Summary
فيروس جدري (VV) وقد استخدم على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية وتحسين صحة الإنسان. توضح هذه المقالة طريقة بسيطة وفعالة للغاية لتحرير الجينوم VV باستخدام نظام كريسبر-Cas9.
Introduction
فيروس جدري (VV) هو فيروس الحمض النووي يلفها عائلة الفيروسة الجدرية وقد لعبت دورا حاسما في واحدة من أعظم الإنجازات في مجال الطب من القضاء على مرض الجدري. في مرحلة ما بعد الاستئصال من مرض الجدري، وقد وضعت VV كناقل لإيصال الجينات لقاحات ضد فيروس نقص المناعة البشرية والأمراض المعدية الأخرى 1-7 عن طريق إدخال جينات من مختلف مسببات الأمراض في ناقلات VV. كما تم استخدامها على نطاق واسع VV كناقل للسرطان العلاج المناعي 8-14 خاصة لتطوير فيروس جدري حال الورم تكرار استهداف الورم. من أجل خلق متجه لقاح فعال مع تحسين الانتقائية لخلايا السرطان، ويطلب تعديلات داخل الجينوم الفيروسي، بما في ذلك الحذف الجينات أو إدخال الجينات العلاجية.
مع تطور تكنولوجيا الحمض النووي والتوصل إلى فهم أفضل لعلم الأحياء الجزيئية وعلم الفيروسات وإدخال دنا غريب في VV تم تحقيق أصلاد باستخدام إعادة التركيب مثلي (HR) في 1980s 15. هذه الطريقة لا تزال تستخدم على نطاق واسع لبناء ناقلات VV. ويتحقق مقدمة من التعديل الوراثي باستخدام ناقلات المكوك للموارد البشرية، والذي يعيد توحيد مع الجينوم VV في الخلايا المصابة مسبقا. ومع ذلك، فقد أثبتت هذه الطريقة أن تكون فعالة للغاية (أقل من 1٪ كفاءة إعادة التركيب مثلي 16) وغالبا ما يؤدي إلى الإدراج عشوائية من علامة التحديد في المناطق و / أو فقدان علامة على التوسع فيروس غير المستهدفة.
كفاءة من الحمض النووي إعادة التركيب مثلي لإدخال الحمض النووي الخارجية في مواضع الجيني يمكن أن تتعزز بشكل كبير في وجود فواصل مزدوج الجديلة (DSBs) 17. ولذلك، فإن التكنولوجيا التي يمكن أن تحدث DSBs في مواضع الهدف يحمل إمكانات كبيرة للهندسة الجينات من VV.
ويبين النظام كريسبر-Cas9 وضعت مؤخرا الوعد لتحريك DSBs في أي منطقة VV الجينات. كريسبر-Cas9 هو RNA-نوكلياز الموجهة تشارك في المناعة التكيفية ضد غزو فاجات والمواد الوراثية الأجنبية الأخرى 18-20. هناك ثلاثة أنظمة كريسبر-CAS في مجموعة من الأنواع الميكروبية 21. ويستخدم على نطاق واسع في نظام كريسبر-كاس من النوع الثاني لتحرير جينوم الخلايا حقيقية النواة والفيروسات كبيرة. وهو يتألف من Cas9 نوكلياز داخلية موجهة RNA (من المكورات العقدية المقيحة)، الحمض النووي الريبي واحد دليل (sgRNA) وcrRNA تفعيل عبر (tracrRNA) 22-24. يعترف المجمع Cas9 / sgRNA ومكملة 20 النوكليوتيدات الجيني تسلسل السابقة سلسلة 5'-NGG-3 "Protospacer عزر المجاور (PAM) في خلايا الثدييات 22 و 23. وقد تم استخدامه بنجاح لتوليد فعالية الخلايا المعدلة وراثيا، والفيروسات والنماذج الحيوانية 22-32.
وقد ثبت أن نظام كريسبر-Cas9 أن تكون أداة فعالة لجينوم تستهدف في تركيبة مع إعادة التركيب مثلي في سيتوبلازم الخلية VV إصابة CV-1الصورة لتوليد فيروسات جدري متحولة 33، 34. من أجل توسيع إمكانية تطبيق هذه الطريقة، ونحن تقديم معلومات مفصلة حول منهجية هذا النظام. بروتوكول صفها يمكن استخدامها لإنشاء VV متحولة مع حذف جينات معينة و / أو تسليح الفيروس متحولة مع التحوير العلاجية.
