Abstract
En grundläggande fråga i cellbiologi är hur cell- och organell storlekar regleras. Det har länge varit känt att storleken på kärnan skalar i allmänhet med storleken på cellen, särskilt under embryogenes när dramatiska minskningar i både cell och nukleära storlekar uppstår. Mekanismer för storlek reglering kärn är till stor del okända och kan vara relevanta för cancer där förändrad kärn storlek är en viktig diagnostisk och prognostisk parameter. In vivo metoder för att identifiera kärnstorleksregulatorer kompliceras av det väsentliga och komplexa natur kärnfunktion. Tillvägagångssättet in vitro som beskrivs här för att studera kärnstorlekskontroll utnyttjar de normala sänkningar av kärnstorlek som inträffar under Xenopus laevis utveckling. Först kärnor monterade i X. laevis ägg extrakt. Därefter är dessa kärnor isolerade och återsuspenderades i cytoplasman från embryon sent skede. Efter en 30-90 min inkubation period, kärn ytareaminskar med 20-60%, vilket ger en användbar analys för att identifiera cytoplasmatiska komponenter som finns i sent stadium embryon som bidrar till utvecklingskärn storlek skalning. En stor fördel med denna metod är den relativa lätthet med vilken de ägg och embryoextrakt kan biokemiskt manipuleras, vilket möjliggör identifiering av nya proteiner och aktiviteter som reglerar kärn storlek. Som med alla in vitro-metod, är validering av resultat i ett in vivo-system viktig, och mikroinjektion av X. laevis embryon är särskilt lämpligt för dessa studier.
Introduction
Storlekarna på cellulära organeller skala typiskt med storleken på cellen, och detta har kanske bäst dokumenterade för skalning av nukleär storlek med cellstorlek 10/01. Detta gäller särskilt under embryogenes och celldifferentiering, när dramatiska minskningar i både cellen och kärn storlek observeras ofta 11,12. Dessutom är förändrad kärn storlek en viktig parameter i cancerdiagnos och prognos 13-17. Mekanismer som bidrar till storlek reglering kärn är till stor del okända, delvis på grund av komplexiteten och väsentliga karaktären hos kärnstruktur och funktion. Den här beskrivna metoden utvecklades som en in vitro analys för nukleär storlek skalning som är mottaglig för biokemisk manipulation och klarläggande av mekanismerna för storleksreglering nukleär.
Xenopus laevis ägg extrakt är ett väl etablerat system för att sammanfatta och studera komplexa cellulära processer i ett in vitro 18-22. En viktig fördel med extraktet systemet är att X. laevis ägg extrakt representerar en nästan outspädd cytoplasma vars sammansättning kan lätt ändras, till exempel genom tillsats av rekombinanta proteiner eller immunotömning. Vidare är en möjlighet att manipulera väsentliga processerna genom att använda behandlingar som annars kan vara dödlig i ett in vivo sammanhang. Modifieringar av äggextrakt förfarande medger isolering av extrakt från X. laevis embryon snarare än ägg och dessa embryoextrakt är lika mottagliga för biokemisk manipulation 23. Under X. laevis utveckling, encelliga befruktade embryot (~ 1 mm diameter) genomgår en serie av tolv snabba divisioner cell (stegen 1-8) för att generera flera tusen 50 μm diameter och mindre celler och nådde ett utvecklingsstadium benämnd midblastula övergång (MBT) eller steg 24-26 augusti. MBT kännetecknas av uppkomsten av zygotiska transkription, cellmigration, asynkrona celldelningar, förvärv av gap faser, och etablering av kärn steady-state storlekar snarare än kontinuerlig kärn expansion i pre-MBT embryo. Från steg 4 till gastrulation (steg 10,5-12), volymen av enskilda kärnor minskar med mer än 10-faldigt 11.
Här är målet att identifiera mekanismer som ansvarar för dessa minskningar i kärn storlek under utvecklings progression. Tillvägagångssättet är att först samla kärnor i X. laevis ägg extrakt och att isolera dessa kärnor från ägg cytoplasman / extrakt. Dessa kärnor återsuspenderades sedan i cytoplasman från slutet gastrulastadium embryon. Efter en inkubationstid, kärnorna från ägg extrakt blir mindre i sent skede embryo extrakt. Resonerade vi att detta woulskulle vara en användbar analys för att identifiera cytoplasmatiska komponenter som förekommer i sent stadium embryon som bidrar till utvecklingskärn storlek skalning. Med hjälp av denna analys, i kombination med in vivo validering, visade vi att proteinkinas C (PKC) bidrar till utvecklings minskningar av kärnstorlek i X. laevis 23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla Xenopus förfaranden och studier genomfördes i enlighet med NRC Guide för vård och användning av försöksdjur 8: e upplagan. Protokoll godkändes av University of Wyoming Institutional Animal Care och användning kommittén (Assurance # A-3216-01).
1. Framställning av X. laevis Egg Utdrag (anpassad från 27,28)
- Prime kvinnliga X. laevis grodor minst tre dagar och högst två veckor innan insamling av ägg med en enda 100 IE injektion av dräktigt sto serum gonadotropin (PMSG).
