Abstract
parabiosis cirúrgica de dois animais de diferentes origens genéticas cria um cenário único para estudar células-intrínseca contra papéis de células-extrínseca para genes candidatos de interesse, comportamentos migratórios de células e sinais de secretada em configurações genéticas distintas. Porque os animais parabiótica compartilhar uma circulação comum, qualquer sangue ou fator transmitidas pelo sangue de um animal serão trocadas com o seu parceiro e vice-versa. Assim, as células e os factores moleculares derivadas de um fundo genético pode ser estudado no contexto de um segundo fundo genético. Parabiose de ratinhos adultos tem sido amplamente utilizado para a pesquisa do envelhecimento, cancro, diabetes, obesidade, e desenvolvimento do cérebro. Mais recentemente, parabiose de embriões de peixe-zebra foi usado para estudar a biologia do desenvolvimento da hematopoiese. Em contraste com os ratinhos, a natureza transparente de embriões de peixe-zebra permite a visualização directa das células no contexto parabiótica, tornando-se um método único e poderoso para a investigação de fmecanismos celulares e moleculares undamental. A utilidade desta técnica, no entanto, é limitado por uma curva de aprendizagem para gerar os embriões de peixe-zebra parabiótica. Este protocolo fornece um método passo-a-passo sobre como cirurgicamente fundir o blástulas de dois embriões de peixe-zebra de diferentes origens genéticas para investigar o papel de genes candidatos de interesse. Além disso, os embriões de peixe-zebra parabiótica são tolerantes ao choque térmico, tornando o controlo temporal da expressão do gene possível. Este método não requer um sofisticado set-up e tem amplas aplicações para estudar a migração de células, especificação de destino, e diferenciação in vivo durante o desenvolvimento embrionário.
Introduction
Criação de mosaicos genéticos (quimeras) entre o tipo selvagem e animais geneticamente modificados é uma estratégia bem estabelecida e clássica para a investigação de células-intrínseca contra as funções das células-extrínseca de genes candidatos 1-6. Blástula transplante no peixe-zebra tem sido amplamente utilizada para gerar embriões quiméricos para estudos de célula-autonomia 7-9. Dependendo do tecido de interesse, no entanto, pode ser um desafio para segmentar previsivelmente células do doador para o tecido desejado (por exemplo, sangue) 1-3, 7-9. Geneticistas rato há muito utilizados métodos cirúrgicos parabiótica para gerar organismos siameses com uma circulação compartilhada 10-14. Porque os animais parabiótica compartilhar uma corrente sanguínea comum, as interações entre células que se originou a partir de um animal com células do outro animal de um fundo genético diferente podem ser estudadas 10-16. Recentemente, o grupo de Karima Kissa demonstraram elegantemente a capacidade de crecomeu embriões de peixe-zebra siameses e depois usar este sistema para estudar tronco hematopoiéticas e células progenitoras (HSPC) a migração 15. Além disso, parabiosis peixe-zebra foi recentemente utilizado para investigar o papel da caderina endotelial 5 em células-tronco hematopoiéticas (HSC) emergência e migração, 16 e estudar o papel das células do estroma no nicho HSPC durante o desenvolvimento do peixe-zebra 17.
Ao contrário dos ratos, os embriões de peixe-zebra são transparentes e permitir a visualização directa das células durante o desenvolvimento parabiótica, tornando o sistema único e poderoso. O utilitário de parabiosis no peixe-zebra, no entanto, é limitada por uma curva de aprendizagem, e cirurgia parabiótica sobre os embriões delicados pode ser tecnicamente desafiadora, sem instruções detalhadas e demonstração visual. O objetivo deste protocolo é fornecer um conjunto de instruções claras, passo-a-passo para acompanhar tutoriais em vídeo sobre como gerar embriões de peixe-zebra parabiótica para estudartemporal de células-intrínseca, ou funções das células-extrínseca de um gene (s) candidato por fusão cirúrgica de desenvolver blástulas tetra. modificações importantes e recomendações adicionais para aumentar a sobrevida parabiont e novas aplicações experimentais estão incluídos.
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Protocol
Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal Hospital Infantil de Boston. Este protocolo é modificado de um método previamente publicado a 15.
1. Preparação de Reagentes (dias ou semanas de antecedência)
- Prepare 1,5% pratos revestidos por agarose. Adicionar 1,5 g de agarose a 100 ml de meio de Zebrafish E3 em uma garrafa de Erlenmeyer. Calor, dissolver a agarose, e depois verter em aproximadamente 5 ml de 100 mm de diâmetro x 20 mm de placas de petri profundas.
