Abstract
Хирургическая парабиозом двух животных разных генетических фонов создает уникальный сценарий для изучения клеток по сравнению с внутренней клеточной внешняя роли для генов-кандидатов, представляющих интерес, миграционным поведением клеток и спрятали сигналов в различных генетических условиях. Поскольку парабиотического животные имеют общую циркуляцию, любая кровь или фактор через кровь от одного животного будет обмениваться со своим партнером, и наоборот. Таким образом, клетки и молекулярные факторы, полученные из одного генетического фона могут быть изучены в контексте второго генетического фона. Парабиозе взрослых мышей широко используется для исследований старения, рака, диабета, ожирения и развития мозга. Совсем недавно, парабиозом из эмбрионов данио были использованы для изучения биологии развития кроветворения. В отличие от мышей, прозрачный характер эмбрионов данио позволяет прямой визуализации клеток в парабиотического контексте, что делает его уникальным мощным методом исследования пundamental клеточные и молекулярные механизмы. Полезность этого метода, однако, ограничена крутой кривой обучения для генерации парабиотического эмбрионов данио рерио. Этот протокол обеспечивает метод шаг за шагом о том, как хирургическим путем сплавления blastulae двух эмбрионов данио различных генетических фонов для изучения роли генов-кандидатов, представляющих интерес. Кроме того, парабиотического данио эмбрионы толерантны к тепловому удару, что делает временной контроль экспрессии гена возможно. Этот метод не требует сложного настройки и имеет широкое применение для изучения миграции клеток, спецификации судьбы и дифференциации в естественных условиях во время эмбрионального развития.
Introduction
Создание генетических мозаик (химер) между дикого типа и генетически модифицированных животных является устоявшейся и классическая стратегия для исследования клеток внутренней клеточной сравнению внешняя функций генов - кандидатов 1-6. Бластулы трансплантации в данио широко используется для получения химерных эмбрионов для исследований клеточной автономии 7-9. В зависимости от интересующей ткани, тем не менее, она может быть сложной задачей , чтобы предсказуемо целевых донорских клеток в требуемую ткань (например, крови) 1-3, 7-9. Генетики мыши уже давно используются парабиотического хирургические методы для создания сиамских организмов с общим тиражом 10-14. Поскольку парабиотического животные имеют общую кровеносную систему , взаимодействие между клетками , которые произошли от одного животного с клетками другого животного другого генетического фона могут быть изучены 10-16. В последнее время группа Карима Kissa в элегантно продемонстрировал способность CREели сиамских эмбрионов данио рерио , а затем использовать эту систему для изучения гемопоэтических стволовых и клеток - предшественников (HSPC) миграции 15. Кроме того, данио парабиозом недавно был использован для изучения роли эндотелиальной кадгерину 5 в гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) возникновения и миграции, 16 и изучить роль стромальных клеток в нише HSPC во время данио развития 17.
В отличие от мышей, данио эмбрионы являются прозрачными и позволяют для прямой визуализации клеток в процессе развития парабиотического, что делает систему однозначно мощным. Полезность парабиозе в данио, однако, ограничена крутой кривой обучения, и парабиотического операции на тонких эмбрионов может быть технически сложным без подробной инструкции и визуальной демонстрации. Целью данного протокола является предоставление набора четких, шаг за шагом инструкции для сопровождения видео на основе руководства о том, как генерировать парабиотического данио эмбрионов для изучениявременная, клетка-внутренняя, или клеточные функции внешняя гена кандидата (ов) хирургическим путем слияния разработки blastulae. Основные модификации и дополнительные рекомендации по увеличению выживаемости parabiont и новых экспериментальных приложений включены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол был одобрен Бостонской детской больницы животных по уходу и использованию Комитетом. Этот протокол модифицируется из ранее опубликованного метода 15.
1. Приготовление реагентов (дни или недели вперед)
- Подготовьте 1,5% агарозном покрытием блюда. Добавить 1,5 г агарозы в 100 мл среды рерио E3 в колбе Эрленмейера. Тепло, растворить агарозы, а затем залить приблизительно 5 мл в диаметре 100 мм х 20 мм глубиной чашках Петри.
Примечание: Они используются для dechorionation эмбрионов (шаг 3.1), а также для парабиотического операции (этап 3.3). Хранить блюда агарозном с нанесенным покрытием при температуре 4 ° С в течение нескольких недель; взять их из холодильника и нагреться до комнатной температуры утром в день парабиотического хирургии. - Готовят 4% метилцеллюлозы. Разведите 4 г порошка метилцеллюлозы в 100 мл Е3 в колбе Эрленмейера с мешалкой. Поместите колбу на мешалке при 4 ° С, установленный на самой низкой скорости, и пусть это смешатьна срок до 2-х дней.
