Protocol
Alla djurexperimentella förfaranden genomfördes i enlighet med djurskydds riktlinjer för Yokohama City University.
1. Generering av akut leverskada musmodell
- Tillsätt 1 ml fenol 0,85% NaCl-lösning (0,6 g fenol i 100 ml 0,85% NaCl-lösning) och 1 mg difteritoxin (DT) för att göra en 1 mg / ml DT förrådslösning. Notera: DT vid en koncentration av 1 mg / ml kan förvaras under ca 2 år vid 3 ° C till 8 ° C.
- Seriellt späda ut 1 mg / ml DT stamlösning till 0,3 | j, g / ml DT i fenol 0,85% NaCl-lösning och förbereda en alikvot av 0,3 | ig / ml DT lösning såsom en arbetslösning. Obs! Denna arbetslösning bör vara nyberedd.
- Att genomföra experiment med användning av en subletal dos (~ 50% letalitet), administrera 8 veckor gamla möss en 1,5 | ig / kg dos av DT.
- Utför en intraperitoneal injektion av DT genom att hålla musen i rygg VILA och infoga needle under böj knäna, till vänster eller höger om mittlinjen. Undvik mittlinjen för att förhindra inträngning av urinblåsan. Vinkel nålen vid ca 45 ° i förhållande till kroppen.
- Med användning av en insulinspruta, injicera möss med 100 pl av nyframställd 0,3 | ig / ml DT per 20 g mus vikt. Till exempel bör en 18-g mus erhåller 90 | il av 0,3 | ig / ml DT-lösning.
- Vid 48 h efter DT injektion, samla blod från svansvenen genom att placera musen i fixeringsutrustning och värmer musen svansen i en 37 ° C vattenbad i ca 10 min för att vidga blodkärlen. Sedan gör en 1-mm nick i svansen 2 cm från spetsen med en vass skalpellblad och samla in blod med en microcapillary rör.
- Centrifugera microcapillary röret innehållande blod vid 1500 xg under 5 min och samla upp serumet genom att separera supernatanten och cellpelleten.
- Pipett 50 ul av 1:20 utspätt musserum på GOT / AST-PIII glider. Mät absorbansen hos reaktionsprodukten (blått färgämne) vid 650 nm med användning av en multi-purpose automatisk torr kemianalysator enligt tillverkarens protokoll.
OBS! Utläsning av aspartataminotransferas (AST) / glutaminsyra-oxalättiksyra-transa (GOT) aktivitet visas automatiskt. 2 dagar efter DT injektion, ungefär 60% av mössen uppvisade AST värden mellan 12.000 - 16.000 IU / L och ansågs lida av akut leverskada. Dessa möss överfördes till en ny bur och användes som celltransplantationspatienter.
2. Framställning av humant lever stamceller
- Isolera humana lever stamceller från mänskliga primära fetala leverceller med en cellsorterare med hjälp av cellantigener CDCP1, CD90 och CD66 för att erhålla en CDCP1 + CD90 + CD66- subpopulation, sedan frö den isolerade cellpopulationen på kollagen IV-belagda odlingsskålar, som tidigare rapporterats 15. Använda humana primära fetala leverceller av en embryonalålder mellan vecka 14 och 18.
- Samla mänskliga lever stamceller odlade till 80% - 90% sammanflödet på 100 mm odlingsskålar, aspirera odlingsmedium, tvätta cellerna med 10 ml PBS, och sedan ta bort PBS. Trypsinize cellerna med 2 ml 0,05% trypsin / EDTA-lösning under 5 minuter vid 37 ° C. Obs: Celler på mer än 90% sammanflödet är inte lämpliga för celltransplantation, eftersom celldifferentiering kan påverka deras proliferativa förmåga hos möss.
- Övervaka status för cellen dispersion under ett mikroskop. När cellerna tycks vara flytande eller flödar fritt, stoppa den enzymatiska digestion genom tillsats av 8 ml av DMEM / F12 innehållande 10% FBS.
- Suspendera cellerna långsamt med hjälp av en 10-ml serologisk pipett och överföra celler till en 15-ml koniska rör. Centrifugera cellerna under 5 minuter vid 100 xg och 4 ° C.
- Noggrant resuspendera cellpelleten i 10 ml DMEM / F12 innehållande 10% FBS och bestämma cellantal med hjälp av ett mikroskop räknekammare.
