Abstract
Chirurgische parabiosis van twee dieren van verschillende genetische achtergronden creëert een unieke scenario naar cel-intrinsieke versus cell-extrinsieke rollen voor kandidaat-genen van belang, migrerende gedrag van cellen en uitgescheiden signalen in verschillende genetische instellingen te bestuderen. Omdat parabiotic dieren een gemeenschappelijke circulatie, zal geen bloed of bloed overdraagbare factor van het ene dier worden uitgewisseld met zijn partner en vice versa. Aldus kunnen cellen en moleculaire factoren afgeleid van één genetische achtergrond worden onderzocht in de context van een tweede genetische achtergrond. Parabiosis van volwassen muizen wordt veelvuldig gebruikt voor onderzoek veroudering, kanker, diabetes, obesitas, en hersenontwikkeling. Meer recent is parabiosis zebravis embryo gebruikt om de ontwikkelingsbiologie van hematopoiese bestuderen. In tegenstelling tot muizen, de transparantie van zebravisembryo's maakt de directe visualisatie van cellen in de context parabiotic, waardoor het een uniek krachtige methode voor het onderzoeken fundamental cellulaire en moleculaire mechanismen. De bruikbaarheid van deze techniek wordt echter beperkt door een steile leercurve voor het genereren van de parabiotic zebravisembryo's. Dit protocol wordt stap voor stap methode voor het operatief smelten de blastulae twee zebravis embryo's van verschillende genetische achtergronden van de rol van kandidaatgenen plaats onderzoeken. Bovendien, de parabiotic zebravis embryo tolerant hitteschok, waardoor temporele regulatie van genexpressie mogelijk. Deze methode vereist geen geavanceerde set-up en heeft brede toepassingen voor het bestuderen van celmigratie, het lot specificatie, en differentiatie in vivo tijdens de embryonale ontwikkeling.
Introduction
Oprichting van genetische mozaïeken (chimaera's) tussen wild-type en genetisch gemodificeerde dieren is een gevestigde en klassieke strategie voor het onderzoeken van cel-intrinsieke versus cell-extrinsieke functies van kandidaatgenen 1-6. Blastula transplantatie in zebravis is op grote schaal gebruikt om chimeer embryo voor studies van cel-autonome 7-9 genereren. Afhankelijk van het weefsel van belang, maar het kan lastig zijn om voorspelbaar richten donorcellen het gewenste weefsel (bijvoorbeeld bloed) 1-3, 7-9. Muis genetici hebben lang gebruikt parabiotic chirurgische methoden om samengevoegde organismen te genereren met een gezamenlijke oplage 10-14. Omdat de dieren parabiotic een gemeenschappelijke bloedbaan kunnen interacties tussen cellen die afkomstig zijn van een dier met cellen van de andere dieren van een andere genetische achtergrond te bestuderen 10-16. Onlangs, Karima Kissa de groep elegant aangetoond dat het vermogen om te createn Siamese zebravis embryo's en gebruik van dit systeem om hematopoietische stamcellen en voorlopercellen cel (HSPC) migratie 15 te bestuderen. Bovendien werd zebravis parabiosis onlangs gebruikt om de rol van endotheliale cadherine 5 in hematopoietische stamcellen (HSC) ontstaan en migratie, 16 onderzoeken en om de rol van stromale cellen in de HSPC niche bestuderen bij zebravis ontwikkeling 17.
In tegenstelling tot muizen, zebravis embryo's transparant zijn en de directe visualisatie van cellen tijdens parabiotic ontwikkeling, waardoor het systeem uniek krachtig. Het nut van parabiosis in de zebravis is echter beperkt door een steile leercurve, en parabiotic een operatie aan de delicate embryo's kunnen technisch uitdagende zonder gedetailleerde instructies en visuele demonstratie. Het doel van dit protocol is om een set van duidelijke, stap-voor-stap instructies voor het video-based tutorials over hoe je parabiotic zebravis embryo's voor het bestuderen van het genereren moet begeleidentemporale, cel-intrinsieke of extrinsieke cel-functies van een kandidaat-gen (en) van chirurgische fusie ontwikkelen blastulae. Belangrijkste wijzigingen en aanvullende aanbevelingen voor het verhogen van parabiont overleven en nieuwe experimentele toepassingen zijn inbegrepen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol werd goedgekeurd door het ziekenhuis Animal Care en gebruik Comite van Boston Children's. Dit protocol is een modificatie van een eerder gepubliceerde werkwijze 15.
1. Bereiding van reagentia (dagen of weken op voorhand)
- Bereid 1,5% agarose-beklede schalen. Voeg 1,5 g agarose tot 100 ml zebravis E3 medium in een erlenmeyer. Warmte, ontbinding van de agarose, en giet dan ongeveer 5 ml in diameter van 100 mm x 20 mm diep petrischaaltjes.