- Intermittently использовать шпатель, чтобы разбить комки белые метилцеллюлозы. Кристаллы метилцеллюлоза не полностью растворяются при этой концентрации. Когда раствор становится прозрачным и гомогенным появляется без белых комков, оставшегося, Алиготе раствора в 1,5 мл микроцентрифужных труб и заморозить при -20 ° С в течение длительного хранения.
Примечание: можно использовать более низкие концентрации метилцеллюлозы; Тем не менее, это более высокий процент, более вязким, метилцеллюлоза дала лучшие результаты.
- Intermittently использовать шпатель, чтобы разбить комки белые метилцеллюлозы. Кристаллы метилцеллюлоза не полностью растворяются при этой концентрации. Когда раствор становится прозрачным и гомогенным появляется без белых комков, оставшегося, Алиготе раствора в 1,5 мл микроцентрифужных труб и заморозить при -20 ° С в течение длительного хранения.
- Приготовьте раствор с высоким содержанием кальция Ringer (HCR). Для того, чтобы 400 мл раствора HCR, смешайте 8 мл 5 М NaCl (116 мМ конечная), 400 мкл 3М KCl (2,9 мМ конечная), 800 мкл 5М CaCl 2 (10 мМ FINAL) и 2 мл 1М HEPES (5 мМ конечная) с 390 мл E3 средств массовой информации.
Примечание: раствор Хранить HCR при 4 ° С в течение нескольких недель; нагреться до комнатной температуры утром в день парабиотического хирургии. - Подготовьте 5 - 6 модифицированных пипеток Пастера для передачикольцо бластула пар. Кратко нагревать конец пипетки над горелкой Бунзена. Затем, с использованием больших щипцов, согнуть конец пипетки до приблизительно 45 ° С, в то время как она по-прежнему жарко.
- Для того, чтобы гарантировать, что нет никаких острых краев, которые могут повредить зародыши, удерживают кончик пипетки на короткое время в пламени около 3 сек. Это позволит сгладить / полируют конец пипетки. Этот модифицированный стекло пипетки Пастера используется в сочетании с 10 мл пипеткой насоса (рисунок 1) на шаге 3.5 ниже.
- Подготовьте стеклянные игольчатые инструменты для хирургического сшивания пар бластулы. Потянуть 2 - 3 стеклянные иглы, как это сделано для микроинъекции эмбрионов данио. Используйте LAB-пленку , чтобы зафиксировать каждую стеклянную иглу к концу деревянно или пластиковой ручкой дразня иглой (рис 1А). Использование щипцов, прекращаться конец иглы при диаметре приблизительно 20 - 30 мкм. Используйте микрометра , чтобы направлять этот шаг (рис 1B).
Примечание: Размер пеEdle наконечник имеет важное значение. Если кончик слишком велик становится трудно контролировать точно и может привести к чрезмерному повреждению. Если наконечник слишком мал, то трудно в достаточной степени намотаны эмбрионов.
2. Настройка размножающихся пар данио рерио и коллекции Эмбрионы (День -1 день 0)
- Настройка размножающихся пар взрослых данио. Установите рыбу ночью до операции парабиозом будет проводиться. Используйте разделители для разделения самцов и самок. Для того, чтобы увеличить вероятность того, что будут получены желаемые эмбрионы, создали несколько пар каждой строки. Мы считаем, что, как правило, 20 - 50% пар будут появляться.
- На следующее утро, тянуть делители и позволить спаривание. Соберите все эмбрионы , используя мелкоячеистого ситечко, а затем перенести их в чашку Петри , содержащую E3 эмбриона среду 18.
- Микро-инъекционные эмбрионов по желанию (например, с 25 мкг плазмидной ДНК, 200 мкг мРНК, или с 1 - 6 нг морфолино) в течение 1 часа сбора. Разрешить ихрастут до стадии 256 клеток. Если выражение конструкция ДНК помещают под контроль теплового шока промотора (например, HSP70, 4Б), контролировать время экспрессии генов под действием тепла шокируя parabionts при 37 ° C на более поздней стадии (например., При 36 часов после оплодотворения ).
Примечание: В качестве альтернативы флуоресцентного трансгена, флуоресцентный декстран может быть добавлен к ДНК, РНК или инъекции морфолино смеси (например, декстран, каскад синего в дозе 2 мг / мл). Декстран краситель не будет мешать нормальному развитию и позволит нагнетаемая эмбриона быть идентифицированы под соответствующим флуоресцентным светом после парабиотического слияния. В качестве альтернативы, парабиозом пигментированного штамма (например, АВ) с неокрашенной деформации (например, Каспер) может быть использован для идентификации впрыскиваемого эмбриона на более поздних этапах. - Инкубируйте эмбрионов на 28,5 ° C.Use стереоскоп, чтобы следить за их развитием периодически по мере приближения к 256-клеточным разработчикаelopmental этап (приблизительно 2,5 ФВЧ).
