Summary
Vacciniavirus (VV) har været meget anvendt i biomedicinsk forskning og forbedring af menneskers sundhed. Denne artikel beskriver en enkel, meget effektiv metode til at redigere VV genom ved hjælp af en CRISPR-Cas9 system.
Introduction
Vacciniavirus (VV) er et kappebærende DNA-virus, der tilhører poxvirus familie og har spillet en afgørende rolle i et af de største resultater i medicin for udryddelsen af kopper. I den post-udryddelse æra af kopper, har VV blevet udviklet som en vektor til at levere gener til vacciner mod HIV og andre infektionssygdomme 1-7 ved at indsætte gener fra forskellige patogener i VV-vektorer. VV har også været udbredt anvendt som en vektor til cancerimmunterapi 8-14 især for udvikling af tumor-målrettede replikerende onkolytisk vacciniavirus. For at skabe en effektiv vaccine vektor med forbedret selektivitet for cancerceller, er modifikationer inden for virale genom kræves, herunder gen-deletioner eller introduktion af terapeutiske gener.
Med udviklingen af DNA-teknologi og en bedre forståelse af molekylær biologi og virologi, indsættelse af fremmed DNA i VV blev oprindeligt opnåd under anvendelse af homolog rekombination (HR) i 1980'erne 15. Denne metode er stadig udbredte til at konstruere VV vektorer. Indførelse af den genetiske modifikation opnås ved anvendelse af en shuttle vektor til HR, som rekombinerer med det VV-genomet i præ-inficerede celler. Imidlertid har denne metode vist sig at være meget ineffektive (under 1% homolog rekombination effektivitet 16) og resulterer ofte i tilfældig indsættelse af selektionsmarkør i ikke-målrettede regioner og / eller tab af markøren ved virus ekspansion.
Effektiviteten af DNA homolog rekombination til indsættelse af exogent DNA ved genomisk loci kan dramatisk forøget i nærvær af dobbelt-strenget pauser (DSBs) 17. Derfor er den teknologi, der kan fremkalde DSBs på target loci rummer et stort potentiale for genom engineering af VV.
Den nyligt udviklede CRISPR-Cas9 systemet viser lovende for at udløse DSB'er i enhver VV gen region. CRISPR-Cas9 er et RNA-guidet nuklease involveret i adaptiv immunitet mod invaderende fager og andre fremmede genetiske materialer 18-20. Der er tre CRISPR-Cas-systemer i en række mikrobielle arter 21. Type II CRISPR-Cas systemet er meget brugt til at redigere genomet af eukaryote celler og store vira. Den består af RNA-guidede Cas9 endonuklease (fra Streptococcus pyogenes), en enkelt guide RNA (sgRNA) og trans-aktiverende crRNA (tracrRNA) 22-24. Den Cas9 / sgRNA komplekset genkender den komplementære 20-nukleotid genomiske sekvens forud en 5'-NGG-3 'Protospacer tilstødende motiv (PAM) sekvens i pattedyrceller 22, 23. Det har været anvendt med succes til effektiv generering af genetisk modificerede celler, vira og dyremodeller 22-32.
Den CRISPR-Cas9 systemet har vist sig at være et effektivt redskab til genom målretning i kombination med homolog rekombination i cytoplasmaet i VV inficerede CV-1 celles til at generere mutant vacciniavira 33, 34. For at udvide den potentielle anvendelse af denne metode, præsenterer vi detaljerede oplysninger om systemets metode. Den beskrevne protokol kan bruges til at skabe en mutant VV med et bestemt gen deletion og / eller arm mutantvirusset med et terapeutisk transgen.
Protocol
1. Udarbejdelse af Target RNA og Cas9 konstruktioner og reparation Donor Vector
- Kloning af gRNAs
- Design en guide-RNA-mål sekvens rettet mod N1L genet af vacciniavirus efter princippet tidligere 25 angivet. Juster guide-RNA målsekvensen mod genomet af vacciniavirus (i dette tilfælde, Lister-stammen af vacciniavirus) at udelukke enhver ikke-tilsigtede gRNA målsekvenser.
