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Immunology and Infection

एक सरल और कुशल दृष्टिकोण उत्परिवर्ती चेचक वायरस वैक्टर का निर्माण करने के लिए

Published: October 30, 2016 doi: 10.3791/54171
* These authors contributed equally

Summary

चेचक वायरस (वी.वी.) व्यापक रूप से जैव चिकित्सा अनुसंधान और मानव स्वास्थ्य के सुधार में इस्तेमाल किया गया है। यह लेख एक सरल, अत्यधिक कारगर तरीका एक CRISPR-Cas9 प्रणाली का उपयोग कर वी.वी. जीनोम को संपादित करने का वर्णन है।

Introduction

चेचक वायरस (वी.वी.) एक छा डीएनए poxvirus परिवार से संबंधित वायरस है और चेचक के उन्मूलन की दवा में सबसे बड़ी उपलब्धियों में से एक में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। चेचक के बाद उन्मूलन युग में, वी.वी. वी.वी. वैक्टर में विभिन्न रोगजनकों से जीन डालने से एचआईवी और अन्य संक्रामक रोगों 1-7 के खिलाफ टीके के लिए जीन देने के लिए एक वेक्टर के रूप में विकसित किया गया है। वी.वी. भी बड़े पैमाने पर विशेष रूप से ट्यूमर को निशाना बनाया नकल oncolytic चेचक वायरस के विकास के लिए कैंसर प्रतिरक्षा 8-14 के लिए एक वेक्टर के रूप में इस्तेमाल किया गया है। आदेश में कैंसर की कोशिकाओं के लिए सुधार चयनात्मकता के साथ एक कुशल टीका वेक्टर बनाने के लिए, वायरल जीनोम के भीतर संशोधनों जीन विलोपन या चिकित्सीय जीन की शुरूआत सहित आवश्यक हैं।

डीएनए प्रौद्योगिकी के विकास और वी.वी. में आणविक जीव विज्ञान और विषाणु विज्ञान, विदेशी डीएनए के सम्मिलन का एक बेहतर समझ के साथ मूल रूप को प्राप्त थाडी 1980 के दशक के 15 में मुताबिक़ पुनर्संयोजन (मानव संसाधन) का उपयोग कर। इस पद्धति अभी भी व्यापक रूप से वी.वी. वैक्टर के निर्माण के लिए किया जाता है। आनुवंशिक संशोधन का परिचय जो पूर्व संक्रमित कोशिकाओं में वी.वी. जीनोम के साथ recombines घंटे के लिए एक शटल वेक्टर, का उपयोग करके हासिल की है। हालांकि, इस पद्धति अत्यधिक अक्षम (1% से कम मुताबिक़ पुनर्संयोजन दक्षता 16) साबित हो गया है और अक्सर गैर लक्षित क्षेत्रों और / या वायरस के विस्तार पर मार्कर के नुकसान में चयन मार्कर के यादृच्छिक प्रविष्टि में यह परिणाम है।

जीनोमिक loci में exogenous डीएनए डालने के लिए डीएनए मुताबिक़ पुनर्संयोजन की दक्षता में नाटकीय रूप से डबल भूग्रस्त टूटता है (DSBs) 17 की उपस्थिति में बढ़ाया जा सकता है। इसलिए, प्रौद्योगिकी है कि लक्ष्य loci में DSBs प्रेरित कर सकते हैं वी.वी. के जीनोम इंजीनियरिंग के लिए महान क्षमता रखती है।

हाल ही में विकसित CRISPR-Cas9 प्रणाली किसी भी वी.वी. जीन क्षेत्र में DSBs ट्रिगर के लिए वादा दिखाता है। CRISPR-Cas9 एक RNA- हैनिर्देशित nuclease हमलावर फगेस और अन्य विदेशी आनुवंशिक सामग्री 18-20 के खिलाफ अनुकूली प्रतिरक्षा में शामिल किया गया। माइक्रोबियल प्रजातियों 21 की एक श्रृंखला में तीन CRISPR कैस प्रणालियों रहे हैं। प्रकार द्वितीय CRISPR कैस प्रणाली को व्यापक रूप से संपादन कोशिकाओं और बड़े वायरस के जीनोम के लिए प्रयोग किया जाता है। यह आरएनए निर्देशित Cas9 endonuclease (स्ट्रेप्टोकोकस प्योगेनेस से) के होते हैं, एक गाइड आरएनए (sgRNA) और ट्रांस-सक्रिय crRNA (tracrRNA) 22-24। Cas9 / sgRNA जटिल पूरक 20-न्यूक्लियोटाइड जीनोमिक स्तनधारी कोशिकाओं 22 में एक 5'-NGG -3 'Protospacer आसन्न मूल भाव (पीएएम) अनुक्रम, 23 पूर्ववर्ती अनुक्रम को पहचानता है। यह सफलतापूर्वक आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं, वायरस के प्रभावी पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया गया है और पशु मॉडल 22-32।

