Abstract
中风是在世界发病和死亡的主要原因之一。中风是脑水肿等病理生理事件复杂化。间在中风诱发的脑水肿的发展和演变的最重要的球员是激素精氨酸加压素及其受体，V1a和V2。最近，V1a和V2受体阻滞剂考尼伐坦受到关注作为潜在的药物，以减少中风后的脑水肿。然而，这在中风研究涉及考尼伐坦应用动物模型需要根据给药可行途径进行修改。在这里，48小时连续静脉注射（IV）的结果与小鼠实验中风后腹腔内（IP）考尼伐坦治疗相比。我们开发了在大脑中动脉闭塞与导管安装组合为IV治疗考尼伐坦（0.2毫克）或车辆的颈静脉的协议。动物的不同队列，用0.2治疗考尼伐坦或车辆的IP毫克，每天丸。实验中风诱发脑水肿连续IV和IP处理后的小鼠进行了评估。的结果比较，可知考尼伐坦的连续IV施用减轻小鼠局部缺血后的脑水肿，与考尼伐坦的IP施用。我们得出结论，我们的模型，可用于在中风和脑水肿的上下文考尼伐坦应用今后的研究。
Protocol
实验是按照美国国立卫生研究院的照顾和使用动物研究的指导方针进行，由瑞典医学中心的动物护理和使用委员会批准。所有的程序都用适当的无菌技术进行的。这项研究使用的实验动物均为男性，3个月大，体重野生型C57小鼠25日至27克
1. 在体内诱导中风
- 预涂层与树脂牙灯丝此前的手术。
- 剪切从7-0尼龙线12毫米长片丝。混合2份该树脂与硬化剂的1份，然后立即浸长丝的前端到混合物，以覆盖整个长度的约1/3。快速清除并验证它覆盖的牙科树脂的表面光滑的外套。
- 风干灯丝在使用前2小时。
- 将鼠标进入Ñ麻醉诱导室（2L体积），并设置在2升/分钟进入腔室1.5％异氟烷在25％的富氧室内空气的流动。
- 允许小鼠留在感应室中直至完全麻醉，8由缺乏响应于尾捏确定。
- 将鼠标走上手术台用加热垫，并设定1％的异氟醚浓度维持通过鼻锥自然娩出麻醉。
- 夹上的前部和颈部的背毛，并用酒精喷颈部。在两只眼睛应用兽医眼药膏。
- 连续监测体温，用在手术过程中连接到数字显示直肠温度探头。
- 鼠标放置在仰卧位，应用碘伏10％溶液擦洗消毒，用无菌悬垂盖，然后使沿颈部正中切口，大小10手术刀刀片。 <利>暂时结扎左颈总动脉（CCA）以6.0缝合丝线。
- 放置在左侧颈外动脉（ECA）的另一个领带。
- 放置在颈内动脉（ICA）微血管剪辑。
- 削减与微血管剪刀颈外动脉一小的孔。插入来自涂上树脂牙将在ECA开幕7-0尼龙线做灯丝，并cephalically推进它，同时消除夹，直到感到有阻力（从CCA分叉处约5-7毫米）。
- 放置一个临时粘结到所述内颈动脉，以确保灯丝中的位置。参考下图， 图1A。收用丝线缝合皮肤，并渗透在颈部的前部的伤口用0.2ml 0.5％布比卡因，如在步骤2.6。
- 让鼠标从麻醉中苏醒并恢复意识在恢复室中60分钟。不要离开无人看管的动物，直到它已经恢复足够的意识，以保持胸骨靠着。
- 测试鼠标的神经功能缺损评分（NDS）如下：0 =运动功能正常，躯干和尾板对侧前肢1 =前屈，2 =盘旋至对侧，但在休息，3正常坐姿=偏向对侧侧静止的，4 =无自发运动活性。4,9
- 对于NDS测试，尾巴和地点在一个平面上进行观察（2-3分钟）抬起鼠标。另外，观察在恢复室老鼠。排除表现出比NDS 2从实验降低因MCA闭塞不足小鼠。
注意：激光多普勒血流仪技术可以被用来确认MCA闭塞9-11。
- 对于NDS测试，尾巴和地点在一个平面上进行观察（2-3分钟）抬起鼠标。另外，观察在恢复室老鼠。排除表现出比NDS 2从实验降低因MCA闭塞不足小鼠。
- 重新麻醉如上所述动物后在感应腔室恢复60分钟，再消毒用10％聚维酮碘溶液擦洗先前切开皮肤，并重新打开在手术伤口通过切割和去除丝线缝合颈部的前面。
