Abstract
Kirurgisk parabiosis av to dyr av ulike genetiske bakgrunn skaper en unik situasjon for å studere celle iboende versus celle ytre roller for kandidat gener av interesse, trekkende atferd av celler, og utskilling av signaler i forskjellige genetiske innstillinger. Fordi parabiotic dyr som deler en felles sirkulasjon, vil en hvilken som helst blod eller blodbåret faktor fra ett dyr utveksles med sin partner og vice versa. Således kan celler og molekylære faktorer avledet fra en genetisk bakgrunn studeres i sammenheng med et andre genetisk bakgrunn. Parabiosis av voksen mus har blitt brukt i stor utstrekning for å forskning aldring, kreft, diabetes, fedme, og utvikling av hjernen. Flere nylig, parabiosis av sebrafisk embryoer har blitt brukt til å studere utviklingsbiologi hos hematopoiesis. I motsetning til mus, den gjennomsiktige natur av sebrafisk embryoer tillater direkte visualisering av celler i parabiotic sammenheng, slik at det er en entydig kraftig metode for undersøkelse av fundamental cellulære og molekylære mekanismer. Nytten av denne teknikken, men er begrenset av en bratt læringskurve for å generere parabiotic sebrafisk embryoer. Denne protokollen gir en trinn-for-trinn metode om hvordan man kirurgisk smelte blastulae av to sebrafisk embryoer fra ulike genetiske bakgrunn for å undersøke hvilken rolle kandidat gener av interesse. I tillegg parabiotic sebrafisk embryoer er tolerante for varmesjokk, slik at temporal kontroll av genekspresjon mulig. Denne metoden krever ikke en sofistikert oppsett og har bred programmer for å studere celle migrasjon, skjebne spesifikasjon, og differensiering in vivo under embryonal utvikling.
Introduction
Opprettelse av genetiske mosaikk (kimærer) mellom villtype og genmodifiserte dyr er et veletablert og klassisk strategi for å undersøke celle iboende versus celle ytre funksjoner av kandidatgener 1-6. Blastula transplantasjon i sebrafisk har vært mye brukt til å generere kimære embryoer for studier av celle autonomi 7-9. Avhengig av vev av interesse, men det kan være vanskelig å målrette forutsigbar donorcellene til den ønskede vev (for eksempel blod) 1-3, 7-9. Muse genetikere har lenge benyttet parabiotic kirurgiske metoder for å generere siamesiske organismer med felles sirkulasjon 10-14. Fordi parabiotic dyrene har en felles blodet, kan interaksjoner mellom celler som stammer fra ett dyr med celler av andre dyr av en annen genetisk bakgrunn studeres 10-16. Nylig, Karima Kissa gruppe elegant demonstrert evne til å Crespiste siamesiske sebrafisk embryo og deretter bruke dette systemet til å studere blodkreft stilk og stamceller (HSPC) migrasjon 15. I tillegg ble sebrafisk parabiosis nylig brukt til å undersøke hvilken rolle endothelial cadherin 5 i stamcelle (HSC) veksten og migrasjon, 16 og å studere rollen av stromale celler i HSPC nisje i sebrafisk utvikling 17.
I motsetning til mus, sebrafisk embryoer er transparente og gir mulighet for direkte visualisering av cellene under parabiotic utvikling, noe som gjør at systemet unikt kraftig. Nytten av parabiosis i sebrafisk, men er begrenset av en bratt læringskurve, og parabiotic kirurgi på de delikate embryo kan være teknisk utfordrende uten detaljert instruksjon og visuell demonstrasjon. Målet med denne protokollen er å gi et sett av klare, trinn-for-trinn-instruksjoner for å følge videobaserte veiledninger om hvordan å generere parabiotic sebrafisk embryoer for å studeretemporal, celle-egenverdi, eller celle ytre funksjoner av en kandidat genet (e) ved kirurgisk fusjon for å utvikle blastulae. Viktige endringer og flere anbefalinger for å øke parabiont overlevelse og nye eksperimentelle programmer er inkludert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen ble godkjent av Boston Children Hospital Animal Care og bruk komité. Denne protokollen er modifisert fra en tidligere publisert metode 15.
1. Utarbeidelse av reagenser (dager eller uker i forveien)
- Forbered 1,5% agarose-belagt retter. Tilsett 1,5 g agarose i 100 ml Sebrafisk E3 medium i en Erlenmeyerkolbe. Heat, oppløse agarose, og deretter helle ca 5 ml i diameter 100 mm x 20 mm dype petriskåler.