CRISPR-Cas9 प्रणाली जीनोम वी.वी. की कोशिका द्रव्य में मुताबिक़ पुनर्संयोजन के साथ संयोजन में लक्षित करने के लिए एक कुशल उपकरण साबित हो गया है संक्रमित सीवी -1 सेलएस उत्परिवर्ती चेचक वायरस उत्पन्न करने के लिए 33, 34। क्रम में इस विधि के संभावित आवेदन का विस्तार करने के लिए, हम इस प्रणाली की कार्यप्रणाली के बारे में विस्तृत जानकारी प्रस्तुत करते हैं। वर्णित प्रोटोकॉल एक विशेष जीन विलोपन के साथ एक उत्परिवर्ती वी.वी. बना सकते हैं और / या एक चिकित्सकीय ट्रांस्जीन के साथ उत्परिवर्ती वायरस हाथ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Protocol

1. लक्ष्य शाही सेना और Cas9 निर्माणों और मरम्मत दाता वेक्टर की तैयारी

  1. gRNAs की क्लोनिंग
    1. डिजाइन के लिए एक गाइड-आरएनए लक्ष्य अनुक्रम सिद्धांत में पहले 25 में कहा गया है निम्नलिखित चेचक वायरस के N1L जीन को लक्षित। संरेखित चेचक वायरस के जीनोम के खिलाफ गाइड शाही सेना लक्ष्य अनुक्रम (इस मामले में, चेचक वायरस के लिस्टर तनाव) से बाहर किसी भी बंद लक्ष्य gRNA लक्ष्य दृश्यों शासन करने के लिए।
    2. Synthesize और के रूप में पहले 25 में वर्णित एक gRNA क्लोनिंग वेक्टर में gRNA ओलिगोस क्लोन। सेंगर अनुक्रमण 33 से जिसके परिणामस्वरूप वेक्टर में प्रत्येक व्यक्ति gRNA के अनुक्रम की पुष्टि करें। नाम जिसके परिणामस्वरूप gRNA gRNA एन 2 33 के रूप में निर्माण।
      नोट: gRNA लक्ष्य साइट N1L जीन के भीतर है, और बाएं हाथ और दाहिना हाथ के बीच क्षेत्र में है कि मरम्मत के दाता वेक्टर कवर (चित्रा 1 देखें)।
  2. में परमाणु स्थानीयकरण संकेत (एनएलएस) की कमी Cas9 जीन क्लोनpST1374 वेक्टर और पीएसटी-Cas9 33 के रूप में नामित निर्माण।
    नोट: किसी भी स्तनधारी अभिव्यक्ति क्लोनिंग वेक्टर Cas9 अभिव्यक्ति वेक्टर के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. मानव संसाधन के लिए मरम्मत दाता वेक्टर के निर्माण
    1. संशोधन 33 के लिए लक्ष्य क्षेत्र के रूप में वी.वी. की N1L जीन का प्रयोग करें। सुनिश्चित करें कि बाएँ और दाएँ हथियारों की लंबाई 500-600 के बारे में बीपी प्रत्येक, और लक्ष्य क्षेत्र flanking हैं।
      नोट: बाएं हाथ / दाहिने हाथ लक्ष्य क्षेत्र के साथ 50 बीपी ओवरलैप करने के लिए हो सकता है (चित्रा 1 देखें)।
    2. के रूप में पहले 33, 34 में वर्णित N1L क्षेत्र मरम्मत दाता वेक्टर क्लोन और पीटी N1L के रूप में मरम्मत दाता वेक्टर नामित।
      ध्यान दें: मरम्मत दाता वेक्टर और अपने लक्ष्य क्षेत्र के लिए चित्रा 1 देखें। वी.वी. के अन्य क्षेत्रों के क्षेत्र (जीन) विशिष्ट gRNA (एस) और क्षेत्र विशेष मरम्मत दाता वेक्टर का उपयोग कर निशाना बनाया जा सकता है। किसी भी क्लोनिंग वेक्टर मरम्मत दाता वेक्टर के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    3. </ राजभाषा>
    4. प्लाज्मिड का विस्तार
      1. रासायनिक सक्षम में प्लाज्मिड रूपांतरण निर्माता के निर्देशों के अनुसार कोलाई। प्लाज्मिड एक प्लाज्मिड निकासी किट प्रोटोकॉल निर्माता द्वारा आपूर्ति की चर्चा करते हुए उपयोग कर शुद्ध।

    2. सीडिंग प्रकोष्ठों दिवस (1)