- Dela upp cellerna i 1,0 x 10 6 celler per 50 pl PBS portioner för varje enskild mus och förvara på is tills transplantation.
3. mjälten Transplantation av mänskliga lever stamceller
- Placera en ren bur på en 37 ° C elektrisk värmedyna.
- Söva musen med isofluran inandning (1-1,5% (vol / vol) i två liter syre per minut) genom att placera den under munstycket. Alternativt använder rör innehållande gasväv indränkt med isofluran.
- Se till att musen bedövas genom att lätt klämma den bakre trampdynan. Om ett knä ryck framkallas, placera musen tillbaka i kammaren. Använd veterinär salva på ögonen för att förhindra torrhet under narkos.
- Raka operationsområdet med elektriska hårklippnings och applicera 70% (vol / vol) etanol och povidon-jod för att sterilisera. Sedan göra en 1-cm hudsnitt i vänster flank just nedanför revbensbrosk gränsen av ribborna, följt av en incision påbukväggen, liksom bukhinnan.
- Noggrant exponera mjälten. Använda en 100-ul mikroinjektion spruta med en 32-G 1/2-tums nål för att direkt injicera 1,0 x 10 6 humana hepatiska stamceller i 50 | j, l PBS i mjälten hos varje mus. Luta nålen vid en 5 ° vinkel för injektion.
- Se till att djupet av injektion är mindre än halva tjockleken av mjälten. Nålen ska matas in i mjälten vid en ände (huvudet) och deponera cellerna vid den andra änden (svansen).
- För att förhindra läckage av cellerna efter injektion, tryck försiktigt med ett finger i 2 minuter och sedan ta bort nålen.
- Placera mjälten tillbaka i musen kroppen och stänga kaviteten med en normal drift sutur för muskulaturen och huden.
- Överföra mössen in i en 37 ° C förvärmda bur omedelbart efter transplantation. För att säkerställa att musen är i stånd att andas bekvämt, placera musen på dess sida i buren, entömning kontakt mellan buren sängkläder och platsen för kirurgi.
- Övervaka mössen tills bedövningen avtar för att säkerställa att suturer förblir stängda och mössen återgå till före kirurgi förhållanden.
- Säkerställa möss är försedda med normalt dricksvatten och mat. Efter 1 h, tillbaka buren till musen rummet av djuret centrum och övervaka mössen dagligen.
4. Detektion av transplanterade Human Hepatic Stem Cell-Derived Hepatocyter i muslever
Obs! För följande procedurer avliva alla djur med hjälp av en överdos av ketamin och xylazin följt av halsdislokation.
- Vid 4 - 6 veckor efter transplantation, avliva möss och öppna bukhålan genom att samtidigt skära cutis och fascia med kirurgiska saxar.
- Dissekera bindväven ovanför bukhinnan, med hjälp av en sax som en spridare, och skär bukhinnan längs linea alba att öppna den peritonealahålighet.
- Lyft bröstbenet med pincett, punktera membranet, och skär genom varje sida av bröstbenet upp genom cervikal gördel.
- Avskära hålvenen på bröstsidan av levern och dra matstrupen genom levern i den främre riktningen. Ta bort membranet för att avlägsna levern.
Obs: Var noga med att hålla spetsarna på saxen pekade uppåt för att förhindra skador på bröstkorg organ under. Den tymus har en tendens att då och då hålla fast ryggsidan av bröstbenet och detta måste omsorgsfullt undvikas. - Med användning av membranet som ett handtag, börja dra levern ut ur bukhålan. Interiören hålvenen kommer att hålla levern på plats. Skär inre hålvenen; vara noga med att inte i förtid befria rätt adrenal.
Obs: Möss har fyra lober lever bestående av en median lob, vänster lob, höger lob, och caudatus lob. Gallblåsan är upphängd i den lilla bifurkationen avmedian lob. - Separera loberna från varandra vid föreningspunkterna och bädda in dem i optimal skärtemperatur (oktober) Förening enligt tillverkarens protokoll. Frysa oktober innehåller levervävnad i metallgaller på kryostaten.
- Klipp 5-um tjocka provsektioner med hjälp av en kryostat vid -18 ° C och montera dem på RT objektglas. Lagra lager vid -80 ° C. Förbered bilder för hematoxylin och eosin (H & E) och immunofluorescens färgning enligt tidigare rapporterade förfaranden 16.