Merk: Disse brukes for dechorionation av embryoer (trinn 3.1) og for parabiotic kirurgi (trinn 3.3). Oppbevar agarose-belagt retter ved 4 ° C for et par uker; ta dem ut av kjøleskapet og varm til RT morgenen den dagen parabiotic kirurgi. - Forbered 4% metyl cellulose. Oppløs 4 g metyl-cellulose-pulver i 100 ml E3 i en Erlenmeyer-kolbe med en rørestav. Sett flasken på et rør plate ved 4 ° C, innstilt på laveste hastighet, og la det blandefor opp til 2 dager.
- Midlertidig bruk en slikkepott for å bryte opp hvite klumper av methyl cellulose. De metylcellulose krystallene ikke fullstendig oppløses ved denne konsentrasjonen. Når løsningen blir klar og homogen vises med ingen hvite klumper gjenværende, alikvoter av oppløsningen i 1,5 ml mikrofugerør og fryse ved -20 ° C for langtidslagring.
Merk: Lavere konsentrasjoner av metylcellulose kan benyttes; men dette høyere prosent, og mer viskøs metylcellulose ga de beste resultatene.
- Midlertidig bruk en slikkepott for å bryte opp hvite klumper av methyl cellulose. De metylcellulose krystallene ikke fullstendig oppløses ved denne konsentrasjonen. Når løsningen blir klar og homogen vises med ingen hvite klumper gjenværende, alikvoter av oppløsningen i 1,5 ml mikrofugerør og fryse ved -20 ° C for langtidslagring.
- Forbered Høyt kalsium Ringer (HCR) løsning. For å gjøre 400 ml HCR løsning, bland 8 ml 5M NaCl (116 mM endelig), 400 mL av 3M KCl (2,9 mM endelig), 800 mL 5M CaCl2 (10 mM final), og 2 ml av 1M HEPES (5 mM endelig) med 390 ml E3 media.
Merk: Oppbevar HCR løsning ved 4 ° C for et par uker; varm til RT morgenen dagen for kirurgi parabiotic. - Forbered 5 - 6 modifiserte Pasteur pipetter for overføringring blastula par. I korthet varme enden av pipetten i løpet av en Bunsen-brenner. Deretter, ved hjelp av store tang, bøy enden av pipetten til omtrent 45 ° C mens den fremdeles er varm.
- For å sikre at det ikke er noen skarpe kanter som kan skade fostre, holder spissen av pipetten kort i flammen for rundt 3 sek. Dette vil jevne / poler enden av pipetten. Denne modifiserte glass Pasteur pipette blir anvendt i forbindelse med en 10 ml pipette pumpe (figur 1) i trinn 3.5 nedenfor.
- Forbered glass nål verktøy for kirurgisk søm av blastula par. Trekk 2 - 3 glass nåler som gjøres for mikroinjeksjon av sebrafisk embryoer. Bruk lab-film for å feste hvert glass nål til enden av en tre- eller plastskaftet erte nål (figur 1A). Ved hjelp av tang, brekke av den enden av nålen ved en diameter på ca. 20 - 30 For um. Bruk en scene mikrometer for å lede dette trinnet (figur 1B).
Merk: Størrelsen på neEdle tips er viktig. Dersom spissen er for stor blir det vanskelig å kontrollere nøyaktig og kan føre til overdreven skade. Hvis toppen er for liten, er det vanskelig å tilstrekkelig viklet embryoene.
2. Sette opp hekkende par av Sebrafisk og innkreving av embryoer (Dag -1 til dag 0)
- Sett opp hekkende par av voksen sebrafisk. Sett opp fisk natten før parabiosis operasjonen skal gjennomføres. Bruk skillevegger for å separere hanner og hunner. For å øke sjansen for at de ønskede fostre vil bli innhentet, satt opp flere par av hver linje. Vi finner at typisk 20 - 50% av parene vil gyte.
- Neste morgen, trekke skillevegger og tillate parring. Samle alle embryoer ved hjelp av en finmasket tesil og deretter overføre dem til en petriskål som inneholder E3 embryo medium 18.
- Micro-injisere embryoer som ønsket (for eksempel med 25 pg plasmid DNA, 200 pg mRNA, eller med 1-6 ng morfolino) innen en time av samlingen. La demvokse til 256-cellestadiet. Dersom DNA-ekspresjonskonstruksjon er plassert under kontroll av en varmesjokk-promoter (for eksempel, hsp70, figur 4B), kontrollere tidspunktet for genekspresjon ved varmesjokk de parabionts ved 37 ° C på et senere tidspunkt (f.eks., Ved 36 HPF ).
