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Developmental Biology

Blastulae विकास के सर्जिकल फ्यूजन द्वारा Parabiotic zebrafish भ्रूण की जनरेशन

Published: June 11, 2016 doi: 10.3791/54168

Abstract

विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के दो पशुओं की शल्य parabiosis सेल आंतरिक बनाम अलग आनुवंशिक सेटिंग्स में ब्याज की उम्मीदवार जीन, कोशिकाओं के प्रवासी व्यवहार, और secreted संकेतों के लिए सेल-बाह्य भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा परिदृश्य बनाता है। parabiotic जानवरों एक आम प्रचलन का हिस्सा है क्योंकि, एक जानवर से किसी भी रक्त या रक्त जनित कारक अपने साथी के साथ और इसके विपरीत विमर्श किया जाएगा। इस प्रकार, सेल और आणविक कारकों एक आनुवंशिक पृष्ठभूमि से व्युत्पन्न एक दूसरे आनुवंशिक पृष्ठभूमि के संदर्भ में अध्ययन किया जा सकता है। वयस्क चूहों के Parabiosis अनुसंधान उम्र बढ़ने, कैंसर, मधुमेह, मोटापा, और मस्तिष्क के विकास के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है। हाल ही में, zebrafish भ्रूण की parabiosis hematopoiesis की विकासात्मक जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। चूहों के विपरीत, zebrafish भ्रूण की पारदर्शी प्रकृति parabiotic संदर्भ में कोशिकाओं के प्रत्यक्ष दृश्य परमिट, यह एफ की जांच के लिए एक विशिष्ट शक्तिशाली विधि बनानेundamental सेलुलर और आणविक तंत्र। इस तकनीक की उपयोगिता, तथापि, parabiotic zebrafish भ्रूण पैदा करने के लिए एक तेजी से सीखने की अवस्था के द्वारा सीमित है। इस प्रोटोकॉल कैसे शल्य चिकित्सा द्वारा विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के दो zebrafish भ्रूण की blastulae फ्यूज करने के लिए ब्याज की उम्मीदवार जीन की भूमिका की जांच करने पर एक कदम-दर-कदम तरीका प्रदान करता है। इसके अलावा, parabiotic zebrafish भ्रूण गर्मी झटका करने के लिए सहिष्णु हैं, जीन अभिव्यक्ति संभव के अस्थायी नियंत्रण बना रही है। इस पद्धति का एक परिष्कृत सेट-अप की आवश्यकता होती है और भ्रूण के विकास के दौरान विवो में सेल प्रवास, भाग्य विनिर्देश, और भेदभाव के अध्ययन के लिए व्यापक आवेदन किया है नहीं है।

Introduction

जंगली प्रकार और आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों के बीच आनुवंशिक मोज़ाइक (काइमेरा) का निर्माण सेल आंतरिक बनाम उम्मीदवार जीन 1-6 की सेल-बाह्य कार्यों की जांच के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित और शास्त्रीय रणनीति है। Zebrafish में ब्लासटुला प्रत्यारोपण व्यापक रूप से सेल स्वायत्तता 7-9 की पढ़ाई के लिए chimeric भ्रूण उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया गया है। ब्याज के ऊतकों पर निर्भर करता है, हालांकि, यह चुनौतीपूर्ण जाहिर वांछित ऊतक (जैसे, रक्त) 1-3, 7-9 करने के लिए दाता कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए हो सकता है। माउस जेनेटिकविदों लंबे parabiotic शल्य चिकित्सा पद्धतियों का उपयोग किया है एक साझा परिसंचरण 10-14 के साथ संयुक्त जीवों उत्पन्न करते हैं। Parabiotic जानवरों एक आम खून का हिस्सा है क्योंकि, कोशिकाओं है कि एक अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि के अन्य जानवर की कोशिकाओं के साथ एक जानवर से उत्पन्न बीच बातचीत 10-16 का अध्ययन किया जा सकता है। हाल ही में, करीमा किस्सा समूह सुंदर ढंग से रचनात्मक क्षमता का प्रदर्शनसंयुक्त zebrafish भ्रूण खाया और फिर hematopoietic स्टेम और पूर्वज सेल (HSPC) प्रवास 15 अध्ययन करने के लिए इस प्रणाली का उपयोग करें। इसके अलावा, zebrafish parabiosis हाल ही में hematopoietic स्टेम सेल (एचएससी) उद्भव और प्रवास, 16 में endothelial cadherin 5 की भूमिका की जांच करने के लिए और zebrafish विकास 17 के दौरान HSPC आला में stromal कोशिकाओं की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

चूहों के विपरीत, zebrafish भ्रूण पारदर्शी हैं और parabiotic विकास के दौरान कोशिकाओं के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देते हैं, प्रणाली विशिष्ट शक्तिशाली बना रही है। zebrafish में parabiosis की उपयोगिता, तथापि, एक तेजी से सीखने की अवस्था है, और नाजुक भ्रूण पर parabiotic सर्जरी द्वारा सीमित विस्तृत निर्देश और दृश्य प्रदर्शन के बिना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य स्पष्ट है, कदम दर कदम निर्देश कैसे अध्ययन करने के लिए parabiotic zebrafish भ्रूण उत्पन्न करने पर वीडियो आधारित ट्यूटोरियल के साथ करने का एक सेट प्रदान करने के लिए हैलौकिक, सेल आंतरिक, या एक उम्मीदवार जीन (एस) blastulae के विकास के लिए शल्य चिकित्सा द्वारा संलयन की सेल-बाह्य कार्य करता है। कुंजी संशोधनों और बढ़ती parabiont अस्तित्व और नए प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों के लिए अतिरिक्त सिफारिशें शामिल हैं।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल बोस्टन बच्चों के अस्पताल के पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस प्रोटोकॉल एक पहले प्रकाशित विधि 15 से संशोधित किया गया है।

1. अभिकर्मकों की तैयारी (दिन या अग्रिम में सप्ताह)

