Summary
Vacciniavirus (VV) har använts i stor utsträckning inom biomedicinsk forskning och förbättring av människors hälsa. Den här artikeln beskriver en enkel, effektiv metod för att redigera VV-genomet med hjälp av en crispr-Cas9 systemet.
Introduction
Vacciniavirus (VV) är ett hölje DNA-virus som tillhör poxvirus familjen och har spelat en avgörande roll i en av de största framgångarna inom medicin att utrota smittkoppor. I en tid präglad av smittkoppor efter utrotning har VV utvecklats som en vektor för att leverera gener för vacciner mot HIV och andra infektionssjukdomar 1-7 genom att sätta in gener från olika patogener i VV vektorer. VV har också i stor utsträckning använts som en vektor för cancerimmunterapi 8-14 speciellt för utveckling av tumörinriktade repliker onkolytiska vacciniavirus. För att skapa ett effektivt vaccin vektor med förbättrad selektivitet för cancerceller, är ändringar inom det virala genomet som krävs, inklusive gen deletioner eller införande av terapeutiska gener.
Med utvecklingen av DNA-teknik och en bättre förståelse av molekylärbiologi och virologi, insättning av främmande DNA i VV ursprungligen uppnåd med hjälp av homolog rekombination (HR) i 1980 15. Denna metod är fortfarande i stor utsträckning använts för att konstruera VV vektorer. Införande av den genetiska modifieringen uppnås genom att använda en skyttelvektor för HR, som rekombinerar med VV-genomet i pre-infekterade celler. Emellertid har denna metod visat sig vara mycket ineffektiv (mindre än 1% homolog rekombination effektivitet 16) och resulterar ofta i slumpvis insättning av selektionsmarkören i icke-riktade regioner och / eller förlust av markören vid expansion virus.
Effektiviteten av DNA homolog rekombination för insättning av exogent DNA vid genomisk loci kan dramatiskt förbättrad i närvaro av dubbelsträngsbrott (DSB) 17. Därför håller den teknik som kan framkalla DSB på mål loci stor potential för genom konstruktion av VV.
Den nyligen utvecklade crispr-Cas9 systemet visar löfte för att utlösa DSB i någon VV genregion. Crispr-Cas9 är en RNA-guidad nukleas inblandade i adaptiv immunitet mot invaderande fager och andra främmande genetiskt material 18-20. Det finns tre crispr-Cas-system i ett område av mikrobiella arter 21. Typ II crispr-Cas-systemet används i stor utsträckning för redigering av genomet hos eukaryota celler och stora virus. Den består av RNA-styrda Cas9 endonukleas (från Streptococcus pyogenes), en enda styr RNA (sgRNA) och transaktiverande crRNA (tracrRNA) 22-24. Den Cas9 / sgRNA komplexet igenkänner den komplementära 20-nukleotid-genomisk sekvens som föregår en 5'-NGG-3 'Protospacer intilliggande motiv (PAM) sekvens i däggdjursceller 22, 23. Det har med framgång använts för effektiv generering av genetiskt modifierade celler, virus och djurmodeller 22-32.
Den crispr-Cas9 systemet har visat sig vara ett effektivt verktyg för genom inriktning i kombination med homolog rekombination i cytoplasman av VV infekterade CV-1 cells för att generera muterade vacciniavirus 33, 34. För att utvidga den potentiella tillämpningen av denna metod, presenterar vi detaljerad information om detta system metodik. Det beskrivna protokollet kan användas för att skapa en mutant VV med en särskild gen deletion och / eller arm mutantviruset med en terapeutisk transgen.
Protocol
1. Framställning av mål-RNA och Cas9 Konstruerar och reparation Donor Vector
- Kloning av gRNAs
- Utforma en guide-RNA-målsekvens med inriktning på N1L genen av vacciniavirus i enlighet med principen tidigare 25 angivits. Rikta in guide-RNA-målsekvens mot genomet hos vacciniavirus (i detta fall, Lister-stammen av vacciniavirus) för att utesluta eventuella ej åsyftade gRNA målsekvenser.
- Syntetisera och klona gRNA oligos in i en gRNA kloningsvektor som beskrivits tidigare 25. Kontrollera sekvensen för varje enskild gRNA i den resulterande vektorn av Sånger-sekvensering 33. Namnge den resulterande gRNA konstruera som gRNA N2 33.
