Abstract
בתרבות במבחנה של אפיתל הסימפונות אדם מן המעלה הראשונה (HBE) תאים באמצעות תנאים ממשק אוויר נוזלי מספקת מודל שימושי כדי לחקור את התהליכים של התמיינות תאים בדרכי הנשימה ותפקוד. בשנים האחרונות, השימוש וקטורים lentiviral למסירה transgene הפך לנוהל קבוע. אמנם ישנם דיווחים על התמרה של תאי אפיתל דרכי נשימת בדיל באופן מלא עם lentiviruses פסאודו הקלדה מסוים ללא HIV, את יעילות התמרה הכללית היא בדרך כלל פחות מ -15%. הפרוטוקול המובא כאן מספק שיטה אמינה ויעילה לייצר lentiviruses וכדי transduce תאי אפיתל סימפונות אדם מן המעלה ראשונה. שימוש בתאי אפיתל סימפונות מובחנים, התמרו בתקשורת צמיחת אפיתל סימפונות, בעוד התאים לצרף, עם ריבוי של גורם זיהום של 4 מספק יעילות קרובה ל -100%. פרוטוקול זה מתאר, צעד-אחר-צעד, ההכנה וריכוז וקטורי lentiviral גבוהה כיילו ו התהליך התמרת דואר. הוא דן ניסויים אשר קבעו את תנאי התרבות האופטימליים להשגת transductions היעילה ביותר של תאי אפיתל סימפונות אדם מן המעלה הראשון.
Introduction
פיתוח שכפול פגום, lentiviruses Pseudotyped (LV) סיפקה לחוקרים שיטה בטוחה ויעילה כדי לספק transgenes במבחנה 1. בשל הביטוי שלהם לטווח הארוך, LV אלה יכולים לשמש גם עבור המשלוח ממוקד של תרופות in vivo 2,3. ההפקה של LV דורשת שיתוף transfection של כליה עוברית אנושית (HEK) תאים עם כמה פלסמידים: העברת וקטור, איסור פרסום אריזה / pol, rev אריזה, ומעטפת גליקופרוטאין וירוס stomatitis שלפוחי (VSV-G) פלסמידים. מערכות אריזת דור שלישי נחשבים בטוחים יותר מאשר מערכות דור השני בגלל גן rev מקודד על פלסמיד אריזה נפרד, ובכך להפחית את האפשרות של רקומבינציה לייצר lentivirus שכפול מוסמכות. בעוד שמערכות אריזת דור השני להניב חמש יחידות תמרה הכולל גבוהות פי, הפיצול של הגנום הויראלי המקורי כדי ליצורמערכת הדור השלישי ירד לרמה של תמרה רק 3,4 מינימאלית.
בעוד שורות תאים ניתן transduced יותר בקלות וביעילות, חוקרים הסיט את המוקד שלהם תאים ראשוניים, כי אלה הם יותר נציג in vivo רקמות 5,6. עם זאת, תאים ראשוניים הם עקשנים תמרה. בעוד התמרה של תאים בדרכי הנשימה אפיתל הבדיל באופן מלא דווחו, את היעילות הכוללת כאמור לא עלתה על 15% 7.
המתואר כאן הוא פרוטוקול המאפשר ייצור של LVS גבוהה כייל. גישה צעד-אחר-צעד המתואר להשיג כמעט 100% יעילות התמרה לתאים HBE העיקרי. באופן ספציפי יותר, הפרוטוקול מתאר את תנאי התרבות האופטימליים אינסטרומנטלי להצליח 3. בקצרה, תאי 293T HEK הם transfected באמצעות pCDH וקטור ביטוי lentiviral עם ביטוי נהיגת האמרגן EF-1 של פלואורסצנטי ירוק משופר חלבון (eGFP) או mCherry, חלבון פלואורסצנטי אדום, ומערכת אריזה מדור שלישי. LVS מתפזרת התקשורת נאספת 24 עד 72 שעות מאוחר יותר. את חלקיקי הנגיף מרוכזים עם פוליאתילן גליקול (PEG), שיטה נוחה וקלה של ריכוז נגיפי, לפני האמידה כייל באמצעות אנטיגן p24 assay immunosorbent אנזים צמוד ערכה (ELISA). כתוצאה מכך, התאים HBE העיקרי מובחן הם transduced במדיה התפשטות (מדיום הגידול אפיתל הסימפונות או BEGM) 8, תוך הצמדת (לאחר trypsinized), על ריבוי של זיהום (משרד הפנים) גורם של 4, הוספת ברומיד hexadimethrine דוגרים במשך 16 שעות ( בין לילה). התאים מותר אז להבדיל. מאז transgene ויראלי מתבטא לטווח ארוך (באמצעות האמרגן המתאים, ראה דיון), הביטוי יישמר לאורך בידול לתוך האפיתל בדרכי הנשימה pseudostratified או יכול להיגרם (באמצעות האמרגן מושרה) לאחר התמיינות.