  1. 1.5% agarose लेपित व्यंजन तैयार करें। 100 मिलीलीटर Zebrafish E3 के माध्यम 1.5 जी agarose एक Erlenmeyer फ्लास्क में जोड़ें। गर्मी, agarose भंग, और फिर लगभग 5 एमएल 100 मिमी व्यास x 20 मिमी गहरी पेट्री डिश में डाल देना।
    नोट: ये भ्रूण के dechorionation के लिए उपयोग किया जाता है (3.1 कदम) और parabiotic सर्जरी के लिए (3.3 चरण)। कुछ हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर agarose लेपित बर्तन की दुकान; उन्हें फ्रिज के बाहर ले जाना और गर्म parabiotic सर्जरी के दिन की सुबह आरटी के लिए।
  2. 4% मिथाइल सेलुलोज तैयार करें। हलचल पट्टी के साथ एक Erlenmeyer फ्लास्क में E3 की 100 मिलीलीटर में मिथाइल सेलुलोज पाउडर के 4 ग्राम भंग। 4 डिग्री सेल्सियस पर एक हलचल प्लेट पर फ्लास्क, सबसे कम गति के लिए सेट की जगह है, और यह मिश्रणअप करने के लिए 2 दिनों के लिए।
    1. रुक-रुक कर एक रंग का उपयोग मिथाइल सेलुलोज की सफेद गुच्छों को तोड़ने के लिए। मिथाइल सेलुलोज क्रिस्टल पूरी तरह से इस एकाग्रता में भंग नहीं है। समाधान स्पष्ट हो जाता है और कोई सफेद झुरमुटों शेष, विभाज्य लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूबों में समाधान और फ्रीज के साथ समरूप प्रकट होता है।
      नोट: मिथाइल सेलुलोज की कम सांद्रता में इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, इस उच्च प्रतिशत, अधिक चिपचिपा मिथाइल सेलुलोज सबसे अच्छा परिणाम सामने आए है।
  3. उच्च कैल्शियम की घंटी (एचसीआर) समाधान तैयार है। एचसीआर समाधान की 400 मिलीलीटर बनाने के लिए, 5M NaCl के 8 मिलीलीटर (116 मिमी अंतिम), 3M KCl के 400 μl (2.9 मिमी अंतिम), 5M 2 CaCl (10 अंतिम मिमी), और 1M HEPES की 2ml के 800 μl मिश्रण (5 मिमी अंतिम) E3 मीडिया के 390 मिलीलीटर के साथ।
    नोट: कुछ हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर एचसीआर समाधान; parabiotic सर्जरी के दिन की सुबह आरटी के लिए गर्म है।
  4. हस्तांतरण के लिए 6 संशोधित पाश्चर pipettes - 5 तैयारब्लासटुला जोड़े की अंगूठी। संक्षेप में एक लेम्प बर्नर पर पिपेट के अंत की गर्मी। फिर, बड़े संदंश का प्रयोग, लगभग 45 डिग्री सेल्सियस के लिए पिपेट के अंत मोड़ यह अभी भी गर्म है, जबकि।
    1. कोई तेज किनारों कि भ्रूण को नुकसान पहुंचा सकता है, लगभग 3 सेकंड के लिए लौ में संक्षेप में पिपेट की नोक पकड़ देखते हैं सुनिश्चित करने के लिए। यह / पॉलिश चिकनी जाएगा पिपेट का अंत। इस संशोधित गिलास पाश्चर विंदुक एक 10 मिलीलीटर पिपेट पंप (चित्रा 1) नीचे 3.5 चरण में साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है।
  5. ब्लासटुला जोड़े की शल्य सिलाई के लिए गिलास सुई उपकरण तैयार। 3 गिलास सुई के रूप में zebrafish भ्रूण के microinjection के लिए किया - 2 खींचो। प्रयोगशाला फिल्म का उपयोग एक लकड़ी या प्लास्टिक से संभाला चिढ़ा सुई (चित्रा 1 ए) के अंत करने के लिए प्रत्येक गिलास सुई ठीक करने के लिए। 30 माइक्रोन - संदंश का प्रयोग, लगभग 20 की एक व्यास पर सुई के अंत से टूट गया। एक मंच सुक्ष्ममापी का प्रयोग करें इस कदम (चित्रा 1 बी) में मार्गदर्शन करने के लिए।
    नोट: पूर्वोत्तर के आकारEDLE टिप महत्वपूर्ण है। अगर टिप बहुत बड़ी है यह ठीक नियंत्रित करने के लिए मुश्किल हो जाता है और अत्यधिक नुकसान हो सकता है। टिप बहुत छोटा है, तो यह मुश्किल है पर्याप्त भ्रूण घाव करने के लिए।

