Abstract
В пробирке культуре первичных бронхиального эпителия (HBE) клеток человека с использованием условий радиоинтерфейса-жидкость обеспечивает полезную модель для изучения процессов дифференцировки и функции клеток в дыхательных путях. За последние несколько лет, использование лентивирусов векторов для доставки трансгенной стала обычной практикой. Хотя имеются сообщения о трансдукции полностью дифференцированных эпителиальных клеток дыхательных путей с некоторыми не связанными с ВИЧ псевдо-набран лентивирусах, общая эффективность трансдукции, как правило, менее 15%. Протокол, представленные здесь, обеспечивает надежный и эффективный способ получения лентивирусов и трансдуцировать первичных бронхиальных эпителиальных клеток. Использование недифференцированные бронхиальных эпителиальных клеток, трансдукции в бронхиальных эпителиальных среде для роста, в то время как клетки придают, с кратностью фактора инфекционного 4 обеспечивает эффективность близко к 100%. Этот протокол описывает, шаг за шагом, подготовки и концентрации векторов лентивирусов с высоким титром и гое процесс трансдукции. В нем рассматриваются эксперименты, которые определены оптимальные условия культивирования для достижения высокоэффективных первичных каскадов, бронхиальных эпителиальных клеток человека.
Introduction
Развитие репликации исправный, pseudotyped лентивирусах (LV) предоставила исследователям безопасный и эффективный метод для доставки трансгенов в пробирке 1. Из - за их долговременной экспрессии, эти LV также могут быть использованы для доставки терапевтических агентов в естественных условиях 2,3. Производство РН требует Котрансфекция эмбриональной почки человека (НЕК) клеток с несколькими плазмид: вектор переноса, упаковки кляп / Pol, упаковки оборот, и конверт вируса везикулярного стоматита (VSV гликопротеин-G) плазмид. Упаковочные системы третьего поколения считаются более безопасными , чем системы второго поколения , так как ген Rev кодируется на отдельной упаковочной плазмиды, тем самым уменьшая возможность рекомбинации , чтобы произвести к репликации лентивирус. Хотя упаковочные системы второго поколения дают пять раз выше, общее количество единиц трансдукции, раскол исходного вирусного генома, чтобы создатьсистема третьего поколения уменьшился уровень трансдукции только минимально 3,4.
В то время как клеточные линии могут быть трансдуцированных более легко и эффективно, исследователи сосредоточили свое внимание на первичные клетки, поскольку они являются более репрезентативными в естественных тканей 5,6. Однако первичные клетки невосприимчивыми к трансдукции. В то время как трансдукция полностью дифференцированных эпителиальных клеток дыхательных путей сообщалось, общая эффективность не превышает 15% 7.
Описанный здесь протокол, который позволяет производить с высоким титром LVs. Подход шаг за шагом излагается достичь почти 100% эффективности трансдукции в первичные клетки HBe. Более конкретно, протокол описывает оптимальные условия культивирования инструментальными для успеха 3. В кратком изложении, клетки 293Т НЕК трансфицируют с использованием лентивирусов вектора экспрессии PCDH с промотором стимулировать экспрессию EF-1 усиленного зеленого флуоресцентногобелка (EGFP) или mCherry, красный флуоресцентный белок, а также систему упаковки третьего поколения. LVs, выбрасываемых в СМИ собирают от 24 до 72 ч позже. Вирусные частицы концентрируются с полиэтиленгликолем (ПЭГ), удобный и простой метод концентрации вируса, прежде чем оценить титром с использованием набора антигена р24 твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Впоследствии недифференцированная первичные клетки HBE трансдуцируют в средах пролиферации (бронхиальные эпителиальные среде роста или BEGM) 8, в то время как имеется (после того , как трипсином), при множественности инфекции (MOI) в 4 раза, добавляя бромид hexadimethrine и инкубирование в течение 16 ч ( с ночевкой). Клетки затем дают возможность дифференцировать. Так как вирусный трансген экспрессируется в долгосрочной перспективе (с использованием соответствующего промотора, обсуждение см), выражение будет поддерживаться во время дифференцировки в псевдомногослойный эпителии дыхательных путей или могут быть вызваны (используя индуцируемый промотор) после дифференцировки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Этап 1: Культура НЕК 293T
- Готовят НЕК клетки печати (называемые также НЕК СМИ) добавлением 10% (об / об) фетальной бычьей сыворотки (ФБС) и 1% (об / об) пенициллина / стрептомицина с высоким содержанием глюкозы Дульбекко Модифицированный Орлиное Medium (DMEM),.
