Abstract
Kirurgisk parabiosis av två djur av olika genetisk bakgrund skapar en unik situation för att studera cell inneboende kontra cell yttre roller för gener av intresse, flytt beteenden av celler och utsöndrade signaler i olika genetiska inställningar. Eftersom parabiotic djur delar en gemensam cirkulation, kommer något blod eller blodburen faktorn från ett djur utbytas med sin partner och vice versa. Således kan celler och molekylära faktorer härledda från en genetisk bakgrund att studeras i samband med en andra genetisk bakgrund. Parabiosis av vuxna möss, har varit omfattande forskning åldrande, cancer, diabetes, fetma, och hjärnans utveckling. På senare tid, parabiosis av zebrafisk embryon har använts för att studera utvecklingsbiologi av blodbildningen. Till skillnad från möss, den öppna karaktär zebrafisk embryon medger direkt visualisering av celler i parabiotic sammanhang, vilket gör det unikt kraftfull metod för att undersöka fundamental cellulära och molekylära mekanismer. Användbarheten av denna teknik emellertid är begränsad av en brant inlärningskurva för att generera de parabiotic zebrafiskembryon. Detta protokoll ger en steg-för-steg-metod för att kirurgiskt fusera blastulae av två zebrafisk embryon med olika genetiska bakgrunder för att undersöka rollen av kandidatgener av intresse. Dessutom är de parabiotic zebrafisk embryon är toleranta mot värmechock, vilket gör temporal kontroll av genuttryck möjligt. Denna metod kräver inte en sofistikerad uppsättning upp och har breda applikationer för att studera cell migration, öde specifikation och differentiering in vivo under fosterutvecklingen.
Introduction
Skapande av genetiska mosaiker (chimärer) mellan vildtyp och genetiskt modifierade djur är en väletablerad och klassisk strategi för att undersöka cell inneboende kontra cell yttre funktioner kandidatgener 1-6. Blastula transplantationer i zebrafisk har i stor utsträckning används för att generera chimära embryon för studier av cell autonomi 7-9. Beroende på vävnaden av intresse, kan det dock vara svårt att förutsägbart rikta givarceller till den önskade vävnaden (t ex blod) 1-3, 7-9. Mus genetiker har länge utnyttjat parabiotic kirurgiska metoder för att generera siamesiska organismer med en gemensam omsättning 10-14. Eftersom de parabiotic djuren delar en gemensam blodomloppet kan interaktioner mellan celler som har sitt ursprung från ett djur med celler från det andra djuret av en annan genetisk bakgrund studeras 10-16. Nyligen Karima Kissa grupp elegant visat förmåga till CREåt förenade zebrafisk embryon och sedan använda detta system för att studera hematopoietiska stam- och progenitorceller (HSPC) migration 15. Dessutom har zebrafisk parabiosis nyligen använts för att undersöka rollen av endotelceller cadherin 5 i hematopoetisk stamcellstransplantation (HSC) uppkomst och migration, 16 och studera betydelsen av stromaceller i HSPC nisch under zebrafisk utveckling 17.
Till skillnad från möss, zebrafisk embryon är transparenta och möjliggöra direkt visualisering av celler under parabiotic utveckling, vilket gör systemet unikt kraftfull. Nyttan av parabiosis i zebrafisk, men begränsas av en brant inlärningskurva, och parabiotic kirurgi på den känsliga embryon kan vara tekniskt utmanande utan detaljerade instruktioner och visuell demonstration. Målet med detta protokoll är att tillhandahålla en uppsättning tydliga, steg-för-steg-instruktioner för att följa videobaserade självstudier om hur man skapar parabiotic zebrafisk embryon för att studeratemporal, cell-intrinsic, eller cell extrinsic funktionerna hos en kandidat gen (er) genom kirurgisk fusion av att utveckla blastulae. Nyckel modifikationer och ytterligare rekommendationer för att öka parabiont överlevnad och nya experimentella applikationer ingår.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll godkändes av Boston Barnsjukhus Animal Care och användning kommittén. Detta protokoll är modifierad från en tidigare publicerad metod 15.
1. Beredning av reagenser (dagar eller veckor i förväg)
- Förbereda 1,5% agaros-belagda rätter. Tillsätt 1,5 g agaros till 100 ml Zebrafish E3 medium i en Erlenmeyerkolv. Värme, lös agarosen, och häll sedan ungefär 5 ml i 100 mm diameter x 20 mm djupa petriskålar.