OBS: gRNA målstället är inom N1L genen, och är i området mellan den vänstra armen och högra armen att de reparationsdonatorvektor omslag (se figur 1).
- Klona Cas9 genen som saknar den nukleära lokaliseringssignalen (NLS) in ipST1374 vektor och utse konstruktionen som PST-Cas9 33.
OBS: Alla däggdjursexpressionskloningsvektor kan användas för konstruktionen av Cas9 expressionsvektom. - Konstruktion av reparation donatorvektor för HR
- Använd N1L genen av VV som målområde för modifiering 33. Se till att längderna hos de vänstra och högra armar är cirka 500-600 bp vardera, och flankerar målregionen.
OBS: Den vänstra arm / höger arm kan ha upp till 50 bp överlappning med målområdet (se figur 1). - Klona N1L regionen reparation donatorvektor som beskrivits tidigare 33, 34 och utse reparationsdonatorvektor som PT-N1L.
OBS: Se figur 1 för reparation donatorvektor och dess målområde. Andra regioner i VV kan riktas med hjälp av regionen (gen) specifik gRNA (s) och regionspecifika reparationsdonatorvektor. Alla kloningsvektor kan användas för konstruktion av reparationsdonatorvektor. </ Ol>
- Använd N1L genen av VV som målområde för modifiering 33. Se till att längderna hos de vänstra och högra armar är cirka 500-600 bp vardera, och flankerar målregionen.
- Expansion av plasmid
- Omvandla plasmiden i kemiskt kompetenta E. coli enligt tillverkarens anvisningar. Rena plasmiden med användning av en plasmid extraktion kit med hänvisning till det protokoll som tillhandahålls av tillverkaren.
2. sådd Celler (Dag 1)
- Upprätthålla CV-1-celler (apnjurfibroblaster) i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 5% fetalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin, vid 37 ° C med 5% CO 2.
- Trypsinize CV-1-celler som är från 80 till 90% konfluenta
- Avlägsna cellkulturmediet från T-175-kolv innehållande CV-1-celler. Skölj monoskiktet med 5 ml steril PBS för att avlägsna kvarvarande serum och aspirera PBS. Tillsätt 2,5 ml 1 x Trypsin-EDTA-lösning för att täcka cellerna och placera kolven i 37 ° C inkubator i ca 5 minuter för att underlätta cell lossnar.
- Lägg till10 ml av cellodlingsmedium (se steg 2,1) för att suspendera cellerna under lätt pipett åtgärder. Räkna antalet celler med hjälp av en hemocytometer.
- Sådd celler i 6-brunnsplattor
- Seed 2 x 10 5 CV-1-celler i 2 ml cellodlingsmedium i varje brunn i en 6-brunnsplatta dagen innan transfektion.
ANMÄRKNING: En ytterligare centrifugeringssteg för att avlägsna trypsin är inte nödvändig.
- Seed 2 x 10 5 CV-1-celler i 2 ml cellodlingsmedium i varje brunn i en 6-brunnsplatta dagen innan transfektion.
3. Transfektion av Cas9 Plasmid och gRNA Plasmid (Dag 2)
- Transfektera CV-1-celler (framställda i steg 2.2.3.1) med 0,5 pg pST-Cas9 plasmid och 0,5 mikrogram gRNA N2 plasmid med hjälp av en transfektionsreagens enligt tillverkarens anvisningar.
- Inkubera cellerna under 24 h i en inkubator (37 ° C med 5% CO2), och sedan ersätta mediet med 2 ml färskt cellkulturmedium (beskrivs i steg 2.1).
4. Infektion av CV-1-celler och Shuttle Donor Vector Transfektion för HR (Dag 3)
- Späd ryggraden VVL15 virus med DMEM cellodlingsmedium till en koncentration av 2 x 10 5 pfu / ml. 24 h post-transfektion av Cas9 och gRNA plasmider, tillsätt 100 | il av det utspädda viruset i varje brunn i de transfekterade CV-1-celler.
- 2 h efter virusinfektion, transfektera 1,0 ug shuttle donatorvektor i VVL15-infekterade celler för HR med användning av ett transfektionsreagens enligt tillverkarens instruktioner. Placera de transfekterade cellerna i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 under 24 timmar.
5. Harvest det rekombinanta viruset (dag 4)
- Efter 24 timmar av transfektion med buss donatorvektor för HR i steg 4,2, lossa de transfekterade CV-1-celler med hjälp av en cell skrapa. Samla cellsuspensionen in i ett cryovial och förvara vid -80 ° C för framtida användning.