- Смазать один 10 см блюдо культуры ткани с коллагеном I. Смешайте 30 мкл коллагена I в 2 мл дистиллированной воды. Распространение смесь на блюдо и инкубировать в течение 2 ч при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
- Удалите смесь и дайте блюду Сушат в шкафу с ламинарным потоком в течение 15 мин.
- Пластина НЕК клеток на чашке с нанесенным покрытием при плотности 1 х 10 6 клеток в 10 мл НЕК сред и инкубируют при температуре 37 ° С и 5% СО 2.
- Когда НЕК клетки 50-60% сплошности (рис 1а, через 2-3 дня после посева), переходите к этапу 2. Визуальная оценка сплошности достаточно. Ни один Количественное не требуется.
Примечание: НЕК клетки культивируют в НЕК средах (смотри выше). Когда они достигают слитности, тэй могут быть разделены (например , 1/5) , или замораживают для последующего использования.
2. Стадия 2: Производство и концентрация Лентивирусов (LVS) в НЕК клетках
Примечание: Протоколы должны быть выполнены в соответствии с институциональными и правительственными правилами в соответствии с BSL-2 + (расширенная BSL-2) условия в США.
- Трансфекцию с использованием процедуры осаждения кальция (липофектамина и других агентов трансфекции не были столь же эффективным, как и процедура осаждения кальция). Использование коммерческого набора для трансфекции, рекомендуется, чтобы гарантировать воспроизводимость, хотя процедура изменяется следующим образом. Доведите все реагенты до комнатной температуры. Это день 0.
- Для каждого 10 см блюдо из клеток НЕК293, смешать 4,5 мкг оболочки ДНК pMD2-VSVG, 7,5 мкг упаковочного ДНК pMDLg / pRRE, 3,75 мкг ДНК ВКПП-REV, 10 мкг ДНК лентивирусов вектора экспрессии, 86 мкл раствора 2 М кальция , и стерильную воду в центрифужные пробирки объемом 15 мл до конечного объема 700 мкл(Последние два решения можно найти в комплекте коммерческой трансфекция).
- По каплям, добавьте 700 мкл 2x HEPES-буферном солевом растворе (HBS, предусмотренные в комплекте) трансфекцию в то время как вортексе (в шкафу с ламинарным потоком) и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин (перейдите к шагу 4 во время ожидания).
- В течение раннего периода инкубации, депозит 5 мкл смеси на слайде. Проверьте капельку под микроскопом с объективом 10Х, сосредоточившись медленно вверх и вниз. Тонкий осадок должен быть виден, подтверждая процесс осаждения фосфата кальция (рис 1b).
- Остановка осаждения через 30 мин путем добавления 10 мл НЕК клеток СМИ и пипеткой вверх и вниз перемешать.
- Возьмите блюдо из клеток НЕК из стадии 2.1-2.5, и удалить среду (день 0). Добавьте преципитатный раствора со стадии 2.5 осторожно и медленно вдоль края тарелки.
- На следующий день (день 1), снимите и выбросьте среду, содержащую осадок и заменить его весIth 10 мл НЕК среды. Проверьте наличие тонкого осадка под микроскопом: он должен быть виден в блюдо в пустых пространствах между клетками (рис 1c и г).
- На 2-й день, собирают средства массовой информации с помощью шприца, фильтруют через фильтр в шприце с размером пор 0,45 мкм в 15 мл центрифужную пробирку, содержащую 3,8 мл 40% полиэтиленгликоля раствора (ПЭГ). Инверсия 5x, чтобы смешивать и хранить при температуре 4 ° С в течение по меньшей мере 24 ч (в течение ПЭГ осаждаются с образованием, но не более чем на 5 дней), пока все вирусные коллекции являются полными.