Obs: Dessa används för dechorionation av embryon (steg 3,1) och för parabiotic kirurgi (steg 3,3). Lagra agaros-belagda rätter vid 4 ° C under några veckor; ta dem ur kylskåpet och värm till RT morgonen dagen för parabiotic kirurgi. - Förbered 4% metylcellulosa. Lös upp 4 g metyl-cellulosapulver i 100 ml E3 i en Erlenmeyer-kolv med en omröringsstav. Placera kolven på en omrörningsplatta vid 4 ° C, inställd på lägsta hastighet, och låt den blandaför upp till 2 dagar.
- Intermittent använda en spatel för att bryta upp vita klumpar av metylcellulosa. Metylcellulosan kristallerna inte helt lösa vid denna koncentration. När lösningen blir klar och förefaller homogen utan vita klumpar kvar, portion lösningen i 1,5 ml mikrofugrör och frysa vid -20 ° C för långtidsförvaring.
Notera: Lägre koncentrationer av metylcellulosa kan användas; dock denna högre procentandel, har mer viskös metylcellulosa gav de bästa resultaten.
- Intermittent använda en spatel för att bryta upp vita klumpar av metylcellulosa. Metylcellulosan kristallerna inte helt lösa vid denna koncentration. När lösningen blir klar och förefaller homogen utan vita klumpar kvar, portion lösningen i 1,5 ml mikrofugrör och frysa vid -20 ° C för långtidsförvaring.
- Förbered höga kalcium Ringer (HCR) lösning. För att göra 400 ml HCR lösning, blanda 8 ml 5M NaCl (116 mM slutlig), 400 pl 3M KCl (2,9 mM slutlig), 800 pl 5M CaCl2 (10 mM slutlig) och 2 ml 1 M HEPES (5 mM slutlig) med 390 ml E3 media.
Obs: Affär HCR-lösning vid 4 ° C under några veckor; anta RT morgonen av dagen av parabiotic kirurgi. - Förbered 5 - 6 modifierade Pasteur pipetter för överföringring blastula par. Kortfattat upphetta änden av pipetten över en bunsenbrännare. Sedan, med hjälp stora pincett, vika änden av pipetten till approximativt 45 ° C, medan den fortfarande är varm.
- För att se till att det inte finns några skarpa kanter som kan skada embryon, håller pipettspetsen kort i lågan för cirka 3 sek. Detta kommer att jämna / polera änden av pipetten. Denna modifierade glas pasteurpipett används tillsammans med en 10 ml pipett pump (figur 1) i steg 3,5 nedan.
- Förbered glas nål verktyg för kirurgisk söm av blastula par. Dra 2 - 3 glas nålar som gjort för mikroinjektion av zebrafiskembryon. Använda lab-filmen för att fixera varje glas nål för att i slutet av en trä- eller plast hanteras retas nål (Figur 1A). Använd pincett, bryta i slutet av nålen vid en diameter på ungefär 20 - 30 pm. Använd en mikrometern för att styra det här steget (Figur 1B).
Obs: Storleken på needle tips är viktigt. Om spetsen är för stor blir det svårt att reglera exakt och kan orsaka svåra skador. Om spetsen är för liten är det svårt att i tillräcklig utsträckning lindas embryona.
2. Installera häckande par av Zebrafish och Insamling av embryon (dag -1 till Dag 0)
- Inrätta häckande par av vuxna zebrafisk. Ställ upp fisk natten innan parabiosis operationen ska genomföras. Använd avdelare för att separera män och kvinnor. För att öka oddsen att de önskade embryona kommer att erhållas, som inrättats flera par av varje linje. Vi finner att typiskt 20-50% av paren kommer att leka.
- Nästa morgon, dra avdelare och tillåta parning. Samla alla embryon med hjälp av ett finmaskigt tesil, sedan överföra dem till en petriskål med E3 embryo medium 18.
- Micro-injicera embryon som önskas (t.ex. med 25 pg plasmid-DNA, 200 pg mRNA, eller med 1-6 ng morfolino) inom en timme av samlingen. Låt demväxa tills 256-cellstadiet. Om DNA-expressionskonstruktionen är placerad under kontroll av en värmechockspromotorn (t.ex. hsp70, figur 4B), kontrollera tidpunkten för genuttryck genom värmechockerande de parabionts vid 37 ° C i ett senare skede (t ex., Vid 36 HPF ).
