Summary
Vaccinia virüsü (W), yaygın olarak biyomedikal araştırmalar ve insan sağlığının iyileştirilmesi kullanılmıştır. Bu makalede, bir CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak VV genom düzenlemek için basit, yüksek verimli bir yöntem açıklanır.
Introduction
Vaccinia virüsü (VV) poksvirüs ailesine ait zarflı bir DNA virüsüdür ve çiçek eradikasyon tıpta büyük başarılarından biri çok önemli bir rol oynamıştır. Çiçek sonrası eradikasyon dönemde, VV VV vektörleri içine çeşitli patojenlerden genleri ekleyerek HIV ve diğer bulaşıcı hastalıklara karşı aşılar 1-7 genlerini sunmak için bir vektör olarak geliştirilmiştir. VV Ayrıca, bilhassa, tümör hedefli replike onkolitik vaccinia virüsü geliştirilmesi için kanser immünoterapisi 8-14 için bir vektör olarak kullanılmıştır. kanser hücreleri için geliştirilmiş seçiciliğe sahip etkili bir aşı maddesine vektörü oluşturmak için, viral genom içinde modifikasyonlar geni delesyonu veya terapötik genlerin katılmasıyla da dahil olmak üzere, gerekmektedir.
DNA teknolojisinin gelişmesi ve VV içine moleküler biyoloji ve viroloji, yabancı DNA'nın yerleştirilmesi daha iyi anlaşılması ile başlangıçta elde edildid 1980'lerde 15 homolog rekombinasyon (HR) kullanarak. Bu yöntem hala VV vektörleri oluşturmak için yaygın olarak kullanılan olduğunu. genetik modifikasyon giriş önceden enfekte edilmiş hücrelerde VV genom ile birleşir HR, bir mekik vektörü, kullanılarak elde edilir. Bununla birlikte, bu yöntem, (% 1'den daha az homolog rekombinasyon verimliliği 16) son derece verimsiz olduğu kanıtlanmıştır ve genellikle hedeflenmemiş bölgeler ve / veya virüs genişlemesi üzerine, markör kaybı içine seçim işaretleyicinin rastgele ekleme ile sonuçlanmaktadır.
Genomik lokuslar ekzojen DNA sokulması için DNA homolog rekombinasyon verimliliği önemli ölçüde çift iplikli kırılmalara (DSBs) 17 mevcudiyetinde arttırılabilir. Bu nedenle, hedef lokusların DSBs uyarabilir teknoloji VV genom mühendisliği için büyük bir potansiyele sahiptir.
Son zamanlarda geliştirilen CRISPR-Cas9 sistemin herhangi VV gen bölgesinde DSBs tetiklenmesi için umut vermektedir. CRISPR-Cas9 bir RNA olanişgalci fajlar ve diğer yabancı genetik materyallerin 18-20 karşı adaptif bağışıklık katılan güdümlü nükleaz. Mikrobiyal türlerin 21, bir dizi üç CRISPR-Cas sistemleri vardır. tip II CRISPR-Cas sistemi yaygın ökaryotik hücreler ve büyük virüs genomunu düzenlemek için kullanılır. Bu (Streptococcus pyogenes den), RNA yönlendirmeli Cas9 endonükleaz oluşur tek bir kılavuz RNA (sgRNA) ve trans-aktive edici crRNA (tracrRNA) 22-24. Cas9 / sgRNA kompleks bir memeli hücre 22 5'-NGG-3 'Protospacer bitişik motifi (PAM) sekansı, 23, önceki tamamlayıcı 20 nükleotid genomik dizisini tanır. Başarıyla genetik olarak tadil edilmiş hücreler, virüsler etkin üretimi için kullanılmaktadır ve hayvan modelleri 22-32.
CRISPR-Cas9 sistemi VV sitoplazmasında homolog rekombinasyon ile birlikte hedef genom için etkin bir araç olduğu kanıtlanmıştır CV-1 hücre enfekte olans mutant aşı virüsleri 33, 34 oluşturmak için. Bu yöntemin potansiyel uygulama uzatmak için, biz bu sistemin metodolojisi hakkında detaylı bilgi sunmak. Açıklanan protokol, belirli bir geni delesyonu ile bir mutan VV oluşturmak ve / veya terapötik bir transgen mutant virüs kol için de kullanılabilir.