OBS: Torka av cellodlingsmedium spill med desinfektionsmedel omedelbart och torka sedan igen med 70% ethanol.
6. Rening av modifierad VV (första omgången)
- På dag 1, utsäde 15 6-brunnars plattor med 3 x 10 5 CV-1-celler i varje brunn.
- På dag 2, tina den frusna cellsuspensionen från steg 5,1 i ett vattenbad vid 37 ° C under 3 min och vortexblanda cryovials kraftigt i 30 s för att erhålla cellysat utan att avlägsna cellrester.
- För infektionen av en 6-brunnsplatta av CV-1-celler, utspädd 1 mikroliter av cellysat med 3 ml DMEM och tillsätt 0,5 ml av den utspädda cellysatet in i varje brunn på 6-brunnar, på toppen av mediet redan Present. Infektera alla 6-brunnars plattor som framställts i steg 6,1.
OBS: Borttagning av cellrester är inte nödvändig. - Efter två dagars infektion (dvs på dag 4), identifiera RFP-positiva plack under ett fluorescensmikroskop med hjälp av 10X objektiv och märka plack under plattan med en tuschpenna genom att ringa plack plats.
OBS: Se- Förbered sex märkta cryovials innehåller 200 mikroliter serumfritt DMEM cellodlingsmedium för att plocka upp sex olika RFP-positiva plack. Aspirera cellodlingsmediet från brunnen med märkt plack (n) (steg 6,3). Fäst en 200 mikroliter tips till en P200 pipett, ställa in volymen på 30 mikroliter och ta ~ 10 mikroliter cellkulturmedium från en cryovial.
- Hålla pipetten tryckknappen utan att släppa mediet och använda spetsen för att skrapa området för en märkt plack. Släpp pipetten knappen för att lyfta upp de lösgjorda celler och överför till cryovial innehåller 190 mikroliter av serumfritt DMEM.
- Ta ytterligare 10 mikroliter medium från flaskan med repade celler (från sista steget) och upprepa proceduren för att plocka upp samma RFP-positiva plack tre gånger för att samla så många repad celler som möjligt. Överföra alla celler i samma flaska och lagra flaska vid -80 ° C.
7. Rening av modifierad VV (Andra omgången)
- Seed 3 × 10 5 CV-1-celler i varje brunn i sex 6-brunnars plattor och odla cellerna under 24 timmar.
- Tina frusna cryovials (från steg 6.3.3) i 37 ° C vattenbad under 3 minuter, sedan vortexblanda cryovials kraftigt i 30 sekunder för att få cellysatet.
- Tillsätt 0,5 | il av den blandade cellysat till en brunn i en 6-brunnsplatta. Infektera en 6-brunnar för varje platta. Inkubera VV-infekterade 6-brunnars plattor vid 37 ° C med 5% CO2 i 2 dagar (andra omgången plackrening). Upprepa sedan avsnitt 6.3.
OBS: Mer än sex RFP-positiva plack kan plockas upp; två eller flera 6-brunnars plattor kan användas för rening av varje plack.
- Tillsätt 0,5 | il av den blandade cellysat till en brunn i en 6-brunnsplatta. Infektera en 6-brunnar för varje platta. Inkubera VV-infekterade 6-brunnars plattor vid 37 ° C med 5% CO2 i 2 dagar (andra omgången plackrening). Upprepa sedan avsnitt 6.3.
8. Ytterligare omgångar av plack Purifiering
- Bär på ytterligare tre till fem omgångar av rening genom att följa samma protokoll som beskrivits i steg 7 tills alla plack som bildas från en positiv plack verkar vara RFP-positiv under ett mikroskop.
OBS: Detta plack sedan anses ren. - När plack är ren (Figur 4, alla infekterade celler som uttrycker RFP), skörda en positiv plack i en cryovial och förvara vid -80 ° C som beskrivs i avsnitt 6.3. Verifiera plack enligt det protokoll som beskrivs i steg 9 och 10.
9. Expandera Renat Plaque (er)
- Seed 3 × 10 5 CV-1-celler i varje brunn i en 6-brunnars platta en dag före virusinfektion.
- Tina den frysta cryovial från 8,2 i ett 37 ° C vattenbad under 3 minuter för att erhålla cellysat. Lägg till alla lysatet (utan att ta bort celldebris) i en brunn i en 6-brunnars platta av CV-1-celler (såddes i steg 9,1). Inkubera de infekterade CV-1-celler vid 37 ° C med 5% CO2 i upp till tre dagar.