תחת = "jove_content"> פרוטוקול זה הוא עניין רחב לחוקרים שרוצים להשתמש בתאי HBE עיקריים במקום שורות תאים, והוא עשוי להיות להתאמה קשה אחרים כדי transduce סוגי תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. שלב 1: תרבות של HEK 293T
- כן תקשורת תאי HEK (המכונה בשם מדיה HEK) על ידי הוספת 10% (V / V) בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% (v / v) פניצילין / סטרפטומיצין כדי גלוקוז גבוהה הבינוני של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM).
- שכבה אחת 10 ס"מ צלחת בתרבית רקמה עם קולגן I. Mix 30 μl של קולגן אני ב 2 מ"ל של מים מזוקקים. מורח את התערובת על צלחת דגירה במשך שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- הסר את התערובת ולתת יבש צלחת בארון זרימה למינרית במשך 15 דקות.
- תאי HEK פלייט על הצלחת המצופית בצפיפות של 1 x 10 6 תאים 10 מיליליטר תקשורת HEK לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- כאשר תאי HEK הם 50-60% ומחוברות (איור 1 א, 2-3 ימים לאחר הציפוי), המשך לשלב 2. הערכה חזותית של confluency מספיקה. אין כימות הוא זקוק.
הערה: תאי HEK בתרבית תקשורת HEK (ראה לעיל). כשהם מגיעים confluency, tהיי ניתן לפצל (למשל 1/5) או קפוא למטה לשימוש מאוחר יותר.
2. שלב 2: הפקה וריכוז של Lentiviruses (LVS) בתאים HEK
הערה: הפרוטוקולים צריכים להיות מוצאים להורג בקנה אחד עם תקנות מוסדיות וממשלתיות תחת BSL-2 + (BSL-2 משופר) תנאים בארצות הברית.
- Transfect באמצעות הליך משקעים סידן (lipofectamine וסוכני transfection אחרים לא היו יעילים כמו הליך משקעים סידן). שימוש ערכת transfection מסחרית מומלץ להבטיח שחזור, אם כי הנוהל ישונה כדלקמן. תביאו את כל ריאגנטים לטמפרטורת החדר. זהו יום 0.
- עבור כל צלחת 10 ס"מ של תאים HEK293, לערבב 4.5 מיקרוגרם של המעטפה DNA pMD2-VSVG, 7.5 מיקרוגרם אריזת הדנ"א pMDLg / pRRE, 3.75 מיקרוגרם DNA pRSV-rev, 10 מיקרוגרם DNA של וקטור ביטוי lentiviral, 86 μl של פתרון סידן 2 M מים, סטרילי צינור צנטריפוגות 15 מ"ל לנפח סופי של 700 μl(הפתרונים שני האחרונים הם המסופקים בערכת transfection המסחרית).
- טיפה חכם, להוסיף 700 μl של תמיסת מלח HEPES שנאגרו 2x (HBS, המסופק בערכה transfection) בעוד vortexing (בקבינט זרימה למינרית) ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות (לבצע שלב 4 בזמן ההמתנה).
- בזמן הדגירה מוקדם, הפקדה 5 μl של תמהיל בשקופית. בדוק את אגל תחת מיקרוסקופ עם מטרה 10X, התמקדות לאט למעלה ולמטה. משקע בסדר צריך להיות גלוי, המאשר את התהליך המשקע סידן פוספט (איור 1b).
- עצור את המשקעים לאחר 30 דקות על ידי הוספת 10 מיליליטר של תקשורת תאי HEK ו פיפטה מעלה ומטה כדי לערבב.
- קח את המנה של תאי HEK משלב 2.1-2.5, ולהסיר מדיום (יום 0). מוסיפים את פתרון המשקע משלב 2.5 בזהירות ובאיטיות לאורך דופן הקערה.
- למחרת (יום 1), ולהסיר ולסלק המדיום המכיל את המשקע ולהחליף אותו wה- i 10 מ"ל של מדיום HEK. בדקו אם המשקע בסדר מתחת למיקרוסקופ: זה צריך להיות גלוי בצלחת בחללים ריקים שבין התאים (1c הדמוי ד).