    1. बनाए रखें CV-1 कोशिकाओं (बंदर गुर्दे fibroblasts) Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक, 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ के साथ 2।
    2. Trypsinize CV-1 कोशिकाओं है कि 80-90% मिला हुआ हैं
      1. CV-1 कोशिकाओं से युक्त टी-175 कुप्पी से सेल संस्कृति के माध्यम से निकालें। बाँझ पीबीएस के 5 एमएल के साथ monolayer कुल्ला अवशिष्ट सीरम हटाने और पीबीएस aspirate। कोशिकाओं को कवर किया और सेल टुकड़ी सहायता करने के लिए लगभग 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कुप्पी जगह के लिए 2.5 एमएल 1 × Trypsin-EDTA समाधान जोड़ें।
      2. जोड़नासेल संस्कृति के माध्यम से 10 एमएल कोमल पिपेट कार्रवाई से कोशिकाओं को निलंबित करने के लिए (2.1 कदम देखें)। एक hemocytometer का उपयोग सेल नंबर गणना।
      3. 6 अच्छी तरह प्लेटों में सीडिंग कोशिकाओं
        1. बीज 2 × 10 5 सीवी -1 सेल संस्कृति के माध्यम से 2 एमएल में एक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं अभिकर्मक पहले दिन।
          नोट: trypsin दूर करने के लिए एक अतिरिक्त centrifugation कदम की आवश्यकता नहीं है।

    3. Cas9 प्लाज्मिड और gRNA प्लाज्मिड के अभिकर्मक (2 दिन)

    1. Transfect CV-1 कोशिकाओं 0.5 माइक्रोग्राम पीएसटी-Cas9 प्लाज्मिड के साथ और 0.5 माइक्रोग्राम gRNA एन 2 प्लाज्मिड निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग (कदम 2.2.3.1 में तैयार)।
    2. एक मशीन में 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते (37 डिग्री सेल्सियस 5% के साथ सीओ 2), और फिर ताजा सेल संस्कृति के माध्यम से (2.1 कदम में वर्णित) के 2 एमएल के साथ मध्यम जगह।

    4. CV-1 कोशिकाओं और शटल डोनर वी के संक्रमणEctor अभिकर्मक के लिए मानव संसाधन (3 दिन)

    1. 2 × 10 5 pfu / एमएल की एकाग्रता के लिए DMEM सेल संस्कृति के माध्यम से रीढ़ की हड्डी VVL15 वायरस पतला। Cas9 और gRNA plasmids के 24 घंटे बाद अभिकर्मक, ट्रांसफ़ेक्ट CV-1 कोशिकाओं के प्रत्येक कुएं में पतला वायरस के 100 μL जोड़ें।
    2. 2 घंटे के बाद वायरस के संक्रमण, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग मानव संसाधन के लिए VVL15 संक्रमित कोशिकाओं में transfect 1.0 माइक्रोग्राम शटल दाता वेक्टर। 24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं रखें।

    5. फसल पुनः संयोजक वायरस (4 दिन)

    1. 4.2 कदम में मानव संसाधन के लिए शटल दाता वेक्टर साथ अभिकर्मक के 24 घंटे के बाद, ट्रांसफ़ेक्ट CV-1 एक सेल खुरचनी का उपयोग कोशिकाओं को अलग। एक cryovial में सेल निलंबन लीजिए और भविष्य में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
      नोट: तुरंत कीटाणुनाशक के साथ किसी भी सेल संस्कृति के माध्यम से बहाव से साफ कर लें और फिर 70% एतान के साथ फिर से पोंछराजभाषा।

    6. संशोधित वी.वी. की शुद्धि (पहले दौर)