Anmärkning: Som ett alternativ till en fluorescerande transgen kan fluorescerande dextran tillsättas till DNA, RNA, eller morfolino insprutningsblandning (t.ex. dextran, kaskadblått vid 2 mg / ml). Dextran färgämne kommer inte störa normal utveckling och kommer att göra det möjligt för den injicerade embryot kan identifieras under lämplig fluorescerande ljus efter parabiotic fusion. Alternativt skulle parabiosis av en pigmenterad stam (t.ex., AB) med en icke-pigmenterad stam (t.ex., Casper) användas för att identifiera den injicerade embryot i senare skeden. - Inkubera embryon vid 28,5 ° C.Use en stereoskop att övervaka deras utveckling med jämna mellanrum när de närmar sig 256-cell developmental stadiet (approximativt 2,5 HPF).
Obs: Om det behövs, flytta embryon till olika temperaturer för att säkerställa scenen matchning mellan parabiotic partners (t.ex. morfolino-injicerade embryon utvecklar ofta långsammare än sina un-injicerade motsvarigheter flytta un-injicerade embryon till RT medan morpholino-injicerade embryon placeras. vid 28,5 ° C resulterar i skeden inriktnings efter ett par timmars utveckling).
3. Framställning av Parabiotic Zebrafish embryon genom kirurgisk Fusion utveckla Blastulae
- Som embryona närmar sig 256-cellstadiet (cirka 2,5 HPF), överföra embryon från varje genetisk bakgrund (dvs. genetisk mutant, transgena linjerna och / eller genetisk manipulation) i separata agaros belagda rätter (t.ex. en maträtt för morfolino- injicerade embryon och en andra skålen för embryon kontroll). Alternativt, överföra embryon för att rengöra, skrapfria glasbägare eller glaspetriskålar.
Obs: Undvik att använda obelagda plastskålar som embryon fastnar på plast och skadas en gång ur sina chorions. - Dekantera E3 media förrän lagom vätska återstår att täcka embryon (ca 7 - 10 ml). Tillsätt 200 pl av 50 mg / ml blandning av proteaser som isolerats från den extracellulära vätskan av Streptomyces griseus (proteaser). Snurra embryona försiktigt varje par minuter.
- När 50% av embryona har kommit ut ur sina chorions, som normalt tar 5-10 minuter, skölj dem tre gånger med en generös volym (ca 15 - 20 ml) av färskt E3 embryo medium.
- Dechorionate alla embryon kvar i sina chorions genom att försiktigt dra dem upp i den modifierade glas pasteurpipett och sedan försiktigt skingra dem. När embryon har dechorionated och tvättas, byt E3 media med HCR-lösning. Som ett alternativ till proteaser, avlägsna de chorions manuellt med en fin pincett. Sikta på att ha 60-100 dechorionated embryon tillgängliga för varje experimentell skick.
Obs: Detta är flera gånger mer än i slutändan kommer att användas, men många embryon kan komma att skadas under hantering eller kirurgi för parabiosis. När embryona dechorionated, hålla dem under vatten och inte tillåter dem att röra vattenytan, eftersom ytspänningen kommer att få dem att förstöras. Tänk på att använda en högre dos av proteaser låter embryona att komma ut ur sina chorions tidigare och på ett mer synkroniserat sätt. När man använder en lägre dos av proteaser, embryona ta längre tid att ta sig ur sina chorions och göra det på ett mindre synkront sätt, vilket kan resultera i en del av embryona skadas av långvarig exponering för proteaser.
- Dechorionate alla embryon kvar i sina chorions genom att försiktigt dra dem upp i den modifierade glas pasteurpipett och sedan försiktigt skingra dem. När embryon har dechorionated och tvättas, byt E3 media med HCR-lösning. Som ett alternativ till proteaser, avlägsna de chorions manuellt med en fin pincett. Sikta på att ha 60-100 dechorionated embryon tillgängliga för varje experimentell skick.
- När 50% av embryona har kommit ut ur sina chorions, som normalt tar 5-10 minuter, skölj dem tre gånger med en generös volym (ca 15 - 20 ml) av färskt E3 embryo medium.
- Tina metylcellulosa (i steg 1,2 ovan) och centrifugera i en bordscentrifug på max hastighet under 10 minuter för att pelle olösta kristaller som kan skada embryon eller brista deras äggulas.
- Efter centrifugering, använd den klara övre fraktionen (cirka 75% av volymen). Överföring 1 - droppar 1,5 cm diameter av metylcellulosa i en 1,5% agaros-överdragna petriskål. Vara noga med att undvika att dra upp någon av de pelleterade kristaller från botten av röret.
