEM / F12 8 ml를 첨가하여 효소 소화를 멈춘다.
- 천천히 10 ㎖의 혈청 피펫을 사용하여 세포를 정지하고, 15 mL의 원뿔형 튜브에 세포를 옮긴다. 100 XG에 5 분, 4 ° C를위한 세포를 원심 분리기.
- 조심스럽게 10 % FBS를 함유하는 10 ㎖의 DMEM / F12에서 세포 펠렛을 재현 탁하고 현미경 카운팅 챔버를 이용하여 세포 수를 결정한다.
- 각 마우스 PBS 씩 50 μL 당 1.0 × 10 6 세포로 세포를 나누어 이식까지 얼음에 저장합니다.
인간의 간 줄기 세포의 3 Intrasplenic 이식
- 37 ° C 전기 가열 패드에 깨끗한 케이지를 놓습니다.
- 노즐 아래에 배치하여 - (분당 산소의 2 L에서 1.5 % (부피 / 부피) 1) 마우스 사용 이소 플루 란 흡입 마취. 또한, 이소 플루 란 적신 거즈를 포함하는 튜브를 사용합니다.
- 마우스를 가볍게 뒤쪽 발바닥을 곤란하게하여 마취되어 있는지 확인합니다. 무릎 경련이 유발되는 경우, 다시 실에서 마우스를 놓습니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다.
- 전기 면도기를 사용하여 수술 부위를 면도하고 (부피 / 부피) 에탄올 및 포비돈 요오드 소독 할을 70 %를 적용합니다. 그런 다음 절개에 이어 바로 리브의 늑골 테두리 아래 왼쪽 측면에서 1 cm의 피부 절개를 만들복벽뿐만 아니라 복막.
- 조심스럽게 비장 노출됩니다. 직접 각 마우스의 비장에 50 ㎕의 PBS에 1.0 × 106 인간 간 줄기 세포를 주입하기 위해 32-G / 2 인치 바늘 100 μL 미세 주입 주사기를 사용한다. 주입을위한 5 ° 각도로 바늘을 기울입니다.
- 주사의 깊이가 비장의 절반 이하 두께 있는지 확인하십시오. 바늘을 한쪽 끝 (헤드)에서 비장을 입력하고, 다른 단부 (꼬리)의 셀을 증착한다.
- 주입 따라 셀의 누출을 방지하기 위해, 2 분간 부드럽게 손가락을 이용하여 압력을인가하고 바늘을 제거.
- 다시 마우스 본체에 비장을 놓고 근육과 피부를위한 정상 주행 봉합와 공동을 닫습니다.
- 즉시 이식 다음 37 ° C 미리 예열 케이지에 쥐를 전송합니다. 마우스를 보장하기는 편안하게 호흡 케이지에 옆에 마우스를 배치 할 수있다케이지 침구 및 수술 부위 사이의 접촉을 무효화.
- 마취가 봉합 폐쇄 유지하기 위해 오프 착용하고 마우스 조건 수술 전으로 돌아갈 때까지 마우스를 모니터링합니다.
- 마우스를 확인하는 것은 정상적인 마시는 물과 음식이 제공됩니다. 1 시간 후, 동물 센터의 마우스 방에 케이지를 반환하고 매일 쥐를 모니터링 할 수 있습니다.
4. 감지 이식 인간의 간 마우스 간에서 세포 유래 간세포 줄기
주 : 다음 절차는 자궁 경부 전위 다음 케타민과 자일 라진의 과다 복용을 사용하여 모든 동물을 안락사.
- 4시 - 육주, 이식을 게시 쥐를 안락사 동시에 커티스 절단 및 밴드 수술 가위를 사용하여 복강을 엽니 다.
- , 복막 위의 결합 조직을 해부 확산기로 가위를 사용하고 복막을 열 수있는 원격 교육 알바 함께 복막을 잘라공동.
- , 집게로 흉골을 들어 올려 다이어프램에 구멍 및 자궁 거들을 통해 흉골의 각면을 잘라.
- 간 흉부 측의 대정 맥을 절단하고, 앞쪽 방향으로 간을 통해 식도를 당깁니다. 간을 제거하기 위하여 진동판을 제거한다.