- 从ECA取出长丝执行以下步骤：
- 广场上的ICA微血管剪辑。解开对ICA的缝线拉出长丝的同时抱夹打开。
- 关闭剪辑和近端放置领带到非洲经委会晋级。
- 除去夹子和从CCA除去结扎以恢复血流到大脑。参考下图， 图1B。
2.安装静脉导管进入颈静脉连续48小时处理
注：步骤1.16.3没有鼠标醒后立即进行安装导管。
- 使用柔性管的两种不同的尺寸：插入所述内部管道（外径0.94毫米;以包含药物被注入）到外管（外径3.18毫米;对于内管的保护）。
- P花边鼠标在俯卧位，适用10％聚维酮碘溶液擦洗消毒，并在脖子上的，大小10手术刀刀片后面有1厘米的切口。转小鼠成仰卧位，重新消毒用10％聚维酮碘溶液擦洗颈部的前部，并重新打开在颈部的前部的外科手术伤口。隧道从背面到颈部的前所作的切口在皮肤下的管道，并从打开的伤口1厘米exteriorize它。
- 从颈部的前部横向约1cm距离中线的左边除去皮下脂肪组织。找到左侧颈内静脉，将两条领带沿静脉相距5mm，并且略微拉长静脉。就微血管剪刀两个关系之间的颈静脉一个小孔;插入内管5 mm深尾端尖（朝心脏）。
- 固定管与两个联系的颈静脉。关闭皮肤在颈部的前端与3-0丝线缝合。参考下图， 图1C。
- 固定油管的颈部与缝合背面的皮肤，并通过一个旋转连接管连接到一个微注射静脉泵。旋转允许在笼子里面有完全访问食物和水的小鼠自由流动。
- 渗透前面的皮肤切口和颈部用0.2ml 0.5％布比卡因防止手术后疼痛的背面。
注：根据机构特定动物的协议，动物可能与阿片类药物，NSAIDs类药物或抗生素前和手术后进行治疗。然而，提及的治疗可能会改变缺血性脑卒中结局结果 （见讨论部分 ）11-14 - 让动物在回收室唤醒，然后安置动物在一个单独的笼子，直到实验结束点。不要让动物无人看管，直到它已经恢复了足够的意识，以保持胸骨靠着。
- 以1.5ml / kg /小时，4设置为连续48小时静脉治疗考尼伐坦的（0.14毫克/毫升，在5％右旋糖）或车辆输注速度和开始输注。
注意：四输注考尼伐坦的总量应该大约为0.2毫克/小鼠/天，1.44毫升总体积。
注意：为0.2毫克总量在1.44毫升5％右旋糖，每天两次执行考尼伐坦腹腔（IP）注射。实现IP注射如前所述。15通过抓住主体和尾部的后表面的皮肤抑制的小鼠。注入考尼伐坦或车辆进入使用26 G / 1 /寸毫针腹部的左下腹。15 - 观察动物每天两次的实验（48小时）的整个持续时间。让动物充分获得食物和水。如果动物表现出痛苦或呼吸困难的迹象，请教兽医。如果安乐死是必要的严重DIST动物RESS参考以下步骤3.1，并排除在研究动物。
在终点中风诱发脑水肿3.评估
- 通过用5％异氟醚的过麻醉牺牲鼠标。
- 使用手术刀，使过沿中线颅骨切开皮肤，并缩回皮以暴露在大脑中的整个颅骨。在枕骨大孔开始，切开颅骨沿两侧大脑的周边横向，然后小心地抬起而不触及它下面的大脑。切断从脊柱脑和附着在颅骨的基础上的神经。
- 取出大脑，它从嗅球和小脑分开，并解剖沿纵裂大脑进入缺血和非缺血大脑半球，如前所述。9
- 通过如前面描述的4,9比较湿到干比（WDR）评估脑水肿。权衡组织之前和在烘箱中在100℃下干燥3天。计算脑含水量（BWC）的％H 2 O =（1-干重/湿重）×100％。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
动物的体温是在生理范围内，并且在整个冲程感应的手术过程稳定。两个小鼠表现出NDS低于2 MCAO从该研究中排除之后。