Protocol
1. إعداد الهدف RNA وCas9 التركيبات وإصلاح ناقلات المانحة
- استنساخ gRNAs
- تصميم الهدف تسلسل دليل الحمض النووي الريبي استهداف الجين N1L من فيروس جدري وفقا لمبدأ ذكر سابقا 25. محاذاة تسلسل الهدف دليل الحمض النووي الريبي ضد جينوم فيروس جدري (في هذه الحالة، ليستر سلالة من فيروس جدري) لاستبعاد أي تسلسل gRNA الهدف بعيدا عن الهدف.
- تجميع واستنساخ oligos gRNA في ناقلات الاستنساخ gRNA كما هو موضح سابقا 25. تأكيد تسلسل كل gRNA فرد في ناقلات الناجم عن سانجر تسلسل 33. اسم gRNA مما أدى بناء كما gRNA N2 33.
ملاحظة: الموقع المستهدف gRNA ضمن الجينات N1L، وليس في المنطقة بين الذراع الأيسر والذراع اليمنى أن إصلاح المانحة ناقلات تغطية (انظر الشكل 1).
- استنساخ الجين Cas9 تفتقر إلى إشارة توطين النووية (NLS) فيناقلات pST1374 وتعيين بناء كما PST-Cas9 33.
ملاحظة: أي الثدييات التعبير استنساخ ناقلات يمكن استخدامها لبناء ناقلات التعبير Cas9. - بناء ناقلات إصلاح المانحة للموارد البشرية
- استخدام الجينات N1L من VV باسم المنطقة المستهدفة لتعديل 33. تأكد من أن أطوال الأسلحة اليسار واليمين حوالي 500-600 نقطة أساس لكل منهما، وتطوق المنطقة المستهدفة.
ملاحظة: ذراع / يمين الذراع الأيسر يمكن أن يصل إلى 50 التداخل بي بي مع المنطقة المستهدفة (انظر الشكل 1). - استنساخ إصلاح المنطقة ناقلات المانحة N1L كما هو موضح سابقا 33 و 34 و تعيين ناقلات المانحة الإصلاح، PT-N1L.
ملاحظة: انظر الشكل رقم 1 لناقلات إصلاح المانحة والمنطقة المستهدفة. قد تكون مستهدفة مناطق أخرى من VV باستخدام المنطقة (الجينات) -specific gRNA (ق) وناقلات إصلاح المانحة الخاصة بكل منطقة. أي ناقلات الاستنساخ يمكن استخدامها لبناء ناقلات إصلاح المانحة. </ رأ>
- استخدام الجينات N1L من VV باسم المنطقة المستهدفة لتعديل 33. تأكد من أن أطوال الأسلحة اليسار واليمين حوالي 500-600 نقطة أساس لكل منهما، وتطوق المنطقة المستهدفة.
- التوسع البلازميد
- تحويل البلازميد إلى E. المختصة كيميائيا القولونية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تنقية البلازميد باستخدام طقم استخراج البلازميد في اشارة الى توفيره من قبل الشركة المصنعة للبروتوكول.
2. خلايا البذر (يوم 1)
- الحفاظ على CV-1 الخلايا (الخلايا الليفية قرد الكلى) في Dulbecco لتعديل المتوسطة النسر (DMEM) تستكمل مع المصل 5٪ بقري جنيني (FBS)، و 100 البنسلين U / مل، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
- يعرض للتريبسين CV-1 الخلايا التي هي 80-90٪ متكدسة
- إزالة مستنبت خلايا من القارورة T-175 التي تحتوي على CV-1 الخلايا. شطف أحادي الطبقة مع 5 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة لإزالة المصل المتبقي ونضح برنامج تلفزيوني. إضافة 2.5 مل من محلول 1 × التربسين-EDTA لتغطية الخلايا ووضع القارورة في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق تقريبا لمساعدة مفرزة الخلية.
- إضافة10 مل من مستنبت الخلية (راجع الخطوة 2.1) تعليق الخلايا عن طريق العمل ماصة لطيف. إحصاء عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
- بذر خلايا في 6 لوحات جيدا
- البذور 2 × 10 5 CV-1 الخلايا في 2 مل من مستنبت خلية في كل بئر من لوحة 6 جيدا قبل يوم واحد ترنسفكأيشن.
ملاحظة: خطوة الطرد المركزي إضافية لإزالة التربسين غير مطلوب.
- البذور 2 × 10 5 CV-1 الخلايا في 2 مل من مستنبت خلية في كل بئر من لوحة 6 جيدا قبل يوم واحد ترنسفكأيشن.