Merk: Som et alternativ til en fluoriserende transgenet, kan fluorescerende dekstran bli tilsatt til DNA, RNA, eller morfolino injeksjon blanding (for eksempel dekstran, kaskade blå ved 2 mg / ml). Den dekstran fargestoffet vil ikke forstyrre normal utvikling og vil gi rom for det injiserte embryo som skal identifiseres under passende fluorescerende lys etter parabiotic fusjon. Alternativt kunne parabiosis av en pigmentert stamme (f.eks AB) med en ikke-pigmentert stamme (f.eks Casper) anvendes for å identifisere den injiserte embryo på senere stadier. - Inkuber embryoer ved 28,5 ° C.Use et stereoskop å følge deres utvikling jevne som de nær 256-celle developmental scenen (ca. 2,5 HPF).
Merk: Ved behov, skift embryoer til forskjellige temperaturer for å sikre scenen matchende mellom parabiotic partnere (f.eks morfolino-injiserte embryoer utvikler ofte langsommere enn sine un-injisert kolleger Shifting un-injiserte embryoer til RT mens morfolino-injiserte embryoer er plassert. ved 28,5 ° C vil det resultere i sine etapper samkjøre etter et par timer med utvikling).
3. generasjon Parabiotic Sebrafisk embryoer ved Kirurgisk Fusion of Utvikling Blastulae
- Som embryoene nærmer 256-cellestadiet (ca. 2,5 HPF), overføre embryoene fra hver genetisk bakgrunn (dvs. genetisk mutant, transgene linjer og / eller genetisk manipulasjon) i separate agarose-belagt retter (f.eks en tallerken for morpholino- injiserte embryoer og en andre rett for kontroll embryoer). Alternativt overføre embryoene å rengjøre, ripefritt glass kanner eller glass petriskåler.
Merk: Unngå å bruke ubestrøket plast retter som embryoene vil holde seg til plast og bli skadet en gang ut av sine chorions. - Dekanter E3 media inntil akkurat nok væske gjenstår å dekke embryoer (ca. 7 - 10 ml). Tilsett 200 ul 50 mg / ml blanding av proteaser isolert fra den ekstracellulære væske av Streptomyces griseus (proteaser). Virvel embryoene forsiktig hvert par minutter.
- Når 50% av embryoene har kommet ut av sine chorions, som vanligvis tar 5-10 minutter, skyll dem tre ganger med en sjenerøs volum (ca 15 - 20 ml) av fersk E3 embryo medium.
- Dechorionate noen embryoer blir værende i sine chorions ved å forsiktig trekke dem opp i den modifiserte glass Pasteur pipette og deretter forsiktig avskaffe dem. Når embryoene har blitt dechorionated og vasket, erstatte E3 media med HCR løsning. Som et alternativ til proteaser, fjerne chorions manuelt ved hjelp av en fin pinsett. Mål å ha 60 - 100 dechorionated embryoer tilgjengelig for hver eksperimentell betingelse.
Merk: Dette er flere ganger mer enn til slutt vil bli brukt, men mange embryoer er sannsynlig å bli skadet under håndtering eller kirurgi for parabiosis. Når embryoene dechorionated, holde dem under vann, og ikke tillate dem å ta på overflaten av vannet, som overflatespenningen vil føre dem til å bli ødelagt. Husk at du bruker en høyere dose av proteaser gjør embryoene til å komme ut av sine chorions raskere og på en mer synkronisert mote. Ved bruk av en lavere dose av proteaser, embryoene tar lenger tid for å komme ut av sine chorions og gjør dette i en mindre synkron måte, noe som kan resultere i en del av embryoene blir skadet ved langvarig eksponering for proteaser.
- Dechorionate noen embryoer blir værende i sine chorions ved å forsiktig trekke dem opp i den modifiserte glass Pasteur pipette og deretter forsiktig avskaffe dem. Når embryoene har blitt dechorionated og vasket, erstatte E3 media med HCR løsning. Som et alternativ til proteaser, fjerne chorions manuelt ved hjelp av en fin pinsett. Mål å ha 60 - 100 dechorionated embryoer tilgjengelig for hver eksperimentell betingelse.
- Når 50% av embryoene har kommet ut av sine chorions, som vanligvis tar 5-10 minutter, skyll dem tre ganger med en sjenerøs volum (ca 15 - 20 ml) av fersk E3 embryo medium.
- Tine metylcellulose (laget i trinn 1.2 ovenfor) og sentrifuger i en tabletop sentrifuge på maks hastighet i 10 min til pellet uoppløste krystaller som vil skade embryoene eller brudd plommes.
- Etter sentrifugering ved å bruke den klare øvre fraksjon (ca. 75% av volumet). Transfer 1 til 1,5 cm diameter dråper methyl cellulose i en 1,5% agarose-belagt petriskål. Vær nøye med å unngå å trekke opp noen av pelle krystaller fra bunnen av røret.