    1. 1 दिन, 3 × 10 5 CV-1 प्रत्येक में अच्छी तरह से कोशिकाओं के साथ 15 6 अच्छी तरह प्लेटें बीज।
      1. 2 दिन, 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में 5.1 कदम से जमे हुए सेल निलंबन पिघलना और हटाने सेल मलबे के बिना सेल lysate प्राप्त करने के लिए 30 एस के लिए सख्ती cryovials भंवर।
    2. CV-1 कोशिकाओं में से एक 6 अच्छी तरह से थाली के संक्रमण के लिए, DMEM के 3 एमएल के साथ सेल lysate के 1 μL पतला और 0.5 एमएल, पहले से ही 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में पतला सेल lysate के जोड़ने मीडिया के शीर्ष पर वर्तमान। सभी 6 अच्छी तरह से कदम 6.1 में तैयार प्लेटों को संक्रमित।
      नोट: सेल मलबे को हटाने की आवश्यकता नहीं है।
    3. संक्रमण के दो दिन बाद (यानी, दिन 4 पर), आरएफपी पॉजिटिव सजीले टुकड़े 10X उद्देश्य लेंस का उपयोग कर एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे सजीले टुकड़े प्लेट पट्टिका स्थान चक्कर से एक मार्कर पेन का उपयोग कर नीचे की पहचान और लेबल।
      नोट: देखें
    4. छह लेबल cryovials 200 μL सीरम मुक्त DMEM सेल संस्कृति छह अलग आरएफपी पॉजिटिव सजीले टुकड़े लेने के लिए मध्यम युक्त तैयार करें। लेबल पट्टिका (एस) (कदम 6.3) के साथ अच्छी तरह से सेल संस्कृति के माध्यम aspirate। , एक P200 पिपेट के लिए एक 200 μL टिप देते हैं 30 μL में मात्रा निर्धारित है और एक cryovial से ले ~ 10 μL सेल संस्कृति के माध्यम से।
    5. मध्यम रिहा बिना पिपेट पुश बटन पकड़ और एक लेबल पट्टिका के क्षेत्र खरोंच करने के लिए टिप का उपयोग करें। अलग कोशिकाओं उठा और यह सीरम मुक्त DMEM के 190 μL युक्त cryovial में स्थानांतरित करने के लिए पिपेट पुश बटन रिलीज।
    6. (अंतिम चरण से) खरोंच कोशिकाओं के साथ शीशी से एक और 10 μL मध्यम ले और एक ही आरएफपी पॉजिटिव पट्टिका तीन बार के रूप में संभव के रूप में कई खरोंच कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए चुनने की प्रक्रिया को दोहराएँ। एक ही शीशी में सभी कोशिकाओं स्थानांतरण और -80 डिग्री सेल्सियस पर शीशी की दुकान।

7. संशोधित वी.वी. की शुद्धि (दूसरा दौर)

  1. बीज 3 × 10 5 CV-1 प्रत्येक में कोशिकाओं की अच्छी तरह से छह 6 अच्छी तरह प्लेटें और संस्कृति 24 घंटे के लिए कोशिकाओं।
  2. 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में (कदम 6.3.3 से) जमे हुए cryovials गला लें, तो सेल lysate प्राप्त करने के लिए 30 सेकंड के लिए सख्ती cryovials भंवर।
    1. मिश्रित सेल lysate के 0.5 μL एक 6 अच्छी तरह से थाली में से एक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ें। प्रत्येक पट्टिका के लिए एक 6 अच्छी तरह से थाली को संक्रमित। 2 दिनों के लिए 5% सीओ 2 (दूसरा दौर पट्टिका शुद्धि) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर वी.वी. संक्रमित 6 अच्छी तरह प्लेटें सेते हैं। तब खंड 6.3 दोहराएँ।
      नोट: अधिक से अधिक छह आरएफपी पॉजिटिव सजीले टुकड़े उठाया जा सकता है; दो या दो से अधिक 6 अच्छी तरह प्लेटें एक पट्टिका की शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

8. फलक पुरी के आगे राउंडदिखाएं

  1. एक ही प्रोटोकॉल जब तक सभी सजीले टुकड़े एक सकारात्मक पट्टिका से गठित एक खुर्दबीन के नीचे आरएफपी सकारात्मक होना प्रकट चरण 7 में वर्णित के बाद एक आगे की शुद्धि के तीन से पांच राउंड पर ले।
    नोट: तो फिर इस पट्टिका शुद्ध माना जाता है।
  2. एक बार जब पट्टिका शुद्ध है (चित्रा 4, आरएफपी व्यक्त सभी संक्रमित कोशिकाओं), -80 डिग्री सेल्सियस पर एक cryovial और दुकान में एक सकारात्मक पट्टिका फसल धारा 6.3 में वर्णित है। प्रोटोकॉल चरण 9 और 10 में वर्णित निम्नलिखित पट्टिका की जाँच करें।

9. विस्तृत शुद्ध पट्टिका (s)

  1. बीज 3 × 10 5 CV-1 वायरस के संक्रमण से पहले एक एक दिन 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं।
  2. सेल lysate प्राप्त करने के लिए 3 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 8.2 से जमे हुए cryovial गला लें। CV-1 कोशिकाओं के 6 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में (सेल मलबे को हटाने के बिना) सभी lysate जोड़ें (9.1 कदम में वरीयता प्राप्त)। 5 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संक्रमित CV-1 कोशिकाओं को सेतेऊपर से 3 दिनों के लिए% सीओ 2।
    1. सभी शुद्ध सजीले टुकड़े (कम से कम तीन सजीले टुकड़े) का विस्तार करें।
      नोट: संक्रमण समय lysate में वायरस की मात्रा के आधार पर 1-3 दिनों से भिन्न होता है।
  3. एक सेल खुरचनी का उपयोग वी.वी. संक्रमित कोशिकाओं फसल जब 50% से अधिक कोशिकाओं को एक माइक्रोस्कोप के नीचे देखा cytopathic प्रभाव दिखाने (कोशिकाओं गोल कर रहे हैं, आसानी से अलग और आरएफपी सकारात्मक)। एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में सेल संस्कृति के माध्यम से एक साथ अलग कोशिकाओं लीजिए।
    1. 3 मिनट के लिए 300 ग्राम पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं। तैरनेवाला निकालें और आगे उपयोग करें जब तक डिग्री सेल्सियस -80 पर सेल गोली रखने के लिए या चरण 10 के लिए तुरंत सेल गोली का उपयोग करें।