- En dag före försöket, injicera primade grodor med 800 IE humant koriongonadotropin (HCG) och plats vid 16 ° C i en L per groda av en / 3x Marc modifierade ringsignaler (MMR). Se tabell 1 för alla buffertkompositioner.
Obs: Vissa grodor kommer inte lägger ägg eller lägger dålig kvalitet ägg. Typiskt 2 - 3 grodor injiceras för att säkerställa åtminstone en groda kommer att ligga sufficient antal ägg av god kvalitet. Den genomsnittliga groda kommer att lägga tillräckligt med ägg för att producera åtminstone 1 ml ägg extrakt. - Förbereda en L 1 / 3x MMR med kallt destillerat avjoniserat vatten (DDH 2 O), 500 ml buffert B, 1 L buffert C, 500 ml buffert D och 100 ml buffert E.
- Transfer lagt ägg till ett glas kristallisationsskål (150 x 75 mm). Med hjälp av en plast Pasteur pipett med spetsen avskuren, lägga ut vita pösiga aktiverade ägg eller lyserade ägg. Endast behålla ägg med tydliga och lika mörka djur stolpar och vita vegetabiliskt stolpar.
- Förbered 13 x 51 mm centrifugrör med 1 ml av Buffert E supplementerat med 355 | iM cytokalasin D tillsatt precis före användning i steg 1,7.
- Dejelly och tvätta äggen.
- Tvätta ägg kort med kall 1 / 3x MMR i en lämplig storlek bägare, ändra bufferten 3 - 4 gånger.
- Ta bort gelé rockar från äggen genom inkubation med buffert B. Detta kommer att ta allt från 3 till 10 minuter. Eftersom de molniga gelé rockar frigörs från äggets, ändra bufferten.
Obs: Dejellying är klar när äggen visas tätt packade i ett hörn av skålen när lutas och vegetabiliskt poler är orienterade nedåt. Ägg är mycket bräckligare efter dejellying, så inte ruvar äggen med buffert B för längre än nödvändigt och efterföljande tvättar behöver utföras mycket noggrant. - Tvätta ägg kort med 3 - 4 byten av buffert C.
- Tvätta ägg kort med 2 byten av buffert D.
- Tvätta ägg kort med 2 byten av buffert E.
- Fyll centrifugrör med ägg med ett brett hål glaspipett eller plast pipett. Sug bort överflödig buffert. Att packa äggen och ta bort så mycket buffert som möjligt, centrifug i svängande hink rotorn vid 212 xg under 60 sekunder och därefter vid 478 xg under 30 sek. Sug bort överflödig buffert.
Obs: Det är viktigt att ta bort så mycket överskott buffert som möjligt i detta steg för att säkerställa att ägget extraktet minimalt utspädd. - I en svängande bucket rötor, ultracentrifug under vakuum i 15 minuter vid 12.000 xg och 4 ° C för att krossa ägg öppna och separera i olika lager, med cytoplasman är den bärnstensfärgade skikt i mitten. Ta centrifugrör och omedelbart på is.
- Samla extraktet.
- Med användning av en 18 gauge nål och spruta, punktera centrifugröret strax ovanför den mörka pigmenterat skikt på botten av röret och ta bort mittbärnstensfärgat cytoplasmisk skiktet. Samlar inte in någon av topp lipidskiktet. Samla cytoplasman i en lämpligt dimensionerad rör.
Obs: I allmänhet ger en groda åtminstone 1 ml extrakt. - Tillägg cytoplasma med 1/1000 volymen av 19,7 mM cytochalasin D, 1/1000 volymen av LPC lager, och 1/50 volym 50x energimix. Vänd försiktigt röret för att blanda. Inte överdrivet pipettera extraktet.
- Förvara utdraget på is och använda den inom tre timmar av förberedelser för bästa resultat.
- Med användning av en 18 gauge nål och spruta, punktera centrifugröret strax ovanför den mörka pigmenterat skikt på botten av röret och ta bort mittbärnstensfärgat cytoplasmisk skiktet. Samlar inte in någon av topp lipidskiktet. Samla cytoplasman i en lämpligt dimensionerad rör.
Obs: Proceduren volymerna presenteras här är för upp till 8 testiklar.
- Ta bort 0,05% bensokain (10% bensokain lager ställdes i etanol och späddes till 0,05% i groda tank vatten) från 4 ° C och värm till rumstemperatur. Söva och offra manliga X. laevis grodor i bensokain-lösning vid rumstemperatur under 20-30 min. Se till döden genom avsaknad av hjärtslag genom att undersöka och känna bröstet, genom bristande respons på mekanisk stimulering, och / eller genom halshuggning.
- Göra en U-formad incision längs buken. Ta bort tubulated massa gula fett organ. På toppen av njurarna, lokalisera testiklarna, som är ovala ljusrosa massor cirka 1 cm i längd 29. Skära testiklarna och rulla dem på läskpapper för att ta bort blod och annan vävnad.