- Använda en markör för att förutbestämma positionen hos varje droppe på bottensidan av skålen. Placera 12 - 15 droppar (2 - 3 portioner till ett värde) av metylcellulosa per 100 mm petri diameter skål. Förbered så många plattor som behövs per experiment.
Obs: Använd varje droppe för fusion av en enda blastula par. Märket kommer att utse platsen för varje droppe när media tillsätts-vid vilken tidpunkt dropparna blir nästan osynlig.
- Förbered en 40 ml alikvot av antibiotika kompletterat HCR lösning per agaros belagda skålen framställd ovan i steg 3,3. Till varje 40 ml alikvot av HCR lägga penicillin-streptomycin vid 50 U / ml, ampicillin vid 50 U / ml, och kanamycin vid 0,5 | ig/ Ml.
- När du är redo att utföra blastula fusioner, noggrant fylla varje av de rätter som innehåller metylcellulosa droppar med 40 ml av antibiotikumet tillskott HCR lösning. Om HCR lösningen tillsätts alltför snabbt, kan det störa dropparna.
- Fäst modifierade glas pasteurpipett (i steg 1,4 ovan) till en 10 ml pipett pump. Under en stereoskop samla en dechorionated embryo från varje bakgrund (t.ex. en morfolino-injicerade embryo och en vild-typ embryo).
- Innan dosering två embryon använder pasteurpipett att göra en liten fördjupning i mitten av metylcellulosa droppe, sedan försiktigt sätta båda embryon i depression.
Not: Under överföringsprocessen, vrid pasteurpipett något uppåt så att embryona avgör in böjen av pasteurpipett för att undvika deras making kontakt med ytan av vätskan på toppen eller botten av pipetten (vilket kan leda till their bristning).
- Innan dosering två embryon använder pasteurpipett att göra en liten fördjupning i mitten av metylcellulosa droppe, sedan försiktigt sätta båda embryon i depression.
- Omedelbart efter avsättning av embryona in i metylcellulosa, använd en trä- eller plast hanteras retas nål med en gel-laddning pipettspetsen på änden (Figur 1A) för att noggrant placera embryona inom metylcellulosa så att deras djur poler är direkt vidröra varandra.
- Utnyttja mjuka svepande rörelser genom metylcellulosa nära embryona att flytta dem utan att direkt vidröra dem. Låt embryona sitta i 5 minuter så att metylcellulosa kommer bosätta sig i omkring dem. Under denna tid, ladda nästa par i en droppe.
Obs! Undvik att göra direkt kontakt med embryon och särskilt noga med att inte röra någon del av gulesäcken, som lätt kommer att brista.
- Utnyttja mjuka svepande rörelser genom metylcellulosa nära embryona att flytta dem utan att direkt vidröra dem. Låt embryona sitta i 5 minuter så att metylcellulosa kommer bosätta sig i omkring dem. Under denna tid, ladda nästa par i en droppe.
- Använda glasålen verktyget noggrant lindade varje embryo vid deras kontaktpunkt. Med en mild sy rörelse, kan celler från den första embryot dras in i det andra embryot och sedan tillbaka igen.Vid slutet av denna rörelse, håller nålen på plats för 2-3 sekunder och sedan dra bort det väldigt långsamt.
Obs: Det är en period av cirka 2-3 sekunder efter embryona sårade där de två vävnaderna verkar vara mer lim och mer benägna att fästa till varandra. Därför tror vi att hålla nålen på plats en kort stund efter sårskada hjälper till att hålla sårade vävnader i varje embryo i kontakt under den inledande tidsperioden omedelbart efter sårskada. - Tillåta dessa embryon att sitta under 10 - 15 min vid RT. Under tiden fortsätter att sy nya par i andra droppar metylcellulosa. Efter 10-15 minuter, bedöma om det första paret har varit fäst (Figur 2A).
Obs: Om embryona längre bifogas, upprepa sömnaden processen så länge embryona är yngre än runt 30% epiboly skede. Vanligtvis tillåter upp till tre försök att sy embryona tillsammans. Om embryona verkar ha haft en bifogad fil men connection inte är väsentlig, utföra ytterligare sömmar vid kanten av anslutningen för att förstärka det. Undvik att skaka eller flytta rätter under parabiotic kirurgi och inkubationsperioder.