10 उत्परिवर्ती वी.वी. का संशोधन पीसीआर का उपयोग का सत्यापन

  1. कदम 9.3.1 में तैयार निर्माता प्रोटोकॉल के बाद एक डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग सेल गोली से वी.वी. डीएनए निकालें। डबल आसुत जल के 200 μL के साथ डीएनए Elute।
    नोट: डीएनए निकालने और अगर क्लोन के रूप में सही संशोधन / प्रविष्टि युक्त सत्यापित है वायरल उत्पादन के लिए बाकी रखने के लिए गोली की मात्रा का आधा का प्रयोग करें।
  2. N1L जीन का विलोपन और N1L क्षेत्र में आरएफपी जीन की प्रविष्टि का सत्यापन।
    1. N1L जीन (L025) और L026 जीन N1L जीन के खिलाफ बनाया गया प्राइमरों का उपयोग फैले एक डीएनए टुकड़ा बढ़ाना। आरएफपी विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग आरएफपी जीन बढ़ाना। एक नियंत्रण डीएनए पीसीआर द्वारा A52R फैले A52R विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग कर टुकड़ा बढ़ाना।
      नोट: विशिष्ट प्राइमरों के लिए कच्चे माल की सूची देखें।
      1. एक पीसीआर मास्टर मिश्रण किट का उपयोग पीसीआर प्रदर्शन करना। 25 पीसीआर प्रतिक्रिया डीएनए टेम्पलेट के 2 μL का उपयोग करने का μL सेट, 2 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर पीसीआर प्रतिक्रिया denature, और फिर इन चरणों का पालन पीसीआर के 30 चक्र चलाने: 15 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए denature, तो पानी रखना 15 एस के लिए 52 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए टेम्पलेट्स के लिए प्राइमरों 30 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर पीसीआर प्रतिक्रिया का विस्तार।
  3. एक 1% agarose जेल 33 पीसीआर का उपयोग उत्पादों को हल। एक यूवी जेल डॉक्टर का उपयोग कर जेल छवि पर कब्जा है। N1L पीसीआर नकारात्मक है और A52R और आरएफपी PCRs सकारात्मक रहे हैं, तो पट्टिका सही ढंग से N1L क्षेत्र में संशोधित किया गया है।

Representative Results

एक नए वी.वी. वेक्टर के निर्माण के लिए, कुंजी प्रारंभिक बिंदु के लिए डिजाइन और एक दाता शटल वेक्टर कि जीनोम के एक विशेष क्षेत्र को लक्षित कर सकते निर्माण करना है। इस अध्ययन में, वी.वी. N1L जीन एक उदाहरण के लक्ष्य के रूप में इस्तेमाल किया गया था। पुनर्संयोजन और वी.वी. में लक्षित क्षेत्र के लिए दाता शटल वेक्टर के कैसेट चित्र 1 में दिखाया गया है। आदेश मुताबिक़ पुनर्संयोजन की दक्षता बढ़ाने के लिए, Cas9 और एक N1L विशेष gRNA व्यक्त plasmids सीवी में सह ट्रांसफ़ेक्ट थे -1 कोशिकाओं 48 घंटे मुताबिक़ पुनर्संयोजन 33 प्रदर्शन करने से पहले। एक दिन (24 घंटे) बाद अभिकर्मक, आरएफपी CV-1 कोशिकाओं (चित्रा 2) में व्यक्त की गई थी। मुताबिक़ पुनर्संयोजन से पूरे lysate (चरण 5) के साथ CV-1 कोशिकाओं के संक्रमण के बाद, आरएफपी सकारात्मक और नकारात्मक दोनों सजीले टुकड़े CV-1 कोशिकाओं (चित्रा 3) में मनाया गया। शुद्धि प्रोटोकॉल वर्णित के बाद, एक शुद्ध पट्टिका सह शुद्धि के 3-5 दौर के बाद प्राप्त किया जा uld। के रूप में चित्रा 4 में दिखाया गया है, उत्परिवर्ती चेचक वायरस के साथ एक शुद्ध पट्टिका से निकाली गई सेल lysate के साथ संक्रमण के बाद सभी सजीले टुकड़े एक आरएफपी संकेत प्रस्तुत किया। सत्यापित करने के लिए कि क्या शुद्ध उत्परिवर्ती वी.वी. सही जीन संशोधन किया था, पीसीआर लक्षित N1L जीन की अनुपस्थिति पुष्टि करने के लिए, के रूप में चित्रा 5 में दिखाया जाता था। संशोधित वायरस की पीसीआर आरएफपी के लिए एक सकारात्मक संकेत है और N1L के लिए एक अनुपस्थित संकेत (पता चला चित्रा 5 लेन एजी) है, जबकि नियंत्रण वायरस (सीटीआर) के एक अक्षुण्ण N1L क्षेत्र के साथ के लिए N1L की पीसीआर परिणाम सकारात्मक है। A52R के नियंत्रण डीएनए टुकड़े सब पुनः संयोजक वायरस और सीटीआर वायरस के लिए सकारात्मक थे। आरएफपी पॉजिटिव सजीले टुकड़े में मानव संसाधन दक्षता इस प्रयोग (यह पिछले काम 34 में 94% करने के लिए किया गया था) में 100% (6/6) है। विधि यहाँ बताया 100 से अधिक गुना से पुनर्संयोजन दक्षता में सुधार हुआ है पारंपरिक प्रोटोकॉल 33, 34 की तुलना में।