2. (0 दिन के लिए दिन -1) Zebrafish और भ्रूण के संग्रह का प्रजनन जोड़े की स्थापना

  1. वयस्क zebrafish के प्रजनन जोड़े के सेट करें। मछली रात को सेट करें parabiosis सर्जरी से पहले ही किया जा सकता है। पुरुषों और महिलाओं को अलग करने के लिए डिवाइडर का प्रयोग करें। हालात यह है कि वांछित भ्रूण प्राप्त हो जाएगा प्रत्येक पंक्ति के कई जोड़े की स्थापना की वृद्धि हुई है। जोड़े में से 50% अंडे जाएगा - हम जानते हैं कि आम तौर पर 20 पाते हैं।
  2. अगली सुबह, डिवाइडर खींचने के लिए और संभोग अनुमति देते हैं। एक ठीक जाल चाय का झरनी उपयोग कर किसी भी भ्रूण लीजिए, तो उन्हें E3 भ्रूण माध्यम से 18 से युक्त एक पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण।
  3. माइक्रो-इंजेक्षन भ्रूण वांछित के रूप में (जैसे, 25 पीजी प्लास्मिड डीएनए, 200 पीजी mRNA, या 1 के साथ साथ - 6 एनजी morpholino) संग्रह के लिए 1 घंटे के भीतर। उन्हें अनुमति256 सेल चरण तक बढ़ता है। डीएनए अभिव्यक्ति का निर्माण एक गर्मी झटका प्रमोटर के नियंत्रण में रखा जाता है (जैसे, hsp70, चित्रा 4 बी), जीन अभिव्यक्ति के समय गर्मी parabionts चौंकाने वाला से 37 डिग्री सेल्सियस पर एक बाद में मंच पर (नियंत्रण जैसे।, 36 HPF पर )।
    नोट: एक फ्लोरोसेंट transgene के लिए एक विकल्प, फ्लोरोसेंट dextran (2 मिलीग्राम / एमएल पर जैसे, dextran, झरना नीला) डीएनए, आरएनए, या morpholino इंजेक्शन मिश्रण में जोड़ा जा सकता है। dextran डाई सामान्य विकास के साथ हस्तक्षेप नहीं करेगा और इंजेक्शन भ्रूण के लिए parabiotic संलयन के बाद उचित फ्लोरोसेंट प्रकाश के तहत पहचाना जा करने की अनुमति देगा। वैकल्पिक रूप से, एक गैर pigmented तनाव के साथ एक pigmented तनाव के parabiosis (जैसे, एबी) (जैसे, कैस्पर) बाद के चरणों में इंजेक्शन भ्रूण की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  4. एक त्रिविमदर्शी 28.5 डिग्री C.Use में भ्रूण सेते के रूप में समय समय पर उनके विकास पर नजर रखने के लिए वे 256-सेल देव के पासelopmental चरण (लगभग 2.5 HPF)।
    नोट: यदि आवश्यक हो, अलग तापमान के भ्रूण को शिफ्ट parabiotic भागीदारों (जैसे, morpholino इंजेक्शन भ्रूण अक्सर अपने संयुक्त राष्ट्र के इंजेक्शन समकक्षों की तुलना में धीमी विकसित आरटी के लिए संयुक्त राष्ट्र के इंजेक्शन भ्रूण स्थानांतरण के बीच मंच मिलान सुनिश्चित करने के लिए है, जबकि morpholino इंजेक्शन भ्रूण रखा जाता है। 28.5 डिग्री सेल्सियस उनकी चरणों के विकास की एक दो घंटे के बाद) aligning में परिणाम होगा।