참고 : 위의 팁은 아래의 흉부 장기의 손상을 방지하기 위해 위쪽으로 지적 유지하기 위해주의해야합니다. 흉선은 때때로 흉골의 지느러미 측면에 집착하는 경향이있다이 조심스럽게 피해야한다. - 핸들로 진동판을 사용하여, 복강 내에서 간 당기는 시작한다. 내부 대정맥은 장소에 간을 개최합니다. 내부 대정 맥을 잘라; 중간에 오른쪽 부신을 해방 않도록주의하십시오.
참고 : 마우스가 중간 엽으로 구성된 네 잎 모양 간, 왼쪽 엽, 우엽과 미상 로브 있습니다. 담낭은 작은 분기에 현탁중간 엽. - 접합에서 서로의 로브를 분리하고 제조 업체의 프로토콜에 따라 최적의 절삭 온도 OCT () 화합물을 포함. 그라 이오 스탯의 금속 격자의 간 조직을 포함 OCT를 고정.
- -18 ° C에서 그라 이오 스탯을 사용하여 5 μm의 두께 샘플 부분을 잘라 RT 현미경 슬라이드에 그들을 탑재합니다. -80 ° C에서 주식을 저장합니다. 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E)과 이전에보고 절차 (16)에 따라 면역 형광 염색법에 대한 슬라이드를 준비합니다.
5. 인간 알부민 분비의 탐지 및 키메라 비율의 계산
- 인간 간 재구성을 측정하기 위해, 혈청 및 제조자의 지시에 따라 인간 알부민 ELISA 키트를 사용하여 인간 알부민 ELISA 수행한다.
- 전체 - 인간화 간에서 실시간으로 발현의 PCR 분석을 인간형 키메라 간 비율을 계산한다. 상대 예를 결정인간의 마우스 크로스 굴지 인간 고유의 굴지의 Pression의 수준 비율 (비율 1) 인간 - 마우스 크로스 굴지에 마우스 특정 굴지의 비율 (비율 2). 키메라 비율은 비율이 1 /로 (비율 1 + 비율 2)를 계산한다.
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Representative Results
장백의-트렉 / SCID 쥐 간세포는 알부민 프로모터의 조절 하에서 인간 DT 수용체 HB-EGF 유전자를 발현하고 DT 정부 (12) 아래의 세포 독성 효과를 나타낸다. 간 손상에 DT 치료의 효과를 평가하기 위해, 1.5 μg의 / kg의 DT의 용량은 8 주령 장백의 - 트렉 / SCID 마우스에 주입하고 간 48 시간 포스트 DT 관리의 병리학 적 변화는 조직 학적으로 평가 하였다. (DT하지 처리) 대조군 마우스와 비교하여 처리 마우스 DT 증가 혈청 AST 활성이 정체에 대한 수정을 도시하는 무질서 간 구조를 나타내었다. 또한, DT-처리 생쥐의 간세포 함께 어두운 핵 (아마 세포 사멸 간세포) 여러 깊이 스테인드 acidophilic 세포질 흠도 있었다; 다른 간세포는 그림 1 (보존 또는 거의 또는 전혀 포털 정맥 염증 어두운 핵을 가진 공포 형성 세포질을 전시 등장 (12)을 이용하여 생성 될 수 있다는 것을 보여 주었다 이전 연구의 것과 일치율이다.
인간 HpSCs 체외 배양 장기 사용 및 일부 ALB 적은 CK19 양성 세포 균일 세포 형태를 나타낼 수있다. 6주 마우스 간으로 이식 게시물 인간 HpSCs은 현미경 기본 시험을 실시하고 조직 학적으로 평가 하였다; 인간 HpSCs 원래 쥐 간세포 (도 2)를 대체하여 간 구조를 재구성 한 것으로 관찰되었다. 거시적으로, 사일에서 인간 HpSC 이식, 균일 검출 된 간 주위에 분포 된 작은 인간의 간 클러스터를 게시; 사십오일 게시물 이식에서 이러한 큰 클러스터 (그림 3)으로 확산했다. 누구인간의 간세포로 재구성 제작 마우스 간은 "인간화 간을."지정되었다 이러한 결과는 인간의 HpSC 이식을 받아야 치명적인 전격 성 간부전와 마우스는 정상 마우스 간에서 관찰 된 것과 유사한 간 구조를 나타낼 수 있음을 나타냅니다.