Opmerking: Deze worden gebruikt voor dechorionation embryo's (stap 3.1) en de parabiotic chirurgie (stap 3,3). WINKEL agarose-beklede schalen bij 4 ° C gedurende enkele weken; neem ze uit de koelkast en warm op de ochtend van de dag van de operatie parabiotic Rt. - Bereid 4% methylcellulose. Ontbinden 4 g methylcellulose poeder in 100 ml van de E3 in een erlenmeyer met een roerstaafje. Plaats de kolf op een roer plaat staan bij 4 ° C, op de laagste snelheid en laat het mixenmaximaal 2 dagen.
- Tussenpozen gebruik maken van een spatel te breken witte massa's van methyl cellulose. De methylcellulose kristallen niet volledig oplossen bij deze concentratie. Wanneer de oplossing helder en homogeen wordt zonder witte klonten resterende monster van de oplossing in 1,5 ml microfuge buizen en bevriezen bij -20 ° C voor langdurige opslag.
Opmerking: Lagere concentraties methylcellulose kan worden gebruikt; echter deze hogere percentage viskeuzer methylcellulose heeft opgeleverd beste resultaten.
- Tussenpozen gebruik maken van een spatel te breken witte massa's van methyl cellulose. De methylcellulose kristallen niet volledig oplossen bij deze concentratie. Wanneer de oplossing helder en homogeen wordt zonder witte klonten resterende monster van de oplossing in 1,5 ml microfuge buizen en bevriezen bij -20 ° C voor langdurige opslag.
- Bereid High Calcium Ringer-oplossing (HCR). Aan 400 ml van HCR oplossing te maken, meng 8 ml 5M NaCl (116 mm definitief), 400 ul van 3M KCl (2,9 mm finale), 800 ul van 5M CaCl2 (10 mM definitief), en 2 ml 1M HEPES (5 mM definitief) met 390 ml van E3 media.
Opmerking: WINKEL HCR oplossing bij 4 ° C gedurende enkele weken; warm op de ochtend van de dag van de operatie parabiotic Rt. - Bereid 5-6 aangepast Pasteurpipetten voor de overdrachtring blastula paren. Kort verwarmen eind van de pipet in een Bunsen brander. Dan, met grote tang, buig het uiteinde van de pipet tot ongeveer 45 ° C terwijl het nog heet.
- Om ervoor te zorgen dat er geen scherpe randen die embryo's kunnen beschadigen, houdt u de punt van de pipet kort in de vlam voor ongeveer 3 sec. Hierdoor worden de overgangen / polish het einde van de pipet. Deze gemodificeerde glazen Pasteur pipet wordt gebruikt in combinatie met een 10 ml pipet pomp (figuur 1) in stap 3.5.
- Bereid glazen naald hulpmiddelen voor chirurgische stikken van blastula paren. Trek 2-3 glazen naalden zoals voor micro-injectie van de zebravis embryo's. Gebruik lab-folie op elke glazen naald vast aan het einde van een hout- of kunststof steel plagen naald (Figuur 1A). Behulp van een tang, breek het uiteinde van de naald op een diameter van ongeveer 20-30 urn. Gebruik een micrometer deze stap (figuur 1B) te leiden.
NB: De omvang van het needle tip is belangrijk. Als de tip te groot is wordt het moeilijk om precies te controleren en kan overmatige slijtage veroorzaken. Als de tip te klein is is het moeilijk om voldoende verwonden embryo.
2. Het opzetten van broedparen van de zebravis en verzamelen van embryo's (dag -1 tot dag 0)
- Opzetten broedparen van volwassen zebravissen. Het opzetten van vis de avond voor de parabiosis operatie zal worden uitgevoerd. Gebruik verdelers om mannen en vrouwen te scheiden. Om de kans dat de gewenste embryo's zullen worden verkregen, het opzetten van verschillende paren van elke lijn te verhogen. We vinden dat doorgaans 20-50% van de paren paaien.
- De volgende ochtend, trek de verdelers en laat de paring. Verzamel elke embryo's met behulp van een fijnmazig theezeefje, breng ze over naar een petrischaal met E3 embryo medium 18.
- Micro-injecteren embryo's naar wens (bijvoorbeeld 25 pg plasmide-DNA, 200 pg mRNA, of met 1-6 ng morfolino) binnen 1 uur van de collectie. Laat zegroeien tot 256-cel stadium. Als de DNA-expressieconstruct onder de controle van een heat shock promoter is geplaatst (bijvoorbeeld hsp70, figuur 4B), de controle van de timing van genexpressie door warmte schokkende de parabionts bij 37 ° C in een later stadium (bijv. Bij 36 HPF ).