- Expandera alla de renade plack (minst tre plack).
OBS: Infektionen Tiden varierar från 1-3 dagar beroende på mängden av virus i lysatet.
- Expandera alla de renade plack (minst tre plack).
- Skörda VV-infekterade celler med användning av en cellskrapa när mer än 50% celler visar cytopatisk effekt observerades under ett mikroskop (celler är rundade, enkelt loss och RFP positiva). Samla in de lösgjorda celler tillsammans med cellodlingsmedium i en 15 ml rör.
- Pellets cellerna genom centrifugering vid 300 g under 3 min. Avlägsna supernatanten och hålla cellpelleten vid -80 ° C tills vidare användning eller använd cellpelleten omedelbart för steg 10.
10. Kontroll av Ändring av Mutant VV Använda PCR
- Extrahera VV-DNA från cellpelleten som framställts i steg 9.3.1 med användning av en DNA-extraktion kit genom att följa tillverkarens protokoll. Eluera DNA med 200 mikroliter av dubbeldestillerat vatten.
Anmärkning Använd hälften av volymen av pelleten för att extrahera DNA och hålla resten för viral produktion om klonen verifieras såsom innehållande den korrekta modifieringen / införing. - Kontroll av strykningen av N1L genen och införande av RFP genen i N1L regionen.
- Amplifiera ett DNA-fragment som spänner över N1L genen (L025) och L026-genen med användning av primrar utformade mot N1L genen. Förstärk RFP genen med hjälp av RFP specifika primers. Amplifiera ett kontroll-DNA-fragment som spänner över A52R genom PCR med användning av A52R specifika primrar.
OBS: Se lista över material för specifika primers.- Utföra PCR med användning av en PCR-huvudblandning kit. Ställ in 25 mikroliter av PCR-reaktion med användning av 2 mikroliter av DNA-mall, denaturera PCR-reaktionen vid 94 ° C under 2 minuter, och sedan köra 30 cykler av PCR följande steg: denaturera DNA vid 94 ° C under 15 sekunder, sedan glödga primrarna till DNA-mallar vid 52 ° C under 15 s förlänga PCR-reaktionen vid 72 ° C under 30 s.
- Amplifiera ett DNA-fragment som spänner över N1L genen (L025) och L026-genen med användning av primrar utformade mot N1L genen. Förstärk RFP genen med hjälp av RFP specifika primers. Amplifiera ett kontroll-DNA-fragment som spänner över A52R genom PCR med användning av A52R specifika primrar.
- Lös de PCR-produkter med användning av en 1% -ig agarosgel 33. Fånga gelen bilden med en UV-gel doc. Om N1L PCR är negativ och A52R och RFP PCR är positiva, då plattan är korrekt ändras i N1L regionen.
Representative Results
För byggandet av en ny VV vektor, är den viktigaste utgångspunkten för att utforma och bygga en donator skyttelvektor som kan rikta en viss region av genomet. I denna studie var VV N1L genen som används som ett exempel mål. Kassetten av donator skyttelvektor för rekombination och den målsökta regionen i VV visas i figur 1. För att öka effektiviteten hos den homologa rekombinationen, plasmider som uttrycker Cas9 och en N1L specifik gRNA samtransfekterades in i CV -1 celler 48 timmar före utförande av homolog rekombination 33. En dag (24 timmar) efter transfektion, var RFP uttryck i CV-1-celler (Figur 2). Efter infektion av CV-1-celler med hela lysatet från homolog rekombination (steg 5), RFP-positiva och negativa plack båda observerades i CV-1-celler (Figur 3). Efter reningsprotokollet som beskrivs, en ren platta co uld erhållas efter 3-5 omgångar av rening. Såsom visas i fig 4, alla placker efter infektion med cell-lysat härrörande från en ren plack med det mutanta vacciniavirus presenterade en RFP-signal. För att kontrollera om den rena mutanten VV hade rätt genmodifiering, användes PCR för att bekräfta frånvaron av riktade N1L genen, som visas i Figur 5. PCR av det modifierade viruset visade en positiv signal för RFP och en frånvarande signal för N1L ( figur 5 lane AG), medan PCR-resultaten från N1L för kontrollviruset (Ctr) med en intakt N1L region är positiv. Styr DNA-fragment av A52R var positiva för alla rekombinanta virus och CTR-viruset. HR effektivitet i RFP-positiva plack är 100% (6/6) i detta experiment (det var upp till 94% i det tidigare arbetet 34). Den metod som beskrivs häri har förbättrat rekombination verkningsgrad med mer än 100 gånger jämfört med konventionella protokoll 33, 34.