3. ترنسفكأيشن من Cas9 البلازميد وgRNA البلازميد (يوم 2)
- Transfect CV-1 خلايا (المعد في خطوة 2.2.3.1) مع 0.5 ميكروغرام PST-Cas9 البلازميد و 0.5 ميكروغرام البلازميد gRNA N2 باستخدام كاشف ترنسفكأيشن وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في حاضنة (37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2)، ثم قم باستبدال متوسطة مع 2 مل من جديد خلية ثقافة المتوسط (كما هو موضح في الخطوة 2.1).
4. العدوى من CV-1 خلايا والمكوك المانحة الخامسector ترنسفكأيشن للموارد البشرية (يوم 3)
- تمييع العمود الفقري VVL15 فيروس مع DMEM مستنبت الخلية إلى تركيز 2 × 10 5 PFU / مل. 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن من Cas9 وgRNA البلازميدات، إضافة 100 ميكرولتر من الفيروس المخفف في كل بئر من الخلايا CV-1 transfected.
- 2 ح إصابة آخر الفيروسات، transfect 1.0 ميكروغرام ناقلات المانحة المكوك إلى الخلايا المصابة VVL15 للموارد البشرية باستخدام كاشف ترنسفكأيشن وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. وضع الخلايا transfected في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة.
5. الحصاد الفيروس المؤتلف (يوم 4)
- بعد 24 ساعة من ترنسفكأيشن مع ناقلات المانحة المكوكية للموارد البشرية في الخطوة 4.2، فصل transfected خلايا CV-1 باستخدام مكشطة الخلية. جمع تعليق خلية إلى cryovial وتخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
ملاحظة: تمحو أي تسرب زراعة الخلايا المتوسطة مع مطهر فورا ثم امسح مرة أخرى مع إيثان 70٪رأ.
6. تنقية للVV التعديل (الجولة الأولى)
- في يوم 1، البذور 15 6 لوحات بشكل جيد مع 3 × 10 5 CV-1 الخلايا في كل بئر.
- في يوم 2، ذوبان الجليد تعليق خلية مجمدة من الخطوة 5.1 في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ودوامة cryovials بقوة لمدة 30 ثانية للحصول على الخلايا المحللة دون إزالة الحطام الخلية.
- لإصابة واحدة لوحة 6 جيدا من CV-1 الخلايا، وتمييع 1 ميكرولتر من المحللة الخلية مع 3 مل من DMEM وإضافة 0.5 مل من المحللة خلية المخفف في كل بئر من لوحة 6 جيدا، على رأس وسائل الإعلام بالفعل حاضر. تصيب كل 6 لوحات جيدا أعدت في الخطوة 6.1.
ملاحظة: لا يلزم إزالة الحطام الخلية. - بعد يومين من الإصابة (أي في يوم 4)، وتحديد ويحات طلب تقديم العروض الايجابية تحت المجهر مضان باستخدام 10X عدسة موضوعية وتسمية لويحات تحت لوحة باستخدام القلم علامة بوضع دائرة حول موقع البلاك.
ملاحظة: انظر- إعداد ستة cryovials المسمى تحتوي على 200 ميكرولتر المصل خالية DMEM مستنبت خلايا لالتقاط ستة ويحات طلب تقديم العروض الايجابية المختلفة. نضح مستنبت الخلية من البئر مع لوحة المسمى (ق) (الخطوة 6.3). إرفاق غيض 200 ميكرولتر إلى ماصة P200، ضبط مستوى الصوت في 30 ميكرولتر واتخاذ ~ 10 ميكرولتر مستنبت الخلية من cryovial واحد.
- الاستمرار على زر ماصة دفع دون الإفراج المتوسط واستخدام معلومات سرية الى نقطة الصفر في منطقة البلاك المسمى واحد. حرر زر ماصة دفع لرفع خلايا منفصلة وتحويلها إلى cryovial تحتوي على 190 ميكرولتر من DMEM المصل خالية.
- تتخذ وسيلة أخرى 10 ميكرولتر من القارورة مع خلايا خدش (من الخطوة الأخيرة) وكرر الإجراء من التقاط نفس-طلب تقديم العروض الايجابية البلاك ثلاث مرات لجمع أكبر عدد ممكن من خلايا خدش ممكن. نقل جميع الخلايا في نفس القارورة وتخزين القارورة في -80 درجة مئوية.
7. تنقية للVV التعديل (الجولة الثانية)
- البذور 3 × 10 5 CV-1 الخلايا في كل بئر من ستة 6 لوحات جيدا وثقافة الخلايا لمدة 24 ساعة.
- ذوبان الجليد في cryovials المجمدة (من الخطوة 6.3.3) في 37 ° C حمام الماء لمدة 3 دقائق، ثم دوامة cryovials بقوة لمدة 30 ثانية للحصول على المحللة الخلية.