Opmerking: Als alternatief voor een fluorescerende transgen fluorescent dextran kan worden aan het DNA, RNA of morfolino injectie mengsel toegevoegd (bijvoorbeeld dextran, cascade blauw bij 2 mg / ml). De dextran kleurstof zal niet interfereren met de normale ontwikkeling en zal zorgen voor de geïnjecteerde embryo kan worden geïdentificeerd onder de desbetreffende tl-licht na parabiotic fusie. Als alternatief zou de parabiosis van een gepigmenteerde stam (bijvoorbeeld AB) met een niet-gepigmenteerde stam (bijv Casper) worden gebruikt om de geïnjecteerde embryo identificeren latere stadia. - Incubeer de embryo's bij 28,5 ° C.Use een stereoscoop om hun ontwikkeling regelmatig controleren als ze in de buurt van de 256-cel developmental fase (ongeveer 2,5 HPF).
Opmerking: Indien nodig, verschuiven embryo's op verschillende temperaturen om stadium matching tussen parabiotic partners (bv-morfolino geïnjecteerde embryo's ontwikkelen zich vaak langzamer dan hun un geïnjecteerd tegenhangers Het verschuiven van de VN-geïnjecteerde embryo's tot KT te waarborgen en tegelijkertijd de-morfolino geïnjecteerde embryo's worden geplaatst. bij 28,5 ° C zal resulteren in fasen af te stemmen na een paar uur van de ontwikkeling).
3. Productie van Parabiotic zebravis embryo's door Surgical Fusion of Developing Blastulae
- Aangezien het embryo naderen de 256-cellig stadium (ongeveer 2,5 HPF), breng de embryo's van elke genetische achtergrond (dat wil zeggen, genetische mutant, transgene lijnen en / of genetische manipulatie) in afzonderlijke agarose beklede schalen (bijvoorbeeld een schotel voor morfolino- geïnjecteerde embryo's en een tweede gerecht voor controle embryo's). Alternatief: breng de embryo's schoon te maken, krasvrij glas bekers of glazen petrischaaltjes.
Opmerking: Vermijd het gebruik van ongecoate plastic schaaltjes als de embryo's zal vasthouden aan het plastic en eenmaal beschadigd worden uit hun chorions. - Decanteer de E3 media tot net voldoende vloeistof blijft de embryo dekking (ongeveer 7-10 ml). Voeg 200 ul van 50 mg / ml mengsel van proteasen geïsoleerd uit de extracellulaire vloeistof van Streptomyces griseus (proteasen). Zwenk de embryo's zachtjes om de paar minuten.
- Bij 50% van de embryo's uit hun chorions, wat gewoonlijk 5 gekomen - 10 minuten, spoel ze driemaal met een royale (ongeveer 15 - 20 ml) vers E3 embryo medium.
- Dechorionate geen embryo's die nog in hun chorions door ze voorzichtig opstellen in de gewijzigde glas Pasteur pipet en vervolgens voorzichtig het wegnemen van hen. Zodra de embryo's zijn dechorionated en gewassen, vervang de E3 media met HCR-oplossing. Als alternatief voor proteasen, verwijderen chorions handmatig met een fijne pincet. Doel om 60 hebben - 100 dechorionated embryo's beschikbaar voor elke experimentele conditie.
Opmerking: Het is verscheidene malen meer dan uiteindelijk worden gebruikt, maar veel embryo's waarschijnlijk tijdens behandeling of de operatie voor parabiosis beschadigd. Zodra de embryo's worden dechorionated, houd ze onder water en laat ze niet naar de oppervlakte te raken van het water, omdat de oppervlaktespanning zal ervoor zorgen dat ze worden vernietigd. Houd er rekening mee dat het gebruik van een hogere dosis van proteasen kan de embryo's uit hun chorions eerder en op een meer synchroon te komen. Bij gebruik van een lagere dosis van proteasen, de embryo duurt langer uit hun chorions en wel in een lager synchrone wijze, wat kan resulteren in een deel van de embryo beschadiging door langdurige blootstelling aan proteases.
- Dechorionate geen embryo's die nog in hun chorions door ze voorzichtig opstellen in de gewijzigde glas Pasteur pipet en vervolgens voorzichtig het wegnemen van hen. Zodra de embryo's zijn dechorionated en gewassen, vervang de E3 media met HCR-oplossing. Als alternatief voor proteasen, verwijderen chorions handmatig met een fijne pincet. Doel om 60 hebben - 100 dechorionated embryo's beschikbaar voor elke experimentele conditie.
- Bij 50% van de embryo's uit hun chorions, wat gewoonlijk 5 gekomen - 10 minuten, spoel ze driemaal met een royale (ongeveer 15 - 20 ml) vers E3 embryo medium.
- Ontdooi de methylcellulose (gemaakt in stap 1.2 hierboven) en centrifuge in een tafelblad centrifuge op maximale snelheid gedurende 10 min om onopgeloste kristallen die de embryo's zal beschadigen of scheuren hun dooier pellets.