Protocol
Hedef RNA ve Cas9 Yapıları ve Onarım Donör Vektör 1. Hazırlık
- gRNAs klonlanması
- Daha önce 25 belirtilen prensip aşağıdaki aşı virüsünün N1L genini hedef alan bir kılavuz-RNA hedef dizisi tasarlayın. ineklerdeki çiçek hastalığı virüs genomu karşı kılavuz-RNA hedef sekans hizalama (bu durumda, aşı virüsü Lister suşu) bir hedef dışı gRNA hedef sekanslarını ekarte etmek için.
- Sentezlemek ve daha önce 25 açıklandığı gibi bir gRNA klonlama vektörüne gRNA oligos klonlamak. Sanger dizileme 33 ile sonuçlanan vektör içinde her gRNA sırasını onaylayın. Ortaya çıkan gRNA gRNA N2 33 olarak inşa adlandırın.
NOT: gRNA hedef site N1L geni içinde ve sol kol ve sağ kol arasındaki bölgede olduğu onarım verici vektör kapakları (Şekil 1).
- nükleer lokalizasyon sinyali (NLS) yoksun Cas9 genini klonlamakpST1374 vektör ve PST-Cas9 33 olarak yapı belirleyin.
NOT: herhangi bir memeli sentezleme klonlama vektörü Cas9 sentezleme vektörünün kurulması için kullanılabilir. - HR onarım donör vektörü İnşaatı
- Modifikasyon 33 için hedef bölge olarak VV N1L genini kullanın. sol ve sağ kol uzunlukları yaklaşık 500-600 bp her ve hedef bölgeyi komşu olduğundan emin olun.
NOT: Sol kol / sağ kol hedef bölge ile 50 bp üst üste kadar olabilir (Bakınız Şekil 1). - Daha önce 33, 34 anlatıldığı gibi N1L bölge onarım donör vektör Clone ve pT-N1L olarak onarım donör vektör belirler.
NOT: onarım donör vektörü ve hedef bölge için Şekil 1'e bakınız. VV Diğer bölgeler bölgesi (gen) -özel gRNA (ler) ve bölgeye özgü onarım verici vektörü kullanılarak hedef alınabilir. Herhangi bir klonlama vektörü onarım verici vektör yapımı için kullanılır. </ Ol>
- Modifikasyon 33 için hedef bölge olarak VV N1L genini kullanın. sol ve sağ kol uzunlukları yaklaşık 500-600 bp her ve hedef bölgeyi komşu olduğundan emin olun.
- plasmid genişletilmesi
- Kimyasal olarak, yeterli E. plazmidi Dönüşümü E. coli, üreticinin talimatlarına göre aktifleştirilir. İmalatçı tarafından sağlanan protokole ilişkin bir plazmid ekstraksiyon takımı kullanılarak plazmit saflaştırılır.
2. Tohum Hücreler (Gün 1)
- Bakım CV-1 37 ° C de% 5 fetal sığır serumu (FBS), 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 'de hücreleri (Maymun böbrek fibroblastları),% 5 CO 2.
- % 80-90 konfluent Trypsinize CV-1 hücreleri,
- CV-1 hücreleri ihtiva eden T-175 şişesi hücre kültür ortamı çıkarın. PBS kalan serumu çıkarmak ve aspire steril PBS 5 ml tek tabaka durulayın. hücreleri kapsar ve hücre ayrışması yardımcı olmak için yaklaşık 5 dakika boyunca 37 ° C inkübatör içine yerleştirilir 2.5 ml 1 x tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin.
- EklemekHücre kültür ortamı 10 ml yumuşak bir pipet hareketi ile hücrelerin süspansiyonu (adım 2.1). Bir hemasitometre kullanarak hücre sayıları saymak.
- 6-yuvalı plakalar içinde Hücrelerin Serpilmesi
- 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğuna, hücre kültür ortamı 2 mL tohum 2 x 10 5 CV-1 hücreleri, transfeksiyondan bir gün önce.
Not: tripsin çıkarmak için ek bir santrifüjleme aşaması gerekli değildir.
- 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğuna, hücre kültür ortamı 2 mL tohum 2 x 10 5 CV-1 hücreleri, transfeksiyondan bir gün önce.
Cas9 Plazmid ve gRNA 3. Plasmid transfeksiyonu (Gün 2)
- 0.5 ug PST-Cas9 plasmidi ile ve imalatçının talimatlarına göre bir transfeksiyon ayıracı kullanılarak 0.5 ug gRNA N2 plazmid (adım 2.2.3.1 hazırlandı) Transfect CV-1 hücreleri.