Obs: Trots deras tidiga utvecklingsstadium och upplevd bräcklighet, kan cellmassorna embryona tolerera en avsevärd mängd manipulation (dvs skadade och sömmar), och fortfarande utvecklas normalt. Äggulan dock kan spricka med endast minsta beröring, döda embryot. När sy de två blastulae med glasålen, inte att ta kontakt med gränssnittet mellan cellmassan och äggula av varje embryo. - Inkubera embryon O / N vid 28,5 ° C i samma skålen och media (inte ändra media). Av följande morgon, kommer embryon har flyttat ut ur det mesta löst metylcellulosa droppar. Ta bort alla embryon som inte framgångsrikt sammansmälta. Häll media och ersätt med en ny 25 ml E3.
Obs: Om man arbetar med enpigmenterad stam, tillsätt 500 pl 0,15% (50x) fenyltiokarbamid (PTU) till en slutlig koncentration av 0,003% för att blockera pigmentering. Embryon måste hela tiden vara i PTU att upprätthålla undertryckande av pigmentering.
4. Mikroskop Setup Image Acquisition, bearbetning och analys
- Bered 0,8% låg smältpunkt (LMP) agaros: Lägg 0,8 g LMP agaros till 100 ml E3 och värme tills den är helt upplöst. Medan den är varm, alikvot 1 ml av LMP agaros i 1,5 ml mikrofugrör i ett 37 ° C värmeblock. LMP agaros förblir smält vid 37 ° C. Tillsätt 40 | il av 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricaine till varje 1 ml alikvot av LMP agaros vid 37 ° C. Obs: Om man arbetar med en pigmenterad stam, tillsätt 20 pl 0,15% (50x) PTU till varje 1 ml prov.
- Lagra den återstående LMP agaros under flera månader i förseglade 50 ml rören vid 4 ° C.
- Söva parabiotic embryon som skall avbildas genom att tillsätta 1 ml av 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricainetill de 25 ml av E3 att embryona är redan i.
- Snurra försiktigt skålen så att embryona kommer pool i mitten. Sedan, med hjälp av en bred spets plast överföringspipett upprätta embryon i så lite vätska som möjligt. Vänd pipetten upprätt och försiktigt studsa embryon så att de sjunker till botten av pipetten.
- Med embryon vid botten av pipetten, överföra dem till en 1 ml alikvot av LMP agaros genom att lätt röra pipettspetsen till ytan av agarosen. Undvika att överföra överskottsvätska eftersom detta kommer att späda ut agaros.
- Efter utvisa överflödig vätska från pipetten, använd pipetten för att blanda försiktigt embryon i agarosen, använd sedan pipetten att överlåta samtliga agarosen och embryon till brunnen av en glasbotten (nr 1,5 täck), 6- brunnar.
Obs: Var noga med att kasta pipetten efter överföring av embryon till bildplatta. Kvarvarande agaros kommer att ställa in i pipetten, rendering det ineffektivt för vidare användning. Snarare använder en ny pipett varje gång. - Under en stereoskop, använda en gel-laddning pipettspets fäst på slutet av en trä handtag retas nål för att placera embryon ner mot täckglaset (så att de är inom arbetsavstånd mikroskop målet) och i önskad riktning för avbildning.
Obs: Flytta kontinuerligt tills agarosen har helt inställd. Var noga med att montera parabiotic embryon enligt vilken embryo av paret är som skall avbildas. Med tanke på den slumpmässiga orienteringen av de conjoined embryon, för vissa par kan det vara svårt att avbilda båda embryon. I detta scenario, återställa embryon från agarosen med hjälp av en pincett och en bred spets plast överföringspipett och sedan montera för avbildning ur ett annat perspektiv. - När agarosen har satt, täck med 2 - 3 ml E3 kompletterat med tricaine (och PTU vid behov).
- Image embryon med hjälp av en inverterad brett fält epi-fluorescens, laser-scanning konfokala eller spinning disk konfokalmikroskop. Välj det mål som är lämpligast för den önskade avbildning. För en hel embryo synfält, använder en 4x mål. Välja en högre förstoring, såsom ett 20x objektiv, för att avbilda en specifik vävnad 16, 19.
Obs: Om du använder en upprätt mikroskop, montera i LMP agaros (liknande ovan) på en glaskupa halka. Invertera glaset täckglas på en glasmikroskopskiva som har en ring av vakuum fett fylld med samma E3-tricaine-PTU 16, 19. - Process förvärvade bilder med hjälp av gratis bildanalys programpaket som NIH Image J / FIJI 16, 19.