- Na centrifugatie, gebruikt de heldere bovenste deel (ongeveer 75% van het volume). Transfer 1-1,5 cm diameter druppels methylcellulose in een 1,5% agarose beklede petrischaal. Let er op dat de opstelling van een van de gepelleteerde kristallen uit de bodem van de buis.
- Gebruik marker om de positie van elk druppeltje vooraf bepalen aan de onderzijde van de schaal. Place 12-15 druppels (2-3 porties ter waarde) methylcellulose per 100 mm petrischaal. Bereid zoveel platen als nodig per experiment.
Opmerking: Gebruik elke druppel voor de fusie van een enkele blastula paar. Het merk zal de locatie van elke druppel zodra de media wordt toegevoegd-op welk punt de druppels worden bijna onzichtbaar te wijzen.
- Bereid een 40 ml aliquot van antibiotica aangevuld HCR oplossing per-agarose gecoate schaal hierboven bereid in Stap 3,3. Aan elke 40 ml van HCR add penicilline-streptomycine bij 50 U / ml ampicilline bij 50 U / ml en kanamycine bij 0,5 ug/ Ml.
- Als u klaar bent om te blastula fusies uit te voeren, zorgvuldig te vullen elk van de gerechten die methylcellulose druppels met 40 ml van het antibioticum aangevuld HCR-oplossing. Als de HCR oplossing te snel wordt toegevoegd, kan het de druppels verstoren.
- Bevestig de gewijzigde glas Pasteur pipet (gemaakt in stap 1.4 hierboven) om een 10 ml pipet pomp. Onder een stereoscoop verzamelen één dechorionated embryo uit elke achtergrond (bijvoorbeeld één-morfolino geïnjecteerd embryo en één wild-type embryo).
- Vóór het afgeven van de twee embryo Gebruik de Pasteur pipet een kleine holte in het midden van de methylcellulose druppel maken vervolgens voorzichtig zowel embryo's in de holte te deponeren.
Opmerking: Tijdens het overdrachtsproces, zet de Pasteur pipet iets omhoog zodat de embryo regelen in de bocht van het Pasteur pipet teneinde het contact maken met het oppervlak van de vloeistof aan de bovenkant of onderkant van de pipet (vermijden die kan leiden naar their breuk).
- Vóór het afgeven van de twee embryo Gebruik de Pasteur pipet een kleine holte in het midden van de methylcellulose druppel maken vervolgens voorzichtig zowel embryo's in de holte te deponeren.
- Onmiddellijk na het afzetten van de embryo's in de methylcellulose, gebruik dan een hout- of kunststof-behandeld plagen naald met een gel-loading pipet tip over het einde (Figuur 1A) om zorgvuldig de positie van de embryo's in de methylcellulose dat hun dier polen zijn direct raken elkaar.
- Maak gebruik van zachte vegende bewegingen door de methylcellulose in de buurt van de embryo's om ze te verplaatsen zonder ze aan te raken. Laat de embryo's te zitten voor 5 minuten zodat de methylcellulose zal vestigen in om hen heen. Gedurende deze tijd, laadt u het volgende paar naar een andere druppel.
Opmerking: Vermijd direct contact met de embryo's en er vooral voor dat een deel van de dooierzak, die gemakkelijk zal scheuren niet aan te raken.
- Maak gebruik van zachte vegende bewegingen door de methylcellulose in de buurt van de embryo's om ze te verplaatsen zonder ze aan te raken. Laat de embryo's te zitten voor 5 minuten zodat de methylcellulose zal vestigen in om hen heen. Gedurende deze tijd, laadt u het volgende paar naar een andere druppel.
- Met behulp van de glazen naald tool, voorzichtig gewonden elk embryo tot hun aanspreekpunt. Met een zachte naai beweging kunnen cellen van de eerste embryo worden getrokken in de tweede embryo en weer terug.Aan het einde van deze beweging, houd de naald in de plaats voor 2 - 3 sec en dan trek het weg heel langzaam.
Opmerking: Er is een periode van ongeveer 2-3 seconden na de embryo gewond waar de twee weefsels lijken lijm en meer kans te hechten aan elkaar te zijn. Zo zijn wij van mening dat het houden van de naald op zijn plaats kort na verwonding helpt om de gewonden weefsels van elk embryo in contact voor de eerste periode onmiddellijk na verwonding te houden. - Laat deze embryo's te zitten voor 10-15 minuten bij kamertemperatuur. Intussen blijven nieuwe paren in andere druppels methylcellulose steek. Na 10-15 min, beoordelen of het eerste paar verbonden (figuur 2A) is gebleven.
Opmerking: Als de embryo langer zijn bevestigd, herhaalt het stiksel werkwijze zolang de embryo jonger dan rond 30% epiboly fase. Meestal dit zorgt voor maximaal drie pogingen om de embryo samenvoegen. Als de embryo's lijken een bijlage, maar de c te hebben gehandhaafdDownloaded from www.vandenborre.be Basisaansluitingen niet substantieel, voert de aanvullende stiksel aan de rand van de verbinding te versterken. Vermijd schudden of verplaatsen gerechten tijdens de parabiotic operatie en incubatietijd.