在缺血小鼠48小时生产同侧半球梗死体积。的TTC染色切片的评价表明，半球的约50％是由缺血（ 图1D）后梗塞的影响，如通过Zeynalov，E。和多尔，S。，2009年10脑缺血性中风的发病引起严重的出版在氧和营养物质的脑组织的剥夺。作为该局部脑组织缺氧的结果，神经元和胶质细胞的死亡，从而形成大脑的梗塞部分。 图1D示出了受MCAO引起梗塞代表小鼠脑切片，并给出了一个损伤的大小的估计。 在MCAO诱导48小时60分钟后脑含水量（BWC）的评价显示考尼伐坦IV施用（0.2毫克/天）显著减少同侧和对侧半球脑水肿，（ 图2A）。与此相反，由0.2毫克丸药考尼伐坦的IP的治疗每日未能产生对脑卒中诱发的脑水肿（ 图2B）相似的积极影响。 对血浆和尿渗透压考尼伐坦效果的证实在所有实验动物在实验的终点来实现的。考尼伐坦处理的第IV或IP增加血浆和小鼠中所有小鼠降低尿渗透压4血浆渗透压值如下：313±4.4毫渗量/公斤（车辆，IV）与355±7.5 *毫渗量/公斤（考尼伐坦，Ⅳ）如以前出版，第4和340±7.7毫渗量/公斤（车辆，IP）与383±8.8 *毫渗量/公斤（考尼伐坦，IP）。在小鼠尿渗透压值如下：1210.6±13.4毫渗量/公斤（车辆，IV）与595.0±57.4 *毫渗量/公斤（考尼伐坦，IV）中，如先前所发表的，图4和1535.0±80.9毫渗量/公斤（车辆IP）与242.0±23.2 *毫渗量/公斤（考尼伐坦，IP）。表现为所有的数据平均值±SEM，* P≤0.05与相应的控制。 
图 1： 在实验性卒中模型，IV导管的安装，并且在灯丝的冲程位置后48小时代表梗塞体积的图 （以蓝色示出）预涂覆有在左侧颈内动脉树脂（绿色）（ICA）闭塞（A）和再灌注时间（B）的过程中。在左颈静脉（C）的所述柔性管子末端的正确位置。 Experimenta小鼠升行程在48小时生产同侧半球梗死体积。小鼠在48小时MCAO后处死，并取出大脑，在协议中所描述（步骤3.1-3.3）。大脑切成2毫米厚的切片，并用TTC（D）的染色。图1D已经从原来的文章Zeynalov，E和多尔，S.，2009年修改10 请点击此处查看该图的放大版本。 
图 2： 连续静脉内（IV）和腹膜内（IP）的考尼伐坦（0.2毫克/天）对脑卒中诱发的脑水肿的治疗考尼伐坦静脉治疗48小时给药的影响 。考尼伐坦治疗静脉应用在同侧和对侧小时的比例减少局部缺血后的脑水肿Emisphere公司（A）。图2A已经从原来的文章由Zeynalov 等改性，2015年4考尼伐坦的IP处理48小时各组中未能减少因实验中风的脑水肿，每组10。小鼠进行缺血再灌注如上述（步骤1.1.1-1.15.3）协议中所述。然后考尼伐坦（0.2毫克）的IP注射立即给药，在22小时再灌注46小时。小鼠处死;大脑取出并干燥在烤箱，如在该协议中描述（步骤3.1-3.4）。 （二）所有的数据都以平均值±SEM，* P <0.05与相应的控制。 请点击此处查看该图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这项研究有临床前研究中风重要的价值。这项研究表明，小鼠实验中风后考尼伐坦（0.2毫克/天）的持续静脉注射，有效降低治疗后的48小时脑水肿。 IP注射相同剂量对脑水肿考尼伐坦的效果也进行了研究。考尼伐坦治疗由双方IV和IP路由产生aquaresis由所示小鼠：1）血浆渗透压略高于生理水平的提高;和2）在尿渗透压降低由于在肾水再吸收的堵塞。因此，基于对治疗结果，我们报告中指出，四交付方法，对中风引起的水肿形成另外一个重要的有益作用。