Nota: Estes são usados para dechorionation de embriões (Etapa 3.1) e para a cirurgia parabiótica (Passo 3.3). Armazenar pratos de agarose revestidas a 4 ° C durante algumas semanas; levá-los para fora do frigorífico e aquecimento à temperatura ambiente na manhã do dia da cirurgia parabiótica. - Prepare a 4% de metil-celulose. Dissolve-se 4 g de pó de celulose de metilo em 100 ml de E3, em um balão de Erlenmeyer com uma barra de agitação. Colocar o balão sobre uma placa de agitação a 4 ° C, definida para a velocidade mais baixa, e deixá-lo misturarpor até 2 dias.
- Intermitentemente use uma espátula para quebrar aglomerados brancos de metil-celulose. Os cristais de metil celulose não se dissolve totalmente nesta concentração. Quando a solução se torna claro e parece homogénea, sem grumos brancos restante, parte alíquota da solução em tubos de 1,5 ml de microcentrífuga e congelamento a -20 ° C para armazenamento a longo prazo.
Nota: as concentrações mais baixas de metilcelulose pode ser utilizado; No entanto, esta percentagem mais elevada, metilcelulose mais viscoso produziu os melhores resultados.
- Intermitentemente use uma espátula para quebrar aglomerados brancos de metil-celulose. Os cristais de metil celulose não se dissolve totalmente nesta concentração. Quando a solução se torna claro e parece homogénea, sem grumos brancos restante, parte alíquota da solução em tubos de 1,5 ml de microcentrífuga e congelamento a -20 ° C para armazenamento a longo prazo.
- Preparar a solução de cálcio elevado Ringer (HCR). Para fazer 400 ml de solução HCR, mistura 8 mL de 5M NaCl (116 mM final), 400 ul de KCl 3M (2,9 mM final), 800 ul de 5M de CaCl2 (10 mM final) e 2 mL de HEPES 1 M (5 mM final) com 390 ml de meio E3.
Nota: A solução da loja HCR a 4 ° C durante algumas semanas; aquecimento à temperatura ambiente na manhã do dia da cirurgia parabiótica. - Prepare 5 - 6 pipetas Pasteur modificados para a transferênciatocar blástula pares. Resumidamente aquecer a extremidade da pipeta ao longo de um bico de Bunsen. Em seguida, usando uma pinça grandes, dobrar a extremidade da pipeta para aproximadamente 45 ° C, enquanto ele ainda está quente.
- Para garantir que não existem arestas cortantes que possam danificar embriões, segure a ponta da pipeta brevemente na chama por cerca de 3 segundos. Isto irá suavizar / polonês a extremidade da pipeta. Esta pipeta de Pasteur de vidro modificado é utilizado em conjunto com uma pipeta 10 ml de bomba (Figura 1) no passo 3.5 a seguir.
- Preparar as ferramentas de seringas de vidro para costura cirúrgica de pares de blástula. Puxe 2 - 3 agulhas de vidro como se fez para microinjeção de embriões de peixe-zebra. Use laboratório de película para corrigir cada agulha de vidro para o final de uma agulha provocação lenha ou de plástico de cabo (Figura 1A). Usando fórceps, parta a ponta da agulha com um diâmetro de cerca de 20 - 30 | im. Use um micrômetro estágio para orientar esta etapa (Figura 1B).
Nota: O tamanho do NEponta edle é importante. Se a ponta for muito grande, torna-se difícil de controlar com precisão e pode causar danos excessivos. Se a ponta é demasiado pequeno, é difícil para os embriões suficientemente enrolada.
2. Criação de casais reprodutores de Zebrafish e colheita de embriões (dia -1 para o Dia 0)
- Configurar casais reprodutores de peixe-zebra adulto. Configurar peixes na noite anterior à cirurgia parabiosis deve ser conduzida. Use divisórias para separar machos e fêmeas. Para aumentar as chances de que os embriões desejados serão obtidos, criados vários pares de cada linha. Nós achamos que tipicamente 20 - 50% dos pares vão aparecer.
- Na manhã seguinte, retire os divisores e permitir o acasalamento. Recolher qualquer embriões usando um chá coador de malha fina, em seguida, transferi-los para uma placa de Petri contendo meio embrião E3 18.
- Embriões micro-injectar como desejado (por exemplo, com 25 pg de DNA de plasmídeo, 200 pg de ARNm, ou com 1-6 ng morfolino) dentro de 1 hora da recolha. Permitir-lhescrescer até o estágio de 256 células. Se a construção de expressão de ADN é colocado sob o controlo de um promotor de choque térmico (por exemplo, hsp70, Figura 4B), controlar o momento da expressão do gene pelo calor chocar os parabionts a 37 ° C, numa fase posterior (por ex., Em 36 HPF ).