Opmerking: Ondanks hun vroeg ontwikkelingsstadium en waargenomen kwetsbaarheid kan de celmassa's van het embryo een aanzienlijke hoeveelheid manipulatie (bijv verwonding en stikken) tolereren en nog steeds normaal te ontwikkelen. De dooier, echter kan scheuren met alleen de geringste aanraking, waarbij het embryo. Wanneer stiksels twee blastulae de glazen naald, niet in contact met de interface tussen de celmassa en dooier van elk embryo maken. - Incubeer de embryo's O / N bij 28,5 ° C in dezelfde schotel en media (niet de media niet veranderen). Tegen de volgende ochtend, zal de embryo's uit zijn verhuisd van de veelal opgelost methylcellulose druppels. Verwijder alle embryo's die niet met succes werden gefuseerd. Giet de media en te vervangen door een nieuwe 25 ml E3.
Opmerking: Als het werken met eengepigmenteerde stam, voeg 500 ul 0,15% (50x) fenylthioureum (PTU) tot een eindconcentratie van 0,003% tot pigmentatie te blokkeren. Embryo's zal moeten voortdurend blijven PTE tot onderdrukking van de pigmentatie te handhaven.
4. Microscoop Setup, Image Acquisition, verwerking en analyse
- Bereid 0,8% laag smeltpunt (LMP) agarose: Voeg 0,8 g LMP agarose tot 100 ml E3 en verhit tot het volledig is opgelost. De hete oplossing aliquot 1 ml LMP agarose in 1,5 ml microfuge buizen in een 37 ° C verwarmingsblok. De LMP agarose wordt gesmolten bij 37 ° C blijven. Voeg 40 gl 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricaïne aan elke 1 ml van LMP agarose bij 37 ° C. Opmerking: Als het werken met een gepigmenteerde stam, voeg 20 pl 0,15% (50x) PTU elk 1 ml aliquot.
- Bewaar de resterende LMP agarose enkele maanden in gesloten 50 ml buizen bij 4 ° C.
- Verdoven parabiotic embryo's worden afgebeeld door toevoeging van 1 ml van 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricaïnede 25 ml van E3 dat de embryo zich reeds bevindt.
- Zwenk het gerecht, zodat de embryo's zal zwembad in het midden. Dan, met behulp van een breed-getipt plastic overdracht pipet het opstellen van de embryo's in zo weinig vloeistof mogelijk. Draai de pipet rechtop en zachtjes stuiteren van de embryo's, zodat ze af te wikkelen naar de bodem van de pipet.
- De embryo's in de bodem van de pipet, overbrengen naar een 1 ml portie van LMP agarose door licht aanraken van de pipet op het oppervlak van de agarose. Vermijd het overbrengen van overtollige vloeistof, omdat dit zal de agarose verdunnen.
- Na het verdrijven van de overtollige vloeistof uit de pipet, gebruikt u de pipet om de embryo's meng binnen de agarose, gebruik dan de pipet om alle agarose en embryo's over te brengen naar de bron van een glazen bodem (nr 1,5 dekglaasje), 6- well plaat.
Opmerking: Zorg ervoor dat de pipet gooi deze na de overdracht van de embryo's naar de beeldvormende plaat. Resterende agarose wordt ingesteld binnen de pipet, rendering ineffectief voor verder gebruik. In plaats daarvan gebruik maken van een nieuwe pipet elke keer. - Onder een stereoscoop, gebruik dan een aan het uiteinde van een hout behandeld teasing naald vaste gel-loading pipet tip om de embryo's terug naar de dekking van glas te plaatsen (om ervoor te zorgen dat ze zich binnen de werkafstand van de microscoop objectief) en in de gewenste richting voor beeldvorming.
Opmerking: Verplaats continu totdat de agarose volledig is ingesteld. Zorg ervoor dat de parabiotic embryo mount volgens welke embryo van het paar wordt afgebeeld. Gezien de willekeurige oriëntatie van de samengevoegde embryo voor sommige paren het moeilijk om zowel het embryo kan zijn. In dit scenario te herstellen van de embryo's uit de agarose met behulp van een pincet en een breed-getipt plastic overdracht pipet en vervolgens monteer voor de beeldvorming vanuit een ander perspectief. - Zodra de agarose is ingesteld, bedek met 2-3 ml E3 aangevuld met tricaïne (PTU en indien nodig).
- Beeld de embryo's met een omgekeerde wide-field epi-fluorescentie, laser-scannen confocale of draaiende schijf confocale microscoop. Selecteer de doelstelling meest geschikt is voor de gewenste beeldvorming. Dat de hele embryo gezichtsveld, gebruik een 4x objectief. Selecteer een sterkere vergroting, zoals een 20x objectief om beeld een specifiek weefsel 16, 19.