- Syntetisere og klone gRNA oligoer i en gRNA kloningsvektor som tidligere 25 beskrevet. Bekræfte sekvensen for hver enkelt gRNA i den resulterende vektor af Sanger-sekventering 33. Navngive resulterende gRNA konstruktion som gRNA N2 33.
BEMÆRK: gRNA målsted er inden for N1L genet, og er i området mellem den venstre arm og højre arm, at reparationen donorvektor covers (se figur 1).
- Klone Cas9 genet mangler kernelokaliseringssignalet (NLS) ipST1374 vektor og udpege konstruktionen som pST-Cas9 33.
BEMÆRK: Enhver pattedyrsekspression kloning vektor kan anvendes til konstruktion af Cas9 ekspressionsvektoren. - Konstruktion af reparation donorvektor for HR
- Brug N1L gen af VV som målområde for ændring 33. Sørg for, at længderne af venstre og højre arm er omkring 500-600 bp hver, og flankerer målområdet.
BEMÆRK: venstre arm / højre arm kan have op til 50 bp overlap med målområdet (Se figur 1). - Klone N1L regionen reparation donorvektor som tidligere 33, 34 beskrevet og udpege reparationen donorvektor som pT-N1L.
BEMÆRK: Se figur 1 til reparation donor vektor og dens målområde. Andre regioner i VV kan målrettes under anvendelse region (gen) -specifik gRNA (er) og region-specifik reparation donorvektor. Alle kloningsvektor kan anvendes til konstruktion af reparationen donorvektoren. </ Ol>
- Brug N1L gen af VV som målområde for ændring 33. Sørg for, at længderne af venstre og højre arm er omkring 500-600 bp hver, og flankerer målområdet.
- Udvidelse af plasmid
- Omdan plasmidet ind kemisk kompetent E. coli ifølge producentens anvisninger. Oprens plasmidet under anvendelse af et plasmid ekstraktionskit Under henvisning til protokollen leveret af producenten.
2. Seeding Celler (dag 1)
- Oprethold CV-1-celler (abenyrefibroblaster) i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 5% føtalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin ved 37 ° C med 5% CO 2.
- Trypsinisér CV-1-celler, der er 80-90% sammenflydende
- Fjern celledyrkningsmediet fra T-175-kolbe indeholdende CV-1-celler. Skyl monolaget med 5 ml sterilt PBS til fjernelse af resterende serum og aspirér PBS. Tilføj 2,5 ml 1 x Trypsin-EDTA-opløsning for at dække cellerne og kolben anbringes i 37 ° C inkubator i ca. 5 min til støtte Cellefrigørelse.
- Tilføje10 ml cellekulturmedium (se trin 2.1) at suspendere cellerne under let pipette handling. Tæl celle numre ved hjælp af en hæmocytometer.
- Seeding celler i 6-brønds plader
- Seed 2 × 10 5 CV-1-celler i 2 ml celledyrkningsmedium i hver brønd i en 6-brønds plade dagen før transfektion.
BEMÆRK: Et yderligere centrifugeringstrin til fjernelse af trypsin er ikke nødvendig.
- Seed 2 × 10 5 CV-1-celler i 2 ml celledyrkningsmedium i hver brønd i en 6-brønds plade dagen før transfektion.
3. Transfektion af Cas9 plasmid og gRNA Plasmid (dag 2)
- Transficere CV-1-celler (fremstillet i trin 2.2.3.1) med 0,5 ug pST-Cas9 plasmid og 0,5 ug gRNA N2 plasmid under anvendelse af et transfektionsreagens i henhold til producentens instruktioner.
- Inkubér cellerne i 24 timer i en inkubator (37 ° C med 5% CO2), og derefter erstatte mediet med 2 ml frisk celledyrkningsmedium (beskrevet i trin 2.1).