5. detektion av humant albumin utsöndring och Beräkning av chimär Rate
- För att mäta human lever rekonstitution, utför humant albumin ELISA med användning av serum och en humant albumin ELISA-kit enligt tillverkarens instruktioner.
- Beräkna den humaniserade levern chimära hastighet genom realtids-PCR-analys av uttrycksnivåer i hela-humaniserad levern. Bestämma den relativa exförhållande pression nivå av humanspecifik aktin till human-mus-tvär aktin (förhållande 1) och förhållandet mellan mus specifik aktin till human-mus-tvär aktin (förhållande 2). Den chimära hastighet beräknas som förhållandet 1 / (förhållande 1 + förhållande 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alb-treck / SCID möss hepatocyter uttrycker human DT-receptorn HB-EGF-genen under kontroll av en albuminpromotorn och uppvisar cytotoxiska effekter efter DT administration 12. För att utvärdera effekterna av DT-behandling på leverskada, var DT doser på 1,5 pg / kg injicerades i 8 veckor gamla Alb-treck / SCID-möss och de patologiska förändringar i levern 48 h efter DT administrering var histologiskt bedömas. Jämfört med kontrollmöss (som inte behandlats med DT), DT-behandlade mössen uppvisade en oorganiserad lever arkitektur visar en korrigering för överbelastning med ökad serum AST-aktivitet. Dessutom hepatocyterna av DT-behandlade möss hade flera, djupt färgade acidofila cytoplasmiska inklusioner tillsammans med mörka kärnor (mest troligen apoptotiska hepatocyter); några andra hepatocyter verkade konserverade eller uppvisade en vakuoliserade cytoplasma med mörka kärnor med liten eller ingen portådern inflammation (Figur 1 12.
Mänskliga hPSCs kan användas för långsiktig in vitro odling och uppvisar enhetlig cellmorfologi med några ALB och färre CK19-positiva celler. Vid 6 veckor efter transplantation in mus lever, var den mänskliga hPSCs utsätts för grundläggande undersökning i mikroskop och utvärderas histologiskt; mänskliga hPSCs observerades ha rekonstituerade levern strukturen genom att byta ut de ursprungliga mus hepatocyter (Figur 2). Makroskopiskt vid 4 dagar efter mänsklig HpSC transplantation, små humana lever kluster som jämnt fördelade runt levern upptäcktes; vid 45 dagar efter transplantation, dessa hade frodats i stora kluster (Figur 3). Vemle muslevrar ombildade med humana hepatocyter betecknades "humaniserade lever." Dessa resultat tyder på att möss med dödlig fulminant leversvikt som genomgår human HpSC transplantation kan uppvisa lever strukturer som liknar dem som observerats i normala möss lever.
Före testning huruvida de omogna humana hepatocyter som transplanterats in i möss hade potential för differentiering och kunde fungera in vivo, närvaron av humana hepatocyter i muslevrar först bekräftades genom immunhistokemisk analys på ca 6 veckor efter human HpSC transplantation. Leversektioner från möss med 60% humant cellrepopulation som specifikt och positivt samarbete färgade med humana kärnor och mänsklig cytokeratin 8/18 (Ck8 / 18) antikroppar befanns innehålla givar-cellerna humana hepatocyter, medan den ursprungliga kontrollmöss lever var negativ för dessa markörer (Figur 4).
in vivo, var uttrycket av humant albumin (ALB) och humant cytokeratin 19 (CK19) bedömas immunhistokemiskt. Humana HpSC-härledda humana hepatocyter var väl differentierade i musen lever och uppvisade uppreglerade human ALB uttryck. Humana ALB-positiva och CK19 negativa hepatocyter liknade funktionella hepatocyter, medan celler som positivt samar färgade med humant ALB och CK19 uppvisade bipotential kapacitet för differentiera till hepatocyter och cholangiocytes (Figur 5). En storskalig scanning metod som används för att analysera alla mänskliga HpSC-härledda humaniserade leverlober avslöjade närvaron av flera runda och koloniliknande kluster kring leverlober med tydliga mänskliga kärnor och CK8 / 18 uttryck (figur 6), vilket visar koloni bildande förmåga av mänskliga hPSCs i de humaniserade levrar. Återplantering nivå nådde upp till 90%en månad efter transplantation (Figur 7A) och humant albumin utsöndring detekterades i den nyinsatta möss lever (Figur 7B), vilket tyder på att de mänskliga hPSCs framgångsrikt kunde rekonstruera Alb-treck / SCID muslever. Dessa resultat visar att mänskliga hPSCs har hög potential för differentiering till funktionella leverceller in vivo som svar till undsättning av defekta mus leverfunktioner.