- Tvätta testiklar i buffert T. Använd en snäv monterad mortelstöt för att mala testiklar med 1 ml buffertT i ett 1,5 ml rör tills den var homogen (10 slag eller mer). Centrifug 5-10 sekunder i en minicentrifug och samla supernatanten, ta bort stora bitar av vävnad. Upprepa centrifuger gång till och samla upp supernatanten.
- Överföra spermieinnehållande lösningen till en 15 ml plaströr. Höj volymen till totalt 2 ml med buffert T. Centrifugera vid 1411 xg under 10 minuter vid 16 ° C för att pelletera spermier.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 500 | il buffert T. Centrifugera vid 1411 xg under 10 min vid 16 ° C. Upprepa detta steg en gång eller två gånger efter behov för att rengöra pellet av somatiska och röda blodkroppar.
- Återsuspendera pelleten i 100 | j, l Buffert T och 300 ^ il buffert S. Inkubera vid rumstemperatur under 5 min.
Obs: Buffert S innehåller lysolecitin, som är ansvarig för demembranation. - Lägg tre volymer buffert R (beredda färska före användning). Vänd röret exakt en gång. Centrifugera vid 1411 xg under 15 min vid 16 &# 176; C.
- Resuspendera pelleten i 400 pl buffert R och sedan lägga till ytterligare 2 ml buffert R. Centrifugera vid 1411 xg under 15 minuter vid 16 ° C.
- Återsuspendera pelleten i 50 | il buffert T.
- Späd 1 pl demembranated spermiekärnor med 9 pl buffert T. Applicera detta utspädning till en hemocytometer. Räkna antalet tunna S-formade spermier kärnor i en stor 4 x 4 rutnät, och multiplicera den siffran med 100 för att erhålla koncentrationen av beståndet i spermiekärnor per il.
- Späd lager till 100.000 spermier kärnor per il med buffert T, vilket resulterar i en 200x lager. Förbereda 3 - 5 | il alikvoter. Flash frysa i flytande kväve och förvaras vid -80 ° C.
3. Nuclear Assembly
- Supplement 100 pl äggextrakt med 1,5 | il 35,5 mM cykloheximid (slutlig koncentration ~ 0,5 mM), 6 | il 20x kalciumstamlösning (slutlig koncentration ~ 0,6 mM) och 0,7 | il 200x spermier (slutlig koncentration ~ 700spermier kärnor / l). Skala reaktionsvolymen upp eller ned efter behov. Invertera eller knacka försiktigt för att blanda.
Obs: Utdrag cyklade från metafas till inter ger en mer robust och pålitlig plattform för kärnteknisk anläggning. - Inkubera i ett vattenbad vid 16 - 20 ° C under 90 min. Blanda genom att försiktigt knacka var 15 minuter för att säkerställa kärnor hålla sig svävande i extraktet.
- Övervaka utvecklingen av kärnteknisk anläggning på 45 minuter genom att framställa en squash på följande sätt.
- Pipett 2 pl extrakt på en glasskiva och tillsätt 2 pl kärna fix.
- Overlay med en 22 mm 2 täck. Bild på ett epifluorescensmikroskop med vatten, olja, eller luft 20 - 100X mål och en DAPI filter.
Notera: Kärnor kan visualiseras genom ljusfält avbildning, men är mycket lättare att visualisera genom fluorescens. - Använd kärnor omedelbart eller flash frysa alikvoter i flytande kväve och förvaras vid -80 ° C.
Obs: Lägga 4% glycerol till kärnorna prIOR frysning kan bidra till att bibehålla sin integritet. Frysta kärnor är i allmänhet fortfarande livskraftig och kan nukleära importen, men frysning processen kan leda till störs eller mer strukturellt sköra kärnor. Kärnor upp till ett år efter frysning kan användas.
4. Framställning av X. laevis Embryo Extract
- Inducera kvinnlig X. laevis grodor att lägga ägg som beskrivs i 1.1 och 1.2.
- Isolera testiklar från manliga X. laevis grodor som beskrivs i 2.2. Sänk testiklar i L15-medium kompletterat med 50 IU / ml penicillin och streptomycin i ett glas 35 x 10 mm petriskål. Förvara vid 4 ° C i upp till två veckor.
- Samla och befrukta äggen.
- Samla nylagda ägg genom att hålla grodor över ett glas återanvändbar petriskål och främja äggläggning genom ett lätt tryck på den nedre delen av ryggen nära kloaken. Klämma grodan för hårt kan leda till skada, vilket leder till en uppsvälld mage och requiring eutanasi 29.
- Prop skålen med en ungefärlig 45 ° vinkel, tillåter ägg samlas i kanten av skålen, ta bort allt överflödigt buffert och tillsätt tillräckligt 1 / 3x MMR knappt täcka äggen. Befrukta ägg inom 15 minuter efter provtagning.
- Använda en tätt inpassad mortelstöt för att blöta upp och homogenisera 1/4 av en testikel i ett 1,5 ml rör med 500 | il av hög salt Modifierade Barths Saline (hög salthalt MBS). Lägg macererade testiklarna att äggen och möjliggöra befruktning ske vid rumstemperatur under 15 - 20 min, sedan översvämma ägg med en / 3x MMR.