4. Infektion af CV-1 Celler og Transport Donor Vektor Transfektion for HR (Dag 3)
- Fortynd rygraden VVL15 virus med DMEM celledyrkningsmedium til en koncentration på 2 x 10 5 pfu / ml. 24 timer efter transfektion af Cas9 og gRNA plasmider, tilsættes 100 pi af den fortyndede virus i hver brønd i de transficerede CV-1-celler.
- 2 timer efter virusinfektion, transficere 1,0 ug shuttle donor vektor i VVL15-inficerede celler til HR bruger transfektionsreagens i henhold til producentens anvisninger. Placer de transficerede celler i et 37 ° C inkubator med 5% CO2 i 24 timer.
5. Harvest det rekombinante virus (dag 4)
- Efter 24 timers transfektion med shuttle donorvektor for HR i trin 4.2, frigøre de transficerede CV-1-celler ved anvendelse af en celleskraber. Saml cellesuspensionen til en kryoglas og opbevares ved -80 ° C til senere brug.
BEMÆRK: Tør cellekulturmedium spild med desinfektionsmiddel straks og derefter tørre igen med 70% ethanol.
6. Oprensning af Modified VV (første runde)
- På dag 1, frø 15 6-brønds plader med 3 × 10 5 CV-1-celler i hver brønd.
- På dag 2 optø frosne cellesuspension fra trin 5.1 i et vandbad ved 37 ° C i 3 minutter og vortex de kryoglas kraftigt i 30 s for at opnå cellelysat uden at fjerne cellerester.
- Til inficering af en 6-brønds plade af CV-1-celler, fortyndes 1 pi cellelysat med 3 ml DMEM og tilsæt 0,5 ml af den fortyndede cellelysat i hver brønd i 6-brønds plade, på toppen af medier allerede nuværende. Inficere alle 6-brønds plader fremstillet i trin 6.1.
BEMÆRK: Fjernelse af cellerester er ikke påkrævet. - Efter to dage med infektion (dvs. på dag 4), identificere RFP-positive plaques under et fluorescensmikroskop hjælp 10X objektiv og mærke de plaques under pladen ved hjælp af en markør pen ved cirkelbevægelser plak placering.
BEMÆRK: Se- Forbered seks mærkede kryoglas indeholdende 200 pi serumfrit DMEM cellekulturmedium at afhente seks forskellige RFP-positive plaques. Aspirer celledyrkningsmediet fra brønden med mærket plaque (er) (trin 6.3). Vedhæft en 200 uL tip til en P200 pipette, indstille lydstyrken på 30 uL og tage ~ 10 uL cellekulturmedium fra en kryohætteglas.
- Hold knappen pipette tryk uden at slippe mellemstore og bruge spidsen at ridse område på én mærket plak. Slip pipette skub til at løfte de løsrevne celler og overføre det ind i cryovialet indeholdende 190 pi serum-frit DMEM.
- Tag endnu 10 uL medium fra hætteglasset med de ridsede celler (fra sidste trin) og gentag proceduren for at afhente den samme RFP-positive plak tre gange for at samle så mange ridset celler som muligt. Overfør alle celler i den samme hætteglas og opbevares hætteglas ved -80 ° C.
7. Oprensning af Modified VV (Anden runde)
- Seed 3 × 10 5 CV-1-celler i hver brønd på seks plader med 6 brønde og dyrke cellerne i 24 timer.
- Optø frosne kryoglas (fra trin 6.3.3) i 37 ° C vandbad i 3 minutter, derefter vortex kryoglas kraftigt i 30 sek for at opnå cellelysat.
- Tilsæt 0,5 pi af det blandede cellelysat til en brønd af en 6-brønds plade. Inficere en plade med 6 brønde for hver plak. Inkubér VV-inficerede 6-brønds plader ved 37 ° C med 5% CO2 i 2 dage (Anden runde plakoprensning). Gentag derefter afsnit 6.3.