마우스에 이식 미성숙 인간 간세포 분화의 가능성이 있고, 생체 내에서 기능 할 수 있는지를 시험하기 전에 마우스의 간에서의 인간 간세포의 존재는 제 면역 분석 대략 6주 후 인간 HpSC 이식에 의해 확인 하였다. 60 %의 인간 세포를 다시 채우기와 마우스에서 간 부분이 특히 원래 제어 쥐의 간이었다 반면 긍정적으로 공동 스테인드 인간의 핵 및 인간의 사이토 케라틴 8/18로 (CK8 / 18) 항체는 공여 세포 유래 인간의 간세포를 포함하는 것으로 밝혀졌다 이러한 마커에 대한 부정적인 (그림 4).
생체 내에서 세포 분화의 정도를 평가하기 위해 인간 알부민 (ALB)와 인간의 사이토 케라틴 19 (CK19)의 발현을 면역 조직 화학적 평가 하였다. 인간 HpSC 유래 인간의 간세포 잘 마우스 간에서 분화 된 인간 ALB 발현을 상향 조절 나타냈다. ALB 양성 인간과 CK19 음성 간세포에 긍정적 인 인간 ALB으로 염색 공동과 CK19는 간세포와 담관 (그림 5)로 분화에 대한 바이 포텐셜 능력을 전시 세포 반면, 기능성 간세포를 닮았다. 모든 인간 HpSC 유래 인간화 간 로브를 분석하는데 사용되는 대형의 주사 방법은 콜로니를 보여주는 여러 라운드 맑고 인간 핵과 CK8 / 18 식 (도 6)과 간 돌출부 주변 콜로니 형상 클러스터의 존재를 밝혔다 인간화 간 인간 HpSCs의 능력을 형성한다. 다시 채우기 수준은 90 %까지 도달일개월 다음 이식 (도 7a)과 인간 알부민 분비는 인간 HpSCs 성공적으로 장백의 - 트렉 / SCID 마우스의 간을 재구성 할 수 있음을 나타내는 다시 채워 쥐의 간 (그림 7B)에서 검출되었다. 이러한 결과는 인간 HpSCs 결함 마우스 간 기능의 복구에 응답하여 생체 내에서 작용 성 간세포로의 분화에 대한 높은 가능성을 가지고 있음을 보여준다.
그림 1. 간 손상. 디프테리아 독소 (DT) 주입 후 장백의 - 트렉 / SCID (독소 수용체 매개 세포 녹아웃) 마우스에서 발생없이 48 시간 후 DT 관리와 마우스 간의 조직학 (헤 마톡 실린 - 에오신 염색). DT 용량 : 1.5 μg의 / kg, 정상 간 (왼쪽 패널)의 혈청 AST 활동 : 30 IU / L; DT-처리 간 혈청 AST 활동 (오른쪽 패널) : 15000IU / L. 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 전격 성 간 장애를 가진 장백의 - 트렉 / SCID 마우스에 인간의 간 줄기 세포의 이식. 육주에서 인간의 HpSCs와 인간화 간의 육안보기 (왼쪽 패널) 및 조직 학적 분석 (헤 마톡 실린 - 에오신 염색, 오른쪽 패널) 이식을 게시 . m 마우스 간 영역; 시간, 인간의 기증자 인간의 영역을 세포 유래. 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