Opmerking: Bij gebruik van een rechtopstaande microscoop, monteren in LMP agarose (vergelijkbaar met boven) op een glazen afdekplaat slip. Keer de glazen dekglaasje op een glazen microscoopglaasje dat een ring van vacuüm vet gevuld met dezelfde E3-tricaïne-PTU 16, 19 heeft. - Proces verkregen beelden met behulp van gratis beeldanalyse softwarepakketten zoals NIH Image J / Fiji 16, 19.
Let op: Tel het aantal cellen en kwantificeren van de dynamiek zoals mobiele migratie en celdeling met behulp van segmentatie en het bijhouden van algoritmes 16, 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Consistent met eerder gepubliceerde studies 15, parabiotic succesvolle fusie van zebravisembryo's afhankelijk van de staging en oriëntatie van de twee embryo en de concentratie van methylcellulose. Met slechts een paar eenvoudige, goedkope instrumenten, chirurgisch gefuseerd ontwikkelen blastulae werden gegenereerd die uitgroeide tot parabiotic embryo's met gedeelde omloop. Deze instrumenten omvatten een gemodificeerd Pasteur pipet, een 10 ml pipet pomp en hout behandeld plagen naalden die alleen of met een van lab-film eind vaste gel-lading-punt of glazen micro-injectie naald (figuur 1) gebruikt.
Na het plaatsen van de twee blastulae in 4% methylcellulose en gebruik van de gel-lading-punt hen oriënteren hun dierlijke polen tegenover elkaar (figuur 2A) werden de embryo's zorgvuldig gewonden op het punt waar de glazen micro-injectie needle (Figuur 2B). Een grotere mate van verwonding (vergelijk figuur 2B naar figuur 2C), en herzien embryo paren een eerste verbinding met extra verwonding versterken, vergroot de kans dat de embryo handhaven van een verbinding die resulteerde in succesvolle combinatie (figuur 3A-C, Film 1) en zonder bijkomende morfologische gebreken of vertraagde ontwikkeling. Indien goed gedaan, werden bijna 100% van de embryo paren versmolten, hoewel een fractie van deze embryo's (ongeveer 25%) nooit de circulatie in beide helften vastgesteld. Door het oriënteren van de twee blastulae hun dierlijke polen rechtstreeks gericht zijn betrouwbaar head-to-head of dooierzak naar dooierzak fusies gegenereerd met gedeelde circulatie. In de meeste gevallen, de embryo had twee harten pompen van een gedeelde gemeenschappelijke omloop (Figuur 3D).
Om te bevestigen dat de embryo's inderdaad hun omloop gedeeld, fluorescerende dextran was injected in omloop, die vervolgens kan worden gezien circuleren door beide embryo's (Movie 2). Daarnaast transgene embryo's die GFP + erytrocyten (LCR: eGFP) hadden werden gefuseerd met embryo's die mCherry + vasculaire endotheliale cellen (Flk1: HRAS-mCherry) gehad. Met 48 HPF, werden GFP + erytrocyten waargenomen circuleert door de Flk1: HRAS-mCherry partner embryo (Figuur 4A en Movie 3). Om de bruikbaarheid van het systeem uit te breiden parabiotic, temporele regulatie van genexpressie werd toegevoegd. Voorafgaand aan fusie, een van de twee embryo werd geïnjecteerd met hsp70: eGFP DNA construct 20. Terwijl de gefuseerde embryo groeiden bij 28,5 ° C, werd geen fluorescentie waargenomen. Daarentegen na een korte 30 min hitteschok bij 37 ° C werd een heldere GFP signaal zichtbaar was in een van de twee embryo (figuur 4B). In sommige gevallen waren GFP + -cellenwaargenomen in omloop in de niet-geïnjecteerde partner embryo. Dus plaatsen van een gen van belang onder de controle van een heat shock promoter biedt extra temporele controle om studies die cel-intrinsieke of extrinsieke cel-functies van kandidaatgenen.
Figuur 1. Gereedschap voor het genereren van Parabiotic zebravis embryo's.
(A) Geannoteerde afbeelding toont instrumenten die worden gebruikt voor chirurgische fusie van de ontwikkeling van blastulae. Tools omvatten een gemodificeerde Pasteur pipet (boven), die wordt gebruikt in combinatie met een 10 ml pipet pomp (groen). Hout behandeld plagen naalden alleen of met een plastic gel-loading pipet tip of getrokken glas microinjectie gebruikt naald-vormig bevestigd aan het einde met een lab-film. (B) Afbeelding toont de uiteinden van drie glazen micro-injectie behoefteles die zijn gebroken met een pincet op verschillende diameters. De naalden zijn die bovenop een micrometer; de kleinste lijnen zijn verdeeld 10 urn uit elkaar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Chirurgische Fusion of Developing Blastulae.