- Повторите шаг 2,8 дни 3 и 4. На 4-й день не заменяют НЕК среды, но обеззараживать с 10% отбеливателя и выбросить блюдо.
- Центрифуга все трубки сбора (как правило, все коллекции вместе на 5-й день) в 1,650 мкг в течение 20 мин при 4 ° C, чтобы осадить вирус. Удалите и отбросить супернатант, и снова вращаются со скоростью 1,650 мкг в течение 5 мин при 4 ° С, чтобы собрать и удалить любой оставшийся ПЭГ супернатанта.
- ResusПЭНД гранула из каждой пробирки в 200 мкл бронхиальной эпителиальной ростовой среды (BEGM) без амфотерицина 8. Бассейн их вместе и аликвоты по 200 мкл. Вирус Хранить при температуре -80 ° C. Алиготе еще 10 мкл для выполнения ВИЧ-1 Gag (p24) антиген ELISA анализа.
- С помощью коммерческого набора ELISA, выполнить анализ антигена р24 в соответствии с протоколом производителя. Анализ дает оценку вирусного p24 в пг / мл.
3. Этап 3: Культура Первичная HBE Клетки
- Тарелка HBE клетки в 10 мл BEGM среды (100 мкл амфотерицина В , если проход 0 клетки используются для устранения возможного грибкового заражения) при плотности 1 х 10 6 клеток в коллагена I покрытием 10 см блюдо культуры ткани. Инкубируют при 37 ° С и 5% СО 2.
- На следующий день, удалите среду и заменить 10 мл BEGM (100 мкл амфотерицина для прохода 0 клеток) в общей сложности на 4 дня. Возвращение в инкубатор.
- После 4 днейAYS, используйте только BEGM без амфотерицин B. Изменение СМИ через день.
- Когда клетки составляют 80-90% сплошности (рис 2а; ~ 7 дней после посева), приступить к трансдукции (обратите внимание на 3.5 для подготовки перед трансдукции). Опять же, визуальная оценка состояния сплошности достаточна. Ни один Количественное не требуется.
- До трансдукции, пальто проницаемые опорные пластины с раствором коллагена IV разводили 1/10 стерильной дистиллированной водой. Добавьте 200 мкл в каждую вставку и просушить в течение ночи в шкафу с ламинарным потоком.
4. Стадия 4: Трансдукция HBe клеток
- Удалить вложение , добавляют 3 мл 0,1% трипсина в 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты в фосфатном буферном растворе (ЭДТА / ФБР) и инкубировать 5 мин при 37 ° С и 5% СО 2. Проверьте под микроскопом (10х) объективной, чтобы увидеть, если все клетки отсоединяются. Если нет, вернитесь в инкубатор еще в течение 5 мин.
- Когда все клетки отделяют, добавляют 3мл соевого ингибитора трипсина (SBTI 1 мг / мл), перемешивают и перенос т в центрифужную пробирку на 15 мл. Гранул клетки центрифугированием при 460 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 3 мл BEGM и приступить к подсчету.
- Клетки Ресуспендируют HBE ( в настоящее время прохождение 1 или P1) в соотношении 2 × 10 5 клеток на одну проницаемой опорной вставки 12 мм в 400 мкл BEGM (смотри таблицу 2). Экстраполировать эти числа, основанные на количестве проницаемых вставках поддержки, которые будут трансдуцированных.
| поверхность | Площадь поверхности | Количество клеток | СМИ | Объем (СМИ) |
| 10 см блюдо | 52,7 см 2 | 1 х 10 6 | BEGM | 10 мл | </ TR>
| 12 мм фильтр | 1.13 см 2 | 2 х 10 5 | BEGM | 400 мкл |
| 24 мм фильтр | 4,52 см 2 | 8 х 10 5 | BEGM | 800 мкл |
Таблица 2: Медиа экстраполяция на количество клеток.
- Использование множественности инфекции (MOI) в 4 раза, добавьте соответствующий объем вируса к клеточной суспензии.