我们的主要发现是，IV处理产生的脑水肿减轻比考尼伐坦IP路由效果更佳。考尼伐坦是组合V1a和V2受体拮抗剂，可用于临床使用至COR矩形低钠血症，血容量和渗透压。16考尼伐坦已经显示纠正患者低钠血症各种条件17考尼伐坦的临床情况表明，它在脑水肿的上下文勘探可导致快速长凳到床头的翻译。脑室内递送实验选择性V1A受体阻断剂的使用已经被证明可以减少由其他研究者描述局部缺血后的脑水肿的形成。3,18然而，无论是在这些研究中使用的药物，也没有治疗路径的药物建议在可能的临床应用不远的将来。
机制，使大脑缺血引起AVP脑水肿是复杂的。然而，一些重要的分子的玩家是设置在血脑屏障界面定位于血管壁钠和氯共转运19,20和V1A受体。 V2的阻挡考尼伐坦的作用是负责exces排泄由肾和血液渗透压，这也可能有助于防止脑水肿的发展的高程。21这些机制的水资源可能仍然在播放时考尼伐坦被直接输送到循环，以避免可能降低考尼伐坦可用性组织障碍。然而，剂量和治疗持续时间的理由是基于以前出版的观察结果。4它仍有 待确定局部血流的损伤诱导的下降后考尼伐坦是否到达脑的缺血部位。它也需要进行调查大脑是否接收足够量的考尼伐坦的由在脑动脉阻塞V1A受体以产生期望的局部作用，如预防血管收缩。
实验方案的目的是要解决的选择的问题为考尼伐坦的治疗途径。根据研究结果，该研究为考尼伐坦广告的IV途径大力支持服侍。然而，需要建立和为了检测小鼠卒中后在治疗结果显著差别微调协议的最重要的步骤。在这些步骤是：1）在MCAO（60分钟）的持续时间; 2）日剂量（0.2毫克），和输注速度（1.5毫升/ kg /小时）;和3）的治疗（48小时）的长度。 MCAO的持续时间决定的局部缺血损伤的程度这对于协议，因为它不可逆地损害脑组织极为重要。太严重受伤将难以为动物以48小时存活，或动物可能成为对脑水肿考尼伐坦治疗不太敏感。另一方面，MCAO的持续时间小于60分钟，可能不足以诱导缺血性损伤的小鼠，并且，因此，不会产生脑水肿。剂量和治疗的长度被选择的基础上对考尼伐坦使用美国FDA建议。16然而，已经报道了对考尼伐坦人用剂量是效率不高的小鼠中风后减轻脑水肿。因此，剂量的小鼠，它诱导了针对局部缺血后的脑水肿显著保护要增加10倍。4选择正确的滴注速度的重要性在于，它可以影响总血量，血压和间质液的积累，如果率大大超过建议的速率。然而，总血容量和血压测量是非常丰富。
在缺血的手术感应是一种侵入性的过程，需要精确的重视协议的所有步骤，并重新认识该技术的故障排除技巧是很重要的。一些意想不到的手术并发症，如过度动脉出血由于一个意外撕裂动脉减少用于实验的成功率，提高死亡率。然而，静脉出血可以通过施加轻微的压力瓦特停止第i个无菌海绵。
本协议描述的脑缺血，这意味着该MCA闭塞生产无论是在向右或向左MCA单方面的诱导。然而，该协议可以根据外科医生的优选MCA闭塞和IV导管安装侧被修改。 图1图解描述了MCAO程序， 图1A和B中 ，IV导管安装协议的最关键部分的图， 图如图1C所示 ，并且在实验（48小时）的终点MCAO引起的脑梗塞的代表性脑切片，如先前出版，10 图1D。虽然图和代表脑切片暗示MCAO于大脑的左侧诱导，如果MCAO于大脑的右侧只要整个烯诱导作为一致性我们不认为在结果中的巨大差异轮胎的研究得以保持。
在手术过程中和麻醉后的恢复期间，动物可能会遇到的苦恼，由于手术后的疼痛和严重的神经功能缺损。在许多情况下，术后疼痛管理可以被限制为仅使用局部麻醉剂，如0.5％布比卡因。由于在人类中脑血管意外，以及在小鼠中实验性卒中中风涉及病理生理因素，如炎症，脑梗塞，和脑水肿。9，这些病理生理事件由关键分子玩家从事诸如环加氧酶（COX）13和G蛋白相关受体。22干扰涉及COX分子途径可能由NSAID药物引起的，13，如果他们在这些设置中使用。阿片类药物作用于它们的受体哪些链接到G-蛋白与第二信使12，并且可以改变行程，11和结果的病理生理结果s此研究。这些因素限制了小鼠术后止痛药的使用。