Nota: Como uma alternativa para um transgene fluorescente, dextrano fluorescente pode ser adicionado ao DNA, RNA, ou mistura de injecção morfolino (por exemplo, dextrano, azul cascata a 2 mg / ml). O corante de dextrano não irá interferir com o desenvolvimento normal e permitirão que para o embrião injectada a ser identificado sob a luz fluorescente apropriado após a fusão parabiótica. Alternativamente, o parabiose de uma estirpe pigmentado (por exemplo, AB), com uma estirpe não-pigmentadas (por exemplo, Casper) poderia ser usado para identificar o embrião injectado em fases posteriores. - Incubar os embriões a 28,5 ° C.Use um estereoscópio para acompanhar o seu desenvolvimento periodicamente conforme eles se aproximam o dev de 256 célulasestágio elopmental (aproximadamente 2,5 hpf).
Nota: Se necessário, deslocar embriões a diferentes temperaturas para garantir fase correspondência entre os parceiros parabiótica (por exemplo, os embriões injetados-morfolino desenvolvem frequentemente mais lento do que os seus homólogos com injecção de un Mudando os embriões injetados pela ONU para RT enquanto os embriões injetados-morfolino são colocados. a 28,5 ° C resultará em seus estágios alinhando depois de um par de horas de desenvolvimento).
3. Geração de parabiótica embriões Zebrafish por Fusion cirúrgica de Desenvolvimento blástulas
- À medida que os embriões se aproximar da fase de 256 células (aproximadamente 2,5 HPF), transferir os embriões a partir de cada fundo genético (isto é, mutante genética, linhas transgénicas e / ou manipulação genética) em placas revestidas com agarose separadas (por exemplo, um prato para morfolino- embriões injetados e um segundo prato de embriões de controle). Em alternativa, transferir os embriões para limpar, copos de vidro sem riscar ou placas de Petri de vidro.
Nota: Evite o uso de pratos de plástico não revestidos, como os embriões vai ficar com o plástico e ser danificado uma vez fora de seus córions. - Decantar os meios E3 até que apenas permanece líquido suficiente para cobrir os embriões (aproximadamente 7 - 10 ml). Adicionar 200 ul de 50 mg / ml de mistura de proteases isoladas a partir do fluido extracelular de Streptomyces griseus (proteases). Agitar os embriões suavemente a cada dois minutos.
- Quando 50% dos embriões têm de sair de suas córions, que normalmente leva 5 - 10 min, lavá-los três vezes com um volume generoso (cerca de 15 - 20 ml) de meio E3 embrião fresco.
- Dechorionate quaisquer embriões restantes em seus córions delicadamente sua elaboração para a pipeta Pasteur de vidro modificado e, em seguida, delicadamente desfazendo-los. Uma vez que os embriões foram dechorionated e lavou-se, substitua a mídia E3 com uma solução de HCR. Como uma alternativa a proteases, remover os córions manualmente utilizando uma pinça fina. Objectivo de ter 60-100 dechorembriões ionated disponíveis para cada condição experimental.
Nota: Este é várias vezes mais do que acabará por ser utilizado, mas muitos embriões são susceptíveis de ser danificado durante o manuseamento ou a cirurgia para parabiose. Uma vez que os embriões são dechorionated, mantê-los submersa e não permitir que eles para tocar a superfície da água, como a tensão superficial vai levá-los a ser destruído. Tenha em mente que a utilização de uma dose mais elevada de proteases permite que os embriões para sair dos seus córions mais cedo e de forma mais sincronizada. Quando se utiliza uma dose inferior de proteases, os embriões demorar mais tempo a sair do seu córions e fazê-lo de uma forma síncrona menos, o que pode resultar em uma porção dos embriões ser danificada por exposição prolongada a proteases.
- Dechorionate quaisquer embriões restantes em seus córions delicadamente sua elaboração para a pipeta Pasteur de vidro modificado e, em seguida, delicadamente desfazendo-los. Uma vez que os embriões foram dechorionated e lavou-se, substitua a mídia E3 com uma solução de HCR. Como uma alternativa a proteases, remover os córions manualmente utilizando uma pinça fina. Objectivo de ter 60-100 dechorembriões ionated disponíveis para cada condição experimental.
- Quando 50% dos embriões têm de sair de suas córions, que normalmente leva 5 - 10 min, lavá-los três vezes com um volume generoso (cerca de 15 - 20 ml) de meio E3 embrião fresco.
- Descongelar o metilcelulose (feita no Passo 1.2 acima) e centrifugar em uma centrífuga de mesa na velocidade máxima de 10 min para sedimentar cristais não dissolvidos que irá danificar os embriões ou ruptura, os seus gemas.