<BR /> 그림 3. 녹색 형광 단백질로 표기 인간의 간 줄기 세포에서 파생 된 인간 답게 간을의 육안 분석. 간 구조 사일 (왼쪽 패널) 45 일 높은 배율 이미지 (오른쪽 패널) 인간의 간 줄기를 가진 다음 이식 세포 (HpSCs). 인간의 간 줄기 세포 (HpSCs은)는 렌티 바이러스 벡터를 사용하여 강화 된 녹색 형광 단백질 (EGFP)으로 표시 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 특성화 인간의 간 항 - 인간 CK8 / 18 (녹색) 항원 및 안티 시간으로 염색 인간의 간세포 구별 세포 유래 / SCID 마우스 장백의 - 트렉에 인간의 간세포를. 면역 조직 화학 분석 줄기 육주에서 인간의 간 줄기 세포 유래 인간화 간에서 잃어버린 핵 항원 (아쿠아 블루) 이식을 게시 할 수 있습니다. m 마우스 간 영역; 시간, 인간의 기증자 인간의 간 영역을 세포 유래. 인간의 간 영역 대 마우스 간 지역 : 백색 점선. 핵은 4 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (파란색)으로 대조 하였다. 스케일 바는 100 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
육주 이식을 게시에 장백의 - 트렉 / SCID 마우스. 면역 조직 화학의 인간화 간을 그림 5. 인간의 간 줄기 세포의 분화 HpSC 유래 간 인간 알부민과 인간의 CK19 분석. 핵은 4 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (파란색)으로 대조 하였다. 스케일 바는 100 μm의 =.jove.com/files/ftp_upload/54167/54167fig5large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
인간의 간 줄기 세포에서 파생 된 여러 개의 대형 클러스터 6 주에 간 로브에서 확인 된 세포 유래 세포는 장백의 - 트렉에서 인간 답게 간을 함께 / SCID 마우스 존재하는 줄기. 인간의 간 그림 6. 여러 클러스터에 대한 면역 조직 화학 분석에 의해 이식을 게시 인간의 CK8 / 18 (녹색)과 인간의 핵 (아쿠아 블루). 스케일 바는 1,000 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7. 인간화장백의 - 트렉 / SCID 마우스의 간 다시 채우기 비율과 인간 알부민 분비. (A) 인간의 간 줄기 세포 이식 다음 마우스 1개월 / SCID 장백의 - 트렉의 키메라 비율; 데이터는 (N = 12) SEM ± 평균으로 표시됩니다. 맨 - 휘트니 테스트 : P <위장과 인간 HpSCs에 대한 0.0005 (B) 인간 알부민 검출 마우스 혈청에서 기증자 세포 이식 다음 일개월.. 데이터는 ± SEM = 평균 (N = 5). 맨 - 휘트니 시험 : P = 위장과 인간 HpSCs에 대한 0.0313. ND : 탐지; 가짜 : PBS 이식 마우스; HpSCTx :. 인간의 HpSCs 이식 생쥐 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
최근의 연구는 마우스 간 성인 간세포 증식 및 간 줄기 세포 (17)를 포함하여 인간 간세포 증식을 할 수 있음을 보여 주었다. 이 다시 채워 간 약물 대사 시험 및 신약 개발 18 전임상 실험 모델로 사용되고있다; 뿐만 아니라, 그들은 세포 성숙과 분화 (19)에 대한 생체 내 환경을 제공하고 있습니다. 본 연구의 주된 목적은 약물 대사 활동의 획득을 위해, 인간 미성숙 간세포 증식, 성숙 및 분화를 허용하는 신규 간 질환의 마우스 모델을 생성 하였다.