- Bruke en markør for å forhåndsbestemme stillingen av hver dråpe på undersiden av fatet. Plasser 12 - 15 dråper (2 - 3 porsjoner 'verdt) metyl cellulose per 100 mm diameter petriskål. Forberede så mange plater som trengs per eksperiment.
Merk: Bruk hver dråpe for fusjon av et enkelt blastula par. Merket vil utpeke plasseringen av hver dråpe når media er lagt-på hvilket tidspunkt dråpene blir nesten usynlig.
- Forbered en 40 ml porsjon av antibiotika-supplert HCR løsning per agarose-belagt parabolen utarbeidet ovenfor i trinn 3.3. Til hver 40 ml porsjon av HCR legge penicillin-streptomycin ved 50 U / ml ampicillin, ved 50 U / ml og kanamycin ved 0,5 ug/ Ml.
- Når den er klar til å utføre blastula fusjoner, fylle nøye hver av skålene inneholdende metylcellulose dråper med 40 ml av den antibiotiske-supplert HCR løsning. Dersom HCR løsning tilsettes for raskt, kan den forstyrre dråpene.
- Fest modifisert glass Pasteur pipette (fremstilt i trinn 1.4 ovenfor) til en 10 ml pipette pumpe. Under et stereoskop samle en dechorionated embryo fra hver bakgrunn (for eksempel en morfolino-injisert embryo og en villtype embryo).
- Før dispensering av de to embryoer, bruk Pasteur pipette for å lage en liten fordypning i midten av metylcellulose fallet, deretter forsiktig avsette begge embryoer i forsenkningen.
Merk: Under overføringsprosessen, snu Pasteur pipette litt oppover slik at embryoene bosette seg i svingen av Pasteur pipette for å unngå deres å gjøre kontakt med overflaten av væsken på toppen eller bunnen av pipetten (som kan føre til their ruptur).
- Før dispensering av de to embryoer, bruk Pasteur pipette for å lage en liten fordypning i midten av metylcellulose fallet, deretter forsiktig avsette begge embryoer i forsenkningen.
- Umiddelbart etter innskudds embryoene inn i methyl cellulose, bruk en tre- eller plast håndtert erting nål med en gel-lasting pipette spissen på slutten (figur 1A) for å nøye flytte embryoene innenfor methyl cellulose slik at deres dyr polene er direkte berøre hverandre.
- Utnytte milde feiende bevegelser gjennom methyl cellulose nær embryoene å omplassere dem uten å berøre dem. La embryoene sitte i 5 min så methyl cellulose vil bosette seg i rundt dem. I løpet av denne tiden, legger du det neste paret inn i en annen dråpe.
Merk: Unngå direkte kontakt med embryoer og ta spesielt vare å ikke berøre noen del av plommesekken, som vil lett sprekke.
- Utnytte milde feiende bevegelser gjennom methyl cellulose nær embryoene å omplassere dem uten å berøre dem. La embryoene sitte i 5 min så methyl cellulose vil bosette seg i rundt dem. I løpet av denne tiden, legger du det neste paret inn i en annen dråpe.
- Bruk av glass nål verktøy, nøye sår hver embryo ved deres kontaktpunkt. Med en svak søm bevegelse, kan celler fra den første embryoet bli trukket inn i andre embryo og deretter tilbake igjen.På slutten av denne bevegelsen, holde nålen på plass for 2-3 sek, og deretter trekke det bort veldig sakte.
Merk: Det er en periode på ca 2 - 3 sekunder etter at embryoene blir såret hvor de to vev synes å være mer klebende og mer sannsynlig å feste til hverandre. Derfor tror vi at å holde nålen på plass kort etter såret bidrar til å holde såret vev av hver embryo i kontakt for den første perioden av tid umiddelbart etter såret. - La disse embryoene sitte i 10-15 min ved RT. I mellomtiden fortsetter å sy nye parene i andre dråper methyl cellulose. Etter 10 - 15 min, vurdere om det første par har forblitt festet (figur 2A).
Merk: Hvis embryoene er lenger festet, gjenta søm prosessen så lenge embryoene er yngre enn rundt 30% epiboly scenen. Vanligvis gjør dette for inntil tre forsøk på å sy embryoene sammen. Hvis embryoene synes å ha opprettholdt et vedlegg, men connection er ikke vesentlig, utføre ekstra søm på kanten av forbindelsen til å forsterke den. Unngå å riste eller flytte retter i løpet av de parabiotic kirurgi og ruge perioder.