- ביום 2, לאסוף התקשורת עם מזרק, מסנן דרך מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר לתוך שפופרת 15 מ"ל צנטריפוגות המכיל 3.8 מ"ל של פוליאתילן גליקול 40% פתרון (PEG). הפוך 5x לערבב ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 24 שעות (עבור PEG לזרז להיוצר, אך לא יותר מ 5 ימים) עד שכל אוספי הווירוס הושלם.
- חזור על שלב 2.8 בימים 3 ו -4 ביום 4 לא להחליף עם המדיום HEK אבל לטהר עם אקונומיקה 10% וזורקים את המנה.
- צנטריפוגה כל צינורות האיסוף (בדרך כלל כל האוספים יחד ביום 5) ב 1,650 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C עד גלולת הווירוס. הסר וזורקים supernatant, ספין שוב ב 1,650 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי לאסוף ולהסיר כל הנותרים של supernatant PEG.
- Resuspend גלולה של כל צינור 200 μl של מדיום הגידול אפיתל הסימפונות (BEGM) ללא amphotericin B 8. פינה אותם יחד aliquot ב 200 μl. וירוס חנות ב -80 מעלות צלזיוס. Aliquot עוד 10 μl נוספים לבצע את assay ELISA HIV-1 Gag (p24) אנטיגן.
- באמצעות ערכת ELISA מסחרית, לבצע assay אנטיגן p24 על פי הפרוטוקול של היצרן. את assay נותן אומדן של p24 ויראלי pg / ml.
3. שלב 3: תאי HBE הראשי התרבות
- פלייט תאים HBE ב 10 מ"ל התקשורת BEGM (עם 100 amphotericin B μl אם תאים 0 מעבר משמשים כדי למנוע זיהום פטרייתי אפשרי) בצפיפות של 1 x 10 6 תאים קולגן אני מצופה 10 ס"מ בתרבית רקמה צלחת. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- ביום הבא, להסיר את המדיום ולהחליף עם 10 מ"ל BEGM (עם 100 B amphotericin μl למעבר 0 תאים) עבור סכום כולל של 4 ימים. חזור אל חממה.
- אחרי 4 דays, להשתמש רק BEGM ללא amphotericin .ב שינוי התקשורת בכל יום אחר.
- כאשר תאים הם 80-90% ומחוברות (איור 2 א; ~ 7 ימים לאחר הציפוי), להמשיך עם תמרה (לשים לב 3.5 הכנה ממושכת לפני התמרה). שוב, הערכה חזותית של confluency מספיקה. אין כימות הוא זקוק.
- לפני התמרה, מעיל מוסיף תמיכה חדיר עם פתרון קולגן IV בדילול 1/10 עם מים מזוקקים סטריליים. הוסף 200 μl לכל כנס ולתת לילה יבש בקבינט הזרימה למינרית.
4. שלב 4: התמרה של תאים HBE
- הסר מדיה, להוסיף 3 מ"ל של טריפסין 0.1% בחומצה 1 מ"מ ethylenediaminetetraacetic ב בופר פוספט (EDTA / PBS) דגירה 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. בדוק מתחת למיקרוסקופ (אובייקטיבי 10X) כדי לראות אם כל התאים מנותקים. אם לא, לחזור אל האינקובטור עבור 5 דקות נוספות.
- כאשר כל התאים מנותקים, להוסיף 3מ"ל של מעכבי סויה טריפסין (SBTI 1 מ"ג / מ"ל), לערבב ולהעביר צינור צנטריפוגות 15 מ"ל. גלולה התאים על ידי ספינינג ב 460 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר supernatant ו resuspend גלולה לתוך 3 מ"ל של BEGM והמשך עם היד נטויה.
- תאי Resuspend HBE (כיום מעבר 1 או P1) ביחס של 2 x 10 5 תאים לכל כנס תמיכה חדיר אחד 12 מ"מ 400 μl של BEGM (ראה טבלה 2). לחיץ מספרים אלה בהתבסס על הכמות מוסיפה תמיכה חדירה כי יהיה transduced.
| משטח | שטח פנים | תא ספירה | כְּלֵי תִקְשׁוֹרֶת | נפח (מדיה) |
| 10 ס"מ צלחת | 52.7 ס"מ 2 | 1 x 10 6 | BEGM | 10 מ"ל | </ Tr>
| 12 מ"מ מסנן | 1.13 ס"מ 2 | 2 x 10 5 | BEGM | 400 μl |
| 24 מ"מ מסנן | 4.52 ס"מ 2 | 8 x 10 5 | BEGM | 800 μl |
טבלה 2: אקסטרפולציה מדיה לכל ספירת תאים.