Примечание: При необходимости, сдвиг эмбрионов до различных температур , чтобы обеспечить соответствие стадии между парабиотического партнерами (например, морфолино-впрыскивается эмбрионов часто развиваются медленнее , чем их не-впрыскивается аналогов Shifting ООН-впрыскивается эмбрионов до комнатной температуры в то время как морфолино-впрыскивается эмбрионы помещаются. при 28,5 ° C приведет к их стадии выравнивая после нескольких часов развития).
3. Генерация парабиотического эмбрионов данио рерио хирургическим путем Fusion разработки Blastulae
- По мере того как эмбрионы приближаются к стадии 256-клеток (примерно 2,5 HPF), передача эмбрионов из каждого генетического фона (т.е. генетического мутанта, трансгенных линий и / или генетических манипуляций) в отдельную посуду агарозных покрытием (например, одно блюдо для морфолино- инъецированные эмбрионы и второе блюдо для контрольных эмбрионов). В качестве альтернативы, передача эмбрионов чистый, без царапин стеклянные мензурки или стеклянные чашки Петри.
Примечание: Избегайте использования непокрытых пластиковой посуды, как эмбрионы будет прилипать к пластику и повредиться один раз из их хорионов. - Переливать носитель E3, пока только достаточное количество жидкости не остается, чтобы покрыть эмбрионов (приблизительно 7 - 10 мл). Добавить 200 мкл 50 мг / мл смеси протеаз , выделенных из внеклеточной жидкости из Streptomyces пзеиз (протеазы). Вихревой эмбрионов нежно каждые пару минут.
- Когда 50% эмбрионов вышли из своих хорионов, которые, как правило, занимает от 5 - 10 мин, промыть их три раза с щедрым объемом (около 15 - 20 мл) свежего эмбриона E3 среды.
- Dechorionate любых эмбрионов, остающихся в их хорионов, осторожно потянув их в измененное стекло пипетки Пастера, а затем аккуратно рассеивать их. После того, как эмбрионы были dechorionated и промывают, замените носитель E3 с раствором HCR. В качестве альтернативы протеаз, удалить хорионов вручную с помощью тонкой пинцетом. Цель иметь 60 - 100 dechorionated эмбрионов, доступных для каждого экспериментального состояния.
Примечание: Это в несколько раз больше, чем в конечном счете будет использоваться, но многие эмбрионы могут быть повреждены во время транспортировки или операции для парабиозе. После того, как эмбрионы dechorionated, держать их под водой и не позволяют им прикасаться к поверхности воды, так как поверхностное натяжение заставит их быть уничтожены. Имейте в виду, что при использовании более высокой дозы протеаз позволяет эмбрионы выйти из их хорионов раньше и в более синхронно. При использовании более низкой дозы протеаз, эмбрионы займет больше времени, чтобы выйти из своих хорионов и делают это в меньшей синхронном режиме, что может привести к части эмбрионов повреждения при длительном воздействии протеаз.
- Dechorionate любых эмбрионов, остающихся в их хорионов, осторожно потянув их в измененное стекло пипетки Пастера, а затем аккуратно рассеивать их. После того, как эмбрионы были dechorionated и промывают, замените носитель E3 с раствором HCR. В качестве альтернативы протеаз, удалить хорионов вручную с помощью тонкой пинцетом. Цель иметь 60 - 100 dechorionated эмбрионов, доступных для каждого экспериментального состояния.
- Когда 50% эмбрионов вышли из своих хорионов, которые, как правило, занимает от 5 - 10 мин, промыть их три раза с щедрым объемом (около 15 - 20 мл) свежего эмбриона E3 среды.
- Разморозить метилцеллюлозы (сделанный в шаге 1.2 выше) и центрифугу в настольной центрифуге на максимальной скорости в течение 10 мин для осаждения нерастворенных кристаллов, которые могут повредить эмбрионов или разрывом их желтокs.
- После центрифугирования, используйте прозрачную верхнюю часть (примерно 75% от объема). Передача 1 - капли диаметром 1,5 см метилцеллюлозы в 1,5% агарозном покрытием чашке Петри. Позаботьтесь, чтобы избежать составления любого из гранулированных кристаллов из нижней части трубки.
- Используйте маркер, чтобы предопределяют положение каждой капельке на нижней стороне тарелки. Поместите 12 - 15 капель (2 - на сумму 3 аликвоты ') метилцеллюлозы на 100 мм чашки диаметром тарелки. Подготовьте столько пластин по мере необходимости на эксперимент.