- Bir kuluçka makinesi içinde 24 saat süreyle inkübe hücreleri (37 ° C,% 5 CO2), ve daha sonra (adım 2.1 tarif edilmiştir), taze hücre kültür ortamında 2 mL orta yerine.
CV-1 hücreleri, ve Servis Verici V 4. Enfeksiyonector Transfeksiyon HR (Gün 3)
- 2 x 10 5 pfu / ml'lik bir konsantrasyona kadar DMEM hücre kültür ortamı ile omurgası VVL15 virüsü seyreltilir. Cas9 ve gRNA plasmidlerin 24 saat post-transfeksiyon, transfekte edilmiş CV-1 hücrelerinde, her kuyuya seyreltilmiş virüs, 100 uL ilave edin.
- 2 saat sonra, virüs enfeksiyonu, üreticinin talimatlarına göre bir transfeksiyon ayıracı kullanılarak HR VVL15 enfekte hücrelere 1.0 ug Servisi verici vektör transfekte. 24 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatör transfekte edilmiş hücrelerin yerleştirin.
5. Hasat Rekombinant virüs (Gün 4)
- Adım 4.2 HR mekik donör vektörü ile transfeksiyondan 24 saat sonra bir hücre kazıyıcı kullanarak nakledilen CV-1 hücreleri ayırmak. kriyotüpe içine hücre süspansiyonu toplayın ve gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C'de saklayın.
NOT: derhal dezenfektan ile herhangi bir hücre kültür ortamı Dökülen siliniz ve daha sonra% 70 Ethan ile tekrar silinol.
Modifiye VV 6. saflaştırılması (Birinci Tur)
- 1. günde, her yuva içinde 3 x 10 5 CV-1 hücreleri ile 15 6 oyuklu plakalar tohum.
- 2. günde, 3 dakika boyunca 37 ° C'de bir su banyosu içinde aşama 5.1 dondurulmuş hücre süspansiyonu çözülme ve hücre artıkları çıkarmadan hücre lizatının elde edilmesi için 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde cryovials girdap.
- CV-1 hücreleri, bir 6-yuvalı plaka Enfeksiyon için, DMEM 3 mL hücre lizatının 1 uL seyreltilmiş ve daha önce ortam üzerine, 6 oyuklu plakanın her bir seyreltilmiş hücre lizatı 0.5 mL eklemek mevcut. Adım 6.1 hazırlanan 6-kuyucuğu bulaştırmak.
Not: Hücre kalıntılarının çıkarılması gerekli değildir. - Enfeksiyon iki gün sonra (yani, günde 4), plak konumunu çizerek bir işaretleyici kalem kullanarak plaka altında plaklar 10X objektif lens kullanarak bir floresan mikroskop altında RFP-pozitif plaklar tanımlamak ve etiket.
NOT: Daha- altı farklı RFP pozitif plaklar almak için 200 uL serumsuz DMEM hücre kültür ortamı içeren altı etiketli cryovials hazırlayın. etiketli plaka (lar) (adım 6.3) ile iyice hücre kültür ortamı aspire. Bir P200 pipet 200 uL ucu takın 30 uL seviyesini ayarlamak ve bir cryovial gelen ~ 10 mcL hücre kültür ortamı alır.
- orta bırakmadan pipet itme düğmesini basılı tutun ve bir etiketli plak alan kazımak için ucu kullanın. müstakil hücreleri yukarı kaldırın ve serum serbest DMEM 190 uL içeren cryovial içine aktarmak için pipet itme düğmesini bırakın.
- (Son adımından) çizik hücreleri ile şişeden başka bir 10 uL orta alın ve mümkün olduğunca çok sayıda çizik hücreleri toplamak için aynı RFP-pozitif plak üç kez toplayıp işlemi tekrarlayın. Aynı şişenin içine tüm hücreleri aktarın ve -80 ° C'de şişe saklayın.
Modifiye VV 7. saflaştırılması (İkinci Tur)
- Her birine Tohum 3 x 10 5 CV-1 hücreler, altı 6 oyuklu plakalar ve Kültür 24 saat boyunca hücre.
- 3 dakika için 37 ° C su banyosunda (aşama 6.3.3 arasında) dondurulmuş cryovials çözülme daha sonra hücre lizatı elde etmek için 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde cryovials girdap.