Obs: Räkna cellantal och kvantifiera dynamik såsom cellmigration och celldelning använder segmentering och spårning algoritmer 16, 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Överensstämmer med tidigare publicerade studier 15, framgångsrik parabiotic fusion av zebrafiskembryon beror på mellanlagrings och orienteringen av de två embryon och koncentrationen av metylcellulosa. Med bara några enkla, billiga verktyg, kirurgiskt smälta utvecklings blastulae genereras som växte till parabiotic embryon med delat cirkulation. Dessa verktyg ingår ett modifierat pasteurpipett, en 10 ml pipett pump, och ved hanteras retas nålar vilka användes antingen ensamma eller med en gel-laddning spets eller glasmikroinjektion nål fäst vid änden av lab-film (Figur 1).
Efter att ha placerat de två blastulae i 4% metylcellulosa och med användning av gel-laddning spets för att orientera dem med deras djur poler vända mot varandra (Figur 2A), var embryona försiktigt sårade vid deras kontaktpunkt med glasmikroinjektion needle (Figur 2B). En högre grad av såra (jämför figur 2B figur 2C), och återbesök embryo par för att stärka en initial förbindelse med ytterligare skadades, ökade sannolikheten för embryona upprätthålla en förbindelse som resulterade i lyckad kombination (Figur 3A-C, Film 1) och utan ytterligare morfologiska defekter eller försenad utveckling. När det görs noggrant, var nästan 100% av embryo par smält, även om en del av dessa embryon (ca 25%) aldrig etablerat hälsosam cirkulation i båda halvor. Genom att orientera de två blastulae med sina djur poler direkt linje, var tillförlitliga head-to-head eller gulesäcken mot gulesäcken fusioner genereras med delad cirkulation. I de flesta fall, embryona hade två hjärtan som pumpar en delad gemensam cirkulation (Figur 3D).
För att bekräfta att embryona delade verkligen deras omsättning, fluorescerande dextran var injsad i omlopp, vilket kan ses senare cirkulerar genom båda embryon (film 2). Dessutom, transgena embryon som hade GFP + erytrocyter (LCR: EGFP) fusionerades med embryon som hade mCherry + vaskulära endotelceller (flk1: HRAs-mCherry). Med 48 HPF, var GFP + erytrocyter observer cirkulerar genom flk1: HRAs-mCherry partner embryot (Figur 4A och Movie 3). Att utöka användbarheten av parabiotic systemet, tids kontroll av genuttryck sätts. Före fusion, en av de två embryon injicerades med en hsp70: EGFP DNA-konstruktion 20. Medan de fuserade embryona växte vid 28,5 ° C, ingen fluorescens observeras. I kontrast, efter en kort 30 min värmechock vid 37 ° C, en klar GFP-signal var synlig i en av de två embryon (figur 4B). I vissa fall var GFP + cellerobserverade cirkulerar i FN-injicerade partner embryo. Således, placering av en gen av intresse under kontroll av en värmechockspromotorn ger ytterligare tidsmässiga kontrollen till studier som undersöker cell inneboende eller cell extrinsic funktioner av kandidatgener.
Figur 1. Verktyg för att generera Parabiotic Zebrafish embryon.
(A) kommenterad bild visar verktyg som används för kirurgisk fusion utveckla blastulae. Verktyg inkluderar en modifierad pasteurpipett (överst), som används i samband med en 10 ml pipett pump (grön). Trä hanteras retas nålar används antingen ensam eller med en plast gel-laddning pipettspetsen eller dras glas mikroinjektion nålad fäst vid änden med lab-film. (B) Bilden visar ändarna av tre glasmikroinjektion behovles som har brutit med en pincett vid olika diametrar. Nålarna är liggande på toppen av en mikrometer; de minsta linjerna är placerade 10 pm från varandra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Kirurgisk Fusion utveckla Blastulae.
Hög förstoring bilder visar två zebrafisk embryon vid höga utvecklingsstadium, orienterade med sina djur poler vända mot varandra, före kirurgisk söm (A), omedelbart efter minimal sårskada (B), och efter mer omfattande sårskada (C). 20 min senare är det uppenbart att embryona har framgångsrikt fuserade baserat på den oavbrutna bro av celler mellan två blastulae (D). Skalastapel representerar 250 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Utveckling av Parabiotic Zebrafish embryon.