Примечание: Используйте каждую капельку для слияния одной пары бластулы. Знак будет обозначать местоположение каждой капельке после того, как средства массовой информации добавляется-точка, при которой капли становятся почти невидимыми.
- Подготовьте 40 мл аликвоты антибиотика подпиткой раствора HCR на чашку агарозном покрытием, полученного выше на стадии 3.3. Каждому 40 мл аликвоты HCR добавить пенициллин-стрептомицина при 50 Ед / мл, ампициллин в количестве 50 ед / мл и канамицину при концентрации 0,5 мкг/ Мл.
- Когда готов к выполнению бластуле слитые, тщательно заполнить каждую из тарелок, содержащих капельки метилцеллюлоза 40 мл антибиотика с добавкой раствора HCR. Если раствор HCR добавляется слишком быстро, это может привести к нарушению капель.
- Прикрепите модифицированный стекло пипетки Пастера (сделанный в шаге 1.4 выше) пипеткой насоса 10 мл. Под стереоскоп собирают один dechorionated эмбриона от каждого фона (например, один морфолинозамещенной впрыскивается эмбриона и одного дикого типа эмбриона).
- Перед разливом двух эмбрионов, использовать пипетку Пастера, чтобы сделать небольшое углубление в середине капли метилцеллюлоза, а затем осторожно депонировать как эмбрионы в депрессию.
Примечание: Во время процесса передачи, включите пипетку Пастера немного вверх так, что эмбрионы, оседать в сгибе пипетку Пастера с тем, чтобы избежать их в контакт с поверхностью жидкости в верхней или нижней части пипетки (что может привести к Theiг разрыва).
- Перед разливом двух эмбрионов, использовать пипетку Пастера, чтобы сделать небольшое углубление в середине капли метилцеллюлоза, а затем осторожно депонировать как эмбрионы в депрессию.
- Сразу же после сдачи на хранение эмбрионов в метилцеллюлозы, используют древесноволокнистых или пластмассовую ручкой дразнящий иглу с гелем-погрузочной кончиком пипетки на конце (рис 1А) тщательно переставить эмбрионов внутри метилцеллюлозы таким образом, что их животные полюса напрямую касаясь друг друга.
- Используйте нежные размашистые движения через метилцеллюлозы близко к эмбрионах, чтобы изменить их без непосредственного прикосновения к ним. Пусть эмбрионы сидят в течение 5 мин, так что метилцеллюлозы поселятся в вокруг них. В течение этого времени, загрузите следующую пару на другой капли.
Примечание: Избегайте прямого контакта с эмбрионами и проявлять особую осторожность, чтобы не касаться любой части желточного мешка, который будет легко привести к разрыву.
- Используйте нежные размашистые движения через метилцеллюлозы близко к эмбрионах, чтобы изменить их без непосредственного прикосновения к ним. Пусть эмбрионы сидят в течение 5 мин, так что метилцеллюлозы поселятся в вокруг них. В течение этого времени, загрузите следующую пару на другой капли.
- С помощью инструмента стекла иглы, осторожно наматывают каждого эмбриона в точке их контакта. С нежным движением шитья, клетки из первого эмбриона можно вытянуть во второй эмбрион, а затем обратно.В конце этого движения, держать иглу на месте в течение 2 - 3 секунды, а затем сделать его прочь очень медленно.
Примечание: Существует период приблизительно 2 - 3 секунды после того, как эмбрионы ранеными, где две ткани, кажется, более клейкий и более вероятно, чтобы прикрепить друг к другу. Таким образом, мы считаем, что проведение иглу на месте на короткое время после того, как ранив помогает держать ранеными ткани каждого эмбриона в контакте в течение начального периода времени сразу после ранения. - Разрешить эти эмбрионы сидеть в течение 10 - 15 мин при комнатной температуре. В то же время, по-прежнему, чтобы сшить новые пары в других капель метилцеллюлозы. Через 10 - 15 мин, оценка первая пара осталась ли прилагается (рис 2А).
Примечание: Если эмбрионы больше присоединены, повторите процесс сшивания до тех пор, пока эмбрионы моложе вокруг эпиболии стадии 30%. Как правило, это позволяет до трех попыток сшить эмбрионов вместе. Если эмбрионы по всей видимости, сохранили вложение, но и грonnection не существенно, выполняют дополнительную колющие на краю соединения, чтобы усилить его. Избегайте встряхивания или перемещения блюд во время парабиотического хирургии и инкубационных периодов.