- Добавить полибрен в / мл конечной концентрации 2 мкг.
- Разлить 400 мкл смеси (BEGM, HBE клетки, вируса и бромид hexadimethrine) на проницаемой опорной вставки в апикальной отсек, и добавьте 1 мл BEGM в одиночку базолатеральной отсек. Выдержите в течение ночи при 37 ° С и 5% CO 2. Всегда пластины HBe клеток без вируса в качестве контроля и отбора испытаний пуромицин , если это применимо.
- На следующий день, бэрOve вершинные и базолатеральных СМИ, промывают PBS, и заменить оба отсека с воздушно-жидкостную интерфейса (ALI) средства массовой информации 8.
- Когда клетки сливающийся, удалить верхушечный жидкость (известный как создание интерфейса воздух-жидкость). Продолжить изменение среды (ALI) в нижнем отсеке через день, пока они не достигнут полной зрелости; как правило, от 3 до 4 недель спустя.
Примечание: Если лентивирусов вектор содержит ген селекции, таких как пуромицин, клетки могут быть выбраны путем добавления пуромицин в соответствии с кривой концентрации отбора. Для клеток HBe, в концентрации 1 мкг / мл было определено, что идеально подходит для последовательного отбора трансдуцированных клеток. Тем не менее, эта концентрация может отличаться для других клеток или условий и должно быть определено путем убийства кривых. Добавление пуромицин может начаться уже через день после того, как носитель был заменен ALI СМИ или позже (2-3 дня), чтобы обеспечить полную экспрессию гена селекции. Не забудьте добавить пуромицин к одной вставке, ча не трансдуцированная. Пуромицин могут быть добавлены до тех пор, пока клетки не будут полностью дифференцированы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показаны различные ключевые этапы оценки клеток и решений в процессе трансфекции. На рисунке 1а показана оптимальная слитности из HEK293T клеток до трансфекции для производства вируса. Важно , что клетки равномерно распределены по всему блюду. Рисунок 1b показывает осадок в капле трансфекции смеси с использованием светлого поля оптики и объектив 10X. Чем больше преципитаты выглядят как песчинки, а не агломератов, тем более эффективной трансфекции будет. В этой картине, осадок немного грубым. Осадок является надежным индикатором, будет ли трансфекцию издает высокий титр вируса. Если какой-либо из ингредиентов либо отсутствует, либо низкого качества (вектор ДНК, например), агломераты будут образовывать, которая является зловещим признаком. Если это так, то разумнее прервать и начать процедуру заново, убедившись в том, чтовсе ингредиенты в смеси, и / или проверки качества векторной ДНК и упаковки ДНК. На фиг.1С показан тот же блюдо , как А, после инкубации в течение ночи. Осадок (и должен быть) видна между клетками. Мы заметили, что клетки не размножаются много в течение 24 ч после трансфекции.
На рисунке 2 показано , как HBE клетки выглядят до и 3 дня после трансдукции. Рисунок 2а изображает примерно 80% сплошности первичных HBe клеток перед обработкой трипсином и трансдукции. 10 см блюдо на 80% слияния дает приблизительно 4 × 10 6 клеток. Рисунок 2b показывает почти 100% трансдукцию недифференцированных клеток P1 HBe с использованием УМВД 4 на проницаемой опорной пластины. Когда клетки HBE высевают на этих проницаемых вставок поддержки, клетки являются относительно плоскими. На этой картинке, высота ячеек составляет всего несколько микрон, которая объясняет, почему0,4 мкм поры видны хотя клетки.