intrasplenic 이식의 과정은 광범위하게 연구되고있다. 쥐의 비장 세포를 이식은 평균 수명에 걸쳐 생존. intrasplenic 이식 프로토콜은 특정 연구 질문 조사에 매우 유용한 것으로 입증되었습니다;많은 실험실은 전 세계적으로 인해 개선 된 생쥐의 생존과 간 재생의 간 세포 이식에 대한 높은 재현성 및 신뢰성 모델이 프로토콜을 사용하려고했습니다. 이식 된 세포의 대다수가 포털 분기를 흡장 할 수있는 간으로 이동시키다 때문에 그러나, 펄프에 비장 세포를 주입하는 것은 위험을 제기. 이 폐색 일시적 일 수 있고, 간 손상을 기존의 경우, 건강한 간 환경에 영향을주지하더라도,이 절차는 또한 간 기능을 감소시키고 문맥 고혈압을 증가시키고 부정적인 세포 생착에 영향을 미칠 수 있었다. 우리가 성공적으로 intrasplenic 이식을 이용하여 간세포 이식을 적용하고 있지만, 몇 가지 문제는 더 연구, 잠재적 인 새로운 셀 소스 특히 주제를 보증합니다. intrasplenic 간세포 이식을 수행 할 때 또한, 상기 셀 로딩 제한이 엄격하여 잠재적 인 방해를 방지하기 위해 따라야남은 간 미세. DT는 수용체는 헤파린 결합 성 EGF 형 증식 인자 (HB-EGF 전구체) (20)의 막 - 고정 된 형태로 확인되었다. 이러한 DT (21)를 결합하지 않는 마우스 및 쥐에서 독소 수용체, HB-EGF 전구체로서 인간과 원숭이, 바인드 DT 및 기능 등의 독소에 민감한 동물에서 유래 HB-EGF 전구체, 반면. 트랜스 제닉 장백의-트렉 / SCID 마우스 모델은 간세포 특이 알부민 프로모터의 조절 하에서 인간 HB-EGF 형 수용체를 발현; DT의 투여 후,이 마우스는 공여 세포 거주 및 확산을위한 공간을 제공 인해 간세포의 조건부 절제에 전격 성 간부전을 개발한다. 그들의 약물 대사 기능을 상실하지만 심지어 미성숙 단계에서 인간 간세포는 그들의 임상 응용 프로그램 (22)을 제한하는, 시험관 내에서 광범위한 증식 능력을 갖는 것으로 알려져있다. TRA 다음 얻어진 조직 학적 및 면역 조직 화학적 연구 결과치명적인 전격 성 간부전과 장백의 - 트렉 / SCID 마우스에 인간의 HpSCs의 nsplantation은 인간의 HpSCs 확장하고 손상된 마우스 간 구조를 재구성 할 수 있음을 표시; 일부 마우스에서 다시 채우기 비율은 거의 100 %였다.
우리의 실험에서, 인간의 HpSC 이식 마우스 생존을 승진 및 마우스 혈청 (16)에 인간 ALB의 증가 분비의 결과. 이 세포는 성숙하고 생체 내에서 차별화 된 인간 HpSC 유래 인간화 된 쥐의 간은 성숙 및 기능 "인간의 기관"비슷 및 약물 개발에 잠재적 인 응용 프로그램을 나타내는, 인간의 약물 대사 활동을 보였다. 이러한 결과는 더 장백의 - 트렉 / SCID 마우스 인간화 간 생성을위한 이상적인 모델인지 확인합니다. 인간 간 줄기 세포 유래 인간화 간 생성을위한 이상적인 모델로 장백의-트렉 / SCID 마우스의 잠재 장점에도 불구하고, 그들은 하나의 고유 한 단점을 갖고; 때 인간의 광고ULT 간세포가 DT의 단일 용량으로 치료 세 장백의 - 트렉 / SCID 마우스에 이식, 더 인간화 간은 인간의 성인 간세포는 증식 능력이 부족 가능성이 있기 때문에, 생성되지 않았다. DT의 추가 투여가 인간 성인 간세포의 이식 후 투여 될 수 없다; 장백의 - 트렉 / SCID 마우스의 간세포에서 DT 수용체 (HB-EGF) 이후 알부민 프로모터의 제어하에, 마우스 간에서 이식 된 인간의 성인 간세포를 파괴 추가 DT 처리.
우리가 알고있는 한, 이는 미성숙 인간 세포에서 인간화 간을 발생하기 위해 제 1 모델이다. 셀 대체율 이식 후받는 사람의 미세 환경 (예를 들어, 간 틈새) 및 미숙과 증식 및 차등 기능 대 성숙한 같은 도너 셀 속성에 의해 영향을 받는다. 줄기 세포 이식에 장백의-트렉 / SCID 결합은 인간의 생성을위한 최적 조건의 이점을 제공 할 것이다화된 간. 이것은 또한 태아 간 세포와 잠재적으로뿐만 아니라 유도 만능 줄기 또는 이식을위한 강력한 도구 구성 이후 이전 DT 처리 간 세포를 ES를 유래는 장백의 - 트렉 / SCID 동물이 건강한 상태로 유지되어, 간 손상은 어떤 유도입니다 포인트 및 마우스는 신장 손상없이 정상적으로 번식. 대조적으로, uPA의 / SCID 마우스는 높은 신생아 사망률을 나타내고 번식하기 어렵다. 또한, 동물의 유로 키나아제의 과발현은 심한 출혈과 신장 손상을 초래할 수있어 세포 이식을위한 기회의 제한 윈도우가 이유 이전에; 장백의 - 트렉 / SCID는 나이에 세포 이식에 사용할 수 있습니다.