- إضافة 0.5 ميكرولتر من المحللة خلية المختلط إلى جانب واحد من لوحة 6 جيدا. إصابة واحدة لوحة 6 جيدا لكل لوحة. احتضان المصابين VV-6 لوحات جيدا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 ل 2 أيام (الثانية تنقية البلاك إيابا). ثم كرر القسم 6.3.
ملاحظة: أكثر من ستة ويحات طلب تقديم العروض إيجابي يمكن التقاطها. اثنين أو أكثر من 6 لوحات بشكل جيد يمكن أن تستخدم لتنقية كل لوحة.
- إضافة 0.5 ميكرولتر من المحللة خلية المختلط إلى جانب واحد من لوحة 6 جيدا. إصابة واحدة لوحة 6 جيدا لكل لوحة. احتضان المصابين VV-6 لوحات جيدا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 ل 2 أيام (الثانية تنقية البلاك إيابا). ثم كرر القسم 6.3.
8. جولات أخرى من اللوحة بوريfication
- الاستمرار في المزيد من ثلاث إلى خمس جولات من تنقية باتباع نفس البروتوكول هو موضح في الخطوة 7 حتى تظهر كافة اللوحات التي تشكلت من لوحة إيجابية واحدة ليكون بين طلب تقديم العروض الايجابية تحت المجهر.
ملاحظة: تعتبر هذه اللوحة ثم نقية. - وبمجرد أن اللوحة هي نقية (الشكل 4، وجميع الخلايا المصابة معربا عن طلب تقديم العروض)، حصاد لوحة إيجابية في cryovial ومخزن في -80 درجة مئوية كما هو موضح في القسم 6.3. تحقق من لوحة بعد بروتوكول هو موضح في الخطوة 9 و 10.
9. توسيع تنقية اللوحة (الصورة)
- البذور 3 × 10 5 CV-1 الخلايا في كل بئر من لوحة 6 جيدا قبل يوم واحد عدوى الفيروس.
- ذوبان الجليد في cryovial المجمدة من 8.2 في 37 ° C حمام الماء لمدة 3 دقائق للحصول على المحللة الخلية. إضافة كافة المحللة (دون إزالة الحطام الخلية) إلى جانب واحد من لوحة 6 جيدا من CV-1 الخلايا (المصنف في الخطوة 9.1). احتضان المصابين CV-1 الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة تصل إلى 3 أيام.
- توسيع كافة ويحات النقاء (ثلاثة على الأقل لويحات).
ملاحظة: الساعة الإصابة يختلف من 1-3 أيام اعتمادا على كمية الفيروس في المحللة.
- توسيع كافة ويحات النقاء (ثلاثة على الأقل لويحات).
- حصاد الخلايا المصابة VV باستخدام مكشطة الخلية عندما يظهر أكثر من 50٪ خلايا تأثير الاستسلامي لاحظ تحت المجهر (يتم تقريب الخلايا، منفصلة بسهولة وطلب تقديم العروض إيجابية). جمع خلايا منفصلة مع مستنبت الخلية في أنبوب 15 مل.
- بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 غ لمدة 3 دقائق. إزالة طاف والحفاظ على بيليه خلية في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى أو استخدام بيليه الخلية مباشرة للخطوة 10.
10. التحقق من تعديل المسخ VV باستخدام PCR
- استخراج VV من الحمض النووي للخلية بيليه أعدت في الخطوة 9.3.1 استخدام عدة استخراج الحمض النووي بعد بروتوكول الشركة المصنعة. أزل الحمض النووي مع 200 ميليلتر من الماء المقطر المزدوج.
ملاحظة: استخدم نصف حجم بيليه لاستخراج الحمض النووي والحفاظ على ما تبقى لإنتاج الفيروسي إذا تم التحقق من استنساخ كما تحتوي على التعديل الصحيح / الإدراج. - التحقق من الحذف من الجينات N1L وإدخال الجين RFP في المنطقة N1L.
- تضخيم جزء الحمض النووي تمتد الجين N1L (L025) والجين L026 باستخدام بادئات مصممة ضد الجين N1L. تضخيم الجين طلب تقديم العروض باستخدام بادئات -specific طلب تقديم العروض. تضخيم جزء تحكم الحمض النووي تمتد A52R بواسطة PCR باستخدام بادئات-A52R محددة.