सामग्री "के लिए: रखने together.within-पेज =" 1 "> आकृति 1
चित्रा 1:। मुताबिक़ पुनर्संयोजन के लिए दाता शटल वेक्टर के कैसेट, और वी.वी. जीनोम में लक्षित क्षेत्र शुद्धि मार्कर जीन आरएफपी H5 प्रमोटर द्वारा संचालित किया जाता है। मरम्मत दाता वेक्टर आरएफपी जीन में N1L क्षेत्र परिणामों को निशाना मुताबिक़ पुनर्संयोजन के बाद N1L क्षेत्र में शामिल किया जा रहा है। 'एक्स' की मरम्मत दाता वेक्टर कि चेचक वायरस के जीनोम पर उसी क्रम बदल देगा में मुताबिक़ अनुक्रम इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। CV-1 कोशिकाओं एक दिन मुताबिक़ पुनर्संयोजन के बाद की इमेजिंग एक दिन afteआर मुताबिक़ पुनर्संयोजन, वी.वी. से संक्रमित और मरम्मत दाता वेक्टर द्वारा ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं आरएफपी सकारात्मक रहे हैं एक:। चरण विपरीत छवि (मूल बढ़ाई 100x) बी:। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवि (मूल बढ़ाई 100x)। स्केल बार = 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। उत्परिवर्ती वायरस के पहले दौर के शुद्धीकरण में एक आरएफपी पॉजिटिव पट्टिका उत्परिवर्ती वायरस के पहले दौर शुद्धि में, लक्ष्य क्षेत्र विलोपन के साथ आरएफपी पॉजिटिव पट्टिका (लाल रेखा के साथ परिक्रमा) द्वारा गठित सजीले टुकड़े से घिरे रहे हैं जंगली प्रकार के वायरस (पीले रंग की लाइन के साथ परिक्रमा) एक:। चरण विपरीत छवि (मूल बढ़ाई 100x) बी:। प्रतिदीप्ति माइकरoscopy छवि (मूल बढ़ाई 100x)। स्केल बार = 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। शुद्ध उत्परिवर्ती वी.वी. शुद्धि के 3-5 राउंड के बाद, शुद्ध सजीले टुकड़े सभी सजीले टुकड़े के रूप में प्राप्त किया गया आरएफपी सकारात्मक थे एक:। चरण विपरीत छवि (मूल बढ़ाई 100x) बी:। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवि (मूल बढ़ाई 100x) । स्केल बार = 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: सत्यापनशुद्ध उत्परिवर्ती वी.वी.। डीएनए वी.वी. से निकाला गया था के एन सी वी-1 कोशिकाओं को संक्रमित। लक्ष्य क्षेत्र N1L पीसीआर द्वारा सत्यापित किया गया था N1L प्राइमरों का उपयोग करने का विलोपन, N1L क्षेत्र में आरएफपी की प्रविष्टि आरएफपी प्राइमरों का उपयोग पीसीआर द्वारा पुष्टि की गई। लेन वायुसेना छह शुद्ध सजीले टुकड़े के अनुरूप है, लेन जी N1L विलोपन पिछले काम 33 में सत्यापित के साथ एक नियंत्रण पट्टिका है, लेन सीटीआर (नियंत्रण) जंगली प्रकार चेचक वायरस (N1L क्षेत्र अक्षुण्ण के साथ) है। A52R जीन सभी नमूनों के लिए नियंत्रण जीन के रूप में परिलक्षित किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

