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Medicine

Generación de un ratón humanizado hígado uso de células madre hepáticas humanas

Published: August 29, 2016 doi: 10.3791/54167
Automatic Translation
*1, *1,2,3, 1
1Department of Regenerative Medicine, Graduate School of Medicine, Yokohama City University, 2Department of Advanced Gastroenterological Surgical Science and Technology, Faculty of Medicine, University of Tsukuba, 3Regenerative Medicine Research Center, Jiangsu University Hospital
* These authors contributed equally

Protocol

Todos los procedimientos experimentales con animales se realizaron de acuerdo con las Directrices para la Protección de Animales de la Universidad de la ciudad de Yokohama.

1. Generación del modelo de lesión hepática aguda Ratón

  1. Añadir 1 ml de solución de NaCl al 0,85% con fenol (0,6 g de fenol en 100 ml de solución de NaCl al 0,85%) a 1 mg toxina de la difteria (DT) para hacer un ml de solución madre 1 mg / DT. Nota: DT a una concentración de 1 mg / ml se puede almacenar durante aproximadamente 2 años a 3 ° C a 8 ° C.
  2. En serie diluir la solución de 1 mg / ml de stock DT a 0,3 g / ml DT en solución con fenol 0,85% de NaCl y preparar una alícuota de la solución de DT / ml 0,3 g como una solución de trabajo. Nota: Esta solución de trabajo debe estar recién preparado.
  3. Para llevar a cabo experimentos utilizando una dosis subletal (~ 50% de letalidad), administrar ratones de 8 semanas de edad, una dosis / kg 1,5 g de DT.
    1. Realizar una inyección intraperitoneal de DT Manteniendo el ratón en decúbito dorsal e inserte el needle por debajo de la curva de las rodillas, hacia la izquierda o derecha de la línea media. Evitar la línea media para evitar la penetración de la vejiga. Ángulo de la aguja en aproximadamente 45 ° con respecto al cuerpo.
    2. Usando una jeringa de insulina, inyectar a los ratones con 100 l de recién preparada 0,3 g DT / ml por 20 g de peso del ratón. Por ejemplo, un joven de 18 g de ratón debe recibir 90 l de la disolución de TD / ml 0,3 mg.
  4. Después de la inyección DT 48 hr, recoger la sangre de la vena de la cola mediante la colocación el ratón en un retenedor y el calentamiento de la cola de ratón en un baño de agua a 37 ° durante aproximadamente 10 min para dilatar los vasos sanguíneos. Luego, haga una de 1 mm incisión en la cola de 2 cm de la punta con una hoja de bisturí afilado y recoger la sangre con un tubo capilar se.
    1. Centrifugar el tubo microcapilar que contiene la sangre a 1.500 xg durante 5 min y se recoge el suero, separando el sobrenadante y las células de pellets.
  5. Pipeta de 50 l de suero de ratón 1:20 diluida sobre GOT / AST-PIII se desliza. Se mide la absorbancia del producto de reacción (colorante azul) en 650 nm usando un analizador de química seca automático multiusos según el protocolo del fabricante.
    NOTA: La lectura de la aspartato aminotransferasa (AST) / actividad transaminasa glutámico oxalacético (GOT) se muestra automáticamente. 2 días después de la inyección de DT, aproximadamente el 60% de los ratones exhibieron valores de AST entre 12.000 - 16.000 UI / L y se considera que sufre de daño hepático agudo. Estos ratones se transfirieron a una nueva jaula y se utilizan como receptores de trasplante celular.