Figur 1. Lever skador uppstår i Alb-Treck / SCID (toxin receptormedierad Cell Knockout) möss efter difteritoxin (DT) injektion. Histologi (hematoxylin-eosin färgning) av mus lever utan och med DT administration efter 48 timmar. DT dos: 1,5 mikrogram / kg, serum AST-aktiviteten av normal lever (till vänster): 30 IU / L; serum AST-aktiviteten av DT-behandlade lever (högra panelen): 15000IU / L. Skalstreck = 100 nm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Transplantation av mänskliga lever stamceller i Alb-Treck / SCID möss med fulminant leversvikt. Makroskopisk vy (till vänster) och histologisk analys (hematoxylin-eosin färgning, högra panelen) av humaniserade lever med mänskliga hPSCs vid 6 veckor efter transplantation . m, muslever region; h, human donatorcell härrörande human region. Skalstreck = 100 nm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
<br /> Figur 3. Makroskopisk analys av humaniserade Lever härrör från humanlever stamceller märkta med grönt fluorescerande protein. hög förstoring bilder av levern struktur 4 dagar (till vänster) och 45 dagar (högra panelen) efter transplantation med humant lever stam celler (hPSCs). Humana lever stamceller (hPSCs) märktes med förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) med en lentivirus vektor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Karakterisering av humant lever Stem Cell-Derived humanhepatocyter i Alb-Treck / SCID möss. Immunhistokemisk analys att skilja mellan humana hepatocyter färgade med anti-humant CK8 / 18 (grön) antigen och anti-h Uman nukleär antigen (aquablått) i humana lever stamceller som härrör humaniserade lever på 6 veckor efter transplantation. m, muslever region; h, humant donatorcell härrörande human lever-regionen. Vit streckad linje: muslever regionen kontra mänskliga levern regionen. Kärnor motfärgades med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (blå). Skalstrecken = 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Human lever stamceller Differentiering i humaniserade Lever av Alb-Treck / SCID möss. Immunohistokemisk analys av humant albumin och human CK19 i HpSC-härledda lever på 6 veckor efter transplantation. Kärnor motfärgades med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (blå). Skalstrecken = 100 ^ m.jove.com/files/ftp_upload/54167/54167fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Flera Kluster av Human lever Stem Cell-härledda celler är närvarande i Alb-Treck / SCID möss med humaniserade Lever. Flera stora kluster som härrör från mänskliga leverstamceller identifierades i levern loberna på 6 veckor efter transplantation av immunohistokemisk analys för mänsklig CK8 / 18 (grön) och humant kärnor (aqua blå). Skalstrecken = 1000 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. HumaniseradLever Återplantering Betygsätt och Humant albumin utsöndring i Alb-treck / SCID möss. (A) chimär hastighet i Alb-treck / SCID möss en månad efter human lever stamcellstransplantation; data presenteras som medelvärde ± SEM (n = 12). Mann-Whitney test: P <0,0005 för Sham och mänskliga hPSCs (B) Detektion av humant albumin i musserum en månad efter donatorcelltransplantation.. Data = medelvärde ± SEM (n = 5). Mann-Whitney test: P = 0,0313 för Sham och mänskliga hPSCs. ND: odetekterbar; Sham: möss som transplanterats med PBS; HpSCTx. Möss som transplanterats med mänskliga hPSCs klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nyligen genomförda studier har visat att muslever kan nyinsatta med humana hepatocyter, inklusive vuxna hepatocyter och proliferativa hepatiska stamceller 17. Dessa nyinsatta lever har använts som prekliniska experimentella modeller för läkemedelsmetabolism testning och läkemedelsforskning och -utveckling 18; dessutom har de gett en in vivo miljö för cellmognad och differentiering 19. Det stora målet med denna studie var att skapa en ny leversjukdom musmodell som tillät human omogen hepatocytproliferation, mognad och differentiering, för förvärv av läkemedelsmetabolism aktiviteter.