ملاحظة: انظر قائمة مواد الاشعال محددة.- أداء PCR باستخدام PCR عدة مزيج الرئيسي. إعداد 25 ميكرولتر من رد فعل PCR باستخدام 2 ميكرولتر من قالب الحمض النووي، وتفسد تفاعل PCR في 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، ثم قم بتشغيل 30 دورات PCR باتباع الخطوات التالية: تفسد الحمض النووي في 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، ثم يصلب الاشعال لقوالب الحمض النووي في 52 درجة مئوية لمدة 15 ثانية تمتد تفاعل PCR عند 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
- تضخيم جزء الحمض النووي تمتد الجين N1L (L025) والجين L026 باستخدام بادئات مصممة ضد الجين N1L. تضخيم الجين طلب تقديم العروض باستخدام بادئات -specific طلب تقديم العروض. تضخيم جزء تحكم الحمض النووي تمتد A52R بواسطة PCR باستخدام بادئات-A52R محددة.
- حل المنتجات PCR باستخدام الاغاروز هلام 1٪ 33. التقاط صورة هلام باستخدام وثيقة هلام الأشعة فوق البنفسجية. إذا كان N1L PCR هو سلبي وA52R وطلب تقديم العروض تقارير إنجاز المشروعات إيجابية، ثم اللوحة يتم تعديل بشكل صحيح في المنطقة N1L.
Representative Results
لبناء ناقلات VV الجديد، ونقطة الانطلاق الرئيسية في تصميم وبناء ناقلات المكوك المانحة التي يمكن أن تستهدف منطقة معينة من الجينوم. في هذه الدراسة، تم استخدام الجينات VV N1L كمثال الهدف. وتظهر الكاسيت من ناقلات المكوك المانحة لإعادة التركيب والمنطقة المستهدفة في VV في الشكل 1. ومن أجل تعزيز كفاءة إعادة التركيب مثلي، البلازميدات معربا عن Cas9 وgRNA N1L محددة وشارك في transfected في السيرة الذاتية -1 خلايا 48 ساعة قبل إجراء إعادة التركيب مثلي 33. ، وأعرب عن يوم واحد (24 ساعة) بعد ترنسفكأيشن طلب تقديم العروض في الخلايا CV-1 (الشكل 2). بعد إصابة CV-1 الخلايا التي تحتوي على المحللة كله من إعادة التركيب مثلي (الخطوة 5)، طلب تقديم العروض إيجابية وسلبية لويحات كانت كل لوحظ في الخلايا CV-1 (الشكل 3). بعد بروتوكول تنقية وصفها، لوحة شارك النقي يونيتبول الحصول عليها بعد 3-5 جولات من تنقية. كما هو مبين في الشكل (4)، قدمت كل ويحات بعد الإصابة مع المحللة خلية مشتقة من لوحة نقية مع فيروس جدري متحولة إشارة طلب تقديم العروض. للتحقق ما إذا كانت متحولة النقي كان VV تعديل الجين الصحيح، تم استخدام PCR لتأكيد عدم وجود الجين N1L المستهدفة، كما هو مبين في الشكل (5). أظهرت PCR للفيروس تعديل إشارة إيجابية لطلب تقديم العروض وإشارة غائبة عن N1L ( الرقم 5 حارة AG)، في حين أن نتائج PCR من N1L للفيروس السيطرة الظهور مع منطقة N1L سليمة إيجابية. وكانت شظايا السيطرة الحمض النووي من A52R إيجابية لجميع فيروسات المؤتلف وفيروس لحد من الخطر. كفاءة الموارد البشرية في ويحات طلب تقديم العروض إيجابي بنسبة 100٪ (6/6) في هذه التجربة (كان يصل إلى 94٪ في الأعمال السابقة 34). وقد تحسنت الطريقة الموصوفة هنا وكفاءة إعادة التركيب من قبل أكثر من 100 أضعاف مقارنة مع البروتوكولات التقليدية 33، 34.