- 6 oyuklu plakanın bir oyuğuna karma hücre lizatının 0.5 uL ekleyin. Her bir plak, bir 6-yuvalı plaka Infect. 2 gün boyunca% 5 CO2 (ikinci devre plak saflaştırma) ile 37 ° C'de VV enfekte 6 oyuklu inkübe edin. Sonra bölüm 6.3 tekrarlayın.
NOT: Daha fazla altı RFP-pozitif plaklar alınabilir; İki ya da daha fazla 6-oyuklu plakalar, her plak saflaştırılması için de kullanılabilir.
- 6 oyuklu plakanın bir oyuğuna karma hücre lizatının 0.5 uL ekleyin. Her bir plak, bir 6-yuvalı plaka Infect. 2 gün boyunca% 5 CO2 (ikinci devre plak saflaştırma) ile 37 ° C'de VV enfekte 6 oyuklu inkübe edin. Sonra bölüm 6.3 tekrarlayın.
Plak Puri 8. Ek turlarSınıflamasına
- bir pozitif plak oluşan tüm plaklar mikroskop altında RFP-pozitif gibi görünen kadar 7. adımda açıklanan aynı protokolü takip arınma daha üç beş tur sürdürmektedir.
Not: Daha sonra bu plak saf olarak kabul edilir. - Plak saf kez bölümde 6.3 anlatıldığı gibi (Şekil 4, RFP ifade tüm enfekte hücreler), -80 ° C'de cryovial ve mağaza içine pozitif plak hasat. Aşama 9 ve 10'da tarif edilen protokol izlenerek plak edin.
9. genişletin Saf Plak (ler)
- Virüs enfeksiyonu önce 6 plaka bir gün her oyuğuna Tohum 3 x 10 5 CV-1 hücreleri.
- Hücre lizatı elde etmek için 3 dakika için bir 37 ° C su banyosu içinde 8.2 dondurulmuş cryovial çözülme. CV-1 hücreleri, 6 gözlü bir plakanın bir kuyuya (hücre kalıntıları çıkarmadan) Tüm lisatı, ekleme (adım 9.1 tohumlanmış). 5 ile 37 ° C 'de enfekte edilmiş CV-1 hücreleri, inkübeEn fazla 3 gün süreyle% CO 2.
- Tüm saflaştırılmış plaklar (en az üç plaklar) genişletin.
NOT: Bu enfeksiyon uzun lizat virüsün miktarına bağlı olarak 1-3 gün arasında değişir.
- Tüm saflaştırılmış plaklar (en az üç plaklar) genişletin.
- % 50'den fazla hücreler mikroskop altında incelendi sitopatik etki gösterirken bir hücre kazıyıcı kullanarak VV-enfekte hücreleri hasat (hücreler kolayca sökülüp ve RFP pozitif yuvarlanır). 15 ml tüp içine hücre kültürü ortamı ile ayrılan hücreler toplanır.
- 3 dakika boyunca 300 g'de santrifüj hücreleri Pelet. Süpernatantı ve daha sonra kullanmak kadar -80 ° C hücre pelletini tutmak veya adım 10 hemen hücre pelet kullanın.
PCR kullanarak Mutant VV Modifikasyonu 10. Doğrulama
- Üreticinin protokolü takip edilerek, bir DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak aşama 9.3.1'de hazırlanan hücre topağından VV DNA ekstrakte edin. iki kez damıtılmış su, 200 uL DNA yıkayın.
NOT: DNA ayıklamak ve klon doğru modifikasyon / ilavesini içeren olarak doğrulandı ise viral üretim için geri kalanı tutmak için pelet hacminin yarısını kullanın. - N1L geninin silme ve N1L bölgeye RFP geninin sokulması doğrulanması.
- N1L gen (L025) ile N1L gen karşı tasarlanan primerler kullanılarak L026 geni kapsayan, bir DNA fragmanını çoğaltmak. RFP-spesifik primerler kullanılarak RFP genini çoğaltmak. A52R-spesifik primerler kullanılarak PCR ile A52R kapsayan bir kontrol DNA fragmanını çoğaltmak.