Obs: Effektiviteten av testiklarna minskar med lagringstiden, därför mer testiklar vävnad kan krävas för en lyckad befruktning vid användning av testiklar som har lagrats i mer än en vecka. - Bekräfta befruktning genom att kontrollera för sammandragning av den mörka pigmenterade animaliska polen och genom rotation av embryona med sina djur poler uppåt, vanligen ca 20 till 30 min efter tillsats av krossad testes. Räkna med den första cellen klyvning ske inom 90 minuter.
- Med hjälp av en bred borrning glaspipett flitigt bort döda (vit och svullna eller ojämn fördelning av äggula och pigment), lyserades, eller obefruktade ägg (dvs inte klyvs), eftersom de snabbt kommer att inducera död i grann embryon.
- Var som helst från 1 till 2,5 h efter befruktning, dejelly embryon i 2-3% cystein upplöstes i 1/3 x MMR och justerades till pH 7,9 med 10 N KOH. Utför två buffertbyten som var 3-4 min. Tvätta embryon med 6 - 10 korta byten av 1 / 3x MMR att avlägsna alla spår av cystein.
Obs: Dejellied embryon har en vitellinmembranet och är inte lika ömtålig som dejellied ägg.
- Med hjälp av en bred borrning glas pipett friska befruktade (dvs, klyvs) embryon till en petriskål med färsk 1 / 3x MMR och låta dem utvecklas till den önskade scenen vid RT, eller om långsammare utveckling är att föredra, 16 ° C. Fortsätt att ta bort döda eller lysed embryon indikeras av brist på första divisionen eller vitt pösigt utseende.
- Kontrollera skede av embryon genom att kontrollera nästan helt stänga blastopore och genom att jämföra med ritningar av iscensatta embryon finns i referensmaterial 24.
Obs: Embryon odlades vid 16 ° C kommer att nå stadiet 11,5-12 i cirka 12 timmar. - Inkubera stadium 11,5 - 12 embryon i färsk 1 / 3x MMR kompletterat med 0,5 mM cykloheximid under 1 h vid RT, för att gripa embryon i sen interfas.
- Överför med bred borrning glas eller plast pipett minst 15 (företrädesvis 30 eller mer) interfas greps embryon till ett mikrocentrifugrör.
Notera: 15 embryon är tillräcklig för att ge ungefär 20 | j, l av extrakt. Skala upp vid behov. - Tillsätt 1 ml ägg lysbuffert (ELB) kompletterat med 1 pl LPC lager. Vänd försiktigt tvätta embryon tillåter embryon att falla till botten av röret och ta bort bufferten. Upprepa detta tvättsteg två gånger. </ Li>
- Resuspendera embryon i 500 pl ELB plus 0,5 pl LPC lager, 5 pl 19,7 mM cykloheximid och 5 pl 35,5 mM cytochalasin D (för att hämma aktin polymerisation). Centrifugera vid 200 xg under 1 minut i en bordsmikrocentrifug.
- Ta bort överflödig buffert och använda en mortelstöt för att grundligt krossa embryon. Centrifugera i en swinging bucket rötor under 10 min vid 10000 x g och 16 ° C.
- Punktera lipidskiktet uppifrån med en 200 l pipett spets. Med en ren 200 l pipettspetsen, ta bort mitt cytoplasma bärnstensfärgad lager till en lämplig storlek röret.
- Tillägg embryo extrakt med 1/50 volym 50x energimix (för att ge ett ATP-regenereringssystem), 1/100 volym av 35,5 mM cyklohexamid, 1/500 volym av 19,7 mM cytokalasin D, och 1/1000 volymen av LPC lager.
- Förbered en squash som beskrivs i 3.3 att visualisera endogena embryonala kärnor i extraktet.
Obs: Embryo extrakt kan frysas med de endogena kärnor på denna punkt. Alikvot för att minska frysnings / upptiningscykler och förvara vid -80 ° C. - Att avlägsna kärnor från embryot extraktet späds det extrakt med en lika stor volym av ELB innehållande 1/50 volym 50x energimixen, 1/100 volym 35,5 mM cyklohexamid, 1/500 volym 19,7 mM cytokalasin D, och 1/1000 volymen av LPC lager. Centrifugera i en svängande hink rotor vid 17.000 xg under 15 min vid 16 ° C.
- Samla supernatanten var noga med att undvika kvarvarande lipid på toppen. Stör inte de pelleterade kärnor i botten av röret. Förbered en squash som beskrivs i 3.3 för att säkerställa att de flesta kärnor har tagits bort. Använd extraktet färska eller delprov och förvara vid -80 ° C.
- För att värma inaktivera embryoextrakt för kontrollexperiment, värme 30 - 100 l alikvoter extrakt vid 56 ° C under 30 minuter med hjälp av en termocykler. Låt värmeinaktiv extrakt för att återgå till rumstemperatur före användning.