Loppet av mjälten transplantation har studerats ingående. Celler som transplanterats in i mjälten hos råttor och möss överlever hela deras genomsnittliga livslängd. Den mjälten transplantationsprotokoll har visat sig vara mycket användbar i att undersöka specifika frågeställningar;många laboratorier runt om i världen har försökt att utnyttja detta protokoll som en mycket reproducerbar och tillförlitlig modell för levercelltransplantation på grund av den förbättrade möss överlevnad och leverregenerering. Emellertid implantera celler in i mjälten massa utgör en risk, eftersom de flesta implanterade cellerna kommer att translokera till levern där de kan ockludera portal grenar. Även om denna ocklusion kan vara tillfällig och kan inte påverka en frisk lever miljö, i fall av redan existerande leverskador, kan denna procedur ytterligare minska leverfunktionen och öka portal hypertension och kan också påverka cell engraftment negativt. Även om vi framgångsrikt har tillämpat hepatocyte transplantation med hjälp av mjälten transplantation, flera frågor motiverar ytterligare undersökning, särskilt föremål för potentiella nya cellkällor. Dessutom, när du utför mjälten hepatocyte transplantation av cellbelastning gränsen måste följas strikt för att förhindra potentiella störningar avkvarleva levermikrocirkulationen. DT-receptorn har identifierats som en membranförankrad form av den heparinbindande EGF-liknande tillväxtfaktor (HB-EGF-prekursor) 20. Medan HB-EGF prekursorer härledda från toxinkänsliga djur, såsom människor och apor, binder DT och fungerar som toxinreceptorer, HB-EGF prekursorer från möss och råttor inte binder DT 21. Det transgena Alb-Treck / SCID-musmodellen uttrycker humana HB-EGF-liknande receptorer under kontroll av en levercellspecifik albuminpromotorn; efter administrering av DT, dessa möss utvecklar fulminant leversvikt på grund av villkorad ablation av leverceller, vilket ger utrymme för donatorcell hemvist och spridning. Humana hepatocyter, även vid en omogen fas, är kända för att ha omfattande fortplantningsförmågan in vitro, även om de förlorar sina läkemedelsmetabolism funktioner, vilket begränsar deras prekliniska applikationer 22. Histologiska och immunhistokemiska fynd som erhållits efter transplantation mänskliga hPSCs i Alb-Treck / SCID-möss med dödlig fulminant leversvikt visade att mänskliga hPSCs kunde expandera och återskapa skadade muslever strukturer; återplantering hastigheten i vissa möss var nästan 100%.
I våra experiment, humant HpSC transplantation främjas mus överlevnad och resulterade i ökad sekretion av humant ALB in i mus-sera 16. Dessa celler mognat också och differentierad in vivo och uppvisade human läkemedelsmetabolism aktiviteter, vilket tyder på att humana HpSC-härledda humaniserade möss lever liknar mogna och funktionella "mänskliga organ" och har potentiella tillämpningar inom läkemedelsutveckling. Dessa resultat bekräftar vidare att Alb-Treck / SCID-mus är en idealisk modell för humaniserad lever generation. Trots utsikterna och fördelarna med Alb-treck / SCID-möss som en idealisk modell för human lever stamceller som härrör humaniserad lever generation, de har en unik nackdel; när mänsklig annonsult hepatocyter transplanterades in i tre Alb-Treck / SCID-möss som behandlats med en enda dos av DT har inga humaniserade levrar genereras, möjligen beroende mänsklig vuxna hepatocyter saknar fortplantningsförmåga. Ytterligare doser av DT kan inte ges efter transplantation av vuxen människa hepatocyte; eftersom DT-receptorn (HB-EGF) i Alb-treck / SCID-möss hepatocyter är under kontroll av albuminpromotorn, ytterligare DT behandling kommer att förstöra de transplanterade humana vuxna hepatocyter i muslever.