2. Preparación de las células madre hepáticas humanas

  1. Aislar células madre hepáticas humanas a partir de células de hígado fetal primarios humanos con un clasificador de células usando los antígenos de las células CDCP1, CD90, CD66 y para obtener una subpoblación CD90 + CDCP1 + CD66-, a continuación, sembrar la población de células aisladas en placas de cultivo recubiertas con colágeno IV, como se informó anteriormente 15. Utilizar células de hígado fetal primarios humanos de una embrionariaedad entre 14 y 18 semanas.
  2. Recoger las células madre hepáticas humanas cultivadas a 80% - 90% de confluencia en placas de cultivo de 100 mm, aspirar el medio de cultivo, se lavan las células con 10 ml de PBS, y luego retirar el PBS. Tripsinizar las células con solución de tripsina / EDTA 2 ml 0,05% durante 5 min a 37 ° C. Nota: Las células en más de un 90% de confluencia no son adecuados para el trasplante de células ya que la diferenciación de células puede influir en su capacidad proliferativa en ratones.
  3. Supervisar el estado de dispersión de las células bajo un microscopio. Cuando las células parecen estar flotando o que fluye libremente, detener la digestión enzimática mediante la adición de 8 ml de DMEM / F12 que contiene 10% de FBS.
  4. Suspender las células lentamente usando una pipeta serológica de 10 ml y la transferencia de las células en un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar las células durante 5 minutos a 100 x g y 4 ° C.
  5. resuspender cuidadosamente el sedimento celular en 10 ml de DMEM / F12 que contiene 10% de FBS y determinar el número de células usando una cámara del microscopio contando.
  6. Dividir las células en 1,0 x 10 6 células por 50 l de PBS alícuotas para cada ratón individual y almacenar en hielo hasta el trasplante.

3. intraesplénicos trasplante de células madre hepáticas humanas

  1. Colocar una jaula limpia en un 37 ° C almohadilla eléctrica.
  2. Anestesiar al ratón usando isoflurano inhalación (1 a 1,5% (vol / vol) en 2 L de oxígeno por min) colocándolo debajo de la boquilla. Alternativamente, utilizar tubos que contienen una gasa empapada con isoflurano.
    1. Asegúrese de que el ratón se anestesia pellizcando suavemente la almohadilla de la pata trasera. Si se provoca un reflejo de la rodilla, coloque el ratón de nuevo en la cámara. Utilice ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
  3. Afeitar el sitio quirúrgico usando una maquinilla eléctrica y aplicar el 70% (/ vol vol) de etanol y povidona yodada para esterilizar. A continuación, hacer una incisión en la piel de 1 cm en el flanco izquierdo justo por debajo del reborde costal de las costillas, seguido de una incisión enla pared abdominal, así como el peritoneo.
  4. Descubra con cuidado el bazo. Utilice una jeringa microinyección de 100 l con un 32-G de aguja 1/2-pulgada para inyectar directamente 1,0 x 10 6 células madre hepáticas humanas en 50 l de PBS en el bazo de cada ratón. Inclinar la aguja en un ángulo de 5 ° para inyección.
    1. Asegúrese de que la profundidad de la inyección es menor que la mitad del espesor del bazo. La aguja debe entrar en el bazo en un extremo (la cabeza) y depositar las células en el otro extremo (la cola).
  5. Para evitar fugas de las células después de la inyección, aplicar una suave presión con el dedo durante 2 minutos y luego retirar la aguja.
  6. Coloque el bazo de nuevo en el cuerpo del ratón y cerrar la cavidad con una sutura continua normal para la musculatura y la piel.
  7. La transferencia de los ratones en una jaula de 37 ° C pre-calentado inmediatamente después del trasplante. Para garantizar el ratón es capaz de respirar sin dificultad, colocar el ratón sobre su lado en la jaula, unamiccional contacto entre la ropa de cama de la jaula y el sitio de la cirugía.
  8. Monitorear los ratones hasta que el efecto de la anestesia para asegurar las suturas permanecen cerrados y los ratones de regreso a las condiciones pre-cirugía.
  9. Asegurar que los ratones se proporcionan con el agua potable normal y alimentos. Después de 1 hora, volver a la jaula para la habitación del ratón del centro de animales y controlar los ratones diariamente.

4. Detección de Trasplantados hepática hepatocitos humanos de células madre derivadas de células en el hígado de ratón

Nota: Para los siguientes procedimientos, la eutanasia a todos los animales utilizando una sobredosis de ketamina y xilazina seguido por dislocación cervical.