- Isolera kärnor monterade i ägget extraktet genom att späda 25 - 150 il förmonterade kärnor i en ml ELB i ett 1,5 ml rör. Centrifugera vid 1600 xg under 3 min vid 4 ° C i en bordsmikrocentrifug. Ta bort buffert, försiktigt så att inte störa den bräckliga pellet av kärnor i botten av röret.
- Resuspendera kärnor i en volym av embryo extrakt lika med den ursprungliga volymen av ägg extrakt som används i 5.1. Använd ELB eller värmeinaktiverat extrakt för kontrollreaktioner, när så är lämpligt.
- Knacka försiktigt på röret för att bryta upp pelleten och resuspendera kärnor. Inkubera vid rumstemperatur under 90 min, att knacka försiktigt på röret för att blanda varje 15-30 min. Notera: De flesta av kärnkrafts krympningen inträffar inom de första 30 minuterna.
- Övervaka utvecklingen av kärn krympning genom att förbereda en squash.
- Pipett 2 pl extrakt på en glasskiva och tillsätt 2 pl kärna fix.
- Överlagring med en 22 mm 2
- Tryck på röret för att återsuspendera kärnorna strax före tillsats av 500 pl fixativ bestående av ELB, 15% glycerol och 2,6% paraformaldehyd. Invertera omedelbart och placera röret på en rotator under 15 min vid rumstemperatur.
- Förbered spinn ner rören genom utrusta 15 ml glasrör med rund botten med rundbottnade plastinlägg (utformning och scheman tillgängliga på begäran). Tillsätt 5 ml av kärn kudde buffert. Släpp en 12 mm cirkulär täck i röret, som är säker på att det ligger plant ovanpå plastinsatsen.
- skikt försiktigt lösningen innehållande fasta kärnor ovanpå kärn kudden med hjälp av ett brett hål pipettspetsen. Centrifugera i en swinging bucket rötor under 15 min vid 1000 x g och 16 ° C.
- Använda en aspirator för att avlägsna allt av bufferten och dra plastinsatsen till toppen av röret. Ta bort täck med ett par fina pincett, var noga med att notera sidan av locketglida på vilket kärnorna spanns. Post-fix i kall metanol (lagrad vid -20 ° C) under 5 min vid RT.
- Överför täck kärna sidan upp på ett ark av plast paraffin film foder en stor plastpetriskål. Placera våta engångsservetter längs sidan av skålen för att förhindra uttorkning.
- Rehydrera kärnor på täck med 500 pl PBS-NP40 (1x PBS plus 0,1% NP40) och aspirera efter 5-10 sekunder.
- skikt noggrant 75 ul PBS-3% bovint serumalbumin (BSA) på täckglas. Gör det möjligt att blockera en timme vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
- Avlägsna blockeringslösning och inkubera med primär antikropp (t.ex., mAb414 mot kärnpor komplexa, 1: 1000) utspädd i PBS-3% BSA under 1 h vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C. Tvätta med fem omedelbara förändringar av PBS-NP40.
- Inkubera med sekundär antikropp utspädd i PBS-3% BSA under 1 h vid RT. Tvätta med fem omedelbara förändringar av PBS-NP40.
- inkuberamed 10 ^ g / ml Hoechst utspädd i PBS-3% BSA under 5 min vid RT. Tvätta fem gånger med PBS-NP40. Ta bort allt överflödigt buffert.
- Montera täck på en bild med 5 pl antifad monteringsmedium. Täta med tydliga nagellack. Bild omedelbart med en epifluorescensmikroskop med 20 - 100x mål eller förvara vid 4 ° C för senare avbildning.
Obs: Utför kvantifiering som tidigare beskrivits 23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Montering av kärnor i Egg Utdrag
De första stegen i detta protokoll är att förbereda X. laevis ägg extrakt (protokoll 1) och demembranated spermiekärnor (protokoll 2). Dessa reagens används sedan för att sätta samman kärnor de novo (Protokoll 3). Figur 1 visar några representativa data. Tillsats av kalcium driver meiotiskt greps ägg extrakt i interfas och cykloheximid håller extraktet greps i interfas. Med 30 - 45 min efter initiering av reaktionen, bör initialt tunna S-formade spermier kärnor börjar tjockna i snigelformade kromatin massorna. Framgångsrik bildning av en intakt kärnhölje kan bedömas genom import och bibehållande av en fluorescensmärkt import gods, såsom GST-GFP-NLS (data visas ej), eller genom kanten färgning för kärnpor komplexet med hjälp av mAb414 som erkänner FG-repeat Containing nucleoporins (Figur 1A). Efter kärnteknisk anläggning inträffar bör kärn form blir mer avrundad och kärnvolymen bör öka kärnhöljet expanderar och kärnproteiner importeras (Figur 1B-C). Underlåtenhet att observera bildningen av en intakt kärnhölje eller kärn tillväxt indikerar en dålig kvalitet ägg extrakt. I det här fallet är det bäst att börja om igen med en ny omgång av ägg.