- Após centrifugação, utilizar a fracção superior clara (aproximadamente 75% do volume). Transferir 1 - gotas com diâmetro de 1,5 cm de metil celulose em uma placa de Petri de 1,5% de agarose-revestido. Tome cuidado para evitar a elaboração de qualquer um dos cristais peletizadas a partir do fundo do tubo.
- Use um marcador para predeterminar a posição de cada gotícula no lado inferior do prato. Coloque 12 - 15 gotas (2 - no valor de 3 alíquotas ') de metil celulose por 100 milímetros de diâmetro prato de petri. Prepare como muitos pratos como necessários por experimento.
Nota: Use cada gota para a fusão de um único par de blástula. A marca irá designar a localização de cada gota uma vez que a mídia é acrescentado no ponto em que as gotas se tornam quase invisíveis.
- Preparar 40 ml de uma alíquota de solução de HCR suplementado com antibiótico por prato revestido-agarose, preparada antes no passo 3.3. Para cada 40 ml de aliquota de HCR adicionar penicilina-estreptomicina a 50 U / ml de ampicilina, a 50 U / ml e canamicina a 0,5 ug/ Ml.
- Quando estiver pronto para executar blástula fusões, preencher cuidadosamente cada uma das placas contendo gotículas de celulose de metilo com 40 ml da solução de HCR suplementado com antibiótico. Se a solução HCR for adicionada muito rapidamente, pode perturbar as gotículas.
- Anexar a pipeta Pasteur de vidro modificado (feita no Passo 1.4 acima) para uma bomba de pipeta de 10 ml. Sob um estereoscópio recolher um embrião dechorionated de cada fundo (por exemplo, um embrião com injecção de morfolino e um tipo selvagem de embriões).
- Antes de fornecer as duas embriões, utilizar a pipeta de Pasteur para fazer uma pequena depressão no meio da queda de metil celulose, então suavemente depositar ambos os embriões para a depressão.
Nota: Durante o processo de transferência, transformar a pipeta de Pasteur ligeiramente para cima de modo que os embriões se adaptar à curvatura da pipeta de Pasteur de modo a evitar o seu contacto tomada com a superfície do líquido, na parte superior ou inferior da pipeta (o que pode levar para theiruptura r).
- Antes de fornecer as duas embriões, utilizar a pipeta de Pasteur para fazer uma pequena depressão no meio da queda de metil celulose, então suavemente depositar ambos os embriões para a depressão.
- Imediatamente após a deposição dos embriões em que a celulose de metilo, usar uma agulha provocando a lenha ou plástico tratado com uma ponta de pipeta de gel de carga na extremidade (Figura 1A) para reposicionar cuidadosamente os embriões dentro da metil-celulose de tal modo que os seus pólos animais são directamente tocando um ao outro.
- Utilize movimentos arrebatadores suaves através da metil-celulose perto dos embriões para reposicioná-los sem tocá-los diretamente. Deixe os embriões sentar-se por 5 minutos para que o metil celulose vai se estabelecer em torno deles. Durante este tempo, carregar o próximo par em outra queda.
Nota: Evite o contato direto com os embriões e ter um cuidado especial para não tocar qualquer parte do saco vitelino, que facilmente se romper.
- Utilize movimentos arrebatadores suaves através da metil-celulose perto dos embriões para reposicioná-los sem tocá-los diretamente. Deixe os embriões sentar-se por 5 minutos para que o metil celulose vai se estabelecer em torno deles. Durante este tempo, carregar o próximo par em outra queda.
- Usando a ferramenta de agulha de vidro, cuidadosamente enrolado cada embrião no seu ponto de contato. Com um movimento suave costura, células a partir do primeiro embrião pode ser puxado para dentro do segundo embrião e, em seguida, novamente.No final deste movimento, segure a agulha no lugar de 2-3 segundos e depois desenhá-lo afastado muito lentamente.
Nota: Não é um período de cerca de 2-3 segundos após os embriões são feridos em que os dois tecidos parecem ser mais aderentes e mais provável para anexar a um outro. Assim, acreditamos que segura a agulha no lugar brevemente após o ferimento ajuda a manter os tecidos feridos de cada embrião em contacto durante o período inicial de tempo imediatamente após o ferimento. - Permitir que esses embriões para se sentar por 10 - 15 min a RT. Nesse meio tempo, continuar a costurar novos pares em outras gotas de metil-celulose. Após 10 - 15 minutos, avaliar se o primeiro par permaneceu ligada (Figura 2A).
Nota: Se os embriões são mais tempo ligado, repetir o processo de costura, enquanto os embriões são mais jovens do que em torno da fase epiboly 30%. Normalmente, isso permite até três tentativas para costurar os embriões juntos. Se os embriões parecem ter mantido um anexo mas o cONEXÃO não é substancial, executar costura adicional na extremidade da ligação para o reforçar. Evitar agitar ou mover pratos durante os períodos de cirurgia e de incubação parabiótica.