Merk: Til tross for sin tidlige utviklingsstadiet og oppfattes skjørhet, kan celle masser av embryoene tolerere en betydelig mengde manipulering (dvs., såret og søm), og fortsatt utvikle seg normalt. Eggeplomme, men kan sprekke med bare den minste berøring, drepe fosteret. Når sy de to blastulae med glasset nålen, ikke komme i kontakt med grenseflaten mellom cellemasse og eggeplomme i hvert embryo. - Inkuber embryoene O / N på 28,5 ° C i den samme retten og media (ikke endre media). Ved neste morgen, vil embryoene har flyttet ut av de mest oppløste metyl cellulose dråper. Fjern eventuelle embryoer som ikke ble vellykket smeltet. Dekanter media og erstatte med en frisk 25 ml E3.
Merk: Hvis du arbeider med enpigmenterte stamme, tilsett 500 pl 0,15% (50x) phenylthiourea (PTU) til en sluttkonsentrasjon på 0,003% for å blokkere pigmentering. Embryoet må være kontinuerlig i PTU å opprettholde undertrykkelse av pigmentering.
4. Microscope oppsett, Image Acquisition, bearbeiding og analyse
- Fremstille 0,8% lavt smeltepunkt (LMP) agarose: Legg 0,8 g LMP agarose til 100 ml E3 og varme til den er helt oppløst. Mens det er varmt, aliquot 1 ml av LMP-agarose i 1,5 ml mikrofugerør i en 37 ° C varmeblokk. LMP-agarose vil forbli smeltet ved 37 ° C. Legg 40 ul av 4 mg / ml (25x), pH 7,0 Tricaine til hver 1 ml alikvot av LMP-agarose ved 37 ° C. Merk: Hvis du arbeider med en pigmentert belastning, tilsett 20 mL av 0,15% (50x) PTU til hver 1 ml delmengde.
- Den gjenværende LMP-agarose i flere måneder i forseglede 50 ml rør ved 4 ° C.
- Bedøve parabiotic embryoer som skal bli avbildet ved å tilsette 1 ml av 4 mg / ml (25x), pH 7,0 Tricainetil 25 ml E3 at embryoene er allerede i.
- Forsiktig virvel parabolen slik at embryoene vil pool i midten. Deretter bruker en bred-tipped plast overføringspipetten utarbeide embryoene i så lite væske som mulig. Slå pipetten oppreist og forsiktig sprette embryoene slik at de bosette til bunnen av pipetten.
- Med embryoene på bunnen av pipetten, overføre dem til en 1 ml alikvot av LMP-agarose ved lett berøring av pipettespissen til overflaten av agarose. Unngå å overføre overflødig væske da dette vil svekke den agarose.
- Etter å utvise overflødig væske fra pipetten, bruker pipette til å forsiktig blande embryoene i agarose, og deretter bruke pipette til å overføre alt av agarose og embryoer til godt over et glass-bunn (nr 1,5 dekkglass), 6- brønns plate.
Merk: Sørg for å forkaste pipetten etter overføring embryoene til bildebehandling plate. Residual agarose vil sette inne pipetten, rendering det ineffektiv for videre bruk. Snarere, bruk en ny pipette hver gang. - I henhold til et stereoskop, bruker en gel-lasting pipettespissen er festet på enden av en tre-håndteres erte nål for å posisjonere embryoene ned mot dekkglass (for å sikre at de er i arbeidsavstanden av mikroskopobjektiv) og i den ønskede orientering for bildebehandling.
Merk: Flytt kontinuerlig til agarose er fullt innstilt. Vær nøye med å montere parabiotic embryoene i henhold til hvilke embryo av paret skal avbildes. Gitt den tilfeldige orientering av sammenhengende embryoer, for noen av parene, kan det være vanskelig å avbilde begge embryoer. I dette scenariet, gjenopprette embryoene fra agarose ved hjelp av en pinsett og en bred-tipped plast overføringspipetten og deretter remontere for avbildning fra et annet perspektiv. - Så snart agarosen har herdet, dekke med 2 - 3 ml E3 supplert med Tricaine (PTU og om nødvendig).
- Bilde embryoene bruker en omvendt bredt felt epi-fluorescens, laser-skanning confocal, eller spinne disk confocal mikroskop. Velg målet mest hensiktsmessig for den ønskede bildebehandling. For en hel-embryo synsfelt, bruk en 4x objektiv. Velge en høyere forstørrelse, slik som et 20x objektiv, å avbilde et spesifikt vev 16, 19.