محتوى "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 ">
الشكل 1: كاسيت من ناقلات المكوك المانحة لإعادة التركيب مثلي، والمنطقة المستهدفة في الجينوم VV هو الدافع وراء طلب تقديم العروض علامة الجينات تنقية من قبل المروج H5. متجه إصلاح المانحة استهداف النتائج المنطقة N1L في الجين طلب تقديم العروض التي يتم إدخالها في المنطقة N1L بعد إعادة التركيب مثلي. 'X' يشير إلى تسلسل مثلي في ناقلات المانحة إصلاح التي من شأنها أن تحل محل نفس تسلسل الجينوم على فيروس جدري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تصوير-CV 1 خلايا يوم واحد بعد إعادة التركيب مثلي يوم واحد بعد عملية الشراءص إعادة التركيب مثلي، والخلايا المصابة مع VV وtransfected بواسطة ناقلات المانحة إصلاح هي من طلب تقديم العروض الايجابية ج: صورة المرحلة النقيض (الأصلي التكبير 100X) B: صورة مضان المجهر (الأصلي التكبير 100X). شريط النطاق = 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): درع-طلب تقديم العروض الايجابية في أول تنقية الجولة من الفيروس متحولة في تنقية الجولة الأولى من الطور للفيروس، ويحيط اللوحة-طلب تقديم العروض الايجابية (دائري مع الخط الأحمر) مع حذف المنطقة المستهدفة من قبل لويحات التي شكلتها الفيروس البري نوع (دائري مع الخط الأصفر) ج: صورة المرحلة النقيض (الأصلي التكبير 100X) ب: الإسفار ميكرصورة oscopy (الأصلي التكبير 100X). شريط النطاق = 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وكان متحولة النقي VV بعد 3-5 جولات من تنقية، تم الحصول على لويحات النقي، وجميع لويحات طلب تقديم العروض بفيروس A:: الشكل 4. صورة المرحلة النقيض (الأصلي التكبير 100X) B: صورة مضان المجهر (الأصلي التكبير 100X) . شريط النطاق = 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: Verificatioن من محض متحولة VV. تم استخراج من VV الحمض النووي إصابة CV-1 الخلايا. حذف المنطقة المستهدفة تم التحقق N1L بواسطة PCR باستخدام بادئات N1L، وأكد على ادراج طلب تقديم العروض في المنطقة N1L بواسطة PCR باستخدام بادئات طلب تقديم العروض. الممرات AF تتوافق مع ستة لويحات النقاء، حارة G هو لوحة التحكم مع N1L حذف التحقق في عمل سابق 33، حارة لحد من الخطر (مراقبة) هو نوع الفيروس جدري البرية (مع المنطقة N1L سليمة). تم تضخيمه A52R الجينات مثل الجينات التحكم لجميع العينات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
هناك نوعان من الأهداف الرئيسية بشأن تعديل VV لأغراض علاجية. واحد هو لحذف جينات معينة، مثل الجين ثيميدين كيناز (TK) للتخفيف فيروس للاستخدام العلاجي المضادة للورم. والآخر هو لتسليح VV مع الجين المطلوب العلاجية (مثل GM-CSF) أو الجين علامة (مثل الجينات وسيفيراز). تحقيق أي من هذه ينطوي على حذف منطقة الهدف / الجينات. وقد تم استخدام الحمض النووي المباشر طريقة ربط 35 وفي المختبر طريقة التعبئة والتغليف 36 سابقا لتوليد فيروسات جدري متحولة مع التعديلات TK الجينات. ومع ذلك، وهذه الأساليب قد حدت تطبيق فيما يتعلق طفرة في مناطق أخرى في الجينوم نظرا لعدم وجود مواقع الانزيم تقييد فريدة من نوعها عبر الجينوم. النهج الحالي لخلق VV متحولة يتضمن ترنسفكأيشن من ناقلات المكوك (المانحة) مع علامة الاختيار (طلب تقديم العروض أو GFP) في CV-1 الخلايا بعد ساعتين الإصابة بفيروس VV للحث على incorporati إعادة التركيب مثلينانوغرام علامة اختيار في المنطقة المستهدفة. ويتبع اختيار ويحات علامة إيجابية من قبل على تنقية 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن. عملية تنقية لوحة يمكن أن تصل إلى 10 طلقة، 3-4 أسابيع الماضية، وغالبا ما يؤدي إلى فيروسات المؤتلف غير مرغوب فيها مع علامات اختيار إدراجها في المناطق بعيدا عن الهدف. يمكن أن الحمض النووي فواصل مزدوج الجديلة تحفز على نحو فعال إعادة التركيب مثلي في خلايا الثدييات 37، وتسخير هذه الآلية، وكفاءة توليد VV متحولة يمكن تحسينها بشكل كبير. وقد تم استخدام نظام Cas9 gRNA الموجهة بنجاح في تحرير الجينوم، ويعزز من كفاءة إعادة التركيب مثلي في الكائنات حقيقية النواة 22 و 25. وفي الآونة الأخيرة، في الخلايا المضيفة جينومات اتش والنوع الأول تم تحريرها فيروس الهربس البسيط من قبل Cas9 الموجهة gRNA- نظام 24 ساعة. وقد ثبت مؤخرا أن نظام كريسبر Cas9 هو أداة قوية لتحرير بكفاءة الجينوم VV وبناء ناقلات VV للتعبير عنجين معين.