BEMÆRK: Mere end seks RFP-positive plaques kan afhentes; to eller flere plader med 6 brønde kan anvendes til oprensning af hver plak.
- Tilsæt 0,5 pi af det blandede cellelysat til en brønd af en 6-brønds plade. Inficere en plade med 6 brønde for hver plak. Inkubér VV-inficerede 6-brønds plader ved 37 ° C med 5% CO2 i 2 dage (Anden runde plakoprensning). Gentag derefter afsnit 6.3.
8. Yderligere runder af plaque Purifikation
- Udøver et yderligere tre til fem runder af oprensning efter den samme protokol beskrevet i trin 7, indtil alle dannet ud fra én positiv plaque plaques synes at være RFP-positive under et mikroskop.
BEMÆRK: Denne plak så betragtes rent. - Når plak er ren (Figur 4, alle inficerede celler, der udtrykker RFP), høste en positiv plaque i en kryohætteglas og opbevares ved -80 ° C som beskrevet i afsnit 6.3. Kontrollere plak ifølge protokollen beskrevet i trin 9 og 10.
9. Expand de oprensede Plaque (er)
- Seed 3 × 10 5 CV-1-celler i hver brønd i en plade med 6 brønde en dag før virusinfektion.
- Optø den frosne kryoglas fra 8,2 i et 37 ° C vandbad i 3 minutter for at opnå cellelysat. Tilføj alle lysatet (uden at fjerne cellerester) i en brønd af en 6-brønds plade af CV-1-celler (podet i trin 9.1). Inkuber de inficerede CV-1-celler ved 37 ° C med 5% CO2 i op til 3 dage.
- Udvid alle de rensede plaques (mindst tre plaques).
BEMÆRK: infektion varierer fra 1-3 dage afhængigt af mængden af virus i lysatet.
- Udvid alle de rensede plaques (mindst tre plaques).
- Høste VV-inficerede celler under anvendelse af en celleskraber, når mere end 50% celler udviser cytopatisk virkning observeret under et mikroskop (celler er afrundede, let fritliggende og RFP positive). Indsamle de løsnede celler sammen med celledyrkningsmedium i et 15 ml rør.
- Pelletere cellerne ved centrifugering ved 300 g i 3 min. Fjern supernatanten og holde cellepelleten ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse eller anvende cellepelleten straks for trin 10.
10. Verifikation af Modifikation af Mutant VV Brug PCR
- Uddrag VV DNA fra cellepelleten fremstillet i trin 9.3.1 under anvendelse af et DNA-ekstraktionskit efter fabrikantens protokol. Eluer DNA med 200 pi dobbelt-destilleret vand.
BEMÆRK: Brug halvdelen af den mængde af pillen til at udtrække DNA og holde resten for viral produktion, hvis klon verificeres som indeholder den korrekte ændring / indsættelse. - Kontrol af sletning af N1L genet og indsættelse af RFP gen i N1L regionen.
- Amplificere et DNA-fragment, der spænder over N1L genet (L025) og L026-genet under anvendelse af primere designet mod N1L genet. Amplificere RFP genet under anvendelse RFP -specifikke primere. Amplificere et kontrol-DNA-fragment, der spænder over A52R ved PCR under anvendelse A52R-specifikke primere.
BEMÆRK: Se liste over materialer til specifikke primere.- Udfør PCR under anvendelse af en PCR Master Mix kit. Opstilles 25 pi PCR-reaktion ved anvendelse af 2 pi DNA-skabelon, denaturere PCR-reaktionen ved 94 ° C i 2 min, og derefter køre 30 cykler af PCR følgende fremgangsmåde: denaturere DNA'et ved 94 ° C i 15 s, hvorefter annealer primerne til DNA templates ved 52 ° C i 15 s udvide PCR-reaktionen ved 72 ° C i 30 s.