인간화 간 마우스의 성공적인 생성은 다음의 주요 단계가 필요 : 1) 간 손상은 일반적 치사량 50 %)를 사용하여 (치사량 레벨로 제한되어야한다; 2) 인간 태아 간 차 전지는 90 %보다 크지 않은 서브 합류 상태로 유지하여야한다;3) 세포 누설 후 intrasplenic 이식을 방지해야한다; 4) 마우스 혈청 인간 알부민의 수준을 정기적으로 모니터링해야합니다. 인간형 마우스 간 생성 과정에 관여하는 중요한 인자의 포괄적 인 이해는 추가 수정 또는 쥐 또는 다른 동물을 이용한 새로운 발전에 기여할 수있다. 가능한 적응은 다음과 같습니다 : 인간 네프론, 자신의 조상으로 개발 및 수리를 검사하고, 덕트 세포와 마우스 본체의 세 가지 차원 구조로 인간 네프론의 자기 조립 (self-assembly)를 수집 신장 손상의 유도; 직접 재 프로그램은 IPS 또는 ES 세포로부터 유래 된 췌장 줄기 / 선조 세포를 사용하여 췌장 섬 세포 손상의 복구를 연구. 공정 변형의 예로는 예컨대 상주 세포 공여 세포의 대전을 용이하게 retrorsine, 스트렙토 또는 시스플라틴과 같은 독성 화학 물질 또는 조직 또는 기관 손상을 제어하는 단계; 피이와 같은 유래 세포 또는 ES iPS-로서받는 셀의 교체를 촉진 도너 세포의 증식 능력을 향상시키기 위해 차동 증식 또는 감소; 적합한 이식 부위를 선택하고 entopic 이식 자궁외 이식 장간막 및 신 캡슐 용 포털 또는 꼬리 정맥을 이용하여, 예를 들어, 효과적인 이식을 위해 세포 주입을 제어하는 단계; 조직 또는 알파 태아 단백 또는 트랜스페린과 같은 줄기 / 전구 또는 미성숙 세포 이식 및 암 세포 추적의 장기 분비 단백질 담당자의 발현을 통해 교체 상태를 모니터링.
이들은 성숙한 간세포로 분화 할 수있는 유리한 환경을 제공 같이 요약 장백의-트렉 / SCID 마우스는 인간 간 줄기 세포 이식에 적절한 모델을 구성한다. 이 새로운 모델은 엄청난 실용적 잠재력을 가지고뿐만 아니라 인간의 간세포 (b)의 생체 확장유타 또한 간 독성과 대사에 대한 약물 화면 및 테스트 후보 치료 약물. 또한, 이러한 결과는 인간 간세포 이식이 기술의 임상 적용을 검토 미래 연구의 발전에 도움이된다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human albumin | Sigma | A6684 | Mouse |
| Human CK19 | Dako | M088801 | Mouse |
| Human nuclei | Millipore | MAB1281 | Mouse |
| Human CK8/18 | Progen | GP11 | Guinea pig |
| CDCP1 | Biolegend | 324006 | Mouse |
| CD90 | BD | 559869 | Mouse |
| CD66 | BD | 551479 | Mouse |
| GOT/AST-PIII | Fujifilm | 14A2X10004000009 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320-033 | |
| FBS | Biowest | S1520 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Diphtheria Toxin | Sigma | D0564-1MG | |
| Human Albumin ELISA Kit | Bethyl Laboratories | E88-129 | |
| Syringe (1 ml) | Terumo | SS-01T | |
| 32G 1/2" needle | TSK | PRE-32013 | |
| O.C.T.Compound(118 ml) | Sakura Finetek Japan | 4583 | |
| MoFlo high-speed cell sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| DRI-CHEM 7000 | Fujifilm | 14B2X10002000046 |
References
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