Nota: Apesar do seu estádio de desenvolvimento precoce e fragilidade percebido, as massas de células dos embriões pode tolerar uma quantidade substancial de manipulação (ou seja, ferindo e costura), e ainda se desenvolvem normalmente. A gema, no entanto, pode romper-se, apenas o menor toque, matando o embrião. Quando costurando os dois blástulas com a agulha de vidro, não de fazer contato com a interface entre a massa celular e gema de cada embrião. - Incubar os embriões O / N a 28,5 ° C no mesmo prato e meios de comunicação (não altere a mídia). Na manhã seguinte, os embriões ter saído das gotículas metil celulose principalmente dissolvidos. Remova todos os embriões que não foram fundidas com sucesso. Decantar a mídia e substituir por um novo 25 ml E3.
Nota: Se trabalhar com umestirpe pigmentada, adicionar 500 ul feniltioureia 0,15% (50x) (PTU) para uma concentração final de 0,003% para bloquear a pigmentação. Embriões terá de permanecer continuamente em PTU para manter a supressão de pigmentação.
4. Setup microscópio, aquisição de imagens, processamento e análise
- Prepare 0,8% de agarose de baixo ponto de fusão (LMP): Adicionar 0,8 g LMP agarose a 100 ml E3 e calor até que esteja totalmente dissolvido. Enquanto quente, alíquota de 1 ml de agarose LMP em 1,5 ml tubos de microcentrífuga em um bloco de aquecimento C 37 °. A agarose LMP permanecerá fundido a 37 ° C. Adicionar 40 ul de 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricaina a cada alíquota de 1 ml de agarose LMP a 37 ° C. Nota: Se estiver trabalhando com uma cepa pigmentada, adicionar 20 mL de 0,15% (50x) PTU para cada alíquota de 1 ml.
- Armazenar a agarose LMP restante durante vários meses em tubos de 50 ml selados a 4 ° C.
- Anestesiar embriões parabiótica a ser trabalhada pela adição de 1 ml de 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricainapara os 25 ml de E3 que os embriões se encontra.
- Agite suavemente o prato de modo que os embriões serão piscina no meio. Em seguida, usando uma pipeta de plástico de largura de ponta elaborar os embriões em tão pouco de líquido possível. Vire a pipeta na posição vertical e gentilmente saltar os embriões para que eles se depositam no fundo da pipeta.
- Com os embriões na parte inferior da pipeta, transferi-los para uma aliquota de 1 ml de agarose LMP por tocar levemente a ponta da pipeta para a superfície da agarose. Evitar a transferência de líquido em excesso, pois isso irá diluir a agarose.
- Depois de expulsar o excesso de líquido da pipeta, use a pipeta para misturar delicadamente os embriões dentro do agarose, em seguida, use a pipeta para transferir todo o agarose e embriões para o bem de um-fundo de vidro (No. 1.5 lamela), 6- bem placa.
Nota: Certifique-se de descartar a pipeta após a transferência dos embriões para a placa de imagem. agarose residual irá definir dentro da pipeta, rendering-lo ineficaz para uso posterior. Em vez disso, utilizar uma pipeta de novo de cada vez. - Sob um estereoscópio, utilizar uma ponta de pipeta de gel de carregamento fixado na extremidade de uma agulha de provocação de cabo de madeira para posicionar os embriões para baixo para a tampa de vidro (para assegurar que estão dentro da distância de trabalho do objectivo microscópio) e na orientação desejada para imagiologia.
Nota: Reposicionar continuamente até que a agarose foi totalmente definida. Tome o cuidado de montar os embriões parabiótica segundo a qual embrião do par está a ser trabalhada. Dada a orientação aleatória dos embriões conjugados, para alguns pares pode ser difícil para a imagem ambos os embriões. Neste cenário, recuperar os embriões a partir da agarose usando uma pinça e uma pipeta de plástico de largura de ponta e remontar para geração de imagens a partir de uma perspectiva diferente. - Uma vez que a agarose definiu, cobrir com 2 - 3 ml de E3 suplementadas com tricaina (PTU e, se necessário).
- Imagem dos embriões usando um grande campo de epi-fluorescência invertido, laser-varredura confocal, ou girando disco microscópio confocal. Seleccionar o objectivo mais adequado para a imagem desejada. Para um campo de todo o embrião de vista, use um objectivo de 4x. Seleccionar uma ampliação mais elevada, tal como uma objectiva de 20x, a imagem de um tecido específico 16, 19.