innehåll "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 1:. Kassetten av donator skyttelvektor för homolog rekombination, och den målsökta regionen i VV-genomet Renings markörgen RFP drivs av H5-promotorn. Reparationen donatorvektor riktar de N1L region resulterar i RFP-genen den införlivas i N1L regionen efter homolog rekombination. "X" anger den homologa sekvensen i reparationsdonatorvektor som kommer att ersätta samma sekvens på vacciniavirusgenomet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Imaging av CV-1-celler en dag efter homolog rekombination En dag after homolog rekombination, de celler som infekterats med VV och transfekterade genom reparation donatorvektor är RFP-positiva A:. Fas kontrastbild (ursprunglig förstoring 100X) B:. Fluorescensmikroskopi bild (ursprunglig förstoring 100X). Skala bar = 50 um. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. En RFP-positiv plack i den första omgången rening av mutantvirus I första omgången rening av mutantviruset, är RFP-positiva plack (inringad med röd linje) med deletion målregionen omgiven av plack som bildas genom vildtypsvirus (inringad med gul linje) A:. fas kontrastbild (ursprunglig förstoring 100X) B:. Fluorescence microscopy bild (ursprunglig förstoring 100X). Skala bar = 50 um. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Den rena mutanta VV Efter 3-5 omgångar av rening, var rena plack erhölls som alla placker var RFP positiva A:. Faskontrastbilden (ursprunglig förstoring 100X) B:. Fluorescensmikroskopi bild (ursprunglig förstoring 100X) . Skala bar = 50 um. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Verification av den rena mutanta VV. DNA extraherades från VV infekterade CV-1-celler. Strykningen av målområdet N1L verifierades genom PCR med användning N1L primers, var införandet av RFP i N1L region bekräftades genom PCR med användning av RFP primers. Lanes AF motsvarar sex renade plack, spår G en kontrollplatta med N1L radering verifieras i tidigare arbeten 33, lane Ctr (kontroll) är vildtyp vacciniavirus (med N1L region intakt). A52R genen förstärktes som kontroll genen för alla prover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Det finns två huvudsakliga mål för modifiering av VV i terapeutiska syften. En är att ta bort en särskild gen, såsom tymidinkinas (TK) genen för att attenuera viruset för anti-tumör terapeutisk användning. Den andra är att armen VV med en önskad terapeutisk gen (t.ex. GM-CSF) eller en markörgen (såsom luciferas-genen). Uppnå någon av dessa innebär en strykning av ett målområde / gen. En direkt DNA ligation metod 35 och en in vitro förpackningsmetod 36 har använts tidigare för att generera mutanta vacciniavirus med TK förändringar av gener. Emellertid har dessa metoder begränsad ansökan avseende mutation av andra regioner i genomet på grund av brist på unika restriktionsenzymställen i hela genomet. Den nuvarande strategin för att skapa muterade VV innebär transfektion av en skyttel (donator) vektor med en selektionsmarkör (RFP eller GFP) i CV-1-celler två timmar efter infektion med VV att framkalla en homolog rekombination incorporating selektionsmarkören i målregionen. Val av markörpositiva plack följs av deras rening 24 h efter transfektion. Plack reningsprocessen kan ta upp till 10 omgångar, senast 3-4 veckor och ofta leder till oönskade rekombinanta virus med selektionsmarkörer insatta i off-målområden. DNA dubbel-strängbrott effektivt kan inducera homolog rekombination i däggdjursceller 37, och genom att utnyttja denna mekanism, kan effektiviteten att generera muterade VV vara betydligt bättre. Den gRNA styrda Cas9 systemet har använts med framgång i genomet redigering och effektiviserar homolog rekombination i eukaryota organismer 22, 25. Nyligen, i värdceller genomen hos adenovirus och typ I herpes simplex-virus redigerats av gRNA styrda Cas9 systemet 24. Det har nyligen visats att crispr Cas9 system är ett kraftfullt verktyg för att effektivt redigering av VV-genomet och konstruera en VV vektor för uttryck av ensärskild gen.