3. Blastulae विकास के सर्जिकल फ्यूजन द्वारा Parabiotic zebrafish भ्रूण की जनरेशन

  1. भ्रूण 256 सेल मंच (लगभग 2.5 HPF) के दृष्टिकोण के रूप में, अलग agarose लेपित व्यंजन (जैसे, morpholino- के लिए एक डिश में प्रत्येक आनुवंशिक पृष्ठभूमि (यानी, आनुवंशिक उत्परिवर्ती, ट्रांसजेनिक लाइनों और / या आनुवंशिक हेरफेर) से भ्रूण स्थानांतरण इंजेक्शन भ्रूण और नियंत्रण भ्रूण के लिए एक दूसरे पकवान)। वैकल्पिक रूप से, साफ करने के लिए, खरोंच से मुक्त गिलास बीकर या कांच पेट्री डिश भ्रूण हस्तांतरण।
    नोट: uncoated प्लास्टिक के बर्तन का उपयोग कर के रूप में भ्रूण प्लास्टिक रहना होगा और एक बार उनके chorions से बाहर क्षतिग्रस्त हो बचें।
  2. E3 मीडिया छानना तक सिर्फ पर्याप्त तरल भ्रूण को कवर करने के लिए रहता है (लगभग 7 - 10 मिलीलीटर)। 50 मिलीग्राम / Streptomyces griseus (proteases) के बाह्य तरल पदार्थ से अलग proteases की मिलीलीटर मिश्रण के 200 μl जोड़ें। भ्रूण धीरे हर कुछ मिनट भंवर।
    1. भ्रूण के 50% अपने chorions, जो आम तौर पर 5 लेता से बाहर आ गए हैं जब - ताजा E3 भ्रूण माध्यम से - (20 मिलीलीटर लगभग 15) 10 मिनट के लिए, उन्हें एक उदार मात्रा के साथ तीन बार कुल्ला।
      1. धीरे संशोधित कांच पाश्चर विंदुक में उन्हें ड्राइंग और फिर धीरे से उन्हें दूर से किसी भी उनकी chorions में शेष भ्रूण Dechorionate। एक बार भ्रूण dechorionated किया गया है और धोया, एचसीआर समाधान के साथ E3 मीडिया की जगह। proteases के लिए एक विकल्प के रूप में, स्वयं एक ठीक संदंश का उपयोग chorions को हटा दें। 100 dechor - 60 करने का लक्ष्यionated प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए उपलब्ध भ्रूण।
        नोट: यह गुना से अंत में इस्तेमाल किया जाएगा और अधिक कई है, लेकिन कई भ्रूण से निपटने या parabiosis के लिए सर्जरी के दौरान क्षतिग्रस्त हो जाने की संभावना है। एक बार भ्रूण dechorionated रहे हैं, उन्हें जलमग्न रखने के लिए और उन्हें पानी की सतह को छूने के रूप में सतह तनाव का कारण होगा उन्हें नष्ट कर दिया जा करने की अनुमति नहीं है। ध्यान रखें कि proteases की एक उच्च खुराक का उपयोग भ्रूण जल्दी ही उनकी chorions के बाहर और एक अधिक सिंक्रनाइज़ फैशन में आने के लिए अनुमति देता है। proteases की एक कम खुराक का उपयोग करते हैं, भ्रूण अब लेने के लिए उनके chorions से उभरने के लिए और एक कम तुल्यकालिक फैशन है, जो भ्रूण के एक हिस्से में परिणाम कर सकते हैं proteases करने के लिए लंबे समय तक निवेश से क्षतिग्रस्त होने में ऐसा करते हैं।
  3. 10 मिनट के लिए methylcellulose (ऊपर 1.2 चरण में किए गए) और अधिकतम गति पर एक टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज में सेंट्रीफ्यूज गला लें undissolved क्रिस्टल जो भ्रूण को नुकसान या उनके जर्दी टूटना होगा गोलीएस।
    1. centrifugation के बाद, स्पष्ट ऊपरी अंश (मात्रा का लगभग 75%) का उपयोग करें। स्थानांतरण 1 - 1.5% agarose लेपित पेट्री डिश में मिथाइल सेलुलोज के 1.5 सेमी व्यास बूँदें। ट्यूब के नीचे से pelleted क्रिस्टल के किसी भी ड्राइंग से बचने के लिए ध्यान रखना।
    2. पकवान के नीचे की ओर एक छोटी बूंद की स्थिति पहले से जाना करने के लिए एक मार्कर का उपयोग करें। 100 मिमी व्यास पेट्री डिश प्रति मिथाइल सेलुलोज की - (3 aliquots की कीमत 2) 15 बूँदें - 12 की जगह। के रूप में कई प्लेटों के रूप में प्रयोग के प्रति जरूरत से तैयार करें।
      नोट: एक ही ब्लासटुला जोड़ी के विलय के लिए एक छोटी बूंद का प्रयोग करें। मार्क प्रत्येक छोटी बूंद एक बार मीडिया जोड़ा जाता है पर जो बात बूँदें लगभग अदृश्य हो जाते हैं के स्थान नामित करेंगे।
  4. agarose लेपित 3.3 कदम में उपरोक्त तैयार पकवान प्रति एंटीबायोटिक पूरक एचसीआर समाधान के लिए एक 40 मिलीलीटर विभाज्य तैयार करें। एचसीआर में से प्रत्येक के 40 मिलीलीटर विभाज्य 0.5 माइक्रोग्राम से कम 50 यू / एमएल, 50 यू / एमएल पर एम्पीसिलीन, और केनामाइसिन पर पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ने/ एमएल।
    1. ब्लासटुला fusions प्रदर्शन करने के लिए जब तैयार है, ध्यान से एंटीबायोटिक पूरक एचसीआर समाधान के 40 मिलीलीटर के साथ मिथाइल सेलुलोज बूंदों से युक्त व्यंजनों की प्रत्येक भरें। एचसीआर समाधान भी जल्दी से जोड़ा जाता है, तो यह बूंदों को बाधित कर सकते हैं।
  5. एक 10 मिलीलीटर पिपेट पंप करने के लिए संशोधित गिलास पाश्चर विंदुक (ऊपर 1.4 चरण में किए गए) संलग्न। एक स्टिरियोस्कोप के तहत प्रत्येक पृष्ठभूमि (जैसे, एक morpholino इंजेक्शन भ्रूण और एक जंगली प्रकार भ्रूण) से एक dechorionated भ्रूण इकट्ठा।
    1. दो भ्रूण वितरण से पहले, पाश्चर विंदुक मिथाइल सेलुलोज बूंद के बीच में एक छोटा सा अवसाद बनाने के लिए है, तो धीरे का उपयोग अवसाद में दोनों भ्रूण जमा।
      नोट: हस्तांतरण प्रक्रिया के दौरान, पाश्चर विंदुक बारी से थोड़ा ऊपर की तरफ इतना है कि भ्रूण पाश्चर विंदुक के मोड़ में बसने के रूप में तो ऊपर या पिपेट के नीचे तरल की सतह के साथ उनके संपर्क बनाने (से बचने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं जो उनके व्यापार के लिएआर टूटना)।
  6. उनके पशु डंडे सीधे हैं कि इस तरह के तत्काल बाद मिथाइल सेलुलोज में भ्रूण जमा करने के बाद, अंत (चित्रा 1 ए) पर एक जेल लोडिंग pipet टिप के साथ एक लकड़ी या प्लास्टिक से संभाला चिढ़ा सुई का उपयोग सावधानी से मिथाइल सेलुलोज के भीतर भ्रूण का स्थान एक दूसरे को छू।
    1. भ्रूण को मिथाइल सेलुलोज बंद के माध्यम से कोमल व्यापक गतियों का उपयोग सीधे उन्हें छू बिना उन्हें स्थिति बदलने के लिए। भ्रूण 5 मिनट के लिए बैठते हैं इसलिए मिथाइल सेलुलोज उनके आसपास में बसने जाएगा। इस समय के दौरान, एक बूंद में अगले जोड़ी लोड।
      नोट: भ्रूण के साथ सीधा संपर्क बनाने से बचें और जर्दी थैली, जो आसानी से टूटना के किसी भी हिस्से को छूने के लिए नहीं विशेष ख्याल रखना।
  7. गिलास सुई उपकरण का उपयोग, ध्यान से संपर्क की उनकी बात पर प्रत्येक भ्रूण घाव। एक सज्जन सिलाई गति के साथ, पहले भ्रूण से कोशिकाओं को फिर से वापस दूसरे भ्रूण में खींचा जा सकता है और उसके बाद।इस प्रस्ताव के अंत में, 2 के लिए जगह में सुई पकड़ - 3 सेकंड और फिर इसे दूर आकर्षित बहुत धीरे धीरे।
    नोट: के बारे में 2 की अवधि है - 3 सेकंड भ्रूण घायल हो जाने के बाद जहां दो ऊतकों अधिक चिपकने वाला और अधिक एक दूसरे को देते हैं होने की संभावना होने लगते हैं। इस प्रकार, हमें विश्वास है कि संक्षेप में लोग घायल हो गए के बाद जगह में सुई पकड़े तुरंत घायल हो गए के बाद समय की प्रारंभिक अवधि के लिए संपर्क में प्रत्येक भ्रूण के घायल ऊतकों रखने में मदद करता है।
  8. आरटी पर 15 मिनट - इन भ्रूणों 10 के लिए बैठने के लिए अनुमति दें। इस बीच में, मिथाइल सेलुलोज के अन्य बूंदों में नए जोड़े सिलाई के लिए जारी है। 10 के बाद - 15 मिनट, आकलन है कि पहली जोड़ी संलग्न (2A चित्रा) बनी हुई है।
    नोट: भ्रूण अब जुड़े होते हैं, जब तक भ्रूण में 30% epiboly मंच के आसपास की तुलना में छोटी हैं के लिए सिलाई प्रक्रिया को दोहराएँ। आमतौर पर यह तीन प्रयास करने के लिए एक साथ भ्रूण सिलाई करने के लिए अनुमति देता है। भ्रूण एक लगाव है, लेकिन सी बनाए रखा है दिखाई देते हैंonnection पर्याप्त नहीं है, इसे मजबूत करने के लिए कनेक्शन के किनारे पर अतिरिक्त सिलाई प्रदर्शन करते हैं। मिलाते हुए या parabiotic सर्जरी और ऊष्मायन अवधि के दौरान बर्तन चलती से बचें।
    नोट: उनके जल्दी विकास मंच और कथित कमजोरी के बावजूद, भ्रूण की सेल आम जनता में गड़बड़ी की एक पर्याप्त राशि (यानी, लोग घायल हो गए और सिलाई) बर्दाश्त कर सकते हैं, और अभी भी सामान्य रूप से विकसित करना। जर्दी, तथापि, केवल थोड़ी सी भी स्पर्श के साथ संबंध विच्छेद कर सकते हैं, भ्रूण हत्या। जब कांच सुई के साथ दो blastulae सिलाई, सेल मास और प्रत्येक भ्रूण की जर्दी के बीच इंटरफेस के साथ संपर्क बनाने के लिए नहीं है।
  9. एक ही थाली और मीडिया (मीडिया परिवर्तन नहीं) में 28.5 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण हे / एन सेते हैं। अगली सुबह तक, भ्रूण ज्यादातर भंग मिथाइल सेलुलोज बूंदों से बाहर स्थानांतरित कर दिया जाएगा। किसी भी भ्रूण कि सफलतापूर्वक जुड़े हुए नहीं थे निकालें। मीडिया छानना और एक ताजा 25 मिलीलीटर E3 के साथ बदलें।
    ध्यान दें: एक साथ काम कर रहे हैंpigmented तनाव, रंजकता ब्लॉक करने के लिए 0.003% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 500 μl 0.15% (50x) phenylthiourea (पीटीयू) जोड़ें। भ्रूण पीटीयू में लगातार रहने के लिए रंजकता के दमन को बनाए रखने की जरूरत होगी।