(AC) Bilderna visar en hel-parabiont syn på tidiga utveckling strax efter skadade (A) och som embryona fortsätter att utvecklas och genomgå epiboly (B och C) Dessa bilder motsvarar Film 1. (D) Bilden visar en parabiotic embryo par vid 36 HPF. Embryona är vid sina gulesäckar, har två hjärter och dela en gemensam cirkulation. Skalstrecken representerar 250 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Visualisera Parabiosis med genetiskt kodade fluorescerande proteiner.
(A) Bilder (fluorescens ensam, höger, overlay med transmitterat ljus, vänster) visar huvudet regionen förenade embryon vid 48 HPF. Den nedre embryo för detta par är transgena för LCR: EGFP (erythroctyes, grön) medan dess partner (överst) är transgena för flk1: HRAs-mCherry, vilka etiketter vaskulära endotelceller (röd). Gröna erytrocyter kan ses cirkulerar genom partner embryot. Den här bilden motsvarar Movie 3 (B) Den vänstra embryot i detta par injicerades med en hsp70: EGFP bygga på en cellstadiet och sedan smält till en un-injicerade partner (höger). När djuren värmechock vid 37 ° C under 30 min vid 36 HPF, var grön fluorescens av GFP observerades i le ft embryo vid 60 HPF. Skalstrecken representerar 500 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1. Tidig utveckling av kirurgiskt smält zebrafisk blastulae. (Högerklicka för att ladda ner).
Filmen visar den tidiga utvecklingen av ett par kirurgiskt smält zebrafisk blastulae. Epiboly kan ses förekommer samtidigt i varje embryo. Denna film är relaterad till figur 3A-C.
2.jpg "/>
Film 2. Fluorescerande dextran injektion belyser en gemensam cirkulation. (Högerklicka för att ladda ner).
Filmen visar fluorescerande dextran injiceras i den gemensamma kardinal venen hos en parabiotic embryoparet vid 60 HPF. Det fluorescerande färgämnet kan ses därefter cirkulera genom båda embryon.
Film 3. Grön blod som flyter genom röda fartyg.mov "> (Högerklicka för att ladda ner).
Filmen visar huvudet regionen förenade embryon vid 48 HPF. Den nedre embryo för detta par är transgena för LCR: EGFP (erythroctyes, grön) medan dess partner (överst) är transgena för flk1: HRAs-mCherry, vilka etiketter vaskulära endotelceller (röd). Gröna erytrocyter ses cirkulerar genom partner embryot. Denna film är relaterat till figur 4A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Parabiotic fusion har varit ett kraftfullt verktyg för att undersöka cellulära funktioner av kandidatgener hos vuxna musmodeller och kycklingembryon 10-14. På senare tid har ett blastula fusion metod beskrivits för att generera förenade zebrafisk embryon 15. I det nuvarande protokollet, är videobaserade självstudier för att demonstrera och bättre beskriva den metod för att skapa parabiotic zebrafisk embryon med olika genetisk bakgrund för att studera tids, cell inneboende, och cell yttre roller kandidatgener av intresse i hematopoetisk utveckling och vidare.
Den metod som beskrivs i detta dokument har nyligen använts för att spåra HSC framväxt i ett embryo, migration via blodcirkulationen till ett embryo av olika genetisk bakgrund, och efterföljande inympning och differentiering 16. I samförstånd med Kissa gruppens slutsatser, iscensättning och embryo positionering befanns bestämma framgångoch anatomisk karaktär parabiotic fusion. Med några viktiga ändringar av protokollet var parabionts genereras med en betydligt högre överlevnad. Dessa inkluderar såra blastulae i större utsträckning, håller nålen på plats för 2-3 sekunder efter sårskada, och sedan gå tillbaka blastula par efter 15 minuter för att förstärka en första anslutning med ytterligare såra, om det behövs. Med dessa ytterligare rekommendationer, överlevde nästan 100% av parabionts och förblev fäst, och 75% av dem delade en gemensam cirkulation.