总之，我们的研究探讨再利用考尼伐坦作为一个深远的目标的可能性。我们的实验中风诱导后考尼伐坦的连续静脉输注的动物模型已经显示出产生一致的结果这表明其在中风患者的潜在用途。更具体地说，我们已经表明，持续静脉治疗中风后考尼伐坦，以防止继发性脑损伤的模型可以用于在小鼠中的临床前研究。这项研究的目的是提供治疗考尼伐坦的另一种应用程序作为一个额外的工具来研究小鼠脑水肿中风后，因为快译到临床设置可能是救命的ICU患者。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢瑞典医疗中心提供资金和设施。我们也感谢克雷格医院的大量使用的实验室空间。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heated Pad | K&H Manufacturing Inc | 1060 | |
| Temperature Monitor with Rectal Probe | Physitemp | 7029 | |
| Silk Suture Spool, 6-0 | Surgical Specialties Corporation | SP114 | |
| Silk Suture on a Needle, 3-0 | Ethicon | 1684G | |
| Nylon Suture, 7-0 | Ethicon | 1696G | |
| Dental Resin Polysiloxane with Hardener | Heraeus Kulzer | 65817930 | |
| Microinfusion IV Pump | Kent Scietific | GT0897 | |
| Swivel 22GA | Instech | 375/22PS | |
| Laboratory Tubing, 0.94 mm x 0.51 mm | Dow Corning | 508-002 | |
| Laboratory Tubing, 3.18 mm x 1.98 mm | Dow Corning | 508-009 |
References
- Gueniau, C., Oberlander, C. The kappa opioid agonist niravoline decreases brain edema in the mouse middle cerebral artery occlusion model of stroke. J Pharmacol Exp Ther. 282, 1-6 (1997).
- Krafft, P. R., et al. Etiology of stroke and choice of models. Int J Stroke. 7, 398-406 (2012).
- Vakili, A., Kataoka, H., Plesnila, N. Role of arginine vasopressin V1 and V2 receptors for brain damage after transient focal cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 25, 1012-1019 (2005).