- באמצעות ריבוי של זיהום (משרד הפנים) גורם של 4, להוסיף נפח מתאים של הנגיף על השעיית התא.
- להוסיף ברומיד hexadimethrine לריכוז סופי 2 מיקרוגרם / מ"ל.
- לוותר 400 μl של תמהיל (BEGM, תאים HBE, וירוס ברומיד hexadimethrine) לכל הכנס תמיכה חדיר לתוך תא הפסגה, ולהוסיף 1 מ"ל של BEGM לבד לתא basolateral. דגירה לילה בשעה 37 ° C ותאי HBE צלחת 5% CO 2. תמיד בלי וירוס כפי מלאה מבחר המבחן puromycin אם זה אפשרי.
- ביום, rem הבאמדיה הפסגה ו basolateral אובה, לשטוף עם PBS, ולהחליף את שני תאים עם התקשורת ממשק אוויר נוזלי (עלי) 8.
- כאשר תאים ומחוברים, להסיר נוזל פסגה (המכונה יצירת ממשק אוויר נוזלי). המשך שינוי המדיום (ALI) בתא התחתון פעם ביומיים עד שהם מגיעים לבגרות מלאה; בדרך כלל 3 עד 4 שבועות לאחר מכן.
הערה: אם וקטור lentiviral מכיל גן הבחירה כגון puromycin, תאים ניתן לבחור על ידי הוספת puromycin פי עקומת ריכוז הבחירה. עבור תאים HBE, מדובר בריכוז מ"ל 1 מיקרוגרם / נקבע להיות אידיאלי עבור בחירה עקבית של תאים transduced. עם זאת, ריכוז זה עשוי להיות שונה עבור תאים אחרים או תנאים צריכים להיקבע על ידי הריגת עקומות. הוספת puromycin יכולה להתחיל מוקדם ככל שיום אחד לאחר שהתקשורת הוחלפה תקשורת ALI או במאוחר (2-3 ימים), כדי לאפשר את הביטוי המלא של גן הבחירה. הקפד להוסיף puromycin כדי להוסיף אחד כי hכפי שלא היה transduced. Puromycin ניתן להוסיף עד שהתאים הם מובחנים באופן מלא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מתאר שלבים עיקריים שונים של הערכת תאים ופתרונות במהלך תהליך transfection. איור 1 א מציג את confluency האופטימלי של תאי HEK293T לפני transfection לייצור וירוס. חשוב כי התאים מופצים באופן שווה על פני הצלחת. איור 1b חושף את המשקע בטיפה את תערובת transfection באמצעות אופטיקה בשדה בהירה מטרת 10X. ככל המשקעים נראים כמו גרגרי חול ולא agglomerates, את יהיה transfection היעיל יותר. בתמונה זו, המשקע הוא גס קצת. המשקע הוא אינדיקטור אמין אם transfection יפיק כייל גבוה של וירוסים. אם כל המרכיבים חסרים או באיכות ירודה (DNA וקטור למשל), agglomerates תהווה, וזה סימן מבשר רעות. אם זה המקרה, זה חכם כדי לבטל ולהפעיל מחדש את ההליך, ולוודא כיכל החומרים הם בתמהיל, ו / או בדיקת האיכות של ה- DNA הווקטור ו- DNA אריזה. תרשים 1C מציג את המנה כמו A, לאחר דגירת הלילה. המשקע הוא (וצריך להיות) גלוי בין תאים. שמנו לב כי התאים אינם מתרבים הרבה במהלך transfection הבא 24 השעות.
איור 2 מראה כיצד תאי HBE להסתכל לפני 3 ימים לאחר התמרה. 2a איור המתארים כ 80% HBE העיקרי ומחובר תאים לפני trypsinization התמר. צלחת 10 ס"מ בנקודת המפגש 80% בתשואה של כ 4 x 10 6 תאים. איור 2b מראה כמעט 100% התמרה של תאים שלא עברו התמיינות P1 HBE באמצעות משרד הפנים של 4 על הכנס תמיכה חדיר. כאשר תאי HBE הם מצופים על מוסיפים תמיכה החדירה אלה, התאים הם שטוחים יחסית. על התמונה הזאת, בעיצומה של התאים הוא רק כמה מיקרונים וזה מסביר מדוע0.4 מיקרומטר נקבוביים גלויים אף התאים.