На рисунке 3 показаны экспериментов по оптимизации , приводящие к представленному протоколу. Все эксперименты были проведены в трех повторах на коллагене I покрытых лунок (24-луночного планшета), с 2 - х 10 5 клеток первичных HBe на каждую лунку. Большинство экспериментов использовали MOI 0,4 с 2 мкг / мл конечной концентрации hexadimethrine bromidein BEGM сред. Флуоресцентные клетки подсчитывали через 3 дня после трансдукции. Даже если начальная оптимизация протокола была выполнена на пластике, результаты были подтверждены на проницаемых вставках поддержки. Кроме того, попытки трансдукции полностью дифференцированные клетки Р1 HBe не удалось (данные не показаны), что подтверждает предыдущие сообщения. Как видно на рисунке 3а, более высокий процент клеток HBE трансдуцируют в BEGM средах по сравнению с ALI. Если клетки высевают за день до трансдукции в BEGM СМИ, эффективностьзначительно снизились по сравнению с передающим в то время как клетки имеется (рис 3b). Когда Р1 HBE клетки высевают за день до трансдукции в ALI средах (вместо BEGM), эффективность трансдукции уменьшается еще больше (данные не показаны). Различие между этими 2 сред является концентрация кальция. BEGM медиа содержит низкую концентрацию кальция (0,1 мМ) по сравнению с ALI сред (1 мМ). Форм кальция и поддерживает плотные контакты и , следовательно, может затруднить вирусные частицы , чтобы пересечь 9 и получить доступ к их рецепторами на базолатеральной мембране. На самом деле, некоторые инфекции были успешными на низком уровне путем разрушения плотных контактов с использованием этиленгликоля тетрауксусной кислоты (EGTA) , например , 10. Как было сказано выше, полностью дифференцированные клетки Р1 HBE являются упорными и могут быть трансдуцированных только с низкой эффективностью 5-7, что может быть из - за плотных соединений с высоким содержанием кальция в средах , содержащих. Другое объяснениенизкая эффективность трансдукции в полностью дифференцированных клетках является активным мукоцилиарная транспортный механизм, где слизь может выступать в качестве барьера. Или, как сообщает Bals и др., Стадия дифференцировки , в которой HBE клетки, является определяющим фактором эффективности трансдукции 10. Тот факт , что больше клеток получают трансдуцированная в BEGM чем в ALI СМИ поддерживает это заявление (рис 3а).
Как видно на рисунке 3b, наблюдалось увеличение почти на 50% эффективности трансдукции , когда клетки были трансдуцированных Придавая по сравнению с клетками высевают за день до. В своем исследовании, Рикс и др. Показали увеличение на 20% при трансдукции была выполнена после того, как 11 трипсином. Вместе эти результаты свидетельствуют о том, что средства массовой информации и состояние зрелости клеток является ключом к успеху трансдукции.
Панель на рисунке3в, демонстрирует hexadimethrine bromideplaying atrivial роль в эффективности трансдукции. Тем не менее, его использование предлагается в данном протоколе, поскольку он не оказывает негативного влияния, но потенциально может быть полезным. Полибрен представляет собой катионный полимер , который используется в вирусологии для повышения эффективности трансдукции 12. Другие опубликовали использование протамина, другого катионного полимера, но никаких существенных различий не было обнаружено в отношении эффективности трансдукции по сравнению с полибрен 13. Полибрен не влияет на рост , ни дифференциации 14-16.
Наконец, различные MÕIS были исследованы на рисунке 3D: высокая эффективность трансдукции произошло с МВД 4. Там не было никакого существенного различия между MOI 0,4 и 4, однако, МВД России 4 трансдуцированная 100% клеток HBe , тогда как MOI 0,4 только трансдуцированная 75%. МВД России определяет, сколько вирусных частиц Wiбудете иметь потенциал, чтобы инфицировать одну ячейку. Существуют различные методы определения Mol. Один из них заключается в определении количества трансдукции единиц (ТУ). С помощью ELISA, количество антигена p24 может быть определена в пг / мл. Вирусный р24 в пикограмм могут быть преобразованы в ТУ, которые необходимы для расчета Mol. MOI рассчитывается путем деления числа ТУ по количеству клеток. Есть 10-100 трансдукции единиц (ТУ) на пикограммовом p24. Все ссылки в тексте относительно MOI основаны на расчетах с 100 ТУ на пикограммовом p24. (Http://tronolab.epfl.ch/webdav/site/tronolab/shared/protocols/TUvsp24.html).