  1. A los 4 - 6 semanas después del trasplante, la eutanasia a los ratones y abrir la cavidad abdominal mediante la reducción simultánea del cutis y la fascia utilizando tijeras quirúrgicas.
  2. Diseccionar el tejido conectivo por encima del peritoneo, con las tijeras como un esparcidor, y cortar el peritoneo a lo largo de la línea alba para abrir el peritonealcavidad.
  3. Levantar el esternón con fórceps, perforar el diafragma, y ​​cortar a través de cada lado del esternón a través de la faja cervical.
  4. Cortar la vena cava en el lado dorsal del hígado y tire del esófago a través del hígado en la dirección anterior. Retire el diafragma a fin de eliminar el hígado.
    Nota: Tenga cuidado de mantener la punta de las tijeras apuntando hacia arriba con el fin de evitar cualquier daño a los órganos torácicos debajo. El timo tiene una tendencia a aferrarse de vez en cuando en el lado dorsal del esternón y esto debe evitarse cuidadosamente.
  5. El uso de la membrana como un mango, empezar a tirar el hígado fuera de la cavidad abdominal. La vena cava interior estará llevando a cabo el hígado en su lugar. Cortar el interior de la vena cava; tener cuidado de no liberar prematuramente la suprarrenal derecha.
    Nota: Los ratones tienen un hígado de cuatro lóbulos que consiste en un lóbulo medio, lóbulo izquierdo, lóbulo derecho y el lóbulo caudado. La vesícula biliar se suspende en la pequeña bifurcación deel lóbulo medio.
  6. Separar los lóbulos de uno al otro en las uniones e integrarlos en el compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Congelar los PTU que contiene el tejido hepático en las rejillas de metal en el criostato.
  7. Cortar secciones de la muestra de 5 micras de grosor usando un criostato a -18 ° C y montarlos en portaobjetos de microscopio RT. Guarde el archivo a -80 ° C. Preparar los portaobjetos para hematoxilina y eosina (H & E) y tinción de inmunofluorescencia de acuerdo con procedimientos previamente reportados 16.

5. Detección de Albúmina Humana secreción y cálculo de la tasa quimérico

  1. Para medir la reconstitución de hígado humano, realizar albúmina humana ELISA utilizando suero y una albúmina ELISA kit humano de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  2. Calcular la tasa de hígado quimérico humanizado por tiempo real PCR análisis de los niveles de expresión en todo el hígado humanizado. Determinar el ex relativarelación de nivel pression de actina humano específico para cruz actina humano-ratón (relación 1) y la relación de actina de ratón específico para cruz actina humano-ratón (relación 2). La tasa quimérico se calcula como cociente / 1 (relación 1 + relación de 2).

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Representative Results

Alb-Treck / hepatocitos ratones SCID expresan el receptor de DT gen HB-EGF humano bajo el control de un promotor de albúmina y exhiben efectos citotóxicos después de la administración DT 12. Para evaluar los efectos del tratamiento DT sobre la lesión hepática, dosis de DT de 1,5 g / kg se inyectaron en ratones SCID de 8 semanas de edad, Alb-Treck / y los cambios patológicos en la administración DT h después de hígado 48 fueron evaluados histológicamente. En comparación con los ratones de control (no tratados con DT), los ratones tratados con DT mostraron una arquitectura hepática desorganizado que muestra una corrección para la congestión con el aumento de actividad de la AST en suero. Además, los hepatocitos de ratones tratados con DT tenían múltiples inclusiones citoplasmáticas acidófilas profundamente teñidos, junto con los núcleos oscuro (muy probablemente hepatocitos apoptóticos); algunos otros parecían hepatocitos conservados o se exhibieron un citoplasma vacuolado con núcleos oscuros con poca o ninguna inflamación de la vena porta (Figura 1 12.