NOT: spesifik primerler için Malzeme Listesine bakınız.- PCR master miks kiti kullanılarak PCR gerçekleştirin. en fazla 25 uL DNA şablonu 2 uL kullanılarak PCR reaksiyonunun yer alan 2 dakika süre ile 94 ° C 'de, PCR reaksiyonu denatüre ve aşağıdaki adımları PCR 30 döngü çalıştırmak: 15 saniye süreyle 94 ° C' de DNA'yı denatüre ardından tav 15 saniye için 52 ° C 'de, DNA şablonları primerler 30 s için 72 ° C'de PCR reaksiyonunu uzanır.
- N1L gen (L025) ile N1L gen karşı tasarlanan primerler kullanılarak L026 geni kapsayan, bir DNA fragmanını çoğaltmak. RFP-spesifik primerler kullanılarak RFP genini çoğaltmak. A52R-spesifik primerler kullanılarak PCR ile A52R kapsayan bir kontrol DNA fragmanını çoğaltmak.
- Bir% 1 agaroz jeli 33 kullanarak PCR ürünleri giderin. UV jel doc kullanılarak jel görüntü yakalamak. N1L PCR negatif ve A52R ve RFP PCR pozitif iseniz, o plak doğru N1L bölgesinde değiştirilir.
Representative Results
Yeni bir VV vektörünün kurulması için, önemli bir başlangıç noktası tasarım ve genomun belirli bir bölgeyi bir verici mekik vektörü inşa etmektir. Bu çalışmada, VV N1L geni örnek hedef olarak kullanıldı. Rekombinasyon ve VV hedef bölge için donör mekik vektörüne kaset Şekil 1 'de gösterilmektedir., Homolog rekombinasyon etkinliğini artırmak amacıyla, Cas9 ve N1L özgü gRNA ifade eden plasmidler CV birlikte-transfekte edilmiştir homolog rekombinasyon 33 gerçekleştirmeden 48 saat önce -1 hücreleri. Bir gün (24 saat) post-transfeksiyon, RFP CV-1 hücrelerinde (Şekil 2) olarak ifade edildi. Homolog rekombinasyon gelen bütün lizat (aşama 5) CV-1 hücre enfeksiyonundan sonra, pozitif bir TTT-negatif plaklar iki CV-1 hücrelerinde (Şekil 3) tespit edilmiştir. arıtma protokolü tarif ardından, saf bir plak ko arınma 3-5 turdan sonra elde edilebilir uld. Şekil 4'te gösterildiği gibi, mutant vaccinia virüsü ile saf plak türetilen hücre lizatı ile enfeksiyondan sonra tüm plaklar bir RFP sinyal verdi. Şekil 5'te gösterildiği gibi, VV doğru gen modifikasyon da saf mutan, PCR, hedef N1L geninin olmadığını teyit etmek için kullanıldı olup olmadığını doğrulamak için. Modifiye virüs PCR RFP bir pozitif sinyal ve N1L için mevcut sinyal (gösterdi Şekil 5, şerit AG), sağlam bir N1L bölge ile kontrol virüsü (TO) için N1L PCR sonuçları olumlu ise. A52R kontrol DNA fragmanları, tüm rekombinant virüs ve Ctr virüsü pozitif bulunmuştur. RFP-pozitif plaklar İK verimliliği bu deneyde (önceki çalışmalarında 34 kadar% 94 idi)% 100 (6/6) 'dir. Burada tarif edilen metod, geleneksel protokollere 33, 34 oranla daha fazla 100 misli rekombinasyon verimliliği geliştirdi.