Рисунок 1:. Трансфекция клеток 293Т НЕК (а) НЕК 293T клетки выращивали до 50-60% сплошности , как видно под объективом 10Х. (Б) Осаждают видна в 5 мкл капли 5 мин после смешивания всех reageNTS под микроскопом (объектив 10Х). (С) оседает в чашке рядом с клетками, после ночной трансфекции (10X объектное). (Г) Увеличение центра (с). Белая стрелка, указывающая для осаждения. Шкала бар = 100 мкм; то же самое для а, Ь и с. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: трансдукция клеток NHBE (а) HBE клетки , выращенные в чашке с покрытием коллагена I 80-90% сплошности (приблизительно 4 х 10 6 клеток) в BEGM СМИ в течение 5 дней (10X) объективной.. Шкала бар = 100 мкм. (Б) EGFP трансдуцированных клеток HBE на проницаемых вставках поддержки (12 мм), 3 дня пост трансдукции (конфокальной, 20X). В этом состоянии, HBE чел Ls являются плоскими и поры мембраны должны быть видны. Шкала бар = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Оптимизация протокола трансдукции (а) Влияние средств массовой информации на эффективность трансдукции.. (Б) Сравнение трансдукции в клетках HBe высевают за день до и трансдукции клеток в то время как есть. (С) Влияние бромистого hexadimethrine на эффективность трансдукции. (D) оценка эффективности трансдукции улучшенных с использованием различных MÕIS. Анализ проводили с использованием Т-теста Стьюдента или множественный тест сравнения Крускала-Уоллиса и Данна. Усы представляют SE и все * представляют р <0,05.ww.jove.com/files/ftp_upload/54176/54176fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол описано здесь обеспечивает почти 100% эффективности трансдукции. Тем не менее, есть шаги в процессе, которые являются важными для достижения этой цели. Например, во время процесса трансфекции, наличие преципитатов в трансдукции смеси (капли) или в чашке на следующий день после того, как трансдукции (рис 1б и г) имеют прямое отношение к хорошей трансфекцией. Отсутствие осадка или присутствие агломератов может быть связано с пропуском одного из реагентов трансфекции, вопроса рН, или плохой плазмидного препарата. Если осадок отсутствует, существует высокая вероятность того, что ни один не будет виден на следующий день. Кроме того, добавление смеси или трансфекции HEK СМИ слишком быстро может привести к НЕК клетки отделяться, препятствуя трансфекции и выход. Другой признак хороший выход на 6-й день, перед стадией центрифугирования: белый осадок должен быть виден в нижней части трубы. Плохая трансфекция с почтини один вирус не будет создавать этот белый осадок. Во время процесса трансдукции, важно использовать первичные клетки HBe, которые были де-дифференцированы и которые находятся в стволовых клеток, как состояние с целью достижения высокой эффективности трансдукции. Применение вектора, содержащего флуоресцентный белок, такой как EGFP или mCherry, что легко визуализируется может быть хорошим инструментом.
Изменения могут быть сделаны, чтобы адаптировать этот протокол для различных первичных клеток. Один из возможных подходов для снижения концентрации кальция в средствах массовой информации. Как показано на рисунке 3а, используя BEGM носитель информации, содержащий более низкую концентрацию кальция привело к значительному повышению эффективности трансдукции в первичных клетках HBe. Другой подход может заключаться в увеличении Mol. Как показано на рисунке 3d, тем выше MOI, тем лучше эффективность трансдукции. Тем не менее, с использованием более высокой MOI может стать токсичным для некоторых клеток.
Тем не менее, есть некоторые Лимита ных к этому протоколу. Этот метод был разработан с использованием прохода 1 HBe клетки. Лёгкие отвергнутые для пересадки были получены с согласия соответствующего для научных исследований, соответствующей стандартам, установленным Хельсинской декларацией. Получение первичных клеток HBE из коммерческих источников, может быть дорогим. Эти клетки, как правило, также доступны только при более высоком проходе. Этот протокол не был протестирован на проходах выше 2. Другим ограничивающим фактором является p24 ELISA антигена анализа. Несколько компаний предлагают комплект, но по высокой цене. Кроме того, вирусная концентрации, с помощью анализа, является только приблизительное значение , так как тест обнаруживает лентивирус р24 и р24 , свободный , выделяемое при временной трансфекции 17. Таким образом, эта оценка MOI только оценка. Наконец, используя другое выражение конструкции (больше или меньше по размеру) не может дать те же результаты. Например, различные эффективности были записаны с использованием mCherry и EGFP (данные не показаны).