Så vitt vi vet är detta den första modellen för att generera en humaniserad levern från omogna humana celler. Cell ersättningsnivån efter transplantation påverkas av mottagaren mikromiljön (t.ex. lever nisch) och donatorcellegenskaper, såsom mogen vs. omogen och proliferativ och differentierad kapacitet. Kombinera Alb-Treck / SCID med stamcellstransplantation kommer att ge optimerade betingelser och fördelar för produktion av humantized levrar. Detta utgör också ett kraftfullt verktyg för transplantation av fetala leverceller och potentiellt samt iPS eller ES-härledda hepatiska celler eftersom före DT behandling, Alb-Treck / SCID djur hålls i ett hälsosamt tillstånd, är inducerbar leverskador på någon punkt, och mössen föda normalt utan njurskada. Däremot uPA / SCID-möss uppvisar hög neonatal mortalitet och är svåra att odla. Dessutom kan överuttryck av urokinas i djuren leda till allvarlig blödning och njurskador och därför finns det en begränsad möjlighet för celltransplantation före avvänjning; Alb-Treck / SCID kan användas för celltransplantation i alla åldrar.
Den framgångsrika generationen av en humaniserad lever mus kräver följande kritiska steg: 1) Leverskada bör begränsas till subletala nivåer (vanligtvis genom att använda den dödliga dosen, 50%); 2) De humana primära fetala leverceller bör bibehållas i en sub-sammanflytande status inte är större än 90%;3) Cell läckage efter mjälten transplantation bör förhindras; och 4) Halterna av humant albumin i mussera ska övervakas med jämna mellanrum. En omfattande förståelse av de kritiska faktorerna som är inblandade i processen för humaniserad muslever generation kan bidra till ytterligare ändringar eller ny utveckling som använder råttor eller andra djur. Möjliga anpassningar inkluderar: induktion av njurskada för att undersöka utveckling och reparation med mänskliga nefroner, deras föregångare, och samla kanalceller och självorganisering av mänskliga nefroner i tredimensionella strukturer i musen kroppen; studera reparation av holmen skada i bukspottkörteln använder bukspottskörteln stam / progenitorceller som härrör från direkt omprogrammeras, IPS, eller ES-celler. Exempel på processmodifieringar inkluderar: kontrollerande vävnad eller organskada med gifter eller kemikalier såsom retrorsine, streptozotocin, eller cisplatin för att underlätta konkurrens av givarceller med inhemska celler; undvikerdifferential eller minska spridning i syfte att öka den proliferativa förmågan hos donatorceller, vilket främjar utbyte av mottagarceller, såsom ES eller IPS härledda celler; välja en lämplig transplantations platser och kontrollera cell infusion för att säkerställa en effektiv transplantation, till exempel, med användning av portalen eller svansvenen för entopic transplantation och tarmkäxet och njurkapsel för ektopisk transplantation; övervaka ersättningsstatus via uttryck av vävnad eller organ utsöndrade proteiner representativa för stam / progenitorceller eller omogna celler transplantation och cancercellen spårning, såsom alfa-fetoprotein eller transferrin.
Sammanfattningsvis, Alb-treck / SCID möss utgör en lämplig modell för human lever stamcellstransplantation, eftersom de ger en gynnsam miljö som gör det möjligt för differentiering till mogna hepatocyter. Denna nya modell har en enorm applikativ potential, inte bara för ex vivo expansion av humana hepatocyter bUT även för drogskärmar och testa kandidat terapeutiska läkemedel för levertoxicitet och metabolism. Dessutom kommer dessa resultat underlätta utvecklingen av framtida studier som undersöker den kliniska tillämpningen av denna teknik för människors levercelltransplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human albumin | Sigma | A6684 | Mouse |
| Human CK19 | Dako | M088801 | Mouse |
| Human nuclei | Millipore | MAB1281 | Mouse |
| Human CK8/18 | Progen | GP11 | Guinea pig |
| CDCP1 | Biolegend | 324006 | Mouse |
| CD90 | BD | 559869 | Mouse |
| CD66 | BD | 551479 | Mouse |
| GOT/AST-PIII | Fujifilm | 14A2X10004000009 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320-033 | |
| FBS | Biowest | S1520 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Diphtheria Toxin | Sigma | D0564-1MG | |
| Human Albumin ELISA Kit | Bethyl Laboratories | E88-129 | |
| Syringe (1 ml) | Terumo | SS-01T | |
| 32G 1/2" needle | TSK | PRE-32013 | |
| O.C.T.Compound(118 ml) | Sakura Finetek Japan | 4583 | |
| MoFlo high-speed cell sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| DRI-CHEM 7000 | Fujifilm | 14B2X10002000046 |
References
- Muruganandan, S., Sinal, C. Mice as clinically relevant models for the study of cytochrome P450-dependent metabolism. Clin. Pharmacol. Ther. 83, 818-828 (2008).
