Abstract
脳卒中は世界中で罹患率および死亡率の主要な原因の一つです。脳卒中は、脳浮腫およびその他の病態生理学的事象によって複雑になります。脳卒中誘発脳浮腫の開発と進化の中で最も重要な選手の中でホルモンのアルギニンバソプレシンおよびその受容体、のV1a及びV2があります。最近、のV1a及びV2受容体ブロッカーコニバプタンは、脳卒中後の脳浮腫を減少させるための潜在的薬物として注目されています。しかし、脳卒中研究におけるコニバプタンアプリケーションを含む動物モデルは、投与の実現可能な経路に基づいて変更される必要があります。ここでは48時間の連続静脈内（IV）の成果は、マウスにおける実験的脳卒中後の腹腔内（IP）コニバプタン治療と比較されます。我々は、中大脳動脈閉塞がコニバプタン（0.2 mg）を、または車両のIV治療のための頸静脈にカテーテルのインストールと組み合わせされたプロトコルを開発しました。動物の異なる集団は0.2で処理しました毎日コニバプタンまたは車両IP mgのボーラス。実験的脳卒中誘発脳浮腫は、連続IVおよびIP処置後のマウスにおいて評価しました。結果の比較はコニバプタンの連続IV投与がコニバプタンのIP投与とは異なり、マウスにおける虚血後脳浮腫を軽減することを明らかにしました。我々は、我々のモデルは、脳卒中や脳浮腫の文脈でコニバプタンアプリケーションの将来の研究のために使用することができると結論します。
Protocol
実験は、研究における動物の管理と使用のための国立衛生研究所のガイドラインに従って実施したとスウェーデンの医療センター動物実験委員会によって承認されました。すべての手順は、適切な無菌技術を用いて実施しました。研究のために利用した実験動物は、25から27グラムに体重を持つ野生型C57マウス、3ヶ月齢、男性でした。
インビボストローク誘導1.
- 手術前に歯科用レジンとのプレコートフィラメント。
- 7-0ナイロン縫合糸からのフィラメントの12ミリメートル長い部分をカットします。硬化剤の1部を樹脂2部を混合し、その後すぐに、約1/3全長のをカバーするために混合物中にフィラメントの先端を浸し。すぐにそれを削除し、それは歯科用レジンの滑らかな表面のコートで覆われていることを確認します。
- 空気は使用前に2時間フィラメントを乾燥します。
- 上にマウスを置きますnは麻酔導入室（2 L容量）、及びチャンバに入る2リットル/分で25％の酸素富化室内空気中1.5％イソフルランの流れを設定します。
- 尾のピンチへの応答の欠如によって決定されるように、完全に、8を麻酔まで、マウスは、誘導チャンバ内に残ることを許可します。
- 加熱パッドで手術台の上にマウスを置き、ノーズコーンを介して自然に配信麻酔の維持のために1％のイソフルラン濃度を設定します。
- フロントや首の後ろで髪をクリップし、消毒用アルコールで首をスプレー。両眼に獣医の眼軟膏を適用します。
- 継続的に体温を監視するには、手術中にデジタルディスプレイに接続直腸温度プローブを使用します。
- 仰臥位でマウスを置き、消毒用ポビドンヨード10％スクラブ溶液を塗布、滅菌ドレープで覆い、その後、サイズ10手術用メスの刃で首に沿って正中切開を行います。 <李>は一時的に6.0絹縫合糸で左総頸動脈（CCA）を連結します。
- 左外頸動脈（ECA）上の別のネクタイを置きます。
- 内頸動脈（ICA）上の微小血管クリップを配置します。
- 微小血管はさみで外頸動脈に小さな穴をカット。 ECAの開口部に歯科用レジンで被覆した7-0ナイロン縫合糸から作られたフィラメントを挿入し、クリップを除去しながら抵抗（CCAの分岐点から約5〜7 mm）の感じられるまで、cephalicallyそれを進めます。
- 位置にフィラメントを確保するために内頸動脈上に一時的なネクタイを置きます。図、 図1（a）を参照してください。絹縫合糸で皮膚を閉じて、ステップ2.6のように、0.5％ブピバカイン0.2ミリリットルと首の前面に傷を浸透させます。
- マウスは麻酔から目覚め、60分間回収室で意識を取り戻すことを可能にします。それは取り戻したまで無人の動物を放置しないでください胸骨横臥を維持するのに十分な意識。
- 0 =正常な運動機能を3 =対側に傾いて、2 =安静時、反対側が、通常の姿勢に旋回、テールリフトの胴体のと反対側の前肢の1 =屈曲、次のように神経学的欠損スコアリング（NDS）のためのマウスをテストします残り4時側=なし自発運動。4,9
- NDSのテストのための観察のための平らな面に尾と場所によって、リフトマウス（2-3分）。また、回収室でマウスを観察します。 MCAの不十分な閉塞に実験から2よりも低いNDSを示すマウスを除外します。