лор "> Есть преимущества этого протокола по сравнению с другими способами. Один из них является процесс трансфекции. В самом деле, предлагаемый протокол может дать такие высокие титры вируса, что собранные средства массовой информации, содержащие вирусы больше не нужно быть сконцентрированным и может быть использовано непосредственно к трансдукции клеток. полиэтиленгликоль (ПЭГ), используемый в этом протоколе , чтобы сконцентрировать вирус, как известно, быть токсичными к клеткам млекопитающих 18. Кроме того, если были использованы выше MOI, это приведет к увеличению риска токсичности даже больше. Тем не менее, если стадия концентрирования ПЭГ становится устаревшим, исследователи, которые были неудачны для трансдукции из-за эффектов токсичности может пересмотреть использование лентивирусах. Еще одним преимуществом этого протокола является отсутствие различий в эффективности трансдукции на пластике или проницаемые опорных вставок. преимущество, заключающееся в состоянии трансдукции на пластике, что меньше необходимы клетки и вирусные частицы. в результате, эти клетки могут быть расширены после трансдукции и переданына проницаемые вставки поддержки при сливающихся (данные не показаны).Выбор векторов зависит от целого ряда проблем, таких как выбор трансдуцированных клеток с пуромицин или экспрессии маркерных белков, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP). Есть несколько коммерческих векторов доступны , которые являются подходящими (pRRLsinPPT.CMV.MCS.Wpre, PCDH-EF1-MCS-IRES-Puro, PCDH-EF1-MCS-T2A-Puro, pGEM-T Easy) 15,19-21. Выбор промоторов создает проблемы, так как обычно используется CMV промотор притихли в дифференцированных эпителиальных клеток дыхательных путей 15. Для экспрессии мерцательного специфичного для клеток, рекомендуется использовать промотор лисица-j1. В качестве альтернативы, EF-1 промотор может быть использован для экспрессии в клетках всех дыхательных путях 20,21. Если белок гиперэкспрессия ищется, размер вставки будет определять, в частности, эффективность трансдукции. Тем не менее, большие размеры могут быть размещены как видно успешной трансдукции полнометражного растворимы аденилатциклазы 22 .The лаборатория опубликовала несколько успешных суперэкспрессия строит 15,16,20-22. Для экспрессии shRNA (обычно под U6 или H1 промотора), множественные конструкции должны быть изучены. Это может быть утомительным с тестов, проведенных в конце дифференцировки (ПЦР и вестерн-блоттинга), но этот процесс не может быть сокращено, так как недифференцированные клетки, не может быть хорошим представлением успеха для клеток, подвергающихся дифференциации. Опять же , лаборатория опубликовала многократный успешно shRNA строит 14,20,21,23.
Используя этот протокол, больше исследователей может быть включена, чтобы значительно улучшить предыдущие бедных каскадов,. Кто-то может оказаться полезным для повышения эффективности, сделав несколько корректировок. Некоторые могут использовать этот инструмент, чтобы обнаружить новые биологические процессы или быть в состоянии доказать понятия, как с помощью нокдаун или избыточная экспрессия стратегий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарим Life Alliance Organ восстановления Агентство Университета Майами для обеспечения легких. Мы также благодарим доктора Лиза Кюнци для получения ДНК, используемой для экспериментов, показанных на рисунке 2B и 3-D, д-р Бен Gerovac и Лиза Новак для вируса mCherry используется для экспериментов на фигурах 3А до C. Мы также благодарим Габриэль Gaidosh от объекта изображения, отделение офтальмологии в университете Майами.