- Amplificere et DNA-fragment, der spænder over N1L genet (L025) og L026-genet under anvendelse af primere designet mod N1L genet. Amplificere RFP genet under anvendelse RFP -specifikke primere. Amplificere et kontrol-DNA-fragment, der spænder over A52R ved PCR under anvendelse A52R-specifikke primere.
- Løse de PCR-produkter under anvendelse af en 1% agarosegel 33. Fang gel billedet ved hjælp af en UV-gel dok. Hvis N1L PCR er negativ og A52R og RFP PCR'er er positive, så pladen er korrekt modificeret i N1L region.
Representative Results
For opførelsen af en ny VV vektor, den centrale udgangspunkt er at designe og konstruere en donor shuttle vektor, der kan målrette en bestemt region af genomet. I denne undersøgelse blev VV N1L genet anvendt som eksempel target. Kassetten af donor shuttle vektor til rekombination og målområdet i VV er vist i figur 1. For at øge effektiviteten af den homologe rekombination, plasmider, der udtrykker Cas9 og en N1L-specifik gRNA blev cotransficeret ind i CV -1 celler 48 timer før udførelse af homolog rekombination 33. En dag (24 timer) post-transfektion blev RFP udtrykt i CV-1-celler (figur 2). Efter infektion af CV-1-celler med hele lysatet fra den homologe rekombination (trin 5), RFP-positive og negative plaques blev begge observeret i CV-1-celler (figur 3). At følge fremgangsmåden beskrevet oprensningsprotokol, en ren plaque co ULD opnås efter 3-5 runder af oprensning. Som vist i figur 4, alle plaques efter infektion med cellelysat afledt fra en ren plak med det mutante vacciniavirus præsenteret en RFP signal. At kontrollere, om den rene mutant VV havde den korrekte genetiske modifikation, blev PCR anvendt til at bekræfte fraværet af det målrettede N1L genet, som vist i figur 5. PCR af det modificerede virus viste et positivt signal for RFP og en fraværende signal for N1L ( Figur 5 lane AG), mens PCR resultater N1L til bekæmpelse virus (CTR) med en intakt N1L region er positiv. De kontrol-DNA-fragmenter af A52R var positive for alle rekombinante vira og Ctr virus. HR effektivitet i RFP-positive plaques er 100% (6/6) i dette forsøg (det var op til 94% i det tidligere arbejde 34). Den heri beskrevne fremgangsmåde har forbedret rekombinationseffektivitet med mere end 100 gange sammenlignet med konventionelle protokoller 33, 34.
indhold "fo: holde-together.within-side =" 1 ">
Figur 1:. Kassetten af donor shuttle vektor til homolog rekombination, og den målrettede region i VV-genomet Oprensningen markørgen RFP drives af H5 promotoren. Reparationen donorvektor målrette N1L regionen resultater i RFP-genet bliver indarbejdet i N1L regionen efter homolog rekombination. 'X' angiver den homologe sekvens i reparation donor vektor, der skal erstatte den samme sekvens på vacciniavirusgenomet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Imaging af CV-1-celler én dag efter homolog rekombination En dag after homolog rekombination, cellerne inficeret med VV og transficeret ved afhjælpning donorvektor er RFP-positive A:. Fasekontrast billede (oprindelig forstørrelse 100X) B:. Fluorescensmikroskopi billede (oprindelig forstørrelse 100X). Scale bar = 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. En RFP-positive plak i første runde rensning af mutant virus I første runde rensning af det muterede virus, er RFP-positive plaque (cirkel med rød linje) med målområdet sletning omgivet af plaques dannet af vildtype virus (cirkel med gul linje) A:. fase kontrast billede (original forstørrelse 100X) B:. Fluorescens MICRoscopy billede (oprindelig forstørrelse 100X). Scale bar = 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Den rene mutant VV Efter 3-5 runder af