Nota: Se estiver usando um microscópio vertical, montagem em LMP agarose (semelhante ao anterior) em uma lamela de vidro. Inverter a lamela de vidro sobre uma lâmina de microscópio de vidro que tem um anel de graxa de vácuo preenchido com o mesmo E3-tricaina-PTU 16, 19. - Processo de aquisição de imagens usando pacotes gratuitos de software de análise de imagem, tais como NIH Imagem J / FIJI 16, 19.
Nota: Contagem o número de células e quantificar a dinâmica como a migração celular e divisão celular usando segmentação e rastreamento algoritmos 16, 19.
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Representative Results
Consistente com os estudos anteriormente publicados 15, parabiótica fusão bem sucedida de embriões de peixe-zebra depende do armazenamento temporário e da orientação dos dois embriões e a concentração de metilcelulose. Com apenas alguns simples, ferramentas de baixo custo, blástulas tetra desenvolvimento cirurgicamente fundidos foram gerados que cresceu em embriões parabiótica com circulação compartilhada. Estas ferramentas incluída uma pipeta Pasteur modificado, uma bomba de pipeta de 10 mL, e de madeira tratadas agulhas provocando que foram utilizados, quer isoladamente ou com uma agulha de ponta de gel-carregamento ou microinjecção de vidro fixo à extremidade de laboratório de película (Figura 1).
Depois de colocar as duas blástulas em metilcelulose a 4% e, utilizando a ponta de gel de carregamento para orientá-los com os seus pólos animais que enfrentam uns aos outros (Figura 2A), os embriões foram cuidadosamente ferido no seu ponto de contacto com o vidro n microinjecçãoeedle (Figura 2B). Um maior grau de ferir (comparar com a figura 2B a Figura 2C), e revisitando pares de embriões para reforçar uma ligação inicial com ferimento adicional, aumentou a probabilidade de os embriões manter uma conexão que resultou na fusão bem sucedida (Figura 3A-C, Filme 1) e sem defeitos morfológicos adicionais ou atraso no desenvolvimento. Quando feito com cuidado, quase 100% dos pares de embriões foram fundidos, embora uma fracção destes embriões (cerca de 25%) nunca estabelecido uma circulação saudável em ambas as metades. Orientando os dois blástulas com seus pólos de animais diretamente alinhados, fusões confiáveis cabeça-de-cabeça ou saco vitelino-a-saco vitelino foram gerados com circulação compartilhada. Na maioria dos casos, os embriões tinham dois corações de bombagem uma circulação comum compartilhada (Figura 3D).
Para confirmar que os embriões efectivamente partilhados sua circulação, dextrano fluorescente foi injectido em circulação, o que pode ser visto posteriormente circulando através de ambos os embriões (Filme 2). Para além disso, os embriões transgénicos que tinham GFP + eritrócitos (LCR: eGFP) foram fundidos com os embriões que tinham mCherry + vascular células endoteliais (Flk1: HRAS-mCherry). Em 48 hpf, GFP + eritrócitos foram observados circula através do Flk1: embrião parceiro HRAS-mCherry (Figura 4A e Filme 3). Para expandir a utilidade do sistema de parabiótica, foi adicionada controlo temporal da expressão do gene. Antes da fusão, um dos dois embriões foram injectados com uma Hsp70: ADN eGFP 20 construir. Enquanto os embriões foram fundidos a crescer a 28,5 ° C, não foi observada nenhuma fluorescência. Em contraste, depois de um breve choque de calor 30 min a 37 ° C, um sinal de GFP clara foi visível em um dos dois embriões (Figura 4B). Em alguns casos as células GFP + eramObservou que circula no embrião parceiro injetou-un. Assim, colocando um gene de interesse sob o controlo de um promotor de choque térmico adicional fornece controlo temporal para os estudos que investigam as funções das células-intrínseca ou extrínseca-celulares de genes candidatos.
Figura 1. ferramentas para gerar parabiótica embriões Zebrafish.
(A) imagem anotada mostra ferramentas utilizadas para a fusão cirúrgica de desenvolver blástulas tetra. As ferramentas incluem uma pipeta de Pasteur modificado (topo), que é usado em conjunto com uma bomba de pipeta de 10 ml (verde). Madeira tratada provocando agulhas são utilizadas por si só ou com uma ponta de pipeta de gel de carregamento de plástico ou micro-injecção de vidro puxado agulhado fixada à extremidade com o laboratório de película. (B) A imagem mostra as extremidades da necessidade microinjecção três vidroles que foram quebrados com uma pinça em diferentes diâmetros. As agulhas são deitado em cima de um micrômetro; as menores linhas são espaçadas 10 mm de distância. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Fusão cirúrgica de Desenvolvimento blástulas.