वहाँ दो मुख्य चिकित्सा प्रयोजनों के लिए वी.वी. के संशोधन के संबंध में लक्ष्य कर रहे हैं। ऐसा ही एक thymidine kinase (टी) जीन विरोधी ट्यूमर चिकित्सकीय प्रयोग के लिए वायरस attenuate करने के लिए के रूप में, एक विशेष जीन को नष्ट करने के लिए है। अन्य एक वांछित चिकित्सीय जीन (जैसे जीएम-सीएसएफ) के रूप में या एक मार्कर जीन (जैसे luciferase जीन के रूप में) के साथ वी.वी. हाथ करने के लिए है। इन दोनों में से किसी एक को हासिल करने के लक्ष्य क्षेत्र / जीन का विलोपन शामिल है। एक सीधा डीएनए बंधाव विधि 35 और इन विट्रो पैकेजिंग विधि 36 टी जीन संशोधनों के साथ उत्परिवर्ती चेचक वायरस उत्पन्न करने के लिए पहले से इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, इन तरीकों जीनोम में अद्वितीय प्रतिबंध एंजाइम साइटों की कमी के कारण जीनोम में अन्य क्षेत्रों के उत्परिवर्तन के संबंध में आवेदन सीमित है। उत्परिवर्ती वी.वी. बनाने के लिए वर्तमान दृष्टिकोण एक मुताबिक़ पुनर्संयोजन incorporati प्रेरित करने के लिए एक चयन मार्कर (आरएफपी या GFP) सीवी -1 कोशिकाओं में वी.वी. के साथ संक्रमण के बाद दो घंटे के साथ एक शटल (दाता) वेक्टर के अभिकर्मक शामिलएनजी लक्ष्य क्षेत्र में चयन मार्कर। मार्कर पॉजिटिव सजीले टुकड़े का चयन उनकी शुद्धि 24 घंटे बाद अभिकर्मक के बाद है। पट्टिका शुद्धिकरण की प्रक्रिया, 10 राउंड तक का समय लग सकता है पिछले 3-4 सप्ताह और अक्सर बंद लक्ष्य क्षेत्रों में डाला चयन मार्कर के साथ अवांछित पुनः संयोजक वायरस की ओर जाता है। डीएनए डबल कतरा टूटता प्रभावी ढंग से स्तनधारी कोशिकाओं 37 में मुताबिक़ पुनर्संयोजन पैदा कर सकते हैं, और इस तंत्र का दोहन करके, उत्परिवर्ती वी.वी. पैदा करने की दक्षता में काफी सुधार किया जा सकता है। GRNA निर्देशित Cas9 सिस्टम सफलतापूर्वक एडीनोवायरस और प्रकार के जीनोम मैं दाद सिंप्लेक्स वायरस gRNA निर्देशित Cas9 द्वारा संपादित किया गया मेजबान कोशिकाओं में जीनोम संपादन में कार्यरत किया गया है और, यूकेरियोटिक जीवों 22 में मुताबिक़ पुनर्संयोजन की क्षमता को बढ़ाता है 25। हाल ही में, प्रणाली 24। यह हाल ही में प्रदर्शित किया गया है कि CRISPR Cas9 प्रणाली कुशलतापूर्वक वी.वी. जीनोम संपादन और एक व्यक्त करने के लिए एक वी.वी. वेक्टर के निर्माण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैविशेष जीन।

दोनों N1L gRNA निर्देशित Cas9 और पारंपरिक मुताबिक़ पुनर्संयोजन (मानव संसाधन) विधि N1L का एक ही लक्ष्य साइट पर सफल मानव संसाधन की घटनाओं में हुई। दिलचस्प है, हालांकि gRNA निर्देशित Cas9 प्रेरित मानव संसाधन पारंपरिक विधि की तुलना में मानव संसाधन क्षमता का बहुत उच्च स्तर पर। इस प्रकार, gRNA निर्देशित Cas9 के उपयोग उत्परिवर्ती वीवीएस प्राप्त करने के लिए के रूप में कई सजीले टुकड़े को शुद्ध करने की आवश्यकता समाप्त। इस काम में, हम काफी उत्परिवर्ती वी.वी. gRNA निर्देशित Cas9 प्रणाली का उपयोग करते हुए 33 की पीढ़ी के लिए दक्षता और समय-सीमा में सुधार हुआ। ध्यान से, मुताबिक़ पुनर्संयोजन के एक उच्च दक्षता प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम पारंपरिक मुताबिक़ पुनर्संयोजन के प्रदर्शन से पहले plasmids 24 घंटे के लिए Cas9 और gRNA व्यक्त के साथ CV-1 कोशिकाओं transfect करने के लिए है। 24 घंटे के अंतराल Cas9 और gRNA एक उचित स्तर पर व्यक्त किया जा करने के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, gRNA अनुक्रम एक विशेष जीन को निशाना बनाने के रूप में हमने पाया है कि अलग अलग gRNA दृश्यों टी अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती हैargeting N1L जीन उनकी क्षमता 33, 34 में विविध।