注：レーザードップラー流量測定技術は、MCA閉塞を確認するために使用することができる9-11。
- NDSのテストのための観察のための平らな面に尾と場所によって、リフトマウス（2-3分）。また、回収室でマウスを観察します。 MCAの不十分な閉塞に実験から2よりも低いNDSを示すマウスを除外します。
- 上記のように誘導室に回復の60分後に動物を麻酔-再、10％ポビドンヨードスクラブ溶液で前の皮膚切開を再滅菌し、上の手術創を再開絹縫合糸を切断して除去することにより、首の前面。
- ECAからフィラメントを削除するには、次の手順を実行します。
- ICA上の微小血管クリップを配置します。 ICAに縫合糸をほどくとオープンクリップを保持しながら、フィラメントを引き出します。
- クリップを閉じて、近位にカットにECAにネクタイを配置します。
- クリップを削除し、脳への血流を回復するためにCCAから合字を削除します。図、 図1Bを参照してください。
連続48時間の治療のための頸静脈に静脈カテーテルの2.インストール
注：マウスの覚醒せずにすぐにステップ1.16.3後、カテーテルのインストールに進んでください。
- フレキシブルチューブの2つの異なるサイズを使用します（外径0.94ミリメートル、注入される薬剤を含むように）インナーチューブを挿入し、外チューブ（外径3.18ミリメートル、インナーチューブの保護のため）に。
- P、腹臥位でマウスをレース消毒に10％のポビドンヨードスクラブソリューションを適用し、サイズ10手術用メスの刃で首の後ろに1cmの切開を行います。仰臥位にマウスを回し、10％ポビドンヨードスクラブ溶液と首の前面を再滅菌し、首の前面に外科創傷を再開。首の前面に背面の切開から皮膚の下のトンネルチューブを、と開いた傷口1センチメートルからそれを体外に出します。
- 正中線から横方向に約1cm首の前面の左側から皮下脂肪組織を削除します。 、左頸静脈を見つけて5ミリメートル離れた静脈に沿って2絆を置き、わずかに静脈を伸ばします。微小血管はさみで2絆間の頚静脈に小さな穴を開けます。 （心臓に向かって）インナーチューブ5ミリメートル、深尾側の先端を挿入します。
- 頚静脈の両方にタイでチューブを固定します。と首の前面に皮膚を閉じます3-0絹縫合糸。図、 図1Cを参照してください。
- 縫合糸で首の後ろに皮膚にチューブを固定して、スイベルを介してマイクロインフュージョンのIVポンプにチューブを接続します。スイベルは、食料や水へのフルアクセス権を持つケージの中にマウスの自由な移動を可能にします。
- 術後の痛みを防ぐために、0.5％ブピバカイン0.2ミリリットルと前面の皮膚切開と首の後ろを潜入。
注：機関特定の動物のプロトコルに応じて、動物は、オピオイド、NSAID類、または抗生物質前および術後で処理することができます。しかし、上記の治療は、虚血性脳卒中のアウトカムの結果を変更することができます （ ディスカッションセクションを参照してください）。11月14日 - 動物は、実験の終了点まで別々のケージに動物を回復室で目覚め、その後収容することができます。それは胸骨を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください横臥。
- 1.5ミリリットル/ kg /時間、4で連続48時間のIVコニバプタンの治療（5％デキストロースで0.14 mg / mlで）または車両の注入速度を設定し、注入を開始します。
注：IV注入コニバプタンの総量は1.44ミリリットルの全容量で約0.2ミリグラム/マウス/日であるべきです。
注：5％デキストロースの1.44ミリリットル中0.2ミリグラムの合計量1日2回コニバプタンの腹腔内（IP）注射を行います。 IP注射は、先に説明した実装します。15は、本体とテールの後面の皮を把持して、マウスを抑えます。 26 G / 1/2インチ針を使用して、左下腹部にコニバプタンまたは車両を注入する。15 - 実験（48時間）の全期間1日2回、動物を観察します。動物が食料や水へのフルアクセスを許可。動物が苦痛または呼吸困難の兆候を示す場合獣医師に相談してください。安楽死は、重度のdistに動物のために必要な場合RESSは、以下のステップ3.1を参照してください、そして研究から動物を除外します。
エンドポイントでの脳卒中誘発脳浮腫の3評価
- 5％イソフルランでオーバー麻酔によりマウスを生け贄に捧げます。
- 正中線に沿って頭蓋骨の上に皮膚切開を行い、脳の上に全体の頭蓋骨を露出させ、皮膚を撤回するためにメスを使用してください。大後頭孔で始まり、それぞれの側の脳の周囲に沿って横方向に頭蓋骨を切断し、その下に脳に触れることなく慎重に持ち上げます。脊柱から脳と頭蓋骨のベースに取り付けられた神経を切断します。