As imagens de alta ampliação mostra dois embriões de peixe zebra na fase alta de desenvolvimento, orientados com os seus pólos animais de frente para o outro, antes da costura cirúrgica (A), imediatamente após o ferimento mínima (B), e após o ferimento mais substancial (C). 20 min depois verifica-se que os embriões foram fundidas com sucesso com base na ponte ininterrupto de células entre os dois blástulas (D). Escalabarra representa 250 m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Desenvolvimento de parabiótica embriões Zebrafish.
(AC) Imagens mostram uma visão inteira-parabiont do desenvolvimento inicial apenas após o ferimento (A) e, como os embriões continuam a desenvolver e submeter epiboly (B e C) Estas imagens correspondem ao filme 1. (D) A imagem mostra um par de embriões parabiótica aos 36 hpf. Os embriões são conectados em seus sacos de gema, tem dois corações e compartilhar uma circulação comum. Barras de escala representam 250 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. A visualização Parabiose com proteínas fluorescentes geneticamente codificados.
(A) Imagens (fluorescência sozinho, direita; sobreposição com luz transmitida, esquerda) mostram a região da cabeça dos embriões siameses em 48 hpf. O embrião fundo deste par é transgénico para LCR: eGFP (erythroctyes, verde), enquanto seu parceiro (em cima) é transgênico para Flk1: HRAS-mCherry, que rotula células endoteliais vasculares (vermelho). eritrócitos verde pode ser visto circulando através do embrião parceiro. Esta imagem corresponde ao filme 3. (B) O embrião esquerda neste par foi injectado com um Hsp70: eGFP construir no estádio de uma célula e, em seguida, fundida a um parceiro de un-injectados (à direita). Quando os animais foram sujeitas a choque térmico a 37 ° C durante 30 min a 36 hpf, observou-se a fluorescência verde de GFP no le embrião pés a 60 HPF. Barras de escala representam 500 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1. desenvolvimento precoce de blástulas tetra peixe-zebra cirurgicamente fundidos. (Clique direito a download).
Filme mostra o desenvolvimento precoce de um par de blástulas tetra peixe-zebra cirurgicamente fundidos. Epiboly pode ser visto que ocorre simultaneamente em cada embrião. Este filme está relacionada à Figura 3A-C.
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Filme 2. injecção de dextrano fluorescente ilumina uma circulação compartilhada. (Clique direito a download).
Filme mostra dextrano fluorescente de ser injetado na veia cardinal comum de um par de embriões parabiótica a 60 hpf. O corante fluorescente pode ser visto posteriormente circulando através de ambos os embriões.
Filme 3. sangue verde que flui através dos vasos vermelhos.mov "> (Clique direito a download).
Filme mostra a região da cabeça dos embriões siameses em 48 hpf. O embrião fundo deste par é transgénico para LCR: eGFP (erythroctyes, verde), enquanto seu parceiro (em cima) é transgênico para Flk1: HRAS-mCherry, que rotula células endoteliais vasculares (vermelho). eritrócitos verdes são vistos circulando através do embrião parceiro. Este filme está relacionada com a Figura 4A.
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Discussion
Fusion parabiótica tem sido uma ferramenta poderosa para investigar as funções celulares de genes candidatos em modelos murinos adultos e embriões de galinha 10-14. Mais recentemente, um método de fusão blástula foi descrito para a geração de embriões de peixe-zebra siameses 15. No presente protocolo, tutoriais em vídeo são usados para demonstrar e descrever a metodologia para a criação de embriões de peixe-zebra parabiótica de diferentes origens genéticas para estudar funções temporais, células-intrínseco e células-extrínseca de genes candidatos de interesse no desenvolvimento hematopoiético melhor e além.
O método descrito neste trabalho foi recentemente usada para rastrear HSC emergência em um embrião, a migração através do sangue-circulação para um embrião de diferentes antecedentes genéticos, e enxerto posterior e diferenciação 16. De acordo com o posicionamento resultados, estadiamento e embrião do grupo Kissa foram encontrados para determinar a taxa de sucessoe da natureza anatómica da fusão parabiótica. Com algumas modificações importantes para o protocolo, parabionts foram gerados com uma taxa de sobrevivência significativamente maior. Estes incluem ferindo o blástulas a um maior grau, que prende a agulha no lugar para 2-3 segundos após o ferimento, e, em seguida, rever blástula pares após 15 min para reforçar uma ligação inicial com o ferimento adicional, se necessário. Com estas recomendações adicionais, quase 100% dos parabionts sobreviveu e permaneceu ligado, e 75% deles compartilhou uma circulação comum.