Примечание: Несмотря на ранней стадии развития и воспринимаемой хрупкости, клеточные массы эмбрионов могут переносить значительное количество манипуляций (т.е., ранив и сшивание), и до сих пор развиваются нормально. Желток, однако, может привести к разрыву только малейшем прикосновении, убивая зародыш. Когда сшивание двух blastulae со стеклянной иглы, не вступать в контакт с границы раздела между клеточной массы и желток каждого эмбриона. - Инкубируйте эмбрионов O / N при 28,5 ° С в том же блюде и средств массовой информации (не меняют СМИ). К утру, эмбрионы будут перемещены из растворенных в основном капель метилцеллюлозы. Удалите все эмбрионы, которые не были успешно слитые. Слейте средства массовой информации и заменить свежим 25 мл Е3.
Примечание: При работе спигментированный штамм, добавляют 500 мкл 0,15% (50x) фенилтиомочевину (PTU) до конечной концентрации 0,003%, чтобы блокировать пигментацию. Эмбрионы нужно будет постоянно оставаться в PTU для поддержания подавления пигментации.
4. Настройка микроскопа, изображения сбора, обработки и анализа
- Готовят 0,8% с низкой температурой плавления (LMP) агарозы: Добавить 0,8 г LMP агарозы в 100 мл E3 и тепло до полного растворения. В то время как горячий, аликвоту 1 мл LMP агарозы в 1,5 мл микроцентрифужных труб в блоке нагрева 37 ° C. Агароза LMP будет оставаться в расплавленном состоянии при температуре 37 ° С. Добавить 40 мкл 4 мг / мл (25x), рН 7,0 Tricaine к каждому 1 мл аликвоты LMP агарозы при 37 ° С. Примечание: При работе с пигментированной процедить, добавить 20 мкл 0,15% (50x) PTU к каждому 1мл аликвоты.
- Хранить оставшиеся LMP агарозы в течение нескольких месяцев, в герметичных 50 мл пробирки при температуре 4 ° С.
- Обезболить парабиотического эмбрионов перед созданием образа путем добавления 1 мл 4 мг / мл (25x), рН 7,0 Tricaineв 25 мл Е3, что эмбрионы уже находятся.
- Аккуратно водоворот блюдо так, что эмбрионы будут объединять в середине. Затем, используя широкий наконечниками пластиковые пипетки передачи составить эмбрионов в качестве небольшим количеством жидкости, как это возможно. Включите пипетку в вертикальном положении и слегка подпрыгивать эмбрионов, так что они оседают на самом дне пипетки.
- С помощью эмбрионов в нижней части пипетки, передавать их на 1 мл аликвоты LMP агарозы, слегка касаясь кончиком пипетки к поверхности агарозы. Избегайте передачи избытка жидкости, так как это будет разбавлять агарозы.
- После того, как вытесняя лишнюю жидкость из пипетки, используйте пипетку, чтобы аккуратно перемешать эмбрионов в агарозы, а затем использовать пипетку, чтобы передать все агарозы и эмбрионов в лунку со стеклянным дном (№ 1.5 покровное), 6- луночный планшет.
Примечание: Обязательно выбросьте пипетку после переноса эмбрионов к пластине формирования изображения. Остаточная агарозы будет установлен внутри пипетки, Предоставлениег оно неэффективно для дальнейшего использования. Скорее всего, используйте новую пипетку каждый раз. - Под стереоскопе, используют гель-наливного наконечника пипетки, закрепленный на конце деревянной ручкой дразнящего иглы в положение эмбрионов вниз по направлению к покровного стекла (чтобы гарантировать, что они находятся в пределах рабочего расстояния объектива микроскопа) и в желаемой ориентации для работы с изображениями.
Примечание: Переставьте непрерывно до тех пор, пока агароза полностью установлен. Позаботьтесь, чтобы смонтировать парабиотического эмбрионов в соответствии с которым эмбрион из пары должен быть образ. С учетом случайной ориентации сиамских эмбрионов, для некоторых пар это может быть трудно изображения как зародыши. В этом случае восстановить эмбрионы из агарозы с помощью щипцов и с широким наконечником пластиковые пипетки передачи, а затем перемонтировать для получения изображений с разных точек зрения. - После агарозном установлено, накрыть 2 - 3 мл Е3, дополненной Tricaine (и PTU при необходимости).
- Изображение эмбрионов с использованием инвертированного широкого поля эпи-флуоресценцию, LASэр-сканирующей конфокальной или вращающийся диск конфокальной микроскопии. Выберите цель наиболее подходящую для желаемого изображения. Для целого эмбриона поле зрения, использовать 4x цели. Выберите более высокое увеличение, например, 20x цель, к изображению специфической ткани 16, 19.