Sterk vergrotende beelden tonen twee zebravis embryo's in het hoge ontwikkelingsniveau georiënteerd hun dierlijke polen naar elkaar voor de chirurgische stiksel (A) onmiddellijk na minimale verwonding (B) en daarna meer aanzienlijke verwonding (C). 20 min later blijkt dat de embryo succesvol gefuseerd op basis van de ononderbroken brug van cellen tussen de twee blastulae (D). Schaalstaaf stelt 250 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Ontwikkeling van Parabiotic zebravis embryo's.
(AC) afbeeldingen tonen een hele parabiont aanzicht over vroeg net na verwonding (A) en de embryo's blijven ontwikkelen ondergaan epiboly (B en C) De volgende afbeeldingen komen overeen met film 1. (D) Afbeelding toont een embryo paar parabiotic bij 36 hPF. De embryo's zijn verbonden aan hun dooier zakjes, twee harten en delen een gemeenschappelijke circulatie. Schaal bars vertegenwoordigt 250 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Visualiseren Parabiosis met genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten.
(A) Afbeeldingen (fluorescentie alleen, rechts, overlay met doorvallend licht, links) tonen het hoofd regio Siamese embryo's in 48 HPF. De bodem embryo van dit paar is transgeen voor LCR: eGFP (erythroctyes, groen), terwijl haar partner (boven) is transgeen voor Flk1: HRAS-mCherry, die vasculaire endotheliale cellen (rood) etiketten. Groen erytrocyten kan worden gezien circuleert door de partner embryo. Deze afbeelding komt overeen met film 3 (B) De linker embryo in deze combinatie werd geïnjecteerd met een hsp70: eGFP construct bij de een-cellig stadium en vervolgens gefuseerd met een niet-geïnjecteerde partner (rechts). Als de dieren werden hitte geschokt door 37 ° C gedurende 30 minuten bij 36 HPF, werd de groene fluorescentie van GFP waargenomen in de le ft embryo op 60 HPF. Schaal bars vertegenwoordigen 500 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Film 1. Vroege ontwikkeling van chirurgisch gesmolten zebravis blastulae. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Filmpje toont de vroege ontwikkeling van een paar chirurgisch gefuseerd zebravis blastulae. Epiboly blijkt tegelijkertijd plaatsvinden in elk embryo. Deze film is gerelateerd aan figuur 3A-C.
2.jpg "/>
Movie 2. Fluorescerende dextran injectie verlicht een gedeelde omloop. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Film toont fluorescerende dextran in de ader gemeenschappelijke kardinaal van een parabiotic embryo pair wordt ingespoten bij 60 HPF. De fluorescerende kleurstof zichtbaar vervolgens circuleren door beide embryo.
Movie 3. Groen bloed stroomt door rood schepen.mov "> (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Film toont het hoofd regio Siamese embryo's in 48 HPF. De bodem embryo van dit paar is transgeen voor LCR: eGFP (erythroctyes, groen), terwijl haar partner (boven) is transgeen voor Flk1: HRAS-mCherry, die vasculaire endotheliale cellen (rood) etiketten. Green erytrocyten worden gezien circuleert door de partner embryo. Deze film heeft betrekking op figuur 4A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Parabiotic fusie is een krachtig hulpmiddel om cellulaire functies van kandidaatgenen onderzoeken bij volwassen muizen modellen en kippenembryo's 10-14 geweest. Meer recent heeft een blastula fusiemethode beschreven voor het genereren van samengevoegde zebravisembryo's 15. In het huidige protocol, zijn video-based tutorials gebruikt om aan te tonen en een betere beschrijving van de methode voor het maken van parabiotic zebravis embryo's van verschillende genetische achtergronden om tijdelijk, cel-intrinsieke, en cel-extrinsieke rol van kandidaat-genen van belang in de hematopoietische ontwikkeling te bestuderen en verder.
De methode beschreven in dit document werd onlangs gebruikt om HSC opkomst te volgen in een embryo, migratie via de bloedsomloop naar een embryo van verschillende genetische achtergrond, en de daaropvolgende innesteling en differentiatie 16. In overeenstemming met de bevindingen, enscenering en embryo positionering van de Kissa groep bleken de kans op succes te bepalenen anatomische aard van de parabiotic fusie. Met een paar belangrijke aanpassingen aan het protocol, werden parabionts gegenereerd met een aanzienlijk hogere overlevingskans. Deze omvatten het verwonden blastulae sterkere mate, die de naald in plaats van 2-3 seconden na verwonding, en vervolgens herzien paren blastula na 15 min een eerste verbinding met extra verwonding versterkt, indien nodig. Met deze bijkomende aanbevelingen, bijna 100% van de parabionts overleefden en bleven gehecht, en 75% daarvan heeft een gemeenschappelijke circulatie.