- 前述したように、脳を取り外し嗅球および小脳から分離し、虚血性および非虚血性大脳半球に半球間裂に沿って大脳を分析。9
- 以前に4,9記載されているように、ウェット-乾燥比（WDR）を比較することによって、脳浮腫を評価します。組織の重量を測定前とオーブンで100℃で3日間乾燥させた後。 ％のH 2 O =として脳含水量（BWC）を計算（1乾燥重量/湿潤重量）×100％。
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Representative Results
動物の体温が生理的範囲内であったとストローク誘導の外科的手順を通じて安定。 MCAOは、研究から除外した直後に2よりも低いNDSを示した2匹のマウス。
マウスにおけるMCAOは、48時間で同側半球で梗塞容積を生成します。 TTC染色した切片の評価は、脳虚血性脳卒中の発症が深刻な原因となる2009年10 Zeynalov、E.およびドレ、S.、によって発行された半球の約50％は、MCAO（ 図1D）後の梗塞の影響を受けていることを示しています酸素や栄養素が脳組織の剥奪。この局所脳組織の低酸素症の結果として、ニューロンおよびグリア細胞は、脳の梗塞部分を形成する、死ぬ。 図1Dは、MCAO誘発性梗塞により影響を受ける代表的なマウスの脳切片を示しており、傷害の大きさの推定値を与えます。 48時間60分後MCAO誘導で脳の水分含量（BWC）の評価はコニバプタンIV投与（0.2 mg /日）を大幅に両方の同側および対側半球における脳浮腫、（ 図2A）を減少させることを明らかにしました。これとは対照的に、0.2 mgのボーラスによってコニバプタンのIP-治療は、毎日、脳卒中誘発脳浮腫（ 図2B）に同様のプラスの効果を生み出すことができませんでした。 血漿および尿浸透圧にコニバプタン効果の確認実験の終了時点ですべての実験動物において達成されました。コニバプタンはIV処置または次のようにIPは、プラズマを増加し、全てのマウスにおいて尿浸透圧の減少4血漿浸透圧の値をマウスであった：313±4.4ミリオスモル/キログラム（車両、IV）対355±7.5 *ミリオスモル/キログラム（コニバプタン、IV） 、以前に公開されたように、4と340±7.7ミリオスモル/キログラム（車両、IP）対383±8.8 *ミリオスモル/キログラム（コニバプタン、IP）。次のように、マウスにおける尿浸透圧の値は以下のとおりであった：1210.6±13.4ミリオスモル/キログラム（車両、IV）対595.0±57.4 *ミリオスモル/キログラム（コニバプタン、IV）、以前に公開されたように、4および1535.0±80.9ミリオスモル/キログラム（車両、 IP）対242.0±23.2 *ミリオスモル/キログラム（コニバプタン、IP）。提示されたすべてのデータは平均±SEM、コントロールを対応する* P≤0.05対を意味します。 
図1： 脳卒中後の実験的脳卒中モデル、IVカテーテルのインストール、および48時間での代表的な梗塞体積のダイアグラムは、（青で表示）フィラメントの位置が左内頸動脈（ICA）における樹脂（緑）でプレコーティングオクルージョン（A）及び再灌流時間（B）の間。左頸静脈（C）におけるフレキシブルチューブ先端の正しい位置。エクスペリマウスにおけるリットルのストロークは48時間で同側半球における梗塞体積を生成します。プロトコールに記載されているように（3.1-3.3ステップ）、マウスMCAO後48時間で屠殺し、脳を取り出しました。脳を2mm厚の切片に切断し、TTC（D）で染色しました。図1DはZeynalov、E.およびドレ、S.、2009年までに元の記事から変更されている10 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 
図2： 連続静脈内（IV）および腹腔内（IP）コニバプタン（0.2 mg /日）脳卒中誘発脳浮腫に対する治療コニバプタンIV治療は48時間投与したの影響 。 IV投与コニバプタン処理は、同側および対時間で虚血後脳浮腫を減少させましたemisphere（A）。図2Aは、Zeynalov らによるオリジナル記事から変更されている。、48時間2015年4コニバプタンIP処理は実験的脳卒中によって引き起こされる脳浮腫を軽減するために失敗し、各群においてn = 10。 （ステップ1.1.1-1.15.3）上記のプロトコルに記載されているようにしたマウスは、再灌流でMCAOを受けました。その後コニバプタンのIP注射（0.2 mg）を22時間再灌流の46時間で、すぐに投与しました。マウスを屠殺しました。プロトコル（3.1〜3.4ステップ）で説明したように脳を、オーブン中で除去し、乾燥させました。 （B）全てのデータは平均±SEMとして提示され、* P <0.05、対応する制御対。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