Это исследование спонсируется за счет грантов от NIH, на CF Foundation и стюардесса медицинского научно-исследовательского института д-ру Matthias Salathe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | 12306C | use at 10% |
| DMEM | Thermo Scientific | 11995-040 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Thermo Scientific | 15140-122 | use at 1x |
| Collagen I | BD Biosciences | 354231 | dilute 1:75 in distilled water |
| Calphos | Clontech | 631312 | Transfection kit containing 2 M Calcium solution, 2x HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O |
| Polythylene glycol 8000 | VWR scientific | 101108-210 | stock of 40% |
| Amphotericin B | Sigma | A9528 | use at 1x |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Transwell 12 mm | Corning | 3460 | |
| Collagen IV | Sigma | C7521 | dilute 1:10 in distilled water |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | stock of 2 mg/ml |
| Puromycin (10.000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | use at 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 | lentiviral expression vector |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | packaging DNA |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | packaging DNA |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | packaging DNA |
References
- Ding, B., Kilpatrick, D. L. Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons. Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).
- Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Jr Gene therapy progress and prospects: development of improved lentiviral and retroviral vectors--design, biosafety, and production. Gene Ther. 12, 1089-1098 (2005).
- Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnol. 13, (2013).
- Delenda, C. Lentiviral vectors: optimization of packaging, transduction and gene expression. J Gene Med. 6 Suppl 1, S125-S138 (2004).
- Gresch, O., Altrogge, L. Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells. Methods Mol Biol. 801, 65-74 (2012).
- Jordan, E. T., Collins, M., Terefe, J., Ugozzoli, L., Rubio, T. Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells. J Biomol Tech. 19, 328-334 (2008).
- Castillon, N., et al. Regeneration of a well-differentiated human airway surface epithelium by spheroid and lentivirus vector-transduced airway cells. J Gene Med. 6, 846-856 (2004).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. 107, 183-206 (2005).
- Gonzalez-Mariscal, L., et al. Role of calcium in tight junction formation between epithelial cells. Am J Physiol. 259, C978-C986 (1990).
- Bals, R., et al. Transduction of well-differentiated airway epithelium by recombinant adeno-associated virus is limited by vector entry. J Virol. 73, 6085-6088 (1999).
- Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 17, 441-450 (2008).
- Davis, H. E., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 97, 159-172 (2002).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, 341-347 (2013).
- Manzanares, D., et al. Functional apical large conductance, Ca2+-activated, and voltage-dependent K+ channels are required for maintenance of airway surface liquid volume. J Biol Chem. 286, 19830-19839 (2011).
- Schmid, A., et al. Real-time analysis of cAMP-mediated regulation of ciliary motility in single primary human airway epithelial cells. J Cell Sci. 119, 4176-4186 (2006).
- Unwalla, H. J., Ivonnet, P., Dennis, J. S., Conner, G. E., Salathe, M. Transforming growth factor-beta1 and cigarette smoke inhibit the ability of beta2-agonists to enhance epithelial permeability. Am J Respir Cell Mol Biol. 52, 65-74 (2015).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6, (2006).
- Schneiderman, S., Farber, J. L., Baserga, R. A simple method for decreasing the toxicity of polyethylene glycol in mammalian cell hybridization. Somatic Cell Genet. 5, 263-269 (1979).
- Schmid, A., et al. Soluble adenylyl cyclase is localized to cilia and contributes to ciliary beat frequency regulation via production of cAMP. J Gen Physiol. 130, 99-109 (2007).
- Manzanares, D., et al. Airway Surface Dehydration by Transforming Growth Factor beta (TGF-beta) in Cystic Fibrosis Is Due to Decreased Function of a Voltage-dependent Potassium Channel and Can Be Rescued by the Drug Pirfenidone. J Biol Chem. 290, 25710-25716 (2015).
- Manzanares, D., et al. IFN-gamma-mediated reduction of large-conductance, Ca2+-activated, voltage-dependent K+ (BK) channel activity in airway epithelial cells leads to mucociliary dysfunction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L453-L462 (2014).
- Chen, X., et al. A soluble adenylyl cyclase form targets to axonemes and rescues beat regulation in soluble adenylyl cyclase knockout mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 51, 750-760 (2014).
- Ransford, G. A., et al. Pannexin 1 contributes to ATP release in airway epithelia. Am J Respir Cell Mol Biol. 41, 525-534 (2009).