संपादन वी.वी. में CRISPR / Cas9 के लिए सीमा पुनर्संयोजन के पहले दौर में आरएफपी पॉजिटिव सजीले टुकड़े की दर कम है। जो बनाता पहले दौर थकाऊ स्क्रीनिंग आरएफपी सकारात्मक पुनः संयोजक वायरस युक्त सजीले टुकड़े के लिए पर्याप्त संख्या में, आम तौर पर कम से कम दस 6 अच्छी तरह प्लेटें की जरूरत है, प्राप्त करने के लिए। इसलिए, वहाँ अभी भी प्रोटोकॉल इस सीमा को पार करने के लिए अनुकूलन करने के लिए एक की जरूरत है।

आरएफपी पॉजिटिव सजीले टुकड़े के छोटे आकार के एक अन्य संभावित समस्या है, जो lysate के एक उच्च मात्रा एक 6 अच्छी तरह से थाली को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल की वजह से है। इस पर काबू पाने के लिए, lysate की एक छोटी मात्रा एक 6 अच्छी तरह से थाली संक्रमित करने के लिए बड़े आकार आरएफपी पॉजिटिव सजीले टुकड़े प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। lysate की एक छोटी मात्रा का उपयोग करना भी आरएफपी नकारात्मक लोगों से आरएफपी पॉजिटिव सजीले टुकड़े के बेहतर जुदाई के लिए सक्षम हो जाएगा। नतीजतन पट्टिका शुद्धि के कम दौर शुद्ध आरएफपी पॉजिटिव सजीले टुकड़े प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं।

33, 34 से बचा जा सकता है। इस संपादन वी.वी. के जीनोम के लिए gRNA निर्देशित Cas9 प्रणाली का उपयोग करने का विशेष लाभ होता है। वी.वी. के वादे को देखते हुए, CRISPR / Cas9 प्रणाली का उपयोग जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए और ट्रांसलेशनल मेडिसिन में उत्परिवर्ती वीवीएस के विकास को गति देगा। इसके अलावा, एक ऐसी प्रणाली भी इस तरह के संकेत दे अपने actin आधारित गतिशीलता के लिए वी.वी. द्वारा इस्तेमाल के लिए रास्ते के विच्छेदन के रूप में कोशिका जीव विज्ञान में खोजों, में तेजी लाने जाएगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasmid #41824 41824 Addgene gRNA cloning vector
pST1374 13426 Addgene Cas9 cloning vector
pGEMT easy A1360 promega repair donor vector cloning
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli C4040-10 Invitrogen transformation
QIAprep Spin Miniprep Kit  27106 Qiagen plasmid extraction
Dulbecco’s Eagle’s Medium (DMEM) 11965-092 Life Technologies cell culture medium
fetal bovine serum (FBS)  SH30088.03HI Hyclone cell culture serum
penicillin, streptomycin 15070-063 Thermo Scientific antibiotics
Effectene 301425 Qiagen transfection
Thermo Scientific Nalgene Cryogenic vial; 2.0 mL W-06754-96 Thermo Scientific collect virus
fluorescence microscope  Olympus BX51 Fluorescence  Olympus find RFP-positive plque
DNeasy Blood & Tissue Kit 69506 Qiagen DNA extraction
Extensor Long PCR ReddyMix Master Mix AB-0794/B Thermo Scientific PCR reagent
10 cm culture dish Z688819-6EA sigma cell culture 
6-well plate Z707759 sigma cell culture 
cell scraper C5981 sigma scrap cells
1x Trypsin-EDTA solution T4299 sigma trypsinize cells
Virkon 95015661 Anachem Ltd desinfectant
Falcon tube CLS430791-500EA Sigma hold cell suspension
N1L forward 5’-TATCTAGCAATGGACCGT-3’ Sigma PCR primer
N1L reverse  5’-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3' Sigma PCR primer
A52R forward 5’-ATAGGATTGTGTGCATGC-3’ Sigma PCR primer
A52R reverse 5’-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3’ Sigma PCR primer
RFP forward 5’- GCTACCGGACTCAGATCCA-3’   Sigma PCR primer
RFP reverse 5’-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3’ Sigma PCR primer
Argarose A7431 Sigma resolve PCR product
G:BOX F3 G:BOX F3 Syngene UV gel doc

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References

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संक्रमण अंक 116 चेचक वायरस जीनोम संपादन मुताबिक़ पुनर्संयोजन CRISPR Cas9
एक सरल और कुशल दृष्टिकोण उत्परिवर्ती चेचक वायरस वैक्टर का निर्माण करने के लिए
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Yuan, M., Wang, P., Chard, L. S., Lemoine, N. R., Wang, Y. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (116), e54171, doi:10.3791/54171 (2016).

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