Para incorporar um elemento adicional de controle experimental para o método, embriões parabiótica são demonstradas aqui para ser tolerante ao choque térmico, permitindo o controle temporal da expressão gênica no contexto parabiótica 20. Uma limitação desta técnica é que, em alguns casos, os embriões parceiros parabiótica não estão no mesmo plano após fusão parabiótica. Isso podetorná-lo difícil de montar embriões em LMP agarose para rastrear células em ambos os embriões simultaneamente usando microscopia de lapso de tempo. Para contornar esse problema em potencial, deve-se planejar para gerar vários embriões parabiótica para garantir a orientação desejado seja alcançado. Alternativamente, os embriões podem ser recuperados a partir do LMP usando uma pinça fina e pipeta de Pasteur e re-montado para geração de imagens a partir de uma perspectiva diferente. O objetivo deste protocolo foi o de fornecer um conjunto de instruções claras e concisas para acompanhar tutoriais em vídeo sobre como cirurgicamente fusível desenvolvimento blástulas para gerar embriões de peixe-zebra parabiótica.
Com as principais modificações e recomendações adicionais para aumentar a sobrevida parabiont, este protocolo venha a capacitar os investigadores que desejam utilizar embriões siameses para investigar fatores que regulam a migração celular, especificação de destino, e diferenciação em uma variedade de tecidos e contextos celulares.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | ||
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| Antibiotics: | |||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 | |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 | |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| 50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 | |
| capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 | |
| Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| 10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 | |
| 100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 | |
| PTU. working stock is 0.003% (50x is 0.15%). for 500 ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 | |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 | |
| plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM | |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F | |
| plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 | |
| glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | |||
| Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 | |
| Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |
References
- Zon, L. I., Orkin, S. H. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Dzierzak, E., Speck, N. A. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nat Immunol. 9 (2), 129-136 (2008).
- Li, P., et al. Epoxyeicosatrienoic acids enhance embryonic haematopoiesis and adult marrow engraftment. Nature. 523 (7561), 468-471 (2015).
- Tam, P. P., Rossant, J. Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian development. Development. 130 (25), 6155-6163 (2003).
- Tanaka, M., Gertsenstein, M., Rossant, J., Nagy, A. Mash2 acts cell autonomously in mouse spongiotrophoblast development. Dev. Biol. 190 (1), 55-65 (1997).
- Morin-Kensicki, E. M., Faust, C., LaMantia, C., Magnuson, T. Cell and tissue requirements for the gene eed during mouse gastrulation and organogenesis. Genesis. 31 (4), 142-146 (2001).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348 (6303), 728-730 (1999).
- Parker, L., Stainier, D. Y. Cell-autonomous and non-autonomous requirements for the zebrafish gene cloche in hematopoiesis. Development. 126 (12), 2643-2651 (1999).
- Liao, E. C., Trede, N. S., Ransom, D., Zapata, A., Kieran, M., Zon, L. I. Non-cell autonomous requirement for the bloodless gene in primitive hematopoiesis of zebrafish. Development. 3 (3), 649-659 (2002).
- Kamran, P., Sereti, K. I., Zhao, P., Ali, S. R., Weissman, I. L., Ardehali, R. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
- Wagers, A. J., Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L. Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science. 297 (5590), 2256-2259 (2002).
- Hervey, G. R. The effects of lesions in the hypothalamus in parabiotic rats. J. Physiol. 145 (2), 336-352 (1959).
- Goldman, D. C., Bailey, A. S., Pfaffle, D. L., Al Masri, A., Christian, J. L., Fleming, W. H. BMP4 regulates the hematopoietic stem cell niche. Blood. 114 (20), 4393-4401 (2009).
- Dieterlen-Lièvre, F., Martin, C., Beaupain, D. Quail-chick chimaeras and parabionts: several new models to investigate early developmental events in the haemopoietic system. Folia Biol (Praha). 25 (5), 293-295 (1979).
- Demy, D. L., Ranta, Z., Giorgi, J. M., Gonzalez, M., Herbomel, P., Kissa, K. Generating parabiotic zebrafish embryos for cell migration and homing studies). Nat. Methods. 10 (3), 256-258 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126 (26), 2811-2820 (2015).
- Murayama, E., Sarris, M., Redd, M., Le Guyader, D., Vivier, C., Horsley, W., Trede, N., Herbomel, P. NACA deficiency reveals the crucial role of somite-derived stromal cells in haematopoietic niche formation. Nat Commun. 28 (6), 8375 (2015).
- Shah, D. I., et al. Mitochondrial Atpif1 regulates haem synthesis in developing erythroblasts. Nature. 491 (7425), 608-612 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160 (1-2), 241-252 (2015).
- Adám, A., Bártfai, R., Lele, Z., Krone, P. H., Orbán, L. Heat-inducible expression of a reporter gene detected by transient assay in zebrafish. Exp. Cell Res. 256 (1), 282-290 (2000).