Примечание: При использовании прямой микроскоп, смонтировать в LMP агарозы (аналогично выше) на покровным стеклом. Инверсия покровного стекла на предметное стекло микроскопа , который имеет кольцо из вакуумной смазки , заполненную той же Е3-Tricaine-PTU 16, 19. - Процесс полученных изображений с использованием бесплатных анализа изображений пакетов программного обеспечения , такие как NIH Image J / ФИДЖИ 16, 19.
Примечание: Count числа клеток и количественной оценки динамики , такие как миграция клеток и деление клеток с помощью сегментации и отслеживания алгоритмов 16, 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В соответствии с результатами ранее опубликованных исследований 15, успешно парабиотического слияние эмбрионов данио зависит от постановки и ориентации двух эмбрионов и концентрации метилцеллюлозы. С помощью всего лишь нескольких простых, недорогих инструментов, хирургическим путем слитые развивающиеся blastulae генерировались, которые переросли в парабиотического эмбрионов с общей циркуляцией. Эти инструменты включены модифицированный пипетку Пастера, пипеткой насос 10 мл, а деревянные обработаны иглы дразня , которые использовались либо самостоятельно , либо с помощью иглы гель-наливного наконечника или стекла микроинъекции , прикрепленной к концу с помощью лабораторной пленкой (рисунок 1).
После размещения двух blastulae в 4% растворе метилцеллюлозы и с помощью иглы гель-загрузки , чтобы ориентировать их со своими полюсами животных обращены друг к другу (рис 2А), эмбрионы были тщательно ранеными в точке контакта со стеклом микроинъекции пeedle (Фигура 2В). Более высокая степень ранении (сравните рис 2B на фиг 2C) и пересматривают пар эмбрионов , чтобы поддержать первоначальное соединение с дополнительным ранении, повышает вероятность эмбрионов поддержания связи , что привело к успешному синтезу (рис 3A-C, Movie 1) , и без дополнительных морфологических дефектов или замедленное развитие. Когда это сделано тщательно, почти 100% пар эмбрионов были слиты, хотя доля этих эмбрионов (около 25%) никогда не установлено здоровое кровообращение в обеих половинах. Путем ориентации двух blastulae с их полюсы животных непосредственно выровнены, надежные мешка слитые голова к голове или желтка-к-желтком были получены с общей циркуляцией. В большинстве случаев, эмбрионы имели два сердца насосных общей общей циркуляции (рис 3D).
Для того, чтобы подтвердить, что эмбрионы действительно разделяют их циркуляцию, флуоресцентный декстран был инъекected в обращение, которое можно было увидеть впоследствии циркулирующей через оба эмбрионов (Фильм 2). Кроме того, трансгенные эмбрионы , которые имели GFP + эритроцитами (LCR: EGFP) были слиты с эмбрионами , которые имели mCherry + эндотелиальные клетки сосудов (Flk1: HRAS-mCherry). По 48 часов после оплодотворения, наблюдались GFP + Эритроциты , циркулирующей через Flk1: партнера эмбриона HRAS-mCherry (рис 4A и Movie 3). Для того, чтобы расширить полезность парабиотического системы, был добавлен временной контроль экспрессии генов. До слияния, один из двух эмбрионов вводили с Hsp70: EGFP ДНК - конструкции 20. В то время как слитые эмбрионы растут при 28,5 ° С, не наблюдалось флюоресценции. В отличие от этого , после краткого 30 мин теплового шока при 37 ° С, четкий сигнал GFP , был виден в одном из двух эмбрионов (рис 4б). В некоторых случаях GFP + клеткинаблюдается циркулирующая в оон-впрыскивается партнера эмбриона. Таким образом, размещая интерес ген под контролем промотора теплового шока обеспечивает дополнительное временное управление исследованиях, посвященных клеточно-характеристическая или клеточно-функции внешний генов-кандидатов.
Рисунок 1. Инструменты для генерации парабиотического эмбрионов данио рерио.
(A) Аннотированный изображение показывает инструменты , используемые для хирургического слияния разработки blastulae. Инструменты включают модифицированный пипетку Пастера (верхняя часть), которая используется в сочетании с пипеткой насосом 10 мл (зеленый). Древесина обрабатывается дразнили иглы используются либо самостоятельно , либо с пластиковым наконечником гель загрузкой пипетки или вытащил стеклянный микроинъекции прошитого крепится к концу с лабораторной пленкой. (B) Изображение показывает концы трех стекла микроинъекции необходимостиле, которые были разбиты с пинцетом при разных диаметров. Иглы лежит на верхней части микрометра; самые маленькие линии на расстоянии 10 мкм друг от друга. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Хирургический Слияние Разработка Blastulae.