איור 3 מציג ניסויים אופטימיזציה מוביל הפרוטוקול המובא. כל הניסויים בוצעו triplicates על בארות מצופים לי קולגן (24 גם צלחת), עם 2 x 10 5 תאי HBE עיקריים לכל טוב. מרבית הניסויים בשימוש משרד הפנים של 0.4 עם ריכוז סופי 2 מיקרוגרם / מ"ל של hexadimethrine bromidein התקשורת BEGM. תאי פלורסנט נספרו 3 ימים לאחר התמרה. למרות אופטימיזציה הראשונית של הפרוטוקול שבוצעה על פלסטיק, התוצאות אושרו על מוסיף תמיכה חדירה. בנוסף, מנסה transduce תאי P1 HBE בדיל באופן מלא לא הצליח (מידע לא מוצג), המאשר דוחות קודמים. כפי שניתן לראות באיור 3 א, אחוז גבוה יותר של תאים HBE הם transduced במדיה BEGM בהשוואה לעלי. אם התאים הם מצופים היום לפני התמרה במדיה BEGM, את היעילותמשמעותי הוא ירד לעומת transducing תוך תאי הצמדת (איור 3B). כאשר תאי P1 HBE הם מצופים היום לפני התמרה במדיה עלי (במקום BEGM), את יעילות התמרה מקטינה עוד יותר (מידע לא מוצג). ההבדל בין 2 כלי התקשורת הללו הוא ריכוז סידן. תקשורת BEGM מכילה ריכוז נמוך של סידן (0.1 מ"מ) לעומת תקשורת עליי (1 מ"מ). צורות סידן ושומרת צמתים הדוקים ולכן, יכול להקשות על חלקיקי וירוס לחצות 9 ולגשת הקולטנים שלהם על הממברנה basolateral. למעשה, דלקות שיש אנשים שהצליחו ברמות נמוכות ע"י שיבוש צומת הדוקים באמצעות חומצת tetraacetic אתילן גליקול (EGTA) למשל 10. כאמור, תאי HBE P1 בדיל באופן מלא הם כבדות משקל וניתן transduced רק עם יעילות נמוכה 5-7, אשר יכול להיות בגלל צומת הדוקים במדיה המכילים סידן גבוה. הסבר נוסףיעילות התמרה נמוכה בתאים הבדיל באופן מלא הוא מנגנון תחבורה mucociliary פעיל שבו ריר יכול לפעול כמחסום. או, כפי שדווח על ידי Bals et al., השלב של בידול שבו תאי HBE הם, היא גורם קובע של יעילות התמר 10. העובדה שיותר תאים לקבל transduced ב BEGM מאשר תקשורת ALI תומכת הצהרה זו (איור 3 א).
כפי שניתן לראות באיור 3 ב, עלייה של כמעט 50% יעילים תמרה נצפתה כאשר התאים היו transduced תוך הצמדה לעומת תאים מצופית היום לפני. במחקרם, ריקס et al. נרשמה עלייה של 20% כאשר התמרה בוצעה לאחר trypsinization 11. יחד, משתמעות מתוצאות אלה כי התקשורת למצב של בשלות של תאים היא מפתח להצלחת תמרה.
הפאנל באיור3C, מדגים hexadimethrine bromideplaying תפקיד atrivial יעיל תמרה. עם זאת, השימוש בו הוא הציע בפרוטוקול זה מאז אין לו השפעה שלילית אך עשוי להיות מועיל. ברומיד Hexadimethrine הוא פולימר קטיוני המשמש וירולוגיה כדי לשפר יעילות התמר 12. אחרים פרסמו את השימוש protamine, אחר פולימר קטיוני, אך לא נמצא הבדל מובהק לגבי יעילות התמרה לעומת hexadimethrine ברומיד 13. ברומיד Hexadimethrine לא להשפיע על הצמיחה ולא בידול 14-16.
לבסוף, MOIs השונה נחקר ב -3 D איור: את יעילות התמרה הגבוהה ביותר התרחשה עם משרד פנים של 4. לא היה הבדל משמעותי בין משרד הפנים 0.4 ו -4, עם זאת, משרד הפנים 4 transduced 100% של תאי HBE ואילו משרד הפנים 0.4 transduced רק 75%. משרד הפנים מגדירים כמה וירוס חלקיקי will יש פוטנציאל להדביק תא אחד. ישנן שיטות שונות כדי לקבוע את משרד הפנים. אחד מהם הוא להגדיר את מספר יחידות תמרה (TU). שימוש ELISA, כמות האנטיגן p24 יכול להיקבע pg / ml. p24 ויראלי ב picograms ניתן להמיר ב TU, אשר נחוצים כדי לחשב את משרד הפנים. משרד הפנים מחושב על ידי חלוקת מספר TU במספר התאים. ישנם 10-100 יחידות התמרה (TU) לכל p24 picogram. כל אזכור בטקסט לגבי משרד הפנים מבוססים על חישובים עם 100 TU לכל p24 picogram. (Http://tronolab.epfl.ch/webdav/site/tronolab/shared/protocols/TUvsp24.html).