4. माइक्रोस्कोप सेटअप, छवि अधिग्रहण, प्रोसेसिंग और विश्लेषण

  1. तैयार 0.8% कम पिघलने बिंदु (एलएमपी) agarose: 0.8 ग्राम एलएमपी 100 मिलीलीटर E3 के लिए agarose और गर्मी जब तक पूरी तरह से भंग जोड़ें। जबकि गर्म, विभाज्य agarose एक 37 डिग्री सेल्सियस हीटिंग ब्लॉक में 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूबों में एलएमपी के 1 मिलीलीटर। एलएमपी agarose 37 डिग्री सेल्सियस पर पिघला हुआ रहेगा। 37 डिग्री सेल्सियस पर agarose 4 मिलीग्राम / एमएल (25x), पीएच एलएमपी के प्रत्येक 1 मिलीलीटर विभाज्य 7.0 tricaine के 40 μl जोड़ें। नोट: एक pigmented तनाव के साथ काम कर रहे हैं, तो प्रत्येक 1ml विभाज्य को 0.15% (50x) पीटीयू के 20 μl जोड़ें।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर सील कर 50 मिलीलीटर ट्यूब में कई महीनों के लिए शेष एलएमपी agarose स्टोर।
  2. parabiotic भ्रूण anesthetize 4 मिलीग्राम / एमएल के 1 मिलीलीटर (25x), 7.0 पीएच tricaine जोड़कर imaged किया जाE3 के 25 मिलीलीटर है कि भ्रूण में पहले से ही कर रहे हैं।
  3. इतना है कि भ्रूण बीच में पूल होगा धीरे पकवान ज़ुल्फ़। फिर, जितना संभव हो कम तरल में भ्रूण तैयार करने के लिए एक व्यापक इत्तला दे दी प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग। ईमानदार पिपेट मुड़ें और इतना है कि वे पिपेट के बहुत नीचे करने के लिए व्यवस्थित धीरे भ्रूण उछाल।
    1. पिपेट के नीचे भ्रूण के साथ, हल्के agarose की सतह के लिए विंदुक टिप छू द्वारा एलएमपी agarose की एक 1 मिलीलीटर विभाज्य के लिए उन्हें स्थानांतरित। इस के रूप में अतिरिक्त तरल स्थानांतरित agarose कमजोर होगी बचें।
  4. पिपेट से अतिरिक्त तरल को खदेड़ने के बाद, पिपेट का उपयोग धीरे agarose भीतर भ्रूण मिश्रण करने के लिए है, तो एक गिलास नीचे की अच्छी तरह से (नं 1.5 coverslip) को agarose और भ्रूण के सभी हस्तांतरण पिपेट का उपयोग 6 अच्छी तरह से थाली।
    नोट: इमेजिंग थाली करने के लिए भ्रूण स्थानांतरित होने के बाद पिपेट त्यागने के लिए सुनिश्चित करें। अवशिष्ट agarose पिपेट अंदर की स्थापना की जाएगी, renderinयह छ आगे उपयोग के लिए अप्रभावी। बल्कि, एक नया पिपेट हर बार का उपयोग करें।
  5. एक स्टिरियोस्कोप के तहत, कांच कवर की ओर नीचे भ्रूण की स्थिति के लिए एक जेल लोडिंग विंदुक टिप एक लकड़ी संभाला चिढ़ा सुई के अंत पर तय उपयोग करें (वे खुर्दबीन उद्देश्य के काम दूरी के भीतर हैं सुनिश्चित करने के लिए) और वांछित अभिविन्यास में इमेजिंग के लिए।
    नोट: लगातार Reposition जब तक agarose पूरी तरह से स्थापित किया है। जोड़ी की जो भ्रूण के अनुसार parabiotic भ्रूण माउंट के लिए ध्यान रखना imaged किया जा रहा है। संयुक्त भ्रूण के यादृच्छिक उन्मुखीकरण को देखते हुए कुछ जोड़े के लिए यह दोनों भ्रूण छवि के लिए मुश्किल हो सकता है। इस परिदृश्य में, एक संदंश और एक विस्तृत इत्तला दे दी प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग agarose से भ्रूण की वसूली और फिर एक अलग नजरिए से इमेजिंग के लिए गोड़ा।
  6. tricaine (और यदि आवश्यक हो तो पीटीयू) के साथ पूरक E3 के 3 मिलीलीटर - एक बार agarose का गठन किया है, 2 के साथ कवर किया।
  7. छवि भ्रूण एक औंधा व्यापक क्षेत्र महामारी प्रतिदीप्ति लास का उपयोग कर,एर-स्कैनिंग confocal, या डिस्क confocal खुर्दबीन कताई। उद्देश्य वांछित इमेजिंग के लिए सबसे उपयुक्त का चयन करें। देखने के एक पूरे भ्रूण क्षेत्र के लिए, एक 4X उद्देश्य का उपयोग करें। एक विशिष्ट ऊतक 16, 19 छवि के लिए इस तरह के एक 20x उद्देश्य के रूप में एक उच्च वृद्धि का चयन करें,।
    नोट: एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हैं, तो एक गिलास को कवर पर्ची पर एलएमपी agarose (ऊपर के समान) में माउंट। एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड ही E3-tricaine-पीटीयू 16, 19 के साथ भरा वैक्यूम तेल की एक अंगूठी है उस पर गिलास coverslip पलटना।
  8. प्रक्रिया ऐसी एनआईएच छवि जम्मू / फिजी 16, 19 के रूप में मुफ्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर संकुल का उपयोग कर छवियों का अधिग्रहण किया।
    नोट: सेल नंबर गणना और इस तरह के सेल प्रवास और कोशिका विभाजन विभाजन का उपयोग कर और ट्रैकिंग एल्गोरिदम 16, 19 के रूप में गतिशीलता यों।