Både N1L gRNA styrd Cas9 och traditionella homolog rekombination (HR) metod resulterade i framgångsrika HR evenemang på samma målplatsen av N1L. Intressant, men gRNA styrd Cas9 inducerad HR på mycket högre nivåer av effektivitet än den traditionella HR-metoden. Således, användning av gRNA-guided Cas9 eliminerar behovet att rena så många placker för att erhålla mutanta VVS. I detta arbete har vi förbättrat avsevärt effektiviteten och tidsramen för generering av mutant VV med hjälp av gRNA styrda Cas9 systemet 33. Att notera är en kritiskt steg för att erhålla en hög effektivitet av homolog rekombination för att transfektera CV-1-celler med plasmiderna uttryckande Cas9 och gRNA i 24 h innan du utför den konventionella homolog rekombination. 24 h intervall tillåter Cas9 och gRNA uttryckas på en rimlig nivå. Vidare kan gRNA sekvens rikta en särskild gen måste optimeras som vi funnit att de olika gRNA sekvenser targeting N1L genen varierade i deras effektivitet 33, 34.
Begränsningen för crispr / Cas9 i redigerings VV är den låga RFP-positiva plack i den första omgången av rekombination. För att erhålla ett tillräckligt antal RFP-positiva placker innehållande rekombinant virus, vanligen minst tio 6-brunnars plattor som behövs, vilket gör första omgången screening långtråkig. Det finns därför fortfarande ett behov att optimera protokoll för att övervinna denna begränsning.
Den lilla storleken på RFP positiva plack är ett annat potentiellt problem, som beror på en hög volym av lysat användes för att infektera en 6-brunnsplatta. För att lösa detta, bör en mindre volym av lysat användas för att infektera en 6-brunnars platta för erhållande av större storlek RFP-positiva plack. Med användning av en mindre volym av lysat kommer också att möjliggöra för bättre separation av RFP-positiva plack från de RFP-negativa sådana. Följaktligen färre omgångar av plackrening krävs för att få rena RFP-positiva plack.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid #41824 | 41824 | Addgene | gRNA cloning vector |
| pST1374 | 13426 | Addgene | Cas9 cloning vector |
| pGEMT easy | A1360 | promega | repair donor vector cloning |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | C4040-10 | Invitrogen | transformation |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | 27106 | Qiagen | plasmid extraction |
| Dulbecco’s Eagle’s Medium (DMEM) | 11965-092 | Life Technologies | cell culture medium |
| fetal bovine serum (FBS) | SH30088.03HI | Hyclone | cell culture serum |
| penicillin, streptomycin | 15070-063 | Thermo Scientific | antibiotics |
| Effectene | 301425 | Qiagen | transfection |
| Thermo Scientific Nalgene Cryogenic vial; 2.0 mL | W-06754-96 | Thermo Scientific | collect virus |
| fluorescence microscope | Olympus BX51 Fluorescence | Olympus | find RFP-positive plque |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | 69506 | Qiagen | DNA extraction |
| Extensor Long PCR ReddyMix Master Mix | AB-0794/B | Thermo Scientific | PCR reagent |
| 10 cm culture dish | Z688819-6EA | sigma | cell culture |
| 6-well plate | Z707759 | sigma | cell culture |
| cell scraper | C5981 | sigma | scrap cells |
| 1x Trypsin-EDTA solution | T4299 | sigma | trypsinize cells |
| Virkon | 95015661 | Anachem Ltd | desinfectant |
| Falcon tube | CLS430791-500EA | Sigma | hold cell suspension |
| N1L forward 5’-TATCTAGCAATGGACCGT-3’ | Sigma | PCR primer | |
| N1L reverse 5’-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3' | Sigma | PCR primer | |
| A52R forward 5’-ATAGGATTGTGTGCATGC-3’ | Sigma | PCR primer | |
| A52R reverse 5’-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3’ | Sigma | PCR primer | |
| RFP forward 5’- GCTACCGGACTCAGATCCA-3’ | Sigma | PCR primer | |
| RFP reverse 5’-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3’ | Sigma | PCR primer | |
| Argarose | A7431 | Sigma | resolve PCR product |
| G:BOX F3 | G:BOX F3 | Syngene | UV gel doc |
References
- Baroudy, B. M., Venkatesan, S., Moss, B. Incompletely base-paired flip-flop terminal loops link the two DNA strands of the vaccinia virus genome into one uninterrupted polynucleotide chain. Cell. 28, 315-324 (1982).