Merk: Hvis du bruker en oppreist mikroskop, montere i LMP agarose (tilsvarende ovenfor) på et glass dekkglass. Invertere glass dekkglass på et mikroskop-objektglass som har en ring av vakuum fett fylt med samme E3-Tricaine-PTU 16, 19. - Prosess kjøpte bilder med gratis bildeanalyse programvarepakker som NIH Image J / FIJI 16 19.
Merk: Tell celle tall og kvantifisere dynamikken som cellemigrasjon og celledeling ved hjelp av segmentering og sporing algoritmer 16, 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I samsvar med tidligere publiserte studier 15, vellykket parabiotic fusjon av sebrafisk embryo avhenger av iscenesettelse og orientering av de to embryoer og konsentrasjonen av metylcellulose. Med bare noen få enkle, rimelige verktøy, kirurgisk smeltet utviklings blastulae ble generert som vokste til parabiotic embryoer med felles sirkulasjon. Disse verktøyene er inkludert en modifisert Pasteur pipette, en 10 ml pipette pumpe, og tre behandles teasing nåler som ble brukt, enten alene eller sammen med en gel-lasting spiss eller glassmikroinjeksjon nål festet til enden av lab-film (figur 1).
Etter å ha plassert de to blastulae i 4% metylcellulose, og ved hjelp av gel-lasting spissen for å orientere dem med sine dyr poler vendt mot hverandre (figur 2A), ble embryoene omhyggelig såret ved deres kontaktpunkt med glassmikroinjeksjon needle (figur 2B). En større grad av såret (sammenlign figur 2B figur 2C), og borti fosteret par for å styrke en innledende forbindelse med ekstra såret, økt sannsynligheten for embryoene å opprettholde en forbindelse som resulterte i vellykket fusjon (figur 3A-C, Movie 1) og uten ytterligere morfologiske defekter eller forsinket utvikling. Når gjøres forsiktig, var nesten 100% av embryo parene smeltet, selv om en del av disse embryoer (rundt 25%) aldri etablert en sunn sirkulasjon i begge omganger. Ved å orientere de to blastulae med sine dyr polene direkte linje, ble pålitelige head-to-head eller plommesekk-til-plommesekk fusjoner generert med felles sirkulasjon. I de fleste tilfeller embryoene hadde to hjerter pumping en delt felles sirkulasjon (figur 3D).
For å bekrefte at embryoene faktisk delt opplaget, fluorescerende dekstran var injinjiseres inn i sirkulasjon, noe som kan ses i ettertid som sirkulerer gjennom begge embryoer (Film 2). I tillegg transgene embryoer som hadde GFP + erytrocytter (LCR: EGFP) ble fusjonert til embryoer som hadde mCherry + vaskulære endotelceller (flk1: HRAS-mCherry). Ved 48 HPF, ble GFP + erytrocytter observert sirkulerer gjennom flk1: HRAS-mCherry partner embryo (figur 4A og Movie 3). For å utvide anvendeligheten av den parabiotic system, ble temporal kontroll av genekspresjon tilsatt. Før fusjon, en av de to embryoer ble injisert med en hsp70: EGFP DNA-konstruksjon 20. Mens de smeltede embryoene vokser ved 28,5 ° C, ble det ikke observert fluorescens. I motsetning til dette, etter et kort 30 min varmesjokk ved 37 ° C, en klar GFP signal var synlig i en av de to embryoer (figur 4B). I noen tilfeller ble GFP + -cellerobservert sirkulerer i un-injiserte partner embryo. Således, å plassere et gen av interesse under kontroll av en varmesjokk promoter gir ytterligere temporal kontroll til studier som undersøker celle-celle eller indre-ytre funksjoner av kandidatgener.
Figur 1. Verktøy for generering Parabiotic Sebrafisk embryoer.
(A) Annotated bildet viser verktøy som brukes for kirurgisk fusjon for å utvikle blastulae. Verktøy omfatter et modifisert Pasteur pipette (topp), som brukes i forbindelse med en 10 ml pipette pumpe (grønn). Wood håndtert erting nåler brukes enten alene eller sammen med en plast gel-lasting pipette tips eller trukket glass mikroinjeksjon nålet fast til slutten med lab-film. (B) Bildet viser endene av tre glass mikroinjeksjon behovles som har blitt brutt med en tang på forskjellige diametre. Nålene blir liggende på toppen av en mikrometer; de minste linjene er plassert 10 mikrometer fra hverandre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Kirurgisk Fusion of Utvikling Blastulae.
Høy forstørrelse Bildene viser to sebrafisk embryoer på den høye utviklingstrinn, orientert med sine dyr poler vendt mot hverandre, før kirurgisk søm (A), umiddelbart etter minimal såret (B), og etter mer omfattende såret (C). 20 minutter senere er det klart at embryoene er blitt smeltet på grunnlag av den uavbrutte bro av celler mellom de to blastulae (D). Scalestolpe representerer 250 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Utvikling av Parabiotic Sebrafisk embryoer.