איור 1:. Transfection של תאי 293T HEK (א) תאי HEK 293T גדל 50-60% confluency כפי שניתן לראות תחת מטרת 10X. (ב) משקע גלוי דקות ירידת 5 5 μl לאחר ערבוב כל reagents תחת המיקרוסקופ (אובייקטיבי 10X). (ג) משקע בצלחת ליד התאים, בעקבות transfection הלילה (אובייקטיבי 10X). (ד) הגדלה של מרכז (ג). חץ לבן כדי לזרז. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר; אותו דבר עבור a, b, ו- c. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: התמרה של תאים NHBE (א) תאים HBE גדל בצלחת מצופה לי קולגן כדי 80-90% confluency (כ 4 x 10 6 תאים) בתקשורת BEGM במשך 5 ימים (אובייקטיבי 10X).. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ב) eGFP transduced תאי HBE על מוסיף תמיכה חדירה (12 מ"מ), שלאחר התמר 3 ימים (confocal, 20X). בשעה זו המדינה, cel HBE ls הן שטוחות הנקבוביות של הממברנה גלוי. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: אופטימיזציה של פרוטוקול תמרה (א) שפעת התקשורת על יעילות תמרה.. (ב) השוואה בין התמרה בתאי HBE מצופית היום לפני התמרה של תאים תוך הצמדה. (ג) שפעת ברומיד hexadimethrine על יעילות תמרה. (ד) הערכה יעילה תמרה משופרת באמצעות MOIs השונה. ניתוח בוצע באמצעות מבחן t או Kruskal-ואליס דאן מבחן השוואה המרובה של. ברי שגיאה מייצגים SE וכל * מייצגים p <0.05.ww.jove.com/files/ftp_upload/54176/54176fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מבטיח קרוב יעילות התמר 100%. עם זאת, ישנם צעדים בתהליך שחשובים להשיג מטרה זו. למשל, במהלך תהליך transfection, הנוכחות של משקעים בתמהיל התמרה (ירידה) או בצלחת מחרתיים התמרה (1b הדמוי ד) שהן גם רלוונטיות עבור transfection טוב. היעדרה של משקע או בנוכחות agglomerates יכול להיות בגלל השמטה של אחד ריאגנטים transfection, סוגית pH, או הכנת פלסמיד רעה. אם המשקע חסר, קיימת סבירות גבוהה כי אף יהיה גלוי למחרת. יתר על כן, הוספת לערבב transfection או מדיה HEK מהר מדי עלול לגרום לתאים HEK לנתק, פוגע transfection ותשואה. אינדיקציה נוספת תשואה טובה היא ביום 6 לפני צעד צנטריפוגה: משקע לבן צריך להיות גלוי בחלקו התחתון של הצינור. Transfection רע עם כמעטשום וירוס לא ייצור משקע הלבן הזה. במהלך תהליך התמרה, חשוב להשתמש בתאי HBE עיקריים כי כבר דה-מבודלים שנמצאים בתאי גזע כמו מדינה על מנת להשיג יעילות התמרה גבוהה. שימוש וקטור המכיל חלבון פלואורסצנטי כגון eGFP או mCherry כי היא דמיינה בקלות יכול להיות כלי טוב.
שינויים יכול להיעשות כדי להתאים את הפרוטוקול כדי תאים ראשוניים שונים. גישה אחת תהיה להפחית את ריכוז הסידן בתקשורת. כפי שניתן לראות באיור 3 א, באמצעות תקשורת BEGM המכילה ריכוז נמוך של סידן הביא יעילות התמרה משמעותית גבוהה בתאי HBE עיקריים. גישה אחרת יכולה להיות להגדיל את משרד הפנים. כפי שניתן לראות בתרשים 3D, הגבוהים יותר את הפנים, את יעילות התמרה הטובה יותר. עם זאת, באמצעות משרד פנים גבוה עלול להיות רעיל לתאים מסוימים.