- Madigan, M. T., Martinko, J. M., Parker, J., Brock, T. D. Brock biology of microorganisms, 9th edn. , Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. (2000).
- Cooney, E. L., et al. Safety of and immunological response to a recombinant vaccinia virus vaccine expressing HIV envelope glycoprotein. Lancet. 337, 567-572 (1991).
- Mackett, M., Yilma, T., Rose, J. K., Moss, B. Vaccinia virus recombinants: expression of VSV genes and protective immunization of mice and cattle. Science. 227, 433-435 (1985).
- Legrand, F. A., et al. Induction of potent humoral and cell-mediated immune responses by attenuated vaccinia virus vectors with deleted serpin genes. J Virol. 78, 2770-2779 (2004).
- Panicali, D., Davis, S. W., Weinberg, R. L., Paoletti, E. Construction of live vaccines by using genetically engineered poxviruses: biological activity of recombinant vaccinia virus expressing influenza virus hemagglutinin. Proc Natl Acad Sci. 80, 5364-5368 (1983).
- Wiktor, T. J., et al. Protection from rabies by a vaccinia virus recombinant containing the rabies virus glycoprotein gene. Proc Natl Acad Sci. 81, 7194-7198 (1984).
- Gallucci, S., Matzinger, P. Danger signals: SOS to the immune system. Curr Opin Immunol. 13, 114-119 (2001).
- Matzinger, P. The danger model: a renewed sense of self. Science. 296, 301-305 (2002).
- Guo, Z. S., Bartlett, D. L. Vaccinia as a vector for gene delivery. Expert Opin Biol Ther. 4, 901-917 (2004).
- Kwak, H., Horig, H., Kaufman, H. L. Poxviruses as vectors for cancer immunotherapy. Curr Opin Drug Discov Devel. 6, 161-168 (2003).
- Tysome, J. R., et al. Lister strain of vaccinia virus armed with endostatin-angiostatin fusion gene as a novel therapeutic agent for human pancreatic cancer. Gene Ther. 16, 1223-1233 (2009).
- Kirn, D. H., Wang, Y., Liang, W., Contag, C. H., Thorne, S. H. Enhancing poxvirus oncolytic effects through increased spread and immune evasion. Cancer Res. 68, 2071-2075 (2008).
- Park, B. H., et al. Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial. Lancet Oncol. 9, 533-542 (2008).
- Panicali, D., Paoletti, E. Construction of poxviruses as cloning vectors: insertion of the thymidine kinase gene from herpes simplex virus into the DNA of infectious vaccinia virus. Proc Natl Acad Sci. 79, 4927-4931 (1982).
- Ball, L. A. High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA. J Virol. 61, 1788-1795 (1987).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Mol Cell Biol. 14, 8096-8106 (1994).
- Jansen, R., Embden, J. D., Gaastra, W., Schouls, L. M. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol. 43, 1565-1575 (2002).
- Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321, 960-964 (2008).
- van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes. Trends Biochem Sci. 34, 401-407 (2009).
- Jinek, M., et al. Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation. Science. 343, 1247997 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Bi, Y., et al. High-efficiency targeted editing of large viral genomes by RNA-guided nucleases. PLoS Pathog. 10, 1004090 (2014).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Yang, L., et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Res. 41, 9049-9061 (2013).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31, 827-832 (2013).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
- Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156, 836-843 (2014).
- Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. 32, 551-553 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Ma, Y., et al. Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9. Cell Res. 24, 122-125 (2014).
- Yuan, M., et al. Efficiently editing the vaccinia virus genome by using the CRISPR-Cas9 system. J Virol. 89, 5176-5179 (2015).
- Yuan, M., et al. A marker-free system for highly efficient construction of vaccinia virus vectors using CRISPR Cas9. Mol Ther Methods Clin Dev. 2, 15035 (2015).
- Merchlinsky, M., Moss, B. Introduction of foreign DNA into the vaccinia virus genome by in vitro ligation: recombination-independent selectable cloning vectors. Virology. 190, 522-526 (1992).
- Timiryasova, T. M., Chen, B., Fodor, N., Fodor, I. Construction of recombinant vaccinia viruses using PUV-inactivated virus as a helper. Biotechniques. 31, 534-540 (2001).
- Johnson, R. D., Jasin, M. Double-strand-break-induced homologous recombination in mammalian cells. Biochem Soc Trans. 29, 196-201 (2001).