HPSCs humanos pueden ser utilizados para a largo plazo en cultivo in vitro y muestran la morfología celular uniforme con algunos ALB y menos células CK19 positivas. A las 6 semanas después del trasplante en los hígados de los ratones, los hPSCs humanos fueron sometidos a examen básico bajo un microscopio y se evaluaron histológicamente; Se observaron hPSCs humanos haber reconstituido la estructura del hígado mediante la sustitución de los hepatocitos de ratón original (Figura 2). Macroscópicamente, a los 4 días después del trasplante HPSC humana, pequeños grupos hepáticas humanas que fueron distribuidos uniformemente alrededor del hígado fueron detectados; a los 45 días después del trasplante, éstos habían proliferado en grandes grupos (Figura 3). Quienhígados de ratón le reconstituidos con hepatocitos humanos se designaron "hígados humanizados". Estos resultados indican que los ratones con insuficiencia hepática fulminante letal que se someten a trasplante de HPSC humano pueden exhibir estructuras hepáticas similares a los observados en hígados normales de ratón.

Antes de la prueba si los hepatocitos humanos trasplantados en ratones inmaduros tenían el potencial de diferenciación y podrían funcionar in vivo, la presencia de hepatocitos humanos en hígados de los ratones fue confirmada por primera vez por el análisis inmunohistoquímico aproximadamente a las 6 semanas después del trasplante humano HPSC. secciones de hígado de ratones con la repoblación de células humanas 60% que específicamente y de forma positiva co-manchado con núcleos humanos y citoqueratina humana 8/18 se encontraron (/ 18) Ck8 anticuerpos para contener hepatocitos humanos derivados de células donantes, mientras que los hígados de los ratones de control original eran negativo para estos marcadores (Figura 4).

in vivo, la expresión de albúmina humana (ALB) y citoqueratina humana 19 (CK19) se evaluó mediante inmunohistoquímica. hepatocitos humanos derivados de HPSC humanos estaban bien diferenciados en los hígados de los ratones y exhibió aumentó la expresión de ALB humana. Hepatocitos humanos ALB-positivas y negativas-CK19 se parecían a los hepatocitos funcionales, mientras que las células que co-positivamente teñidas con ALB humana y CK19 exhibió capacidad bipotencial para diferenciarse en hepatocitos y cholangiocytes (Figura 5). Un método de exploración a gran escala para el análisis de todos los lóbulos del hígado humanizados derivados de HPSC humanos reveló la presencia de ronda múltiple y las agrupaciones de colonias como alrededor de los lóbulos del hígado con núcleos humanos claros y CK8 / 18 expresión (Figura 6), lo que demuestra la de colonias capacidad de formación de hPSCs humanos en los hígados humanizados. El nivel de repoblación alcanza hasta el 90%un mes después del trasplante (Figura 7A) y la secreción de albúmina humana se detectó en los hígados de ratones repoblados (Figura 7B), lo que indica que hPSCs humanos podían reconstituir con éxito el / hígado de ratón SCID-Alb TRECK. Estos resultados demuestran que hPSCs humanos tienen un alto potencial para la diferenciación en hepatocitos funcionales in vivo en respuesta al rescate de las funciones del hígado de ratón defectuosos.

