Abstract
在使用空气-液体界面条件下提供了一个有用的模型来研究气道细胞分化和功能的处理原代人支气管上皮（HBE）细胞的体外培养。在过去的几年中，为转基因递送中使用的慢病毒载体的成为普遍的做法。虽然有完全分化的呼吸道上皮细胞与某些非HIV伪类型的慢病毒转导的报道，整体转导效率通常低于15％左右。这里介绍的协议提供了可靠和有效的方法，以产生慢病毒和转导原代人支气管上皮细胞。用未分化的支气管上皮细胞，支气管上皮生长培养基转导，而细胞附着，具有4感染因子的多个提供接近100％的效率。本协议描述的，一步一步的，高滴度的慢病毒载体及日的准备和浓度Ë传导过程。它讨论了确定的最佳培养条件，以实现初级人支气管上皮细胞的高效转导的实验。
Introduction
复制缺陷型，假慢病毒的发展（LV）也为研究人员提供一个安全和有效的方法， 在体外 1提供转基因。由于它们的长期表达，这些LV也可以用于治疗剂的体内 2,3的输送。生产的LV需要人胚胎肾（HEK）细胞的几个质粒共转染：转移载体，包装的gag / POL，包装转速 ，和包络水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）的质粒。第三代包装系统被认为比第二代系统更安全，因为转速基因被编码在一个单独的包装质粒，从而降低重组的可能性，以产生具有复制能力的慢病毒。虽然第二代包装系统收率五倍高的总转导单元，原病毒基因组的分割以创建第三代系统已降低转导的水平仅最低限度3,4。
而细胞系可更容易和有效地转导，研究人员已经将重点转向主细胞，因为这些是更具有代表性的体内组织中5,6。然而，原代细胞是难治转导。而完全分化呼吸道上皮细胞的转导已经报道，整体效率还没有超过15％的7。
这里描述的是一个协议，允许生产高滴度的LV的。一个一步一步的方法概述实现近100％的转导效率分为原发性支气管上皮细胞。更具体地，该协议描述器乐成功3的最佳培养条件。简言之，HEK 293T细胞使用的是带有增强型绿色荧光的EF-1启动子驱动表达慢病毒载体转染PCDH蛋白（EGFP）或mCherry，红色荧光蛋白，和一个第三代包装系统。释放到介质的LV被收集24至72小时后。病毒颗粒集中用聚乙二醇（PEG），病毒浓度的方便和简单的方法，采用了p24抗原的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒滴度估计之前。随后，未分化的初级HBE细胞被转导在增殖培养基（支气管上皮生长培养基或BEGM）8，而安装（被胰蛋白酶处理后），在感染复数的4（MOI）因子，加入聚凝胺和温育16小时（过夜）。然后允许细胞分化。由于病毒的转基因被表达长期（使用适当的启动子，见讨论），表达将在整个分化维持成假呼吸道上皮或可以（使用诱导型启动子）的分化后诱导。
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Protocol
1.第一阶段：HEK 293T文化
- 制备HEK细胞培养基中添加10％（V / V）胎牛血清（FBS）和1％（体积/体积）青霉素/链霉素，以高糖的Dulbecco氏改良Eagle氏培养基（DMEM）（简称为HEK介质）。
- 涂布一10厘米组织培养皿胶原I.混合30胶原微升我在2ml蒸馏水中。扩散混合到培养皿孵育在37℃下2小时和5％ 的 CO 2。
- 取出混合物，并让在层流柜的菜干燥15分钟。
- 板HEK细胞上以在10毫升的HEK媒体1×10 6个细胞的密度涂布培养皿孵育在37℃和5％的CO 2。
- 当HEK细胞50-60％融合（ 图1a，电镀后2-3天），进行第2阶段的Visual汇合的评估就足够了。不需要定量。
注意：HEK细胞是在HEK培养基（见上文）。当他们到达汇合，T哎可以分割（ 例如 1/5）或冷冻下来以后使用。
2.第二阶段：在HEK细胞生产和慢病毒（LVS）的浓度
注：本协议应与机构和政府规章线以下的BSL-2在美国+（增强BSL-2）的条件下执行。
- 使用钙沉淀过程转染（脂质体和其它转染剂不如钙沉淀步骤，有效）。市售的转染试剂盒的用途，建议以保证再现性，虽然该过程修改如下。将所有试剂置于室温。这为0的一天。
- 对于HEK293细胞每10 cm培养皿，搭配4.5微克包膜DNA PMD2-VSVG的，7.5微克包装DNA pMDLg / pRRE，3.75微克DNA PRSV-REV，慢病毒表达载体的10微克DNA，86微升的2M钙溶液和无菌水在一15ml离心管，以700微升的最终体积（在商业转染试剂盒中提供的后两个解）。
- 逐滴添加2×HEPES-缓冲盐水的700微升（HBS，在转染试剂盒中提供），而涡旋（在层流柜）并在室温下温育30分钟（执行步骤4在等待）。
- 在早期的孵化时间，定金5微升幻灯片上的搭配。检查液滴是10X的目标，在显微镜下，重点慢慢向上和向下。一种细的沉淀物应该是可见的，证实了磷酸钙沉淀法（ 图1b）。
- 通过加入10ml的HEK细胞介质和移液器上下的混合停止30分钟后的沉淀。