(AC) Bildene viser en hel-parabiont syn på tidlig utvikling like etter såret (A) og som embryoene fortsette å utvikle og gjennomgå epiboly (B og C) Disse bildene tilsvarer Movie 1. (D) Bildet viser en parabiotic embryo par ved 36 HPF. Embryoene er ved sine plommesekker, har to hjerter og deler en felles sirkulasjon. Skala barer representerer 250 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Visualisering Parabiosis med genetisk kodet Fluorescent Proteiner.
(A) Bilder (fluorescens alene, ikke sant, overlay med overført lys, venstre) viser hoderegionen av siamesiske embryoer ved 48 HPF. Bunnen embryo av dette paret er transgen for LCR: EGFP (erythroctyes, grønn) mens partner (øverst) er transgene for flk1: HRAS-mCherry, hvilke etiketter vaskulære endotelceller (rød). Grønne erytrocytter kan ses som sirkulerer gjennom partner embryo. Dette bildet tilsvarer Movie 3. (B) Venstre embryo i dette paret ble injisert med en hsp70: EGFP konstruere på en cellestadiet og deretter smeltet til en FN-injisert partner (høyre). Når dyrene ble varmesjokk ved 37 ° C i 30 minutter ved 36 HPF, ble den grønne fluorescensen av GFP observert i le ft embryo ved 60 HPF. Skala barer representerer 500 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Movie 1. Tidlig utvikling av kirurgisk smeltet sebrafisk blastulae. (Høyreklikk for å laste ned).
Filmen viser den tidlige utviklingen av et par kirurgisk smeltet sebrafisk blastulae. Epiboly kan sees oppstår samtidig i hvert embryo. Denne filmen er knyttet til figur 3A-C.
2.jpg "/>
Movie 2. Fluorescent dekstran injeksjon lyser en felles sirkulasjon. (Høyreklikk for å laste ned).
Filmen viser fluorescerende dekstran blir injisert i felles kardinal åre av en parabiotic embryo par på 60 HPF. Det fluorescerende fargestoff kan ses deretter sirkulerer gjennom begge embryoer.
Movie 3. Grønn blodet strømmer gjennom røde fartøy.mov "> (Høyreklikk for å laste ned).
Filmen viser hoderegionen av siamesiske embryoer ved 48 HPF. Bunnen embryo av dette paret er transgen for LCR: EGFP (erythroctyes, grønn) mens partner (øverst) er transgene for flk1: HRAS-mCherry, hvilke etiketter vaskulære endotelceller (rød). Grønne erytrocytter blir sett som sirkulerer gjennom partner embryo. Denne filmen er knyttet til figur 4A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Parabiotic fusjon har vært et kraftig verktøy for å undersøke cellulære funksjoner av kandidatgener hos voksne murine modeller og kyllingfoster 10-14. Mer nylig har en blastula fusjon metoden blitt beskrevet for å generere siamesiske sebrafisk embryoer 15. I den foreliggende protokollen, videobaserte veiledninger brukes til å demonstrere og bedre beskrive metodikk for å skape parabiotic sebrafisk embryo av ulike genetiske bakgrunn for å studere tidsmessige, celle egenverdi, og celle ytre rollene som kandidat gener av interesse i blodkreft utvikling og utover.
Den metode som er beskrevet i denne artikkelen ble nylig brukt til å spore HSC veksten i en embryo, migrasjon via blodsirkulasjonen til en embryo av forskjellig genetisk bakgrunn, og påfølgende innpoding og differensiering 16. I samråd med Kissa gruppens funn, iscenesettelse og embryo posisjonering ble funnet å bestemme suksessratenog anatomisk arten av parabiotic fusjon. Med noen viktige endringer i protokollen, ble parabionts generert med en signifikant høyere overlevelse. Disse inkluderer såret blastulae i større grad, holder nålen på plass for 2-3 sek etter såret, og deretter borti blastula par etter 15 minutter for å forsterke en innledende forbindelse med ekstra såret, om nødvendig. Med disse ekstra anbefalingene, nesten 100% av parabionts levde og forble festet, og 75% av dem hadde felles sirkulasjon.