içerik "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Şekil 1:., Homolog rekombinasyon için donör Servisi vektör kaseti ve W genomuna hedef bölgesi saflaştırma marker geni RFP H5 promotör ile tahrik edilir. RFP geninde N1L bölgesi sonucu hedef onarım verici vektör, homolog rekombinasyon sonrası N1L bölgesine dahil edilmiştir. 'X' aşı virüsü genomu aynı diziyi yerini alacak tamir donör vektörü homolog sırasını gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Aften homolog rekombinasyon sonrası CV-1 hücreleri, bir gün Görüntüleme bir günr homolog rekombinasyon, onarım donör vektörle VV ile enfekte ve transfekte hücreler RFP-pozitif A:. Faz kontrastlı görüntü (orijinal büyütme 100X) B:. Floresan mikroskobu görüntüsü (orijinal büyütme 100X). Ölçek çubuğu = 50 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Mutant virüs ilk turda saflaştırma bir RFP-pozitif plak mutant virüs ilk tur saflaştırma, hedef bölge silme ile RFP pozitif plak (kırmızı çizgi ile çember) tarafından oluşturulan plaklar ile çevrilidir vahşi (sarı çizgi ile çember) tipi virüsü A:. Faz kontrastlı görüntü (orijinal büyütme 100X) B:. Floresan microscopy görüntü (orijinal büyütme 100X). Ölçek çubuğu = 50 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. VV arınma 3-5 tur sonra, saf plaklar tüm plaklar olarak elde edildi saf mutant RFP-pozitif A:. Faz kontrastlı görüntü (orijinal büyütme 100X) B:. Floresan mikroskobu görüntüsü (orijinal büyütme 100X) . Ölçek çubuğu = 50 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: VerificatioVV elde edildi, saf mutan VV. DNA N, CV-1 hücrelerini enfekte. N1L N1L primerler kullanılarak PCR ile doğrulanmıştır hedef bölgesinin silinmesi, N1L bölgeye RFP yerleştirme RFP primerler kullanılarak PCR ile onaylandı. Lanes AF altı saflaştırılmış plaklar karşılık, şerit G önceki çalışmalarda 33 doğrulandı N1L silinmesi ile kontrol plak, şerit Ctr (kontrol) (N1L bölge bozulmamış) vahşi tip aşı virüsüdür. A52R gen tüm örnekler için kontrol geni olarak çoğaltıldı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
tedavi amaçlı VV değişiklik ile ilgili olarak iki ana amacı vardır. Bu tür bir anti-tümör terapötik kullanım için virüs azaltmak için timidin kinaz (TK) geni gibi, belirli bir gen silme etmektir. Diğer (GM-CSF gibi) arzu edilen bir terapötik gen ya da (örneğin, lusiferaz geni gibi) bir işaretleyici gen ile VV kol etmektir. Bunlardan birini başarılması bir hedef bölge / genin silinmesini gerektirir. Bir doğrudan DNA ligasyonu yöntemi 35 ve bir in vitro paketleme yöntemi 36 TK geni modifikasyonları mutant vaccinia virüsleri üretmek için daha önce kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu yöntemler, bağlı genom arasında benzersiz restriksiyon enzimi bölgeleri eksikliğine genomunda başka bölgelerde mutasyon ile ilgili kısıtlı uygulanma olanakları vardır. Mutant VV oluşturmak için mevcut bir yaklaşım, homolog rekombinasyon incorporati endüklemek üzere iki saat VV ile enfeksiyondan sonra CV-1 hücrelerinde bir seçim işaretleyici (RFP veya GFP) ile mekik (donör) vektörünün transfeksiyonu kapsarHedef bölgeye seçim markerini ng. Marker-pozitif plak seçimi saflaştırılması 24 saat sonra transfeksiyonu ile takip edilir. plak saflaştırma işlemi, 10 mermi kadar sürebilir son 3-4 hafta ve genellikle kapalı hedef bölgelerde takılı seçim işaretleri ile istenmeyen rekombinant virüslerin neden olabilir. DNA, iki iplikçikli kırılmalar etkili memeli hücrelerinde 37 homolog rekombinasyona neden olabilir, ve bu mekanizma yararlanarak, mutan VV üretme verimi büyük ölçüde geliştirilebilir. GRNA eşliğinde Cas9 sistemi başarılı bir şekilde genom düzenleme çalışan ve 25, ökaryotik organizmalar 22 homolog rekombinasyon verimliliği arttırır edilmiştir. Son zamanlarda, konakçı hücreler, herpes simpleks virüsü gRNA güdümlü Cas9 tarafından düzenlendiği bir adenovirüs ve tip genleri sistem 24. En son CRISPR yer Cas9 sistemi etkin bir şekilde W genomuna düzenleme ve ifade etmek için bir VV vektörünün elde edilmesi için güçlü bir araç olduğu gösterilmiştirÖzellikle geni.