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Representative Results

पहले से प्रकाशित अध्ययन में 15 के अनुरूप, zebrafish भ्रूण के सफल parabiotic संलयन मचान और दो ​​भ्रूण के उन्मुखीकरण और methylcellulose की एकाग्रता पर निर्भर करता है। बस कुछ सरल के साथ, सस्ती उपकरण, शल्य चिकित्सा द्वारा जुड़े हुए विकासशील blastulae उत्पन्न किया गया है कि साझा संचलन के साथ parabiotic भ्रूण में वृद्धि हुई। इन उपकरणों एक संशोधित पाश्चर पिपेट, एक 10 मिलीलीटर पिपेट पंप, और लकड़ी संभाला चिढ़ा सुइयों जो या तो अकेले या एक जेल लोडिंग टिप या कांच microinjection सुई प्रयोगशाला फिल्म से समाप्त करने के लिए निश्चित (चित्रा 1) के साथ प्रयोग किया गया शामिल थे।

4% मिथाइल सेलुलोज में दो blastulae रखने और उन्हें एक दूसरे (2A चित्रा) का सामना करना पड़ उनके पशु डंडे के साथ उन्मुख करने के लिए जेल लोडिंग टिप का उपयोग करने के बाद, भ्रूण ध्यान से गिलास microinjection एन के साथ संपर्क की उनकी बात पर घायल हो गए थेeedle (चित्रा 2 बी)। लोग घायल हो गए (2 सी चित्रा चित्रा 2 बी की तुलना में), और भ्रूण जोड़े समीक्षा अतिरिक्त लोग घायल हो गए के साथ एक प्रारंभिक संबंध मजबूत करने के लिए एक बड़ा डिग्री, एक कनेक्शन है कि सफल संलयन में हुई बनाए रखने के भ्रूण की संभावना में वृद्धि हुई (चित्रा 3 ए-सी, मूवी 1) , और अतिरिक्त रूपात्मक दोष या विलंबित विकास के बिना। जब ध्यान से किया, भ्रूण जोड़े के लगभग 100% जुड़े हुए थे, हालांकि इन भ्रूणों (% के आसपास 25) का एक अंश के दोनों हिस्सों में स्वस्थ संचलन की स्थापना की आवश्यकता नहीं है। दो blastulae orienting के साथ उनके पशु डंडे सीधे गठबंधन करके, विश्वसनीय सिर से सिर या जर्दी थैली करने वाली जर्दी थैली fusions साझा संचलन के साथ उत्पन्न किया गया। ज्यादातर मामलों में, भ्रूण दो दिल एक साझा आम प्रचलन (चित्रा 3 डी) पम्पिंग था।

इस बात की पुष्टि करने के लिए कि भ्रूण वास्तव में उनके प्रचलन साझा, फ्लोरोसेंट dextran Inj थापरिसंचरण, जो बाद में दोनों भ्रूण (मूवी 2) के माध्यम से घूम देखा जा सकता है में ected। इसके अतिरिक्त, ट्रांसजेनिक भ्रूण था कि + GFP एरिथ्रोसाइट्स (LCR: EGFP) भ्रूण था कि mCherry + संवहनी endothelial कोशिकाओं (: HRAS-mCherry flk1) से जुड़े हुए थे। HRAS-mCherry साथी भ्रूण (चित्रा -4 ए और मूवी 3): 48 HPF रखकर + GFP एरिथ्रोसाइट्स flk1 के माध्यम से घूम मनाया गया। parabiotic प्रणाली की उपयोगिता का विस्तार करने के लिए, जीन अभिव्यक्ति के अस्थायी नियंत्रण जोड़ा गया है। फ्यूजन करने से पहले, दो भ्रूण में से एक एक hsp70 इंजेक्शन के साथ किया गया था: EGFP डीएनए का निर्माण 20। जुड़े हुए भ्रूण 28.5 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ रहे थे, वहीं कोई प्रतिदीप्ति मनाया गया। इसके विपरीत, 37 डिग्री सेल्सियस पर एक संक्षिप्त 30 मिनट गर्मी सदमे के बाद, एक स्पष्ट GFP संकेत दिखाई दे दो भ्रूण (चित्रा 4 बी) में से एक में था। कुछ उदाहरणों में GFP + कोशिकाओं थेसंयुक्त राष्ट्र के इंजेक्शन साथी भ्रूण में घूम मनाया। इस प्रकार, एक गर्मी झटका प्रमोटर के नियंत्रण के तहत ब्याज की एक जीन रखने उम्मीदवार जीन की सेल आंतरिक या बाह्य सेल कार्यों की जांच के अध्ययन के लिए अतिरिक्त अस्थायी नियंत्रण प्रदान करता है।