אף על פי כן, יש כמה limita משא לפרוטוקול זה. טכניקה זו פותחה באמצעות מעבר 1 תאים HBE. ריאות דחו להשתלה התקבלו בהסכמה מתאימה העומדות מחקר על הסטנדרטים שנקבעו על ידי הצהרת הלסינקי. קבלת תאי HBE עיקריים ממקורות מסחריים יכולה להיות יקרה. תאים אלה הם בדרך כלל גם זמינים רק עם חלוף גבוה. פרוטוקול זה לא נבדק על קטעים גבוהים 2. עוד גורם מגביל הוא assay אנטיגן p24 ELISA. מספר חברות מציעות את ההערכה אך בעלות גבוהה. בנוסף, ריכוז ויראלי שניתנו על ידי assay, הוא ערך משוער בלבד מאז הבדיקה מזהה p24 lentivirus ו p24 בחינם שפורסמו במהלך transfection חולף 17. לכן, הערכה זו של משרד הפנים היא אומדן בלבד. לבסוף, בעזרת ביטוי שונה בונה (גדול או קטן בגודל) לא יכול לתת את אותן תוצאות. למשל, יעילות שונות נרשמו באמצעות mCherry ו eGFP (מידע לא מוצג).
אף אוזן גרון "> ישנם יתרונות לפרוטוקול זה על פני שיטות אחרות. אחד מהם הוא תהליך transfection. למעשה, בפרוטוקול המוצע יכול להניב טיטר גבוה וירוס כזה שהתקשורת שנאספו המכיל וירוסים כבר לא יהיה צורך להיות מרוכזים ויכול לשמש ישירות transduce תאים. פוליאתילן גליקול (PEG), שימוש בפרוטוקול זה להתרכז וירוס, כבר ידוע להיות רעיל לתאים יונקים 18. בנוסף, אם גבוהי פנים שמשו, זה יגדיל את הסיכון לרעיל עוד יותר. עם זאת, אם צעד ריכוז PEG מתיישן, חוקר כי לא הצליח כדי transduce בשל תופעות רעילות עשוי לשקול מחדש את השימוש lentiviruses. יתרון נוסף של פרוטוקול זה הוא חוסר ההבדלים יעילים התמר על פלסטיק או מוסיף תמיכה חדירה. היתרון של להיות מסוגל transduce על פלסטיק שפחות תאים וחלקיקי וירוס נדרשים. כתוצאה מכך, ניתן להרחיב את התאים שלאחר תמרה והועברועל מוסיפה תמיכה חדירה כאשר ומחוברות (מידע לא מוצג).הבחירה של וקטורים תלויים בכמה נושאים, כגון מבחר של תאי transduced עם puromycin או ביטוי של חלבונים סמן כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). יש וקטורים מסחרי מרובים זמינים המתאימים (pRRLsinPPT.CMV.MCS.Wpre, pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro, pCDH-EF1-MCS-T2a-Puro, pGEM-T קל) 15,19-21. בחירת היזמים מציבה אתגרים, מאז האמרגן CMV נפוץ מושתק בתאי אפיתל דרכי הנשימה הבדיל 15. עבור ביטוי תא ספציפי ריסים, שימוש אמרגן השועל-J1 מומלץ. לחלופין, האמרגן EF-1 יכול לשמש ביטוי בכל התאים דרכי הנשימה 20,21. אם ביטוי יתר של חלבון הוא ביקש, בגודל של הכנס יקבע, בין היתר, יעילות התמרה. עם זאת, ניתן לאכלס במידות גדולות, כפי שניתן לראות על ידי התמרה מוצלחת של adenylyl המסיס באורך מלא cyclase 2מעבדת 2 .the ופרסמה ביטוי יתר מוצלח בונה 15,16,20-22. עבור ביטוי shRNA (בדרך כלל תחת U6 או אמרגן H1), בונה מרובה תצטרך להיחקר. זה יכול להיות מייגע עם בדיקות שנעשו בסוף הבידול (PCR סופגים מערבי), אך התהליך לא יכול להיות מקוצר מאז תאים שאינם בדיל לא יכולים להיות ייצוג טוב של הצלחה עבור תאים שעברו התמיינות. שוב, המעבדה עוסקת shRNA מוצלח רב שפורסמה בונת 14,20,21,23.
שימוש בפרוטוקול זה, ויותר חוקרים עלולים להיות מופעלים כדי לשפר transductions הקודמת גרועה באופן משמעותי. חלקם אולי למצוא את זה שימושי כדי להגדיל את היעילות על ידי ביצוע התאמות כמה. חלקם אולי להשתמש בכלי זה כדי לגלות תהליכים ביולוגיים חדשים או להיות מסוגל להוכיח מושגים, הן באמצעות אסטרטגיות מציאה או ביטוי יתר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מודים הסוכנות שחזור איברים חיים הברית של אוניברסיטת מיאמי למתן הריאות. כמו כן, אנו מודים לד"ר ליסה Künzi לעריכת DNA המשמש הניסויים שמוצג באיור 2B ו 3-D, ד"ר בן Gerovac וליסה נובאק עבור וירוס mCherry המשמש הניסויים איורים 3A ל C. אנו מודים גם גבריאל Gaidosh ממתקן הדמיה, מחלקת עיניים באוניברסיטת מיאמי.