この研究は、前臨床脳卒中研究のための重要な値を有します。この研究では、マウスにおける実験的脳卒中後のコニバプタン（0.2 mg /日）の連続IV注入を効率的に処理の48時間後に脳浮腫を減少させることが明らかになりました。脳浮腫のコニバプタンの同じ用量の腹腔内注射の効果も調べました。で示されるようにIVおよびIPルートの両方によるコニバプタン処理は、マウスで自由水利尿を生成します。少し生理的レベル以上の血漿浸透圧の1）の増加。及び2）による腎臓における水の再吸収の閉塞に尿浸透圧の減少。従って、処理結果に基づいて、我々は、IV送達方法は、脳卒中誘発浮腫形成の追加の重要な有益な効果を有することを報告しています。
当社の主要な発見は、IV治療はコニバプタンのIPルートよりも脳浮腫の軽減に優れた効果を生じたということです。臨床用途はCORするコニバプタンは、利用可能な組み合わせのV1a及びV2受容体拮抗薬でありますRECT低ナトリウム血症、血液量及び重量オスモル濃度16コニバプタンは、様々な条件を有する患者における低ナトリウム血症を修正することが示されている。コニバプタンの17臨床的利用可能性は、脳浮腫の文脈において、その探索は、高速ベンチ・ツー・ベッドサイド翻訳をもたらすことができることを示唆しています。脳室内送達実験選択V1a受容体遮断薬の使用は、他の研究者によって記載虚血後脳浮腫の形成を減少させることが証明されている。3,18しかしながら、これらの研究で使用される薬剤も、薬物の治療経路のいずれもの可能な臨床応用を提案しています近い将来。
脳虚血とAVP原因の脳浮腫によりメカニズムは複雑です。しかし、いくつかの重要な分子選手は、BBBの界面で血管壁に局在するナトリウムと塩化共同輸送体19,20とのV1a受容体です。コニバプタンの影響を遮断V2はexcesの排泄のために責任がありますコニバプタンがコニバプタンの利用可能性を減らすことができる組織の障壁を回避するために、循環に直接配信されたときに腎臓および脳浮腫の発症を防ぐのに役立つかもしれ血液浸透圧の上昇。21これらの機構によってsの水はまだプレイしていてもよいです。しかし、用量および治療 期間の正当化は、以前に公開された観察に基づいていた。4これはコニバプタン地域血流の損傷によって誘発される減少した後、脳の虚血部位に到達したか否かが判断されていません。それはまた、脳が脳動脈内のV1a受容体を遮断することによって、このような血管収縮の防止などの望ましい局所的効果を生成するコニバプタンのに十分な量を受信するかどうかを検討する必要があります。
実験プロトコルはコニバプタンの処理経路の選択の問題に対処するために設計されました。結果に基づいて、研究がコニバプタン広告のIV経路のための強力なサポートを提供しています奉仕。しかしながら、プロトコルの最も重要なステップは、確立されたマウスにおける脳卒中後の治療結果に有意差を検出するために微調整することが必要。これらの工程の中には、MCAO（60分）の1）期間; 2）毎日の用量（0.2 mg）を、および注入速度（1.5ミリリットル/ kg /時間）。および3）治療（48時間）の長さ。 MCAOの期間は不可逆的損害脳組織ためのプロトコルのために極めて重要である虚血性発作の程度を決定します。傷害の厳しすぎるが、それが困難な動物は48時間生き残るためになるだろう、または動物は脳浮腫に対するコニバプタン治療にあまり反応しなくなる可能性があります。一方、MCAOの持続時間未満で60分マウスにおいて虚血性傷害を誘導するのに不十分な場合があり、そして、従って、脳浮腫を生じないであろう。用量および治療 期間は、コニバプタン用FDAの推奨に基づいて選択した。16しかし、ことが報告されていますコニバプタンのためのヒト用量は、脳卒中後の脳浮腫を減少させるためにマウスでは効率的ではありませんでした。従って、用量は、虚血後の脳浮腫に対する有意な防御を誘導したマウスは10倍に増加しなければならなかった。4正確な注入速度を選択することの重要性があれば、それは全血液量、血圧、および間質液の蓄積に影響を与えることができるということです率は大幅に提案したレートを超えます。しかし、全血液量と血圧の測定は、非常に有益であろう。