oprensning blev rene plaques opnået som alle plaques blev RFP-positive A:. Fasekontrast billede (oprindelig forstørrelse 100X) B:. Fluorescensmikroskopi billede (oprindelig forstørrelse 100X) . Scale bar = 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Verification af den rene mutant VV. DNA blev ekstraheret fra VV-inficerede CV-1-celler. Sletningen af målområdet N1L blev bekræftet ved PCR ved hjælp N1L primere blev indsættelsen af RFP i N1L region bekræftet ved PCR ved hjælp RFP primere. Lanes AF svarer til seks rensede plaques, bane G er en kontrol mindeplade med N1L sletning verificeret i tidligere arbejde 33, bane Ctr (kontrol) er vildtype vacciniavirus (med N1L region intakt). A52R genet blev forstærket som kontrol genet for alle prøver. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Der er to primære mål om ændring af VV til terapeutiske formål. Den ene er at slette et bestemt gen, såsom thymidinkinase (TK) genet til at dæmpe virus for anti-tumor terapeutisk anvendelse. Den anden er at arm VV med et ønsket terapeutisk gen (såsom GM-CSF) eller et markørgen (f.eks luciferasegenet). Opnåelse en af disse indebærer sletning af en target region / gen. En direkte DNA ligering metode 35 og en in vitro-pakning metode 36 er tidligere blevet anvendt til at generere mutant vacciniavira med TK gen modifikationer. Imidlertid har disse metoder begrænset anvendelse vedrørende mutation af andre regioner i genomet på grund af mangel af unikke restriktionsenzymsteder i hele genomet. Den nuværende fremgangsmåde til at skabe mutant VV involverer transfektion af en shuttle (donor) vektor med en selektionsmarkør (RFP eller GFP) i CV-1-celler to timer efter infektion med VV at inducere en homolog rekombination incorporating selektionsmarkøren i målområdet. Udvælgelse af markør-positive plaques efterfølges af deres oprensning 24 timer efter transfektion. Den plakoprensning proces kan tage op til 10 runder, sidste 3-4 uger og fører ofte til uønskede rekombinante vira med selektionsmarkører indsat i off-målregioner. DNA dobbelt-strengbrud effektivt kan inducere homolog rekombination i pattedyrceller 37, og ved at udnytte denne mekanisme, kan effektiviteten generere mutant VV forbedres kraftigt. Den gRNA-guidede Cas9 systemet er blevet ansat i genom redigering og forbedrer effektiviteten af homolog rekombination i eukaryote organismer 22, 25. For nylig, i værtsceller genomer adenovirus og type I herpes simplex virus blev redigeret af gRNA-guided Cas9 systemet 24. Det er for nylig blevet påvist, at CRISPR Cas9 systemet er et stærkt værktøj til effektivt at redigere VV-genomet og konstruere en VV-vektor til ekspression af etsærligt gen.
Både N1L gRNA-vejledt Cas9 og den traditionelle homolog rekombination (HR) metode resulterede i vellykket HR begivenheder på det samme mål site af N1L. Interessant, men gRNA-guided Cas9 induceret HR på langt højere niveauer af effektivitet end den traditionelle HR-metoden. Anvendelsen af gRNA-guided Cas9 eliminerer behovet for at oprense så mange plaques at opnå mutante vvs. I dette arbejde, vi markant forbedret effektivitet og tidsramme for generering af mutant VV bruge gRNA-guidede Cas9 systemet 33. Af note, et kritisk trin til opnåelse af en høj effektivitet af homolog rekombination er at transficere CV-1-celler med plasmider, der udtrykker Cas9 og gRNA i 24 timer før udførelse af konventionelle homolog rekombination. Den 24 timer interval giver Cas9 og gRNA at blive udtrykt på et rimeligt niveau. Endvidere kan gRNA sekvens målretter et særligt gen skal optimeres, da vi fandt, at de forskellige gRNA sekvenser targeting N1L gen varierede i deres effektivitet 33, 34.