מחקר זה כבר ממומן על ידי תרומות של NIH, קרן CF והמכון למחקר הרפואי הדיילת אל ד"ר מתיאס Salathe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | 12306C | use at 10% |
| DMEM | Thermo Scientific | 11995-040 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Thermo Scientific | 15140-122 | use at 1x |
| Collagen I | BD Biosciences | 354231 | dilute 1:75 in distilled water |
| Calphos | Clontech | 631312 | Transfection kit containing 2 M Calcium solution, 2x HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O |
| Polythylene glycol 8000 | VWR scientific | 101108-210 | stock of 40% |
| Amphotericin B | Sigma | A9528 | use at 1x |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Transwell 12 mm | Corning | 3460 | |
| Collagen IV | Sigma | C7521 | dilute 1:10 in distilled water |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | stock of 2 mg/ml |
| Puromycin (10.000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | use at 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 | lentiviral expression vector |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | packaging DNA |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | packaging DNA |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | packaging DNA |
References
- Ding, B., Kilpatrick, D. L. Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons. Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).
- Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Jr Gene therapy progress and prospects: development of improved lentiviral and retroviral vectors--design, biosafety, and production. Gene Ther. 12, 1089-1098 (2005).
- Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnol. 13, (2013).
- Delenda, C. Lentiviral vectors: optimization of packaging, transduction and gene expression. J Gene Med. 6 Suppl 1, S125-S138 (2004).
- Gresch, O., Altrogge, L. Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells. Methods Mol Biol. 801, 65-74 (2012).
- Jordan, E. T., Collins, M., Terefe, J., Ugozzoli, L., Rubio, T. Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells. J Biomol Tech. 19, 328-334 (2008).
- Castillon, N., et al. Regeneration of a well-differentiated human airway surface epithelium by spheroid and lentivirus vector-transduced airway cells. J Gene Med. 6, 846-856 (2004).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. 107, 183-206 (2005).
- Gonzalez-Mariscal, L., et al. Role of calcium in tight junction formation between epithelial cells. Am J Physiol. 259, C978-C986 (1990).
- Bals, R., et al. Transduction of well-differentiated airway epithelium by recombinant adeno-associated virus is limited by vector entry. J Virol. 73, 6085-6088 (1999).
- Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 17, 441-450 (2008).
- Davis, H. E., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 97, 159-172 (2002).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, 341-347 (2013).
- Manzanares, D., et al. Functional apical large conductance, Ca2+-activated, and voltage-dependent K+ channels are required for maintenance of airway surface liquid volume. J Biol Chem. 286, 19830-19839 (2011).
- Schmid, A., et al. Real-time analysis of cAMP-mediated regulation of ciliary motility in single primary human airway epithelial cells. J Cell Sci. 119, 4176-4186 (2006).
- Unwalla, H. J., Ivonnet, P., Dennis, J. S., Conner, G. E., Salathe, M. Transforming growth factor-beta1 and cigarette smoke inhibit the ability of beta2-agonists to enhance epithelial permeability. Am J Respir Cell Mol Biol. 52, 65-74 (2015).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6, (2006).
- Schneiderman, S., Farber, J. L., Baserga, R. A simple method for decreasing the toxicity of polyethylene glycol in mammalian cell hybridization. Somatic Cell Genet. 5, 263-269 (1979).
- Schmid, A., et al. Soluble adenylyl cyclase is localized to cilia and contributes to ciliary beat frequency regulation via production of cAMP. J Gen Physiol. 130, 99-109 (2007).
- Manzanares, D., et al. Airway Surface Dehydration by Transforming Growth Factor beta (TGF-beta) in Cystic Fibrosis Is Due to Decreased Function of a Voltage-dependent Potassium Channel and Can Be Rescued by the Drug Pirfenidone. J Biol Chem. 290, 25710-25716 (2015).
- Manzanares, D., et al. IFN-gamma-mediated reduction of large-conductance, Ca2+-activated, voltage-dependent K+ (BK) channel activity in airway epithelial cells leads to mucociliary dysfunction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L453-L462 (2014).
- Chen, X., et al. A soluble adenylyl cyclase form targets to axonemes and rescues beat regulation in soluble adenylyl cyclase knockout mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 51, 750-760 (2014).
- Ransford, G. A., et al. Pannexin 1 contributes to ATP release in airway epithelia. Am J Respir Cell Mol Biol. 41, 525-534 (2009).