Borttagning av endogen Kärnor från Embryo Extract
Nästa steg är att förbereda ett sent stadium embryo extrakt (protokoll 4). Efter inledande framställning av extraktet och före avlägsnande av kärnor, är det bäst att förbereda en Hoechst-färgade squash av en liten alikvot av extraktet. Visualisering av många små embryonala kärnor är en bra indikation på framgång i att förbereda extraktet (Figur 2A). Som endogena embryonala kärnor kan störa nedströms analysis, är det också viktigt att kontrollera en alikvot av extraktet efter avlägsnande kärnor genom utspädning och centrifugering. Jämfört med första squash, bör fåtal kärnor lämnas i extraktet (Figur 2B). Om det fortfarande finns många kärnor närvarande krävs en andra omgång av centrifugering.
Nukleär Krympning Assay
Figur 3 visar representativa resultat för kärn krympande analysen (protokoll 5). Ägg extrakt kärnor återsuspenderades i sent skede embryo extrakt blir mindre med tiden (Figur 3B). En bra negativ kontroll för analysen är att inkubera kärnor med embryoextrakt som har värmeinaktiverat (Figur 3A). Som kärnor inte krympa i värmeinaktiverat extrakt, ger detta en viss tillförsikt som observerats kärn krymper med obehandlad embryo extrakt är inte en följd av osmotiska effekter. Omfattningen av kärn storlekminskningar observerade varierar beroende på den särskilda sats av ägg extrakt kärnor samt kvaliteten på embryoextraktet. Enligt vår erfarenhet är kärn krympning alltid iakttas (t.ex. i mer än 40 olika embryoextrakt), men det är viktigt att upprepa dessa experiment flera gånger med olika kärnor och extraherar att ta itu med den inneboende variationen i analysen. Figur 4 visar en schematisk av hela protokollet.
Figur 1. Nuclear Assembly Time Course i X. laevis Egg Utdrag. Kärnor samlades de novo i X. laevis äggextrakt såsom beskrivs i protokoll 3. Alikvoter från samma reaktion fixerades och visualiserades genom immunofluorescens med användning av en antikropp mot kärnpor komplex (NPC) (mAb414) hos:
Figur 2. Avlägsnande av kärnor från X. laevis Embryo Extract. X. laevis embryoextrakt framställdes från steg 11,5 - 12 embryon såsom beskrivs i protokoll 4. En liten alikvot av extraktet fixerades och färgades med Hoechst: A) före avlägsnandet av kärnor, och B) efter avlägsnande av kärnor genom centrifugering. Skalan bar är 25 pm.om / filer / ftp_upload / 54.173 / 54173fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Representativa data från Nuclear krympande analys. Kärnor samlades de novo i X. laevis ägg extrakt kompletterat med rekombinant GFP-LB3 (för att visualisera den nukleära lamina). Som beskrivits i protokoll 5, var ägg extrakt kärnor isolerades och återsuspenderades i steg 11,5-12 embryo utdrag ur vilken endogena embryonala kärnor hade avlägsnats. Live time-lapse avbildning utfördes vid 30 sek intervall under 90 minuter. Figur paneler visar bilder som förvärvats med 6 minuters intervall för kärnor inkuberade i: A) sent skede embryo extrakt (LEE), och B) värmeinaktiverad (HI) embryoextrakt. Bilder från tidsförlopp fortsätterfrån vänster till höger. Skalan bar är 25 pm. C) Nuclear krympande data från 46 olika ägg och embryoextrakt. Staplarna visar medlen för> 240 kärnor. Felstaplar är standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Schematisk av Nuclear krympande analysen. Varje färgade rutan representerar ett protokoll. Rött indikerar framställning av X. laevis ägg extrakt (protokoll 1). Blått anger framställning av demembranated X. laevis spermier (protokoll 2). Rosa indikerar de novo kärnteknisk anläggning i ägg extrakt (protokoll 3). Grönt anger framställning av X. laevis embryo extrakt (protokoll 4). Lila anger kärnkrafts shrinking analysprotokoll och immunofluorescens (Protokoll 5). Delar av denna siffra har återanvänts från 23. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| buffertnamn | buffertkomposition |
| Marc modifierade Ringers (MMR), 1 / 3x | 33 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,3 mM MgSO 4, 0,7 mM CaCl2, 1,7 mM HEPES, pH 7,4 |
| Extrakt buffert (XB), 10x | 1 M KCl, 1 mM CaCl2, 10 mM MgCl2, 500 mM sackaros, 100 mM HEPES, pH 7,8 (pH justerades med 10 N KOH, lagrad vid 4 ° C) |
| buffert B | 4% cystein upplöstes i 0,8x XB (framställd med kall DDH 2 O, pH endjusted till 7,8 med 10 N NaOH) |
| buffert C | Blanda 100 m av 10x XB med 900 ml kall ddHaO 2 O |
| buffert D | Buffert C plus 5 mM EGTA och 800 | iM MgCl2 |