أدى كل من Cas9 الموجهة gRNA-N1L والطريقة التقليدية إعادة التركيب مثلي (HR) في أحداث الموارد البشرية الناجحة في نفس الموقع المستهدف من N1L. ومن المثير للاهتمام، ولكن gRNA موجهة Cas9 الموارد البشرية التي يسببها في مستويات أعلى بكثير من كفاءة من الطريقة التقليدية للموارد البشرية. وهكذا، فإن استخدام Cas9 الموجهة gRNA-يلغي الحاجة إلى تنقية العديد من اللوحات للحصول على VVS متحولة. في هذا العمل، ونحن كثيرا في تحسين كفاءة والإطار الزمني لجيل من VV متحولة باستخدام نظام Cas9 الموجهة gRNA-33. وتجدر الإشارة، خطوة واحدة حاسمة للحصول على كفاءة عالية من إعادة التركيب مثلي هي ل transfect CV-1 الخلايا مع البلازميدات معربا عن Cas9 وgRNA لمدة 24 ساعة قبل تنفيذ إعادة التركيب مثلي التقليدية. الفاصل الزمني 24 ساعة يسمح Cas9 وgRNA أن يتم التعبير عند مستوى معقول. وعلاوة على ذلك، قد تكون هناك حاجة إلى أن يكون الأمثل تسلسل gRNA تستهدف جينات معينة كما وجدنا أن gRNA مختلفة تسلسل رargeting N1L الجينات تختلف في فعاليتها 33 و 34.
الحد لكريسبر / Cas9 في VV التحرير هو انخفاض معدل ويحات طلب تقديم العروض الايجابية في الجولة الأولى من إعادة التركيب. للحصول على عدد كاف من ويحات طلب تقديم العروض الايجابية التي تحتوي على الفيروس المؤتلف، وعادة ما لا يقل عن عشرة هناك حاجة إلى 6 لوحات جيدة، مما يجعل الجولة الأولى فحص مملة. وبالتالي، لا يزال هناك حاجة لتحسين بروتوكول للتغلب على هذا القيد.
صغر حجم ويحات طلب تقديم العروض الإيجابي هو مشكلة محتملة أخرى، والذي يرجع إلى ارتفاع حجم المحللة استخدم لإصابة لوحة 6 جيدا. للتغلب على هذا، يجب استخدام أصغر حجم المحللة أن تصيب لوحة 6 جيدا للحصول على أكبر حجم ويحات طلب تقديم العروض الايجابية. وسوف تستخدم حجم أصغر من المحللة أيضا تمكين للانفصال أفضل لويحات طلب تقديم العروض إيجابية من تلك، طلب تقديم العروض السلبي. ونتيجة لذلك هناك حاجة جولات أقل من تنقية البلاك الحصول ويحات طلب تقديم العروض الايجابية نقية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid #41824 | 41824 | Addgene | gRNA cloning vector |
| pST1374 | 13426 | Addgene | Cas9 cloning vector |
| pGEMT easy | A1360 | promega | repair donor vector cloning |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | C4040-10 | Invitrogen | transformation |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | 27106 | Qiagen | plasmid extraction |
| Dulbecco’s Eagle’s Medium (DMEM) | 11965-092 | Life Technologies | cell culture medium |
| fetal bovine serum (FBS) | SH30088.03HI | Hyclone | cell culture serum |
| penicillin, streptomycin | 15070-063 | Thermo Scientific | antibiotics |
| Effectene | 301425 | Qiagen | transfection |
| Thermo Scientific Nalgene Cryogenic vial; 2.0 mL | W-06754-96 | Thermo Scientific | collect virus |
| fluorescence microscope | Olympus BX51 Fluorescence | Olympus | find RFP-positive plque |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | 69506 | Qiagen | DNA extraction |
| Extensor Long PCR ReddyMix Master Mix | AB-0794/B | Thermo Scientific | PCR reagent |
| 10 cm culture dish | Z688819-6EA | sigma | cell culture |
| 6-well plate | Z707759 | sigma | cell culture |
| cell scraper | C5981 | sigma | scrap cells |
| 1x Trypsin-EDTA solution | T4299 | sigma | trypsinize cells |
| Virkon | 95015661 | Anachem Ltd | desinfectant |
| Falcon tube | CLS430791-500EA | Sigma | hold cell suspension |
| N1L forward 5’-TATCTAGCAATGGACCGT-3’ | Sigma | PCR primer | |
| N1L reverse 5’-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3' | Sigma | PCR primer | |
| A52R forward 5’-ATAGGATTGTGTGCATGC-3’ | Sigma | PCR primer | |
| A52R reverse 5’-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3’ | Sigma | PCR primer | |
| RFP forward 5’- GCTACCGGACTCAGATCCA-3’ | Sigma | PCR primer | |
| RFP reverse 5’-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3’ | Sigma | PCR primer | |
| Argarose | A7431 | Sigma | resolve PCR product |
| G:BOX F3 | G:BOX F3 | Syngene | UV gel doc |
References
- Baroudy, B. M., Venkatesan, S., Moss, B. Incompletely base-paired flip-flop terminal loops link the two DNA strands of the vaccinia virus genome into one uninterrupted polynucleotide chain. Cell. 28, 315-324 (1982).