Begrænsningen for CRISPR / Cas9 i redigering VV er den lave RFP-positive plaques i den første runde af rekombination. Til opnåelse af et tilstrækkeligt antal RFP-positive plaques indeholdende rekombinant virus, sædvanligvis mindst ti er behov 6-brønds plader, som gør første runde screening trættende. Derfor er der stadig behov for at optimere protokollen for at overvinde denne begrænsning.
Den lille størrelse af RFP-positive plaques er et andet potentielt problem, der skyldes en høj volumen af lysat anvendes til infektion af en plade med 6 brønde. For at overvinde dette, bør et mindre volumen af lysat anvendes til at inficere en plade med 6 brønde til opnåelse af større størrelse RFP-positive plaques. Ved hjælp af en mindre mængde lysat vil også gøre det muligt for en bedre separation af RFP-positive plaques fra RFP-negative. Derfor færre runder af plak rensning skal indhente rene RFP-positive plaques.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid #41824 | 41824 | Addgene | gRNA cloning vector |
| pST1374 | 13426 | Addgene | Cas9 cloning vector |
| pGEMT easy | A1360 | promega | repair donor vector cloning |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | C4040-10 | Invitrogen | transformation |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | 27106 | Qiagen | plasmid extraction |
| Dulbecco’s Eagle’s Medium (DMEM) | 11965-092 | Life Technologies | cell culture medium |
| fetal bovine serum (FBS) | SH30088.03HI | Hyclone | cell culture serum |
| penicillin, streptomycin | 15070-063 | Thermo Scientific | antibiotics |
| Effectene | 301425 | Qiagen | transfection |
| Thermo Scientific Nalgene Cryogenic vial; 2.0 mL | W-06754-96 | Thermo Scientific | collect virus |
| fluorescence microscope | Olympus BX51 Fluorescence | Olympus | find RFP-positive plque |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | 69506 | Qiagen | DNA extraction |
| Extensor Long PCR ReddyMix Master Mix | AB-0794/B | Thermo Scientific | PCR reagent |
| 10 cm culture dish | Z688819-6EA | sigma | cell culture |
| 6-well plate | Z707759 | sigma | cell culture |
| cell scraper | C5981 | sigma | scrap cells |
| 1x Trypsin-EDTA solution | T4299 | sigma | trypsinize cells |
| Virkon | 95015661 | Anachem Ltd | desinfectant |
| Falcon tube | CLS430791-500EA | Sigma | hold cell suspension |
| N1L forward 5’-TATCTAGCAATGGACCGT-3’ | Sigma | PCR primer | |
| N1L reverse 5’-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3' | Sigma | PCR primer | |
| A52R forward 5’-ATAGGATTGTGTGCATGC-3’ | Sigma | PCR primer | |
| A52R reverse 5’-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3’ | Sigma | PCR primer | |
| RFP forward 5’- GCTACCGGACTCAGATCCA-3’ | Sigma | PCR primer | |
| RFP reverse 5’-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3’ | Sigma | PCR primer | |
| Argarose | A7431 | Sigma | resolve PCR product |
| G:BOX F3 | G:BOX F3 | Syngene | UV gel doc |
References
- Baroudy, B. M., Venkatesan, S., Moss, B. Incompletely base-paired flip-flop terminal loops link the two DNA strands of the vaccinia virus genome into one uninterrupted polynucleotide chain. Cell. 28, 315-324 (1982).
- Madigan, M. T., Martinko, J. M., Parker, J., Brock, T. D. Brock biology of microorganisms, 9th edn. , Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. (2000).
- Cooney, E. L., et al. Safety of and immunological response to a recombinant vaccinia virus vaccine expressing HIV envelope glycoprotein. Lancet. 337, 567-572 (1991).
- Mackett, M., Yilma, T., Rose, J. K., Moss, B. Vaccinia virus recombinants: expression of VSV genes and protective immunization of mice and cattle. Science. 227, 433-435 (1985).