Her iki N1L gRNA güdümlü Cas9 ve geleneksel homolog rekombinasyon (HR) yöntemi N1L aynı hedef bölgeye başarılı İK etkinlikleri sonuçlandı. İlginç bir şekilde, bununla birlikte, geleneksel sıcak yöntem daha verimliliği çok daha yüksek seviyelerde Cas9 neden HR gRNA eşliğinde. Bu nedenle, gRNA güdümlü Cas9 kullanımı mutan VVS elde etmek için çok sayıda plak saflaştırılması ihtiyacını ortadan kaldırır. Bu çalışmada, önemli ölçüde gRNA güdümlü Cas9 sistemi 33 kullanılarak mutant VV üretimi için verimlilik ve zaman çerçevesi geliştirmiştir. Dikkat çekici bir şekilde, benzer bir yeniden birleştirme yüksek verim elde etmek için bir kritik adım geleneksel homolog rekombinasyon gerçekleştirmeden önce 24 saat boyunca Cas9 ve gRNA ifade eden plasmidler ile CV-1 hücrelerini transfekte etmektir. 24 saat aralığı Cas9 ve gRNA makul bir düzeyde ifade edilmesini sağlar. Farklı gRNA t dizileri tespit Dahası, belirli bir geni hedef gRNA sekansı optimize edilmesi gerekebilirargeting N1L geni verimliliklerinin 33, 34 değişiyordu.
düzenleme VV CRISPR / Cas9 için sınırlama rekombinasyon ilk turda RFP-pozitif plaklar düşük oranıdır. sıkıcı tarama ilk tur yapar rekombinant virüs içeren TTT pozitif plaklar yeterli sayıda, genellikle en az on 6 oyuklu plakalar ihtiyaç vardır, elde etmek için. Bu nedenle, bu sınırlamayı aşmak için protokol optimize etmek için bir ihtiyaç vardır.
TTT pozitif plaklar küçük boyutlu 6 oyuklu plaka enfekte etmek için kullanılan lizat bir yoğunluğu nedeniyle bir başka olası sorun vardır. Bunun üstesinden gelmek için, lizat daha az miktarda daha büyük bir boyutu TTT-pozitif plaka elde etmek için bir 6-yuvalı plaka enfekte etmek için kullanılır. Lizat daha küçük bir hacmi kullanılması da TTT negatif olanlar TTT pozitif plaklar daha ayrılması için sağlayacaktır. Sonuç olarak plak arınma az mermi saf RFP-pozitif plaklar almaları gerekmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid #41824 | 41824 | Addgene | gRNA cloning vector |
| pST1374 | 13426 | Addgene | Cas9 cloning vector |
| pGEMT easy | A1360 | promega | repair donor vector cloning |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | C4040-10 | Invitrogen | transformation |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | 27106 | Qiagen | plasmid extraction |
| Dulbecco’s Eagle’s Medium (DMEM) | 11965-092 | Life Technologies | cell culture medium |
| fetal bovine serum (FBS) | SH30088.03HI | Hyclone | cell culture serum |
| penicillin, streptomycin | 15070-063 | Thermo Scientific | antibiotics |
| Effectene | 301425 | Qiagen | transfection |
| Thermo Scientific Nalgene Cryogenic vial; 2.0 mL | W-06754-96 | Thermo Scientific | collect virus |
| fluorescence microscope | Olympus BX51 Fluorescence | Olympus | find RFP-positive plque |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | 69506 | Qiagen | DNA extraction |
| Extensor Long PCR ReddyMix Master Mix | AB-0794/B | Thermo Scientific | PCR reagent |
| 10 cm culture dish | Z688819-6EA | sigma | cell culture |
| 6-well plate | Z707759 | sigma | cell culture |
| cell scraper | C5981 | sigma | scrap cells |
| 1x Trypsin-EDTA solution | T4299 | sigma | trypsinize cells |
| Virkon | 95015661 | Anachem Ltd | desinfectant |
| Falcon tube | CLS430791-500EA | Sigma | hold cell suspension |
| N1L forward 5’-TATCTAGCAATGGACCGT-3’ | Sigma | PCR primer | |
| N1L reverse 5’-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3' | Sigma | PCR primer | |
| A52R forward 5’-ATAGGATTGTGTGCATGC-3’ | Sigma | PCR primer | |
| A52R reverse 5’-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3’ | Sigma | PCR primer | |
| RFP forward 5’- GCTACCGGACTCAGATCCA-3’ | Sigma | PCR primer | |
| RFP reverse 5’-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3’ | Sigma | PCR primer | |
| Argarose | A7431 | Sigma | resolve PCR product |
| G:BOX F3 | G:BOX F3 | Syngene | UV gel doc |
References
- Baroudy, B. M., Venkatesan, S., Moss, B. Incompletely base-paired flip-flop terminal loops link the two DNA strands of the vaccinia virus genome into one uninterrupted polynucleotide chain. Cell. 28, 315-324 (1982).