Om een bijkomend experimentele controle om de werkwijze opgenomen worden parabiotic embryo blijkt hier tolerant hitteschok, waardoor temporele regulatie van genexpressie in de context parabiotic 20 zijn. Een beperking van deze techniek is dat in sommige gevallen de parabiotic partner embryo's niet in hetzelfde vlak na parabiotic fusie. Dit kanbemoeilijken embryo in LMP agarose monteren op cellen volgen zowel embryo gelijktijdig met behulp van time-lapse microscopie. Om dit mogelijke probleem te omzeilen, moet men van plan om meerdere parabiotic embryo's te genereren om te zorgen voor de gewenste stand is bereikt. Als alternatief kunnen embryo's uit de LMP worden hersteld met behulp van een fijne pincet en Pasteur pipet en opnieuw gemonteerd voor imaging vanuit een ander perspectief. Het doel van dit protocol is om een set van duidelijke, beknopte instructies voor video-based tutorials over hoe je chirurgisch zekering ontwikkelen blastulae om parabiotic zebravis embryo's te genereren moet begeleiden.
Met belangrijke aanpassingen en aanvullende aanbevelingen voor het vergroten parabiont overleven, dit protocol hopelijk machtigen onderzoekers die willen samengevoegde embryo's gebruiken om factoren die de celmigratie, lot specificatie en differentiatie in een aantal weefsels en cellulaire contexten onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | ||
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| Antibiotics: | |||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 | |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 | |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| 50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 | |
| capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 | |
| Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| 10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 | |
| 100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 | |
| PTU. working stock is 0.003% (50x is 0.15%). for 500 ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 | |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 | |
| plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM | |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F | |
| plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 | |
| glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | |||
| Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 | |
| Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |
References
- Zon, L. I., Orkin, S. H. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Dzierzak, E., Speck, N. A. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nat Immunol. 9 (2), 129-136 (2008).
- Li, P., et al. Epoxyeicosatrienoic acids enhance embryonic haematopoiesis and adult marrow engraftment. Nature. 523 (7561), 468-471 (2015).
- Tam, P. P., Rossant, J. Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian development. Development. 130 (25), 6155-6163 (2003).
- Tanaka, M., Gertsenstein, M., Rossant, J., Nagy, A. Mash2 acts cell autonomously in mouse spongiotrophoblast development. Dev. Biol. 190 (1), 55-65 (1997).
- Morin-Kensicki, E. M., Faust, C., LaMantia, C., Magnuson, T. Cell and tissue requirements for the gene eed during mouse gastrulation and organogenesis. Genesis. 31 (4), 142-146 (2001).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348 (6303), 728-730 (1999).
- Parker, L., Stainier, D. Y. Cell-autonomous and non-autonomous requirements for the zebrafish gene cloche in hematopoiesis. Development. 126 (12), 2643-2651 (1999).
- Liao, E. C., Trede, N. S., Ransom, D., Zapata, A., Kieran, M., Zon, L. I. Non-cell autonomous requirement for the bloodless gene in primitive hematopoiesis of zebrafish. Development. 3 (3), 649-659 (2002).
- Kamran, P., Sereti, K. I., Zhao, P., Ali, S. R., Weissman, I. L., Ardehali, R. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
- Wagers, A. J., Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L. Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science. 297 (5590), 2256-2259 (2002).
- Hervey, G. R. The effects of lesions in the hypothalamus in parabiotic rats. J. Physiol. 145 (2), 336-352 (1959).
- Goldman, D. C., Bailey, A. S., Pfaffle, D. L., Al Masri, A., Christian, J. L., Fleming, W. H. BMP4 regulates the hematopoietic stem cell niche. Blood. 114 (20), 4393-4401 (2009).
- Dieterlen-Lièvre, F., Martin, C., Beaupain, D. Quail-chick chimaeras and parabionts: several new models to investigate early developmental events in the haemopoietic system. Folia Biol (Praha). 25 (5), 293-295 (1979).
- Demy, D. L., Ranta, Z., Giorgi, J. M., Gonzalez, M., Herbomel, P., Kissa, K. Generating parabiotic zebrafish embryos for cell migration and homing studies). Nat. Methods. 10 (3), 256-258 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126 (26), 2811-2820 (2015).
- Murayama, E., Sarris, M., Redd, M., Le Guyader, D., Vivier, C., Horsley, W., Trede, N., Herbomel, P. NACA deficiency reveals the crucial role of somite-derived stromal cells in haematopoietic niche formation. Nat Commun. 28 (6), 8375 (2015).
- Shah, D. I., et al. Mitochondrial Atpif1 regulates haem synthesis in developing erythroblasts. Nature. 491 (7425), 608-612 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160 (1-2), 241-252 (2015).
- Adám, A., Bártfai, R., Lele, Z., Krone, P. H., Orbán, L. Heat-inducible expression of a reporter gene detected by transient assay in zebrafish. Exp. Cell Res. 256 (1), 282-290 (2000).