С высоким увеличением изображения показывают два данио эмбрионов на высокой стадии развития, ориентированные с полюсами животных обращенных друг к другу, перед хирургическим строчкой (А), сразу же после минимальной ранении (B), и после того, как более существенной ранении (C). 20 мин позже, очевидно , что эмбрионы были успешно слиты на основании непрерывного моста ячеек между двумя blastulae (D). Масштабстолбик представляет 250 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Развитие парабиотического эмбрионов данио рерио.
(AC) Изображения показывают вид цельного parabiont раннего развития только после того, как ранении (А) и , как эмбрионы продолжают развиваться и подвергаются эпиболии (B и C) Эти изображения соответствуют видео 1. (D) Изображение показывает пару парабиотического эмбриона в 36 часов после оплодотворения. Эмбрионы соединены на их желтком мешочков, два сердца и разделяют общую циркуляцию. Масштабные столбики представляют 250 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. визуализируя парабиозе с генетически кодируемых флуоресцентных белков.
(A) Изображения (одна флуоресценция, вправо, накладываемые с проходящем свете, слева) показывают , головной участок сиамских эмбрионов на 48 часов после оплодотворения. Дно зародышем этой пары является трансгенным для ЛСК: EGFP (erythroctyes, зеленый) в то время как ее партнер (вверху) является трансгенным для Flk1: HRAs-mCherry, который маркирует сосудистые эндотелиальные клетки (красные). Зеленые эритроцитах можно видеть, циркулирующей через партнера эмбриона. Это изображение соответствует Movie 3. (B) Левый эмбрион в этой паре впрыскивали с Hsp70: EGFP построить на стадии одной клетки , а затем сливают с маркированного впрыскивается партнера (справа). Когда животные были тепловому шоку при 37 ° С в течение 30 мин при температуре 36 часов после оплодотворения, наблюдалась зеленая флуоресценция GFP в ле футов эмбрион на 60 часов после оплодотворения. Масштабные столбики представляют 500 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Фильм 1. Раннее развитие хирургически плавленого данио blastulae. (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать).
Фильм показывает раннее развитие пары хирургически плавленого данио blastulae. Эпиболии можно увидеть происходящие одновременно в каждом эмбриона. Этот фильм относится к фигуре 3А-С.
2.jpg "/>
Фильм 2. Люминесцентные декстран инъекции освещает разделяемую циркуляцию. (Нажмите правой кнопкой мыши , чтобы скачать).
Фильм показывает флуоресцентные декстрана впрыскивают в общую кардинального вену парабиотического пары эмбрионов на 60 HPF. Флуоресцентный краситель можно увидеть в дальнейшем циркулирует через оба эмбрионов.
Фильм 3. Зеленый кровь течет через красные сосуды.мов "> (Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы скачать).
Фильм показывает головной участок сиамских эмбрионов на 48 часов после оплодотворения. Дно зародышем этой пары является трансгенным для ЛСК: EGFP (erythroctyes, зеленый) в то время как ее партнер (вверху) является трансгенным для Flk1: HRAs-mCherry, который маркирует сосудистые эндотелиальные клетки (красные). Зеленые Эритроциты видно, циркулирующей через партнера эмбриона. Этот фильм относится к рисунку 4A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Парабиотического слияние было мощным инструментом для исследования клеточных функций генов - кандидатов у взрослых мышиных моделях и куриных эмбрионов 10-14. Совсем недавно, метод бластула фьюжн был описан для генерации сиамских эмбрионов данио 15. В настоящем протоколе, видео на основе учебные пособия используются для демонстрации и лучше описать методологию для создания парабиотического данио эмбрионов разных генетических фонов с целью изучения временных, клеточно-внутренняя и клеточно-внешняя роли генов-кандидатов, представляющих интерес в кроветворной развития и за его пределами.
Описанный в данной статье метод был недавно использован для отслеживания HSC появление в одном из эмбриона, миграцию через кровообращение к эмбрион различного генетического фона и последующего приживления и дифференцировки 16. В соответствии с полученными данными, постановка и эмбриона позиционирования группы кисса были найдены, чтобы определить вероятность успехаи анатомический характер парабиотического слияния. С помощью нескольких ключевых изменений в протокол, parabionts были получены со значительно более высокой выживаемости. К ним относятся ранив blastulae в большей степени, держа иглу на месте в течение 2 - 3 секунды после того, как получили ранения, а затем пересматривают бластула пары через 15 мин, чтобы усилить первоначальное соединение с дополнительным ранению, если это необходимо. С помощью этих дополнительных рекомендаций, почти 100% от parabionts выжили и остались прикреплены, и 75% из них имели общий тираж.