- Madigan, M. T., Martinko, J. M., Parker, J., Brock, T. D. Brock biology of microorganisms, 9th edn. , Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. (2000).
- Cooney, E. L., et al. Safety of and immunological response to a recombinant vaccinia virus vaccine expressing HIV envelope glycoprotein. Lancet. 337, 567-572 (1991).
- Mackett, M., Yilma, T., Rose, J. K., Moss, B. Vaccinia virus recombinants: expression of VSV genes and protective immunization of mice and cattle. Science. 227, 433-435 (1985).
- Legrand, F. A., et al. Induction of potent humoral and cell-mediated immune responses by attenuated vaccinia virus vectors with deleted serpin genes. J Virol. 78, 2770-2779 (2004).
- Panicali, D., Davis, S. W., Weinberg, R. L., Paoletti, E. Construction of live vaccines by using genetically engineered poxviruses: biological activity of recombinant vaccinia virus expressing influenza virus hemagglutinin. Proc Natl Acad Sci. 80, 5364-5368 (1983).
- Wiktor, T. J., et al. Protection from rabies by a vaccinia virus recombinant containing the rabies virus glycoprotein gene. Proc Natl Acad Sci. 81, 7194-7198 (1984).
- Gallucci, S., Matzinger, P. Danger signals: SOS to the immune system. Curr Opin Immunol. 13, 114-119 (2001).
- Matzinger, P. The danger model: a renewed sense of self. Science. 296, 301-305 (2002).
- Guo, Z. S., Bartlett, D. L. Vaccinia as a vector for gene delivery. Expert Opin Biol Ther. 4, 901-917 (2004).
- Kwak, H., Horig, H., Kaufman, H. L. Poxviruses as vectors for cancer immunotherapy. Curr Opin Drug Discov Devel. 6, 161-168 (2003).
- Tysome, J. R., et al. Lister strain of vaccinia virus armed with endostatin-angiostatin fusion gene as a novel therapeutic agent for human pancreatic cancer. Gene Ther. 16, 1223-1233 (2009).
- Kirn, D. H., Wang, Y., Liang, W., Contag, C. H., Thorne, S. H. Enhancing poxvirus oncolytic effects through increased spread and immune evasion. Cancer Res. 68, 2071-2075 (2008).
- Park, B. H., et al. Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial. Lancet Oncol. 9, 533-542 (2008).
- Panicali, D., Paoletti, E. Construction of poxviruses as cloning vectors: insertion of the thymidine kinase gene from herpes simplex virus into the DNA of infectious vaccinia virus. Proc Natl Acad Sci. 79, 4927-4931 (1982).
- Ball, L. A. High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA. J Virol. 61, 1788-1795 (1987).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Mol Cell Biol. 14, 8096-8106 (1994).
- Jansen, R., Embden, J. D., Gaastra, W., Schouls, L. M. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol. 43, 1565-1575 (2002).
- Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321, 960-964 (2008).
- van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes. Trends Biochem Sci. 34, 401-407 (2009).
- Jinek, M., et al. Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation. Science. 343, 1247997 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Bi, Y., et al. High-efficiency targeted editing of large viral genomes by RNA-guided nucleases. PLoS Pathog. 10, 1004090 (2014).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Yang, L., et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Res. 41, 9049-9061 (2013).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31, 827-832 (2013).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
- Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156, 836-843 (2014).
- Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. 32, 551-553 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Ma, Y., et al. Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9. Cell Res. 24, 122-125 (2014).
- Yuan, M., et al. Efficiently editing the vaccinia virus genome by using the CRISPR-Cas9 system. J Virol. 89, 5176-5179 (2015).
- Yuan, M., et al. A marker-free system for highly efficient construction of vaccinia virus vectors using CRISPR Cas9. Mol Ther Methods Clin Dev. 2, 15035 (2015).
- Merchlinsky, M., Moss, B. Introduction of foreign DNA into the vaccinia virus genome by in vitro ligation: recombination-independent selectable cloning vectors. Virology. 190, 522-526 (1992).
- Timiryasova, T. M., Chen, B., Fodor, N., Fodor, I. Construction of recombinant vaccinia viruses using PUV-inactivated virus as a helper. Biotechniques. 31, 534-540 (2001).
- Johnson, R. D., Jasin, M. Double-strand-break-induced homologous recombination in mammalian cells. Biochem Soc Trans. 29, 196-201 (2001).