- Madigan, M. T., Martinko, J. M., Parker, J., Brock, T. D. Brock biology of microorganisms, 9th edn. , Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. (2000).
- Cooney, E. L., et al. Safety of and immunological response to a recombinant vaccinia virus vaccine expressing HIV envelope glycoprotein. Lancet. 337, 567-572 (1991).
- Mackett, M., Yilma, T., Rose, J. K., Moss, B. Vaccinia virus recombinants: expression of VSV genes and protective immunization of mice and cattle. Science. 227, 433-435 (1985).
- Legrand, F. A., et al. Induction of potent humoral and cell-mediated immune responses by attenuated vaccinia virus vectors with deleted serpin genes. J Virol. 78, 2770-2779 (2004).
- Panicali, D., Davis, S. W., Weinberg, R. L., Paoletti, E. Construction of live vaccines by using genetically engineered poxviruses: biological activity of recombinant vaccinia virus expressing influenza virus hemagglutinin. Proc Natl Acad Sci. 80, 5364-5368 (1983).
- Wiktor, T. J., et al. Protection from rabies by a vaccinia virus recombinant containing the rabies virus glycoprotein gene. Proc Natl Acad Sci. 81, 7194-7198 (1984).
- Gallucci, S., Matzinger, P. Danger signals: SOS to the immune system. Curr Opin Immunol. 13, 114-119 (2001).
- Matzinger, P. The danger model: a renewed sense of self. Science. 296, 301-305 (2002).
- Guo, Z. S., Bartlett, D. L. Vaccinia as a vector for gene delivery. Expert Opin Biol Ther. 4, 901-917 (2004).
- Kwak, H., Horig, H., Kaufman, H. L. Poxviruses as vectors for cancer immunotherapy. Curr Opin Drug Discov Devel. 6, 161-168 (2003).
- Tysome, J. R., et al. Lister strain of vaccinia virus armed with endostatin-angiostatin fusion gene as a novel therapeutic agent for human pancreatic cancer. Gene Ther. 16, 1223-1233 (2009).
- Kirn, D. H., Wang, Y., Liang, W., Contag, C. H., Thorne, S. H. Enhancing poxvirus oncolytic effects through increased spread and immune evasion. Cancer Res. 68, 2071-2075 (2008).
- Park, B. H., et al. Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial. Lancet Oncol. 9, 533-542 (2008).
- Panicali, D., Paoletti, E. Construction of poxviruses as cloning vectors: insertion of the thymidine kinase gene from herpes simplex virus into the DNA of infectious vaccinia virus. Proc Natl Acad Sci. 79, 4927-4931 (1982).
- Ball, L. A. High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA. J Virol. 61, 1788-1795 (1987).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Mol Cell Biol. 14, 8096-8106 (1994).
- Jansen, R., Embden, J. D., Gaastra, W., Schouls, L. M. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol. 43, 1565-1575 (2002).
- Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321, 960-964 (2008).
- van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes. Trends Biochem Sci. 34, 401-407 (2009).
- Jinek, M., et al. Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation. Science. 343, 1247997 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Bi, Y., et al. High-efficiency targeted editing of large viral genomes by RNA-guided nucleases. PLoS Pathog. 10, 1004090 (2014).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Yang, L., et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Res. 41, 9049-9061 (2013).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31, 827-832 (2013).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
- Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156, 836-843 (2014).
- Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. 32, 551-553 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Ma, Y., et al. Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9. Cell Res. 24, 122-125 (2014).
- Yuan, M., et al. Efficiently editing the vaccinia virus genome by using the CRISPR-Cas9 system. J Virol. 89, 5176-5179 (2015).
- Yuan, M., et al. A marker-free system for highly efficient construction of vaccinia virus vectors using CRISPR Cas9. Mol Ther Methods Clin Dev. 2, 15035 (2015).
- Merchlinsky, M., Moss, B. Introduction of foreign DNA into the vaccinia virus genome by in vitro ligation: recombination-independent selectable cloning vectors. Virology. 190, 522-526 (1992).
- Timiryasova, T. M., Chen, B., Fodor, N., Fodor, I. Construction of recombinant vaccinia viruses using PUV-inactivated virus as a helper. Biotechniques. 31, 534-540 (2001).
- Johnson, R. D., Jasin, M. Double-strand-break-induced homologous recombination in mammalian cells. Biochem Soc Trans. 29, 196-201 (2001).