आकृति 1
चित्रा 1. जनरेटिंग Parabiotic Zebrafish भ्रूण के लिए उपकरण।
(ए) एनोटेट की छवि blastulae के विकास की शल्य संलयन के लिए इस्तेमाल किया उपकरणों से पता चलता है। उपकरण एक संशोधित पाश्चर विंदुक (ऊपर) है, जो एक 10 मिलीलीटर पिपेट पंप (हरा) के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है शामिल हैं। लकड़ी संभाला चिढ़ा सुई या तो अकेले या एक प्लास्टिक की जेल लोडिंग विंदुक टिप या खींच लिया गिलास microinjection के साथ इस्तेमाल कर रहे हैं प्रयोगशाला फिल्म के साथ अंत करने के लिए तय needled। (बी) छवि तीन गिलास microinjection की जरूरत के सिरों से पता चलता हैलेस कि विभिन्न व्यास में एक संदंश के साथ टूट गया है। सुई एक माइक्रोमीटर के शीर्ष पर झूठ बोल रहे हैं; छोटी से छोटी लाइनों 10 माइक्रोन से अलग स्थान दिया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 Blastulae विकास के सर्जिकल फ्यूजन।
उच्च बढ़ाई छवियों, शल्य चिकित्सा सिलाई (ए) के लिए पहले, तुरंत कम से कम लोग घायल हो गए (बी) के बाद, और अधिक पर्याप्त लोग घायल हो गए (सी) के बाद विकास के उच्च स्तर पर दो zebrafish भ्रूण, एक दूसरे का सामना कर रहे उनके पशु डंडे के साथ उन्मुख दिखा। 20 मिनट के बाद यह है कि भ्रूण सफलतापूर्वक दो blastulae (डी) के बीच कोशिकाओं की निर्बाध पुल के आधार पर जुड़े हुए किया गया है स्पष्ट है। स्केलबार 250 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. Parabiotic Zebrafish भ्रूण का विकास।
(एसी) छवियों बस लोग घायल हो गए (ए) के बाद प्रारंभिक विकास की एक पूरी-parabiont दृश्य दिखाने के लिए और के रूप में भ्रूण का विकास जारी है और epiboly गुजरना (बी और सी) इन छवियों मूवी 1. के अनुरूप (डी) छवि एक parabiotic भ्रूण जोड़ी से पता चलता है 36 HPF पर। भ्रूण उनके जर्दी थैलियों पर जुड़े हुए हैं, दो दिलों की है और एक आम प्रचलन का हिस्सा है। स्केल सलाखों 250 माइक्रोन प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ चित्रा 4. Visualizing Parabiosis।
(ए) छवियाँ (अकेले प्रतिदीप्ति, सही; प्रेषित प्रकाश के साथ ओवरले, बाएं) 48 HPF पर संयुक्त भ्रूण के सिर क्षेत्र दिखा। HRAS-mCherry, जो संवहनी endothelial कोशिकाओं (लाल) लेबल: जबकि उसके साथी (ऊपर) flk1 के लिए ट्रांसजेनिक है EGFP (erythroctyes, हरा): इस जोड़ी के नीचे भ्रूण LCR के लिए ट्रांसजेनिक है। ग्रीन एरिथ्रोसाइट्स साथी भ्रूण के माध्यम से घूम देखा जा सकता है। इस छवि को मूवी 3. (बी) से मेल खाती है इस जोड़ी में बाईं भ्रूण एक hsp70 इंजेक्शन के साथ किया गया था: EGFP एक सेल मंच पर निर्माण और उसके बाद एक संयुक्त राष्ट्र के इंजेक्शन साथी (दाएं) से जुड़े हुए। जानवरों गर्मी 36 HPF पर 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हैरान थे जब, GFP प्रतिदीप्ति हरी Le में मनाया गया 60 HPF पर फुट भ्रूण। स्केल सलाखों 500 माइक्रोन प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

फिल्म 1
मूवी 1. शल्य चिकित्सा द्वारा जुड़े हुए zebrafish blastulae के प्रारंभिक विकास। (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)।
मूवी शल्य चिकित्सा द्वारा जुड़े हुए zebrafish blastulae की एक जोड़ी के प्रारंभिक विकास से पता चलता है। Epiboly प्रत्येक भ्रूण में एक साथ होने वाली देखा जा सकता है। इस फिल्म में चित्रा 3 ए-सी संबंधित है।

2.jpg "/>
मूवी 2. फ्लोरोसेंट dextran इंजेक्शन एक साझा परिसंचरण illuminates। (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)।
फिल्म से पता चलता फ्लोरोसेंट dextran 60 HPF पर एक parabiotic भ्रूण जोड़ी के आम कार्डिनल नस में इंजेक्शन जा रहा है। फ्लोरोसेंट रंजक बाद में दोनों में भ्रूण के माध्यम से घूम देखा जा सकता है।

मूवी 3
मूवी 3. ग्रीन रक्त लाल जहाजों के माध्यम से बह रही है।MOV "> (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)।
मूवी 48 HPF पर संयुक्त भ्रूण के सिर क्षेत्र से पता चलता है। HRAS-mCherry, जो संवहनी endothelial कोशिकाओं (लाल) लेबल: जबकि उसके साथी (ऊपर) flk1 के लिए ट्रांसजेनिक है EGFP (erythroctyes, हरा): इस जोड़ी के नीचे भ्रूण LCR के लिए ट्रांसजेनिक है। ग्रीन एरिथ्रोसाइट्स साथी भ्रूण के माध्यम से घूम देखा जाता है। यह फिल्म 4 ए चित्रा से संबंधित है।