- Legrand, F. A., et al. Induction of potent humoral and cell-mediated immune responses by attenuated vaccinia virus vectors with deleted serpin genes. J Virol. 78, 2770-2779 (2004).
- Panicali, D., Davis, S. W., Weinberg, R. L., Paoletti, E. Construction of live vaccines by using genetically engineered poxviruses: biological activity of recombinant vaccinia virus expressing influenza virus hemagglutinin. Proc Natl Acad Sci. 80, 5364-5368 (1983).
- Wiktor, T. J., et al. Protection from rabies by a vaccinia virus recombinant containing the rabies virus glycoprotein gene. Proc Natl Acad Sci. 81, 7194-7198 (1984).
- Gallucci, S., Matzinger, P. Danger signals: SOS to the immune system. Curr Opin Immunol. 13, 114-119 (2001).
- Matzinger, P. The danger model: a renewed sense of self. Science. 296, 301-305 (2002).
- Guo, Z. S., Bartlett, D. L. Vaccinia as a vector for gene delivery. Expert Opin Biol Ther. 4, 901-917 (2004).
- Kwak, H., Horig, H., Kaufman, H. L. Poxviruses as vectors for cancer immunotherapy. Curr Opin Drug Discov Devel. 6, 161-168 (2003).
- Tysome, J. R., et al. Lister strain of vaccinia virus armed with endostatin-angiostatin fusion gene as a novel therapeutic agent for human pancreatic cancer. Gene Ther. 16, 1223-1233 (2009).
- Kirn, D. H., Wang, Y., Liang, W., Contag, C. H., Thorne, S. H. Enhancing poxvirus oncolytic effects through increased spread and immune evasion. Cancer Res. 68, 2071-2075 (2008).
- Park, B. H., et al. Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial. Lancet Oncol. 9, 533-542 (2008).
- Panicali, D., Paoletti, E. Construction of poxviruses as cloning vectors: insertion of the thymidine kinase gene from herpes simplex virus into the DNA of infectious vaccinia virus. Proc Natl Acad Sci. 79, 4927-4931 (1982).
- Ball, L. A. High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA. J Virol. 61, 1788-1795 (1987).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Mol Cell Biol. 14, 8096-8106 (1994).
- Jansen, R., Embden, J. D., Gaastra, W., Schouls, L. M. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol. 43, 1565-1575 (2002).
- Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321, 960-964 (2008).
- van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes. Trends Biochem Sci. 34, 401-407 (2009).
- Jinek, M., et al. Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation. Science. 343, 1247997 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Bi, Y., et al. High-efficiency targeted editing of large viral genomes by RNA-guided nucleases. PLoS Pathog. 10, 1004090 (2014).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Yang, L., et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Res. 41, 9049-9061 (2013).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31, 827-832 (2013).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
- Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156, 836-843 (2014).
- Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. 32, 551-553 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Ma, Y., et al. Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9. Cell Res. 24, 122-125 (2014).
- Yuan, M., et al. Efficiently editing the vaccinia virus genome by using the CRISPR-Cas9 system. J Virol. 89, 5176-5179 (2015).
- Yuan, M., et al. A marker-free system for highly efficient construction of vaccinia virus vectors using CRISPR Cas9. Mol Ther Methods Clin Dev. 2, 15035 (2015).
- Merchlinsky, M., Moss, B. Introduction of foreign DNA into the vaccinia virus genome by in vitro ligation: recombination-independent selectable cloning vectors. Virology. 190, 522-526 (1992).
- Timiryasova, T. M., Chen, B., Fodor, N., Fodor, I. Construction of recombinant vaccinia viruses using PUV-inactivated virus as a helper. Biotechniques. 31, 534-540 (2001).
- Johnson, R. D., Jasin, M. Double-strand-break-induced homologous recombination in mammalian cells. Biochem Soc Trans. 29, 196-201 (2001).