| LPC lager, 1,000x | 10 mg / ml vardera av leupeptin, pepstatin och kymostatin löst i DMSO (lagrades i alikvoter vid -20 ° C) |
| buffert E | 100 ml buffert D plus 100 ul LPC lager |
| Energimix, 50x | 190 mM kreatinfosfat dinatrium, 25 mM ATP-dinatriumsalt, 25 mM magnesiumklorid |
| T-buffert | 15 mM PIPES, 15 mM NaCl, 5 mM EDTA, 7 mM MgCl2, 80 mM KCl, 0,2 M sackaros, pH 7,4 (filtersterilisera och lagrades vid 4 ° C) |
| buffert S | 20 mM maltos och 0,05% lysolecitin beredd i buffert T |
| buffert R | T-buffert plus 3% bovintserumalbumin |
| Kalciumstamlösning, 20x | 10 mM CaCl2, 0,1 M KCl, 1 mM MgCl2 (förvaras vid -20 ° C) |
| nucleus fix | 125 | j, l 2 M sackaros, 12,5 | j, l 1 M HEPES pH 7,9, 250 | j, l 37% formaldehyd, 112 | j, l DDH 2 O, 0,5 | il 10 mg / ml Hoechst (lagrad vid rumstemperatur under upp till två veckor) |
| Modifierad Barth saltlösning (MBS), 10x | 880 mM NaCl, 10 mM KCl, 50 mM HEPES, 25 mM NaHCOa 3, pH 7,8 |
| Hög salt MBS | 1x MBS plus 0,7 mM CaCl2 och 20 mM NaCl |
| Ägg lysbuffert, ELB | 250 mM sackaros, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7,8 |
| Nukleär kudde buffert | 1x XB, 0,2 M sackaros, 25% glycerol (filtersteriliseras och lagrades vid 4 ° C) |
Tabell 1. buffertar. Kompositioner av alla buffertar som nämns i detta protokoll beskrivs i den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG | Molecular Probes | A10037 | |
| ATP disodium salt | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Benzocaine | Sigma Aldrich | E1501 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C3306 | |
| Centrifuge | Beckman | J2-21M | |
| Centrifuge rotor | Beckman | JS 13.1 | |
| chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| creatine phosphate disodium | Calbiochem | 2380 | |
| cycloheximide | Sigma Aldrich | C6255 | |
| cytochalasin D | Sigma Aldrich | C8273 | |
| disposable wipes (kimwipes) | Sigma Aldrich | Z188956 | |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | W326306 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glass crystallizing dish (150 x 75 mm) | VWR | 89090-662 | |
| Glycerol | Macron | 5094-16 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Hoechst - bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma Aldrich | B2261 | |
| HCG - Human Chorionic Gonadotropin | Prospec | hor-250-c | |
| L15 Media | Sigma Aldrich | L4386 | |
| leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Lysolecithin | Sigma Aldrich | L1381 | |
| mAb414 | Abcam | ab24609 | |
| MgCl2 | EMD | MX0045-2 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M9397 | |
| Maltose | Sigma Aldrich | M5885 | |
| NP40 | BDH | 56009 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicillin + Streptomycin | Sigma Aldrich | Pp0781 | |
| pepstatin | Sigma Aldrich | P5318 | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P6757 | |
| Plastic paraffin film (parafilm) | Sigma Aldrich | P7793 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Mallinckrodt | 70100 | |
| KOH | Baker | 5 3140 | |
| PMSG - Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Prospec | hor-272-a | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328 | |
| Na2HPO4 | EMD | SX0720-1 | |
| NaOH | EMD | SX0590 | |
| Pestle | Thomas Scientific | 3411D56 | |
| Round bottom glass tubes, 15 ml | Corex | 8441 | |
| Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG) | ThermoFisher | A10037 | |
| sucrose | Calbiochem | 8550 | |
| thermal cycler | Bio-Rad | T100 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-80M | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman | SW 50.1 | |
| Vectashield (anti-fade mounting medium) | Vector | H-1000 |
References
- Conklin, E. Cell size and nuclear size. J. Exp. Embryol. 12, 1-98 (1912).
- Wilson, E. B. The Cell in Development and Heredity. , The Macmillan Company. 727-733 (1925).
- Levy, D. L., Heald, R. Nuclear size is regulated by importin alpha and Ntf2 in Xenopus. Cell. 143 (2), 288-298 (2010).
- Chan, Y. H., Marshall, W. F. Scaling properties of cell and organelle size. Organogenesis. 6 (2), 88-96 (2010).
- Walters, A. D., Bommakanti, A., Cohen-Fix, O. Shaping the nucleus: Factors and forces. J Cell Biochem. 113 (9), 2813-2821 (2012).
- Webster, M., Witkin, K. L., Cohen-Fix, O. Sizing up the nucleus: nuclear shape, size and nuclear-envelope assembly. J Cell Sci. 122 (Pt 10), 1477-1486 (2009).
- Edens, L. J., White, K. H., Jevtic, P., Li, X., Levy, D. L. Nuclear size regulation: from single cells to development and disease. Trends Cell Biol. 23 (4), 151-159 (2013).