Figura 1
Figura 1. Se produce el daño hepático en ratones Alb-TRECK / SCID (Toxina mediada por el receptor de la célula Knockout) A raíz de la toxina diftérica (DT) de inyección. La histología (tinción con hematoxilina-eosina) de hígados de los ratones con y sin administración DT después de 48 horas. dosis DT: 1,5 mg / kg, la actividad de AST sérica de hígado normal (panel izquierdo): 30 UI / L; actividad sérica AST de hígado tratados con DT (panel derecho): 15000IU / L. Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. trasplante de células madre hepáticas humanas en Alb-TRECK Ratones / SCID con Insuficiencia Hepática Fulminante. Macroscópico (panel izquierdo) y el análisis histológico (tinción con hematoxilina-eosina, panel derecho) de hígados humanos humanizados con hPSCs a las 6 semanas después del trasplante . m, región de hígado de ratón; h, donante humano derivado de células región humana. Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3 <br /> Figura 3. Análisis macroscópico de hígados humanizados derivados de células madre hepáticas humanas marcadas con proteína verde fluorescente. Las imágenes de alta magnificación de la estructura del hígado 4 días (panel izquierdo) y 45 días (panel derecho) después de un trasplante hepático humano con el vástago células (hPSCs). Las células madre hepáticas humanas (hPSCs) fueron etiquetados con la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) utilizando un vector de lentivirus. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Caracterización de la actividad hepática humanos de células madre análisis inmunohistoquímico derivado de células de hepatocitos humanos en Alb-TRECK / ratones SCID. Distinguir entre los hepatocitos humanos teñidos con CK8 / (verde) y el antígeno de 18 anti-humano anti-h antígeno nuclear uman (aqua azul) en los hígados humanos derivados de células madre hepáticas humanizados a las 6 semanas después del trasplante. m, región de hígado de ratón; h, donante humano derivado de células de hígado humano región. Blanco línea discontinua: región de hígado de ratón frente a la región del hígado humano. Los núcleos se counterstained con 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (azul). Las barras de escala = 100 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. hepática humana Células Madre Diferenciación en humanizados Los hígados de Alb-TRECK / ratones SCID. Inmunohistoquímico análisis de la albúmina humana y CK19 humana en el hígado derivados de HPSC a las 6 semanas después del trasplante. Los núcleos se counterstained con 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (azul). Barras de escala = 100 m.jove.com/files/ftp_upload/54167/54167fig5large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. varios clústeres de hepáticas humanas Células madre derivadas de células están presentes en Alb-TRECK / ratones SCID con humanizados Los hígados. Se identificaron grandes racimos múltiples derivadas de células madre hepáticas humanas en los lóbulos del hígado a las 6 semanas después del trasplante mediante análisis inmunohistoquímico para humana CK8 / 18 (verde) y los núcleos humana (aqua azul). Las barras de escala = 1,000 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7
Figura 7. humanizadoLa repoblación del hígado tarifas y Albúmina Humana La secreción de Alb-TRECK Ratones / SCID. (A) la tasa quimérico en Alb-TRECK / SCID ratones 1 mes después del trasplante de células madre hepática humana; los datos se presentan como media ± SEM (n = 12). Prueba de Mann-Whitney: p <0,0005 para Sham y hPSCs humanos (B) Detección de albúmina humana en sueros de ratón de un mes tras el trasplante de células de donantes.. Datos = media ± SEM (n = 5). prueba de Mann-Whitney: p = 0,0313 para Sham y hPSCs humanos. ND: no detectable; Sham: ratones trasplantados con PBS; HpSCTx:. Ratones trasplantados con hPSCs humanos Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Estudios recientes han demostrado que el hígado de ratón se puede repoblada con hepatocitos humanos, incluidos los hepatocitos adultos y células madre hepáticas proliferativas 17. Estos hígados repobladas han sido utilizados como modelos experimentales preclínicos para las pruebas de metabolismo de fármacos y el descubrimiento y el desarrollo 18 de drogas; Además, han proporcionado un entorno in vivo para la maduración y la diferenciación celular 19. El principal objetivo del presente estudio fue generar una nueva enfermedad hepática modelo de ratón que permitió la proliferación de hepatocitos humanos inmaduros, la maduración y diferenciación, para la adquisición de las actividades del metabolismo del fármaco.