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Discussion

Parabiotic संलयन वयस्क murine मॉडल और लड़की भ्रूण 10-14 में उम्मीदवार जीन की सेलुलर कार्यों की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण किया गया है। अभी हाल ही में एक ब्लासटुला फ्यूजन विधि संयुक्त zebrafish भ्रूण 15 पैदा करने के लिए वर्णित किया गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, वीडियो आधारित ट्यूटोरियल का प्रदर्शन और बेहतर क्रम में hematopoietic विकास में रुचि के उम्मीदवार जीन की, लौकिक सेल आंतरिक और बाह्य सेल भूमिकाओं अध्ययन करने के लिए विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के parabiotic zebrafish भ्रूण बनाने के लिए कार्यप्रणाली वर्णन किया जाता है और इसके बाद में।

विधि इस पत्र में वर्णित हाल ही में विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि की एक भ्रूण है, और बाद engraftment और भेदभाव से 16 एक भ्रूण में एचएससी उद्भव ट्रैक करने के लिए, रक्त परिसंचरण के माध्यम से पलायन इस्तेमाल किया गया था। किस्सा समूह के निष्कर्षों, मचान और भ्रूण स्थिति के साथ समझौते में सफलता की दर निर्धारित करने के लिए पाए गएऔर parabiotic संलयन के संरचनात्मक प्रकृति। प्रोटोकॉल के लिए कुछ महत्वपूर्ण संशोधनों के साथ, parabionts एक काफी अधिक जीवित रहने की दर के साथ उत्पन्न कर रहे थे। घायल होने के बाद 3 सेकंड, और फिर 15 मिनट के बाद ब्लासटुला जोड़े की समीक्षा, अतिरिक्त लोग घायल हो गए के साथ एक प्रारंभिक संबंध सुदृढ़ करने के लिए यदि आवश्यक हो - ये एक डिग्री से अधिक लोग घायल हो गए blastulae, 2 के लिए जगह में सुई पकड़े शामिल हैं। इन अतिरिक्त सिफारिशों के साथ, parabionts के लगभग 100% बच गया और संलग्न बने रहे, और उनमें से 75% एक आम प्रचलन साझा की है।

विधि करने के लिए प्रयोगात्मक नियंत्रण का एक अतिरिक्त तत्व को शामिल करने के लिए, parabiotic भ्रूण यहां प्रदर्शन कर रहे हैं सदमे गर्मी, parabiotic संदर्भ 20 के भीतर जीन अभिव्यक्ति के अस्थायी नियंत्रण के लिए अनुमति सहिष्णु होना। इस तकनीक की एक सीमा है कि कुछ मामलों में parabiotic साथी भ्रूण parabiotic संलयन के बाद ही विमान में नहीं हैं। यह हो सकता हैयह मुश्किल एक साथ समय व्यतीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग दोनों भ्रूण में कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए एलएमपी में भ्रूण माउंट करने के लिए agarose बनाते हैं। इस संभावित मुद्दे को दरकिनार करने के लिए, एक कई parabiotic भ्रूण उत्पन्न करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए वांछित अभिविन्यास हासिल की है योजना बनानी चाहिए। वैकल्पिक रूप से, भ्रूण एक ठीक संदंश और पाश्चर विंदुक और फिर से मुहिम शुरू की एक अलग नजरिए से इमेजिंग के लिए उपयोग कर एलएमपी से बरामद किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य को कैसे blastulae विकासशील parabiotic zebrafish भ्रूण उत्पन्न करने के लिए फ्यूज शल्य चिकित्सा के लिए पर वीडियो आधारित ट्यूटोरियल साथ करने के लिए स्पष्ट, संक्षिप्त निर्देशों का एक सेट प्रदान किया गया।

कुंजी संशोधनों और बढ़ती parabiont अस्तित्व के लिए अतिरिक्त सिफारिशों के साथ, इस प्रोटोकॉल उम्मीद है कि जांचकर्ताओं जो ऊतकों और सेलुलर संदर्भों की एक श्रृंखला में सेल प्रवास, भाग्य विनिर्देश, और भेदभाव को विनियमित करने वाले कारकों की जांच के लिए संयुक्त भ्रूण का उपयोग करना चाहते हैं सशक्त होगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Methyl cellulose Sigma M0387
Individual components for E3/HCR: For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4
NaCl (Sodium chloride) Sigma-Aldrich S9888
KCl (Potassium chloride) Sigma-Aldrich P9541
CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) Sigma-Aldrich 223506
MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) Sigma-Aldrich 230391
Hepes (1M ) buffer solution ThermoFisher 15630-080
Name Company Catalog Number
Antibiotics:
Pen/Strep gibco by Life technologies 15140-120
Ampicilin sodium salt Sigma Life Science A0166
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus Sigma Life Science K1377
Name Company Catalog Number
50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus Roche 11459643001
capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) Sutter Instrument ITEM#: BF 100-50-10
Teasing needles with wooden handles Fisher Scientific S07894
Glass Pasteur pipettes Fisherbrand 13-678-20A
10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) Novatech International F37898-0000
100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS,
HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG )
Greiner Bio-one 664102
Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable ThermoFisher D-1976
PTU. working stock is 0.003% (50x is 0.15%). for 500 ml, 0.75 g N-Phenylthiourea Sigma-Aldrich P7629
Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) Western Chemical Inc MS 222
LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) Invitrogen 16520100
plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) Fisherbrand 137115AM
Glass-bottom 6-well plates used for imaging MatTek P06G1.5-20-F
plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) Eppendorf 22351656
glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope:
Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease
colorless, weight 5.3 oz (tube) )
Dow Corning Z273554
Glass cover slips Corning Life Sciences 2960-244

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 112 Parabiosis संयुक्त भ्रूण zebrafish hematopoietic स्टेम सेल zebrafish कल्पना सेल आंतरिक और सेल बाह्य कार्य
Blastulae विकास के सर्जिकल फ्यूजन द्वारा Parabiotic zebrafish भ्रूण की जनरेशन
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Cite this Article

Hagedorn, E. J., Cillis, J. L.,More

Hagedorn, E. J., Cillis, J. L., Curley, C. R., Patch, T. C., Li, B., Blaser, B. W., Riquelme, R., Zon, L. I., Shah, D. I. Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae. J. Vis. Exp. (112), e54168, doi:10.3791/54168 (2016).

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