For å innlemme et ytterligere element av eksperimentell kontroll til fremgangsmåten, blir parabiotic embryoer vist her for å være tolerante overfor varmesjokk, slik at for tidsmessig styring av genekspresjon i parabiotic sammenheng 20. En begrensning ved denne teknikk er at det i noen tilfeller parabiotic partner embryoer ikke er i samme plan etter parabiotic fusjon. dette kangjøre det vanskelig å montere embryoene i LMP-agarose for å spore celler i begge embryoer samtidig under anvendelse av time-lapse mikroskopi. For å unngå dette potensielle problemet, bør man har tenkt å generere flere parabiotic embryoer for å sikre den ønskede orientering er oppnådd. Alternativt kan embryoer utvinnes fra LMP med en fin pinsett og Pasteur pipette og re-montert for avbildning fra et annet perspektiv. Målet med denne protokollen var å gi et sett med klare og konsise instrukser å følge videobaserte veiledninger om hvordan å kirurgisk sikring utvikle blastulae å generere parabiotic sebrafisk embryoer.
Med de viktigste endringer og ytterligere anbefalinger for å øke overlevelse parabiont, vil denne protokollen forhåpentligvis styrke søkere som ønsker å bruke sammenhengende embryoer for å undersøke faktorer som regulerer cellemigrering, skjebne spesifikasjon, og differensiering i en rekke vev og celle sammenhenger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | ||
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| Antibiotics: | |||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 | |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 | |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| 50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 | |
| capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 | |
| Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| 10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 | |
| 100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 | |
| PTU. working stock is 0.003% (50x is 0.15%). for 500 ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 | |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 | |
| plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM | |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F | |
| plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 | |
| glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | |||
| Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 | |
| Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |
References
- Zon, L. I., Orkin, S. H. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Dzierzak, E., Speck, N. A. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nat Immunol. 9 (2), 129-136 (2008).
- Li, P., et al. Epoxyeicosatrienoic acids enhance embryonic haematopoiesis and adult marrow engraftment. Nature. 523 (7561), 468-471 (2015).
- Tam, P. P., Rossant, J. Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian development. Development. 130 (25), 6155-6163 (2003).
- Tanaka, M., Gertsenstein, M., Rossant, J., Nagy, A. Mash2 acts cell autonomously in mouse spongiotrophoblast development. Dev. Biol. 190 (1), 55-65 (1997).
- Morin-Kensicki, E. M., Faust, C., LaMantia, C., Magnuson, T. Cell and tissue requirements for the gene eed during mouse gastrulation and organogenesis. Genesis. 31 (4), 142-146 (2001).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348 (6303), 728-730 (1999).
- Parker, L., Stainier, D. Y. Cell-autonomous and non-autonomous requirements for the zebrafish gene cloche in hematopoiesis. Development. 126 (12), 2643-2651 (1999).
- Liao, E. C., Trede, N. S., Ransom, D., Zapata, A., Kieran, M., Zon, L. I. Non-cell autonomous requirement for the bloodless gene in primitive hematopoiesis of zebrafish. Development. 3 (3), 649-659 (2002).
- Kamran, P., Sereti, K. I., Zhao, P., Ali, S. R., Weissman, I. L., Ardehali, R. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
- Wagers, A. J., Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L. Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science. 297 (5590), 2256-2259 (2002).
- Hervey, G. R. The effects of lesions in the hypothalamus in parabiotic rats. J. Physiol. 145 (2), 336-352 (1959).
- Goldman, D. C., Bailey, A. S., Pfaffle, D. L., Al Masri, A., Christian, J. L., Fleming, W. H. BMP4 regulates the hematopoietic stem cell niche. Blood. 114 (20), 4393-4401 (2009).
- Dieterlen-Lièvre, F., Martin, C., Beaupain, D. Quail-chick chimaeras and parabionts: several new models to investigate early developmental events in the haemopoietic system. Folia Biol (Praha). 25 (5), 293-295 (1979).
- Demy, D. L., Ranta, Z., Giorgi, J. M., Gonzalez, M., Herbomel, P., Kissa, K. Generating parabiotic zebrafish embryos for cell migration and homing studies). Nat. Methods. 10 (3), 256-258 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126 (26), 2811-2820 (2015).
- Murayama, E., Sarris, M., Redd, M., Le Guyader, D., Vivier, C., Horsley, W., Trede, N., Herbomel, P. NACA deficiency reveals the crucial role of somite-derived stromal cells in haematopoietic niche formation. Nat Commun. 28 (6), 8375 (2015).
- Shah, D. I., et al. Mitochondrial Atpif1 regulates haem synthesis in developing erythroblasts. Nature. 491 (7425), 608-612 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160 (1-2), 241-252 (2015).
- Adám, A., Bártfai, R., Lele, Z., Krone, P. H., Orbán, L. Heat-inducible expression of a reporter gene detected by transient assay in zebrafish. Exp. Cell Res. 256 (1), 282-290 (2000).