- Nishimura, T., et al. Using chimeric mice with humanized livers to predict human drug metabolism and a drug-drug interaction. J. Pharmacol. Exp. Ther. 344, 388-396 (2013).
- Suemizu, H., et al. Establishment of a humanized model of liver using NOD/Shi-scid IL2Rgnull mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377, 248-252 (2008).
- Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am. J. Pathol. 165, 901-912 (2004).
- Hasegawa, M., et al. The reconstituted 'humanized liver'in TK-NOG mice is mature and functional. Biochem. Biophys. Res. Commun. 405, 405-410 (2011).
- Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah−/−/Rag2−/−/Il2rg−/− mice. Nat. Biotechnol. 25, 903-910 (2007).
- Rhim, J. A., Sandgren, E. P., Degen, J. L., Palmiter, R. D., Brinster, R. L. Replacement of diseased mouse liver by hepatic cell transplantation. Science. 263, 1149-1152 (1994).
- Haridass, D., et al. Repopulation efficiencies of adult hepatocytes, fetal liver progenitor cells, and embryonic stem cell-derived hepatic cells in albumin-promoter-enhancer urokinase-type plasminogen activator mice. Am. J. Pathol. 175, 1483-1492 (2009).
- Sharma, A. D., et al. Murine embryonic stem cell-derived hepatic progenitor cells engraft in recipient livers with limited capacity of liver tissue formation. Cell. Transplant. 17, 313-323 (2008).
- Peltz, G. Can 'humanized' mice improve drug development in the 21st century. Trends Pharmacol. Sci. 34, 255-260 (2013).
- Zhu, S., et al. Mouse liver repopulation with hepatocytes generated from human fibroblasts. Nature. 508, 93-97 (2014).
- Saito, M., et al. Diphtheria toxin receptor-mediated conditional and targeted cell ablation in transgenic mice. Nat. Biotechnol. 19, 746-750 (2001).
- Ishii, T., et al. Transplantation of embryonic stem cell-derived endodermal cells into mice with induced lethal liver damage. Stem Cells. 25, 3252-3260 (2007).
- Machimoto, T., et al. Improvement of the survival rate by fetal liver cell transplantation in a mice lethal liver failure model. Transplantation. 84, 1233-1239 (2007).
- Taniguchi, H., Zheng, Y. -W. Human hepatic stem cell, method for preparation of the same, method for induction of differentiation of the same, and method for utilization of the same. Japan Patent. , 5822287 (2015).
- Zhang, R. -R., et al. Human hepatic stem cells transplanted into a fulminant hepatic failure Alb-TRECK/SCID mouse model exhibit liver reconstitution and drug metabolism capabilities. Stem Cell Res. Ther. 6, 1-12 (2015).
- Strom, S. C., Davila, J., Grompe, M. Chimeric Mice with Humanized Liver: Tools for the Study of Drug Metabolism, Excretion, and Toxicity. Hepatocytes. , Methods in Molecular Biology; 640. Springer. 491-509 (2010).
- Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharm. Sin. B. 2, 549-561 (2012).
- Nowak, G., et al. Identification of expandable human hepatic progenitors which differentiate into mature hepatic cells in vivo. Gut. 54, 972-979 (2005).
- Naglich, J. G., Metherall, J. E., Russell, D. W., Eidels, L. Expression cloning of a diphtheria toxin receptor: identity with a heparin-binding EGF-like growth factor precursor. Cell. 69, 1051-1061 (1992).
- Mitamura, T., Higashiyama, S., Taniguchi, N., Klagsbrun, M., Mekada, E. Diphtheria toxin binds to the epidermal growth factor (EGF)-like domain of human heparin-binding EGF-like growth factor/diphtheria toxin receptor and inhibits specifically its mitogenic activity. J. Biol. Chem. 270, 1015-1019 (1995).
- Liu, Y., Yang, R., He, Z., Gao, W. -Q. Generation of functional organs from stem cells. Cell Regener. 2, 1 (2013).