- Jevtic, P., Edens, L. J., Vukovic, L. D., Levy, D. L. Sizing and shaping the nucleus: mechanisms and significance. Curr Opin Cell Biol. 28, 16-27 (2014).
- Levy, D. L., Heald, R. Mechanisms of intracellular scaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 113-135 (2012).
- Vukovic, L. D., Jevtic, P., Edens, L. J., Levy, D. L. New insights into the mechanisms and functions of nuclear size regulation. Int Rev Cell Mol Biol. 322, 1-59 (2016).
- Jevtic, P., Levy, D. L. Nuclear size scaling during Xenopus early development contributes to midblastula transition timing. Curr Biol. 25 (1), 45-52 (2015).
- Hara, Y., Iwabuchi, M., Ohsumi, K., Kimura, A. Intranuclear DNA density affects chromosome condensation in metazoans. Mol Biol Cell. 24 (15), 2442-2453 (2013).
- Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nat Rev Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).
- Jevtic, P., Levy, D. L. Mechanisms of nuclear size regulation in model systems and cancer. Adv Exp Med Biol. 773, 537-569 (2014).
- Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
- Blom, J. H., Ten Kate, F. J., Schroeder, F. H., van der Heul, R. O. Morphometrically estimated variation in nuclear size. A useful tool in grading prostatic cancer. Urol Res. 18 (2), 93-99 (1990).
- Dey, P. Cancer nucleus: morphology and beyond. Diagn Cytopathol. 38 (5), 382-390 (2010).
- Cross, M. K., Powers, M. A. Learning about cancer from frogs: analysis of mitotic spindles in Xenopus egg extracts. Dis Model Mech. 2 (11-12), 541-547 (2009).
- Voeltz, G. K., Prinz, W. A., Shibata, Y., Rist, J. M., Rapoport, T. A. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124 (3), 573-586 (2006).
- Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
- Edens, L. J., Levy, D. L. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , John Wiley & Sons, Inc. 325-345 (2014).
- Levy, D. L., Heald, R. Biological Scaling Problems and Solutions in Amphibians. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (1), a019166 (2016).
- Edens, L. J., Levy, D. L. cPKC regulates interphase nuclear size during Xenopus development. J Cell Biol. 206 (4), 473-483 (2014).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , 2nd edn, North-Holland Publishing Company. (1967).
- Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30 (3), 687-696 (1982).
- Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
- Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
- Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nat Protoc. 1 (5), 2305-2314 (2006).
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).
- Khan, M. A., et al. Quantitative alterations in nuclear structure predict prostate carcinoma distant metastasis and death in men with biochemical recurrence after radical prostatectomy. Cancer. 98 (12), 2583-2591 (2003).
- Tan, P. H., Goh, B. B., Chiang, G., Bay, B. H. Correlation of nuclear morphometry with pathologic parameters in ductal carcinoma in situ of the breast. Mod Pathol. 14 (10), 937-941 (2001).
- Zeimet, A. G., et al. DNA ploidy, nuclear size, proliferation index and DNA-hypomethylation in ovarian cancer. Gynecol Oncol. 121 (1), 24-31 (2011).
- Theerthagiri, G., Eisenhardt, N., Schwarz, H., Antonin, W. The nucleoporin Nup188 controls passage of membrane proteins across the nuclear pore complex. J Cell Biol. 189 (7), 1129-1142 (2010).
- Wuhr, M., et al. Evidence for an upper limit to mitotic spindle length. Curr Biol. 18 (16), 1256-1261 (2008).
- Loughlin, R., Wilbur, J. D., McNally, F. J., Nedelec, F. J., Heald, R. Katanin contributes to interspecies spindle length scaling in Xenopus. Cell. 147 (6), 1397-1407 (2011).
- Wilbur, J. D., Heald, R. Mitotic spindle scaling during Xenopus development by kif2a and importin. eLife. 2, e00290 (2013).
- Kieserman, E. K., Heald, R. Mitotic chromosome size scaling in Xenopus. Cell Cycle. 10 (22), 3863-3870 (2011).
- Maresca, T. J., Freedman, B. S., Heald, R. Histone H1 is essential for mitotic chromosome architecture and segregation in Xenopus laevis egg extracts. J Cell Biol. 169 (6), 859-869 (2005).
- MacCallum, D. E., Losada, A., Kobayashi, R., Hirano, T. ISWI remodeling complexes in Xenopus egg extracts: identification as major chromosomal components that are regulated by INCENP-aurora B. Mol Biol Cell. 13 (1), 25-39 (2002).
- Goehring, N. W., Hyman, A. A. Organelle growth control through limiting pools of cytoplasmic components. Curr Biol. 22 (9), R330-R339 (2012).
- Du Toit, A. Development: Honey, I shrunk the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 633 (2014).
- Buchner, K. The role of protein kinase C in the regulation of cell growth and in signalling to the cell nucleus. J Cancer Res Clin Oncol. 126 (1), 1-11 (2000).
- Mochly-Rosen, D., Das, K., Grimes, K. V. Protein kinase C, an elusive therapeutic target. Nat Rev Drug Discov. 11 (12), 937-957 (2012).