- Zeynalov, E., Jones, S. M., Seo, J. W., Snell, L. D., Elliott, J. P. Arginine-Vasopressin Receptor Blocker Conivaptan Reduces Brain Edema and Blood-Brain Barrier Disruption after Experimental Stroke in Mice. PloS one. 10, e0136121 (2015).
- Med Lett Drugs Ther.. Conivaptan (Vaprisol) for hyponatremia. The Medical letter on drugs and therapeutics. 48, 51-52 (2006).
- Zhao, X. Y., et al. Effect of arginine vasopressin on the cortex edema in the ischemic stroke of Mongolian gerbils. Neuropeptides. 51, 55-62 (2015).
- Manaenko, A., Chen, H., Kammer, J., Zhang, J. H., Tang, J. Comparison Evans Blue injection routes: Intravenous versus intraperitoneal, for measurement of blood-brain barrier in a mice hemorrhage model. J Neurosci Methods. 195, 206-210 (2011).
- Adams, S., Pacharinsak, C. Mouse anesthesia and analgesia. Curr Protoc Mouse Biol. 5, 51-63 (2015).
- Zeynalov, E., et al. The perivascular pool of aquaporin-4 mediates the effect of osmotherapy in postischemic cerebral edema. Crit Care Med. 36, 2634-2640 (2008).
- Zeynalov, E., Dore, S. Low doses of carbon monoxide protect against experimental focal brain ischemia. Neurotox Res. 15, 133-137 (2009).
- Zeynalov, E., Nemoto, M., Hurn, P. D., Koehler, R. C., Bhardwaj, A. Neuroprotective effect of selective kappa opioid receptor agonist is gender specific and linked to reduced neuronal nitric oxide. J Cereb Blood Flow Metab. 26, 414-420 (2006).
- Ma, M. C., Qian, H., Ghassemi, F., Zhao, P., Xia, Y. Oxygen-sensitive {delta}-opioid receptor-regulated survival and death signals: novel insights into neuronal preconditioning and protection. J Biol Chem. 280, 16208-16218 (2005).
- Ahmad, M., Zhang, Y., Liu, H., Rose, M. E., Graham, S. H. Prolonged opportunity for neuroprotection in experimental stroke with selective blockade of cyclooxygenase-2 activity. Brain Res. 1279, 168-173 (2009).
- Meisel, C., et al. Preventive antibacterial treatment improves the general medical and neurological outcome in a mouse model of stroke. Stroke. 35, 2-6 (2004).
- Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Appl Microbiol. 17, 250-251 (1969).
- Adis International Limited. Conivaptan: YM 087. Drugs in R&D. 5, 94-97 (2004).
- Murphy, T., Dhar, R., Diringer, M. Conivaptan bolus dosing for the correction of hyponatremia in the neurointensive care unit. Neurocrit Care. 11, 14-19 (2009).
- Liu, X., Nakayama, S., Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P., Bhardwaj, A. Arginine-vasopressin V1 but not V2 receptor antagonism modulates infarct volume, brain water content, and aquaporin-4 expression following experimental stroke. Neurocrit Care. 12, 124-131 (2010).
- Wallace, B. K., Jelks, K. A., O'Donnell, M. E. Ischemia-induced stimulation of cerebral microvascular endothelial cell Na-K-Cl cotransport involves p38 and JNK MAP kinases. Am J Physiol Cell Physiol. 302, C505-C517 (2012).
- O'Donnell, M. E., et al. Intravenous HOE-642 reduces brain edema and Na uptake in the rat permanent middle cerebral artery occlusion model of stroke: evidence for participation of the blood-brain barrier Na/H exchanger. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 225-234 (2013).
- Walcott, B. P., Kahle, K. T., Simard, J. M. Novel treatment targets for cerebral edema. Neurotherapeutics. 9, 65-72 (2012).
- Shen, Z., et al. Inhibition of G protein-coupled receptor 81 (GPR81) protects against ischemic brain injury. CNS Neurosci Ther. 21, 271-279 (2015).