El curso del trasplante el interior del bazo se ha estudiado ampliamente. Las células trasplantadas en el bazo de ratas y ratones sobreviven a lo largo de su vida media. El protocolo de trasplante intraesplénica ha demostrado ser muy útil en la investigación de preguntas específicas de investigación;muchos laboratorios de todo el mundo han tratado de utilizar este protocolo como un modelo altamente reproducible y fiable para el trasplante de células hepáticas debido a la mejora de la supervivencia y el hígado de ratones regeneración. Sin embargo, la implantación de células en la pulpa esplénica representa un riesgo, ya que la mayoría de las células implantadas se translocan hacia el hígado, donde pueden ocluir ramas portales. A pesar de que esta oclusión puede ser temporal y podría no afectar a un medio ambiente saludable del hígado, en los casos de daño hepático preexistente, este procedimiento podría reducir aún más la función del hígado y aumenta la hipertensión portal y también puede influir negativamente en el injerto de células. Aunque hemos aplicado con éxito el trasplante de hepatocitos usando el transplante el interior del bazo, varios temas requieren mayor estudio, especialmente el asunto de las posibles nuevas fuentes de células. Por otra parte, cuando se realiza el trasplante de hepatocitos el interior del bazo, el límite de carga de las células debe ser seguido estrictamente con el fin de evitar la posible perturbación pormicrocirculación hepática remanente. El receptor de DT ha sido identificado como una forma anclada a la membrana del factor de unión a heparina de tipo EGF del crecimiento (precursor HB-EGF) 20. Mientras que los precursores de HB-EGF derivados de animales sensibles a la toxina, como los humanos y los monos, DT se unen y funcionan como receptores de toxinas, precursores de HB-EGF procedentes de ratones y ratas no se unen DT 21. El modelo de ratón transgénico Alb-TRECK / SCID expresa receptores de HB-EGF humanos bajo el control de un promotor de albúmina específico de las células del hígado; tras la administración de DT, estos ratones desarrollan insuficiencia hepática fulminante debido a la ablación condicional de hepatocitos, proporcionando espacio para la residencia y la proliferación de células de donantes. Hepatocitos humanos, incluso en una fase inmadura, se sabe que poseen amplia capacidad proliferativa in vitro, aunque pierden sus funciones de metabolismo de fármacos, lo que limita sus aplicaciones preclínicos 22. Los hallazgos histológicos e inmunohistoquímicos obtenidos como consecuencia de la transplantation de hPSCs humanos en ratones Alb-TRECK / SCID con insuficiencia hepática fulminante letal indicó que los hPSCs humanos podrían ampliar y reconstruir las estructuras dañadas del hígado del ratón; la tasa de repoblación en algunos ratones fue casi del 100%.

En nuestros experimentos, el trasplante de HPSC humano promovió la supervivencia del ratón y produjo un aumento de la secreción de ALB humana en suero de ratón 16. Estas células también maduraron y diferenciada in vivo y exhibieron actividades de metabolismo de fármacos humanos, lo que indica que los hígados humanos ratones humanizados derivados de HPSC son similares a madurar y "órganos humanos" funcionales y tienen aplicaciones potenciales en el desarrollo de fármacos. Estos resultados confirman además que el Alb-TRECK / SCID ratón es un modelo ideal para la generación de hígado humanizado. A pesar de las posibilidades y ventajas de los ratones Alb-TRECK / SCID como un modelo ideal para la generación de hígado humano vástago hepática derivado de células humanizado, que poseen una desventaja único; cuando el anuncio humanahepatocitos ULT se trasplantaron en tres ratones SCID Alb-Treck / tratados con una dosis única de DT, no se generaron hígados humanizados, posiblemente debido a hepatocitos adultos humanos carecen de la capacidad proliferativa. Dosis adicionales de DT no se pueden administrar de post trasplante de hepatocitos humanos adultos; ya que el receptor de DT (HB-EGF) en hepatocitos de ratones Alb-Treck / SCID está bajo el control del promotor de albúmina, el tratamiento adicional DT va a destruir los hepatocitos adultos humanos trasplantados en el hígado de ratón.

A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer modelo para generar un hígado humanizado a partir de células humanas inmaduras. Tasa de reemplazo de la célula post-trasplante está influenciada por el destinatario micro-entorno (por ejemplo, el nicho hepática) y propiedades de células donantes, tales como madura vs. inmaduro y proliferativa y la capacidad diferencial. La combinación de Alb-TRECK / SCID con trasplante de células madre proporcionará condiciones y ventajas optimizados para la generación de humanoshígados zados. Esto también constituye una poderosa herramienta para el trasplante de células fetales de hígado y potencialmente, así como iPS o ES-derivado células hepáticas desde antes del tratamiento DT, las / los animales SCID Alb-Treck se mantienen en un estado saludable, el daño hepático es inducible en cualquier punto, y los ratones se reproducen normalmente sin daño renal. Por el contrario, los ratones SCID / uPA exhiben una alta mortalidad neonatal y son difíciles de criar. Además, la sobreexpresión de la uroquinasa en los animales puede conducir a hemorragia grave y el daño renal y por lo tanto hay una ventana de oportunidad limitada para el trasplante de células antes del destete; Alb-TRECK / SCID se puede utilizar para el trasplante de células a cualquier edad.