Att införliva ett inslag av experimentell kontroll metoden är parabiotic embryon visade här att vara tolerant mot värmechock, vilket möjliggör tidsstyrning av genuttryck i parabiotic sammanhang 20. En begränsning med denna teknik är att i vissa fall de parabiotic partner embryona inte är i samma plan efter parabiotic fusion. Detta kangör det svårt att montera embryon i LMP agaros för att spåra celler i båda embryon samtidigt med time-lapse mikroskopi. För att kringgå denna potentiella problem, bör en planerar att generera flera parabiotic embryon för att säkerställa den önskade orienteringen uppnås. Alternativt kan embryon utvinnas från LMP med hjälp av en fin pincett och Pasteurpipett och åter monterade för avbildning ur ett annat perspektiv. Målet med detta protokoll var att ge en uppsättning tydliga, koncisa instruktioner att följa videobaserade självstudier om hur man kirurgiskt säkring utveckla blastulae att generera parabiotic zebrafisk embryon.
Med de viktigaste ändringar och ytterligare rekommendationer för att öka parabiont överlevnad, kommer detta protokoll förhoppningsvis ge utredare som vill utnyttja förenade embryon för att undersöka faktorer som reglerar cellmigration, öde specifikation och differentiering i en rad olika vävnader och cellulära sammanhang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | ||
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| Antibiotics: | |||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 | |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 | |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| 50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 | |
| capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 | |
| Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| 10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 | |
| 100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 | |
| PTU. working stock is 0.003% (50x is 0.15%). for 500 ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 | |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 | |
| plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM | |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F | |
| plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 | |
| glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | |||
| Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 | |
| Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |
References
- Zon, L. I., Orkin, S. H. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Dzierzak, E., Speck, N. A. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nat Immunol. 9 (2), 129-136 (2008).
- Li, P., et al. Epoxyeicosatrienoic acids enhance embryonic haematopoiesis and adult marrow engraftment. Nature. 523 (7561), 468-471 (2015).
- Tam, P. P., Rossant, J. Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian development. Development. 130 (25), 6155-6163 (2003).
- Tanaka, M., Gertsenstein, M., Rossant, J., Nagy, A. Mash2 acts cell autonomously in mouse spongiotrophoblast development. Dev. Biol. 190 (1), 55-65 (1997).
- Morin-Kensicki, E. M., Faust, C., LaMantia, C., Magnuson, T. Cell and tissue requirements for the gene eed during mouse gastrulation and organogenesis. Genesis. 31 (4), 142-146 (2001).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348 (6303), 728-730 (1999).
- Parker, L., Stainier, D. Y. Cell-autonomous and non-autonomous requirements for the zebrafish gene cloche in hematopoiesis. Development. 126 (12), 2643-2651 (1999).
- Liao, E. C., Trede, N. S., Ransom, D., Zapata, A., Kieran, M., Zon, L. I. Non-cell autonomous requirement for the bloodless gene in primitive hematopoiesis of zebrafish. Development. 3 (3), 649-659 (2002).
- Kamran, P., Sereti, K. I., Zhao, P., Ali, S. R., Weissman, I. L., Ardehali, R. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
- Wagers, A. J., Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L. Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science. 297 (5590), 2256-2259 (2002).
- Hervey, G. R. The effects of lesions in the hypothalamus in parabiotic rats. J. Physiol. 145 (2), 336-352 (1959).
- Goldman, D. C., Bailey, A. S., Pfaffle, D. L., Al Masri, A., Christian, J. L., Fleming, W. H. BMP4 regulates the hematopoietic stem cell niche. Blood. 114 (20), 4393-4401 (2009).
- Dieterlen-Lièvre, F., Martin, C., Beaupain, D. Quail-chick chimaeras and parabionts: several new models to investigate early developmental events in the haemopoietic system. Folia Biol (Praha). 25 (5), 293-295 (1979).
- Demy, D. L., Ranta, Z., Giorgi, J. M., Gonzalez, M., Herbomel, P., Kissa, K. Generating parabiotic zebrafish embryos for cell migration and homing studies). Nat. Methods. 10 (3), 256-258 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126 (26), 2811-2820 (2015).
- Murayama, E., Sarris, M., Redd, M., Le Guyader, D., Vivier, C., Horsley, W., Trede, N., Herbomel, P. NACA deficiency reveals the crucial role of somite-derived stromal cells in haematopoietic niche formation. Nat Commun. 28 (6), 8375 (2015).
- Shah, D. I., et al. Mitochondrial Atpif1 regulates haem synthesis in developing erythroblasts. Nature. 491 (7425), 608-612 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160 (1-2), 241-252 (2015).
- Adám, A., Bártfai, R., Lele, Z., Krone, P. H., Orbán, L. Heat-inducible expression of a reporter gene detected by transient assay in zebrafish. Exp. Cell Res. 256 (1), 282-290 (2000).