MCAOの外科的誘導は、侵襲的な処置であり、プロトコルのすべてのステップに正確な注意が必要であり、技術のためのトラブルシューティングのヒントを知ることが重要です。原因誤って引き裂かれた動脈への過剰な動脈出血などのいくつかの予期しない外科手術の合併症は、実験のための成功率を低下させ、死亡率を増加させます。しかし、静脈出血、光圧力Wを適用することにより停止することができます滅菌スポンジi番目。
このプロトコルは、MCA閉塞が右または左MCAのいずれかで生成されることを意味する脳虚血の一方的な誘導を説明します。しかしながら、このプロトコルはMCA閉塞およびIVカテーテル設置の外科医の好ましい側面に応じて変更することができる。1図図 MCAO手順の最も重要な部分の図を示す、 図1AおよびB、IVカテーテルインストールプロトコル、 図1C、およびMCAO誘発性脳梗塞の代表的な脳スライス実験（48時間）の終了時点で、以前に公開されたように、10 図1D。図と代表的な脳スライスは、MCAOは、脳の左側に誘導されたことを意味しているがMCAOは、エン全体の一貫性である限り、脳の右側に誘導された場合、我々は結果の劇的な違いを考えていませんタイヤ試験が維持されます。
手術や麻酔後の回復期間中、動物が原因で術後の痛みや重度の神経障害に苦痛を経験するかもしれません。多くの場合、術後の疼痛管理には、0.5％のブピバカインなどの局所麻酔薬のみの使用に限定することができます。マウスでのヒトにおける脳血管障害だけでなく、実験的脳卒中に起因する脳卒中、炎症、脳梗塞、脳浮腫などの病態生理学的要因が関与する。9これらの病態生理学的なイベントは、このようなシクロオキシゲナーゼなどの重要な分子プレーヤーが従事している（COX）13およびGタンパク質関連受容体。彼らは、これらの設定に使用された13場合はCOXが関与する分子経路と22の干渉は、NSAID薬によって引き起こされることがあります。オピオイドは、Gタンパク質とセカンドメッセンジャー12に連結されており、脳卒中、11結果の病態生理学的結果を変更することができ、それらの受容体に作用します本研究の秒。これらの要因は、術後マウスにおける鎮痛薬の使用を制限します。
要約すると、我々の研究は、これまで到達目標としてコニバプタンを再利用の可能性を探ります。コニバプタンの連続IV注入に続く実験的脳卒中誘発の我々の動物モデルは、脳卒中患者におけるその潜在的な使用を示唆して一貫性のある結果を生成することが示されています。より具体的には、二次的脳損傷を防ぐために、脳卒中後コニバプタンの連続IV治療のモデルマウスでの前臨床研究のために使用することができることを実証しました。臨床現場への高速変換はICU患者のために救命することができるので、この研究は、脳卒中後のマウスに脳浮腫を研究するための追加のツールとしてコニバプタン治療の代替アプリケーションを提供することを意図していました。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
私たちは、資金調達と設備を提供するためのスウェーデンの医療センターに感謝します。また、研究スペースの寛大な使用のためのクレイグ病院に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heated Pad | K&H Manufacturing Inc | 1060 | |
| Temperature Monitor with Rectal Probe | Physitemp | 7029 | |
| Silk Suture Spool, 6-0 | Surgical Specialties Corporation | SP114 | |
| Silk Suture on a Needle, 3-0 | Ethicon | 1684G | |
| Nylon Suture, 7-0 | Ethicon | 1696G | |
| Dental Resin Polysiloxane with Hardener | Heraeus Kulzer | 65817930 | |
| Microinfusion IV Pump | Kent Scietific | GT0897 | |
| Swivel 22GA | Instech | 375/22PS | |
| Laboratory Tubing, 0.94 mm x 0.51 mm | Dow Corning | 508-002 | |
| Laboratory Tubing, 3.18 mm x 1.98 mm | Dow Corning | 508-009 |
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