Чтобы включить дополнительный элемент экспериментального контроля к методу, парабиотического эмбрионы продемонстрировали здесь , чтобы быть терпимым к тепловому шоку, что позволяет временной контроль экспрессии генов в парабиотического контексте 20. Ограничение этого метода заключается в том, что в некоторых случаях парабиотического эмбрионы партнер не в одной плоскости после парабиотического слияния. Это можетсделать его трудно смонтировать эмбрионов в LMP агарозы для отслеживания клеток в обоих эмбрионов одновременно с использованием покадровой микроскопии. Чтобы обойти эту потенциальную проблему, нужно планировать, чтобы генерировать несколько парабиотического эмбрионов для обеспечения желаемой ориентации достигается. В качестве альтернативы, эмбрионы могут быть извлечены из LMP с помощью тонкой щипцов и пипетку Пастера и повторно смонтированные для получения изображений с разных точек зрения. Целью данного протокола является предоставление набора четких, кратких инструкций для сопровождения видео на основе руководства о том, как хирургическим путем взрыватель разработки blastulae для создания парабиотического эмбрионов данио.
С ключевыми изменениями и дополнительные рекомендации по увеличению выживаемости parabiont, этот протокол, мы надеемся расширить возможности исследователей, которые хотят использовать сиамских эмбрионов для исследования факторов, регулирующих клеточную миграцию, спецификации судьбы и дифференциации в различных тканях и клеточных контекстах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | ||
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| Antibiotics: | |||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 | |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 | |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| 50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 | |
| capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 | |
| Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| 10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 | |
| 100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 | |
| PTU. working stock is 0.003% (50x is 0.15%). for 500 ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 | |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 | |
| plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM | |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F | |
| plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 | |
| glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | |||
| Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 | |
| Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |
References
- Zon, L. I., Orkin, S. H. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Dzierzak, E., Speck, N. A. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nat Immunol. 9 (2), 129-136 (2008).
- Li, P., et al. Epoxyeicosatrienoic acids enhance embryonic haematopoiesis and adult marrow engraftment. Nature. 523 (7561), 468-471 (2015).
- Tam, P. P., Rossant, J. Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian development. Development. 130 (25), 6155-6163 (2003).
- Tanaka, M., Gertsenstein, M., Rossant, J., Nagy, A. Mash2 acts cell autonomously in mouse spongiotrophoblast development. Dev. Biol. 190 (1), 55-65 (1997).
- Morin-Kensicki, E. M., Faust, C., LaMantia, C., Magnuson, T. Cell and tissue requirements for the gene eed during mouse gastrulation and organogenesis. Genesis. 31 (4), 142-146 (2001).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348 (6303), 728-730 (1999).
- Parker, L., Stainier, D. Y. Cell-autonomous and non-autonomous requirements for the zebrafish gene cloche in hematopoiesis. Development. 126 (12), 2643-2651 (1999).
- Liao, E. C., Trede, N. S., Ransom, D., Zapata, A., Kieran, M., Zon, L. I. Non-cell autonomous requirement for the bloodless gene in primitive hematopoiesis of zebrafish. Development. 3 (3), 649-659 (2002).
- Kamran, P., Sereti, K. I., Zhao, P., Ali, S. R., Weissman, I. L., Ardehali, R. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
- Wagers, A. J., Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L. Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science. 297 (5590), 2256-2259 (2002).
- Hervey, G. R. The effects of lesions in the hypothalamus in parabiotic rats. J. Physiol. 145 (2), 336-352 (1959).
- Goldman, D. C., Bailey, A. S., Pfaffle, D. L., Al Masri, A., Christian, J. L., Fleming, W. H. BMP4 regulates the hematopoietic stem cell niche. Blood. 114 (20), 4393-4401 (2009).
- Dieterlen-Lièvre, F., Martin, C., Beaupain, D. Quail-chick chimaeras and parabionts: several new models to investigate early developmental events in the haemopoietic system. Folia Biol (Praha). 25 (5), 293-295 (1979).
- Demy, D. L., Ranta, Z., Giorgi, J. M., Gonzalez, M., Herbomel, P., Kissa, K. Generating parabiotic zebrafish embryos for cell migration and homing studies). Nat. Methods. 10 (3), 256-258 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126 (26), 2811-2820 (2015).
- Murayama, E., Sarris, M., Redd, M., Le Guyader, D., Vivier, C., Horsley, W., Trede, N., Herbomel, P. NACA deficiency reveals the crucial role of somite-derived stromal cells in haematopoietic niche formation. Nat Commun. 28 (6), 8375 (2015).
- Shah, D. I., et al. Mitochondrial Atpif1 regulates haem synthesis in developing erythroblasts. Nature. 491 (7425), 608-612 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160 (1-2), 241-252 (2015).
- Adám, A., Bártfai, R., Lele, Z., Krone, P. H., Orbán, L. Heat-inducible expression of a reporter gene detected by transient assay in zebrafish. Exp. Cell Res. 256 (1), 282-290 (2000).