La generación con éxito de un ratón humanizado hígado requiere los siguientes pasos críticos: 1) La lesión hepática se debe limitar a niveles subletales (por lo general mediante el uso de la dosis letal, 50%); 2) Las células de hígado fetal primarios humanos deben mantenerse en un estado sub-confluente no mayor que 90%;3) de la fuga de la célula intraesplénico-trasplante debe prevenirse; y 4) Los niveles de albúmina humana en sueros de ratón se deben controlarse a intervalos regulares. Una amplia comprensión de los factores críticos que participan en el proceso de generación de hígado de ratón humanizado podría contribuir a nuevas modificaciones o nuevos desarrollos que utilizan ratas u otros animales. Posibles adaptaciones incluyen: la inducción de la lesión renal para examinar el desarrollo y la reparación con nefronas humanos, sus progenitores, y la recolección de células de los conductos y el autoensamblaje de nefronas humanos en tres estructuras dimensionales en el cuerpo del ratón; el estudio de la reparación de daños en los islotes pancreáticos utilizando células madre / progenitoras pancreáticas derivadas de iPS, células madre embrionarias, o directamente reprogramadas. Los ejemplos de modificaciones del proceso incluyen: el control de los tejidos o lesiones de órganos con toxinas o productos químicos tales como retrorsina, estreptozotocina, o cisplatino para facilitar la competencia de las células del donante con células residentes; evitandodiferencial o la proliferación de la disminución con el fin de mejorar la capacidad proliferativa de las células del donante, promoviendo así la sustitución de las células receptoras, tales como ES o células derivadas IPS-; la selección de un trasplante de sitios adecuados y el control de la infusión de células para garantizar el trasplante eficiente, por ejemplo, mediante el portal o vena de la cola para el trasplante entopic y el mesenterio y de la cápsula renal para el trasplante ectópico; el análisis del estado de sustitución a través de la expresión de tejido u órgano proteínas secretadas representante de células madre / progenitoras o células trazado de trasplante y el cáncer de células inmaduras, tales como alfa fetoproteína ni transferrina.

En resumen, los ratones SCID Alb-TRECK / constituye un modelo adecuado para el trasplante de células madre hepática humana, ya que proporcionan un entorno beneficioso que permite la diferenciación en hepatocitos maduros. Este nuevo modelo tiene un tremendo potencial aplicativo, no sólo para la expansión ex vivo de hepatocitos humanos but también para pantallas de drogas y fármacos terapéuticos candidatos para pruebas de toxicidad en el hígado y el metabolismo. Además, estos resultados ayudarán en el avance de los futuros estudios que examinen la aplicación clínica de esta técnica para el trasplante de células hepáticas humanas.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human albumin Sigma A6684 Mouse
Human CK19 Dako M088801 Mouse
Human nuclei Millipore MAB1281 Mouse
Human CK8/18 Progen GP11 Guinea pig
CDCP1 Biolegend 324006 Mouse
CD90 BD 559869 Mouse
CD66 BD 551479 Mouse
GOT/AST-PIII Fujifilm 14A2X10004000009
DMEM/F-12 Gibco 11320-033
FBS Biowest S1520
0.05% Trypsin-EDTA  Gibco 25300-054
Diphtheria Toxin Sigma D0564-1MG
Human Albumin ELISA Kit Bethyl Laboratories E88-129
Syringe (1 ml) Terumo SS-01T
32G 1/2" needle TSK PRE-32013
O.C.T.Compound(118 ml) Sakura Finetek Japan 4583
MoFlo high-speed cell sorter Beckman Coulter B25982
DRI-CHEM 7000 Fujifilm 14B2X10002000046

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References

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Zhang, R. R., Zheng, Y. W., Taniguchi, H. Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells. J. Vis. Exp. (114), e54167, doi:10.3791/54167 (2016).

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