- 以HEK细胞的培养皿步骤2.1-2.5，并取出介质（0天）。小心缓慢地添加来自步骤2.5的沉淀溶液沿着盘的边缘。
- 次日（第1天），除去并丢弃培养基含有沉淀并更换瓦特第i个10毫升HEK培养基。检查在显微镜下精细沉淀物：它应该是在细胞（ 图1C和D）之间的空白空间的菜可见。
- 第2天，收集培养基用注射器，过滤器通过0.45μm针筒过滤器进含有3.8毫升40％聚乙二醇（PEG）溶液15毫升离心管中。倒置5倍以混合并储存在4℃下至少24小时（对于PEG沉淀形成，但超过5天不再），直到所有的病毒集合是完整的。
- 天3和4。第4天，重复步骤2.8不HEK中等取代但10％的漂白粉消毒和丢弃的菜。
- 离心机所有收集管（通常在第5天在一起的所有集合）于1650×g离心20分钟，在4℃以沉淀病毒。除去并弃去上清液，并在4℃下于1650 xg离心再次旋转5分钟以收集和去除的PEG上清的任何剩余。
- Resus挂起在200μl支气管上皮生长培养基（BEGM）的每个管的无两性霉素B 8沉淀。池他们在一起，并在200微升等分试样。在-80°C储存病毒。分装额外的10微升进行HIV-1加格（P24）抗原ELISA检测。
- 使用商业ELISA试剂盒，根据制造商的协议来执行一个p24抗原测定。该试验给出了以pg / ml的病毒的p24的估计。
3.第三阶段：培养初HBE细胞
- 在10ml BEGM介质板HBE细胞（用100μl两性霉素B，如果通道0细胞用于消除可能的真菌污染）在我涂覆10厘米组织培养皿胶原一个1×10 6个细胞的密度。在37℃和5％的CO 2。
- 次日，除去培养基并用10ml BEGM取代（用100μl两性霉素B为通道0细胞），共4天。返回到孵化器。
- 经过4天AYS，只使用不BEGM两性霉素B更改媒体隔日1次。
- 当细胞为80-90％汇合（ 图2a;〜铺板后7天），则继续转导（注意3.5用于制备转导之前）。再次，汇合的视觉评估是足够的。不需要定量。
- 前转导，外衣用IV型胶原溶液的透气性支承插入物稀释1/10用无菌蒸馏水。加入200μl到每个插入，并让在层流柜干燥过夜。
4.第四阶段：支气管上皮细胞转导
- 除去介质，用磷酸盐缓冲盐水（EDTA / PBS）中加入3毫升0.1N％胰蛋白酶在1mM的乙二胺四乙酸和孵育在37℃5分钟和5％ 的 CO 2。检查显微镜（10X物镜）下，看看是否所有单元被分离。如果没有，返回到培养箱中另外5分钟。
- 当所有的细胞分离，加入3毫升大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI 1毫克/毫升），混合并转移至15毫升离心管中。通过在460 xg离心纺丝在室温下5分钟沉淀细胞。
- 除去上清液，重悬沉淀于3ml BEGM并具有计数继续。
- 悬浮HBE细胞（现在通道1或P1）以2×10 5个细胞每112毫米透气性支承插入于400μlBEGM的（ 见表2）的比率。推断基于将要转导的透气性支承插入物的量这些数字。
| 表面 | 表面积 | 细胞计数 | 媒体 | 体积（媒体） |
| 10cm皿 | 52.7厘米2 | 1×10 6个 | BEGM | 10毫升 | </ TR>
| 12毫米过滤器 | 1.13厘米2 | 2×10 5个 | BEGM | 400微升 |
| 24毫米过滤器 | 4.52厘米2 | 8×10 5个 | BEGM | 800微升 |
表2：每个细胞计数媒体推断。
- 使用的4感染复数（MOI）因子的多个，添加病毒的适当体积的细胞悬浮液。
- 聚凝胺添加至2微克/毫升的最终浓度。
- 免除400微升每透水支持插入混合（BEGM，HBE细胞，病毒和聚凝胺）进入顶部隔室，独自加入1ml BEGM到基底仓。在37℃和5％的CO 2总是板HBE细胞孵育过夜无病毒作为对照和测试嘌呤选择（如果适用）。
- 第二天，对物OVE根尖和基底外侧培养基，用PBS洗，并替换为空气-液体界面（ALI）媒体8两个室。
- 当细胞汇合，除去心尖流体（称为建立气 - 液界面）。继续隔日舱底部改变介质（ALI），直到他们达到完全成熟;通常为3至4周后。
注意：如果慢病毒载体含有一个选择基因，如嘌呤霉素，细胞可以通过根据选择浓度曲线加入嘌呤霉素进行选择。对于HBE细胞，1微克/ ml的浓度被确定为理想的转导的细胞的一致的选择。然而，这个浓度可能会有所不同其他细胞或条件，应由杀死曲线来确定。媒体已经更换后ALI媒体或更高版本（2-3天），允许选择基因充分表达嘌呤霉素的加入可以开始，早一天。一定要嘌呤霉素添加到一个插入使得h因为没有被转导。可以加入嘌呤霉素直至细胞完全分化。
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Representative Results
图1描绘了在转染过程评估细胞和溶液的不同的关键步骤。 图1A示出的HEK293T细胞的转染病毒的产生之前最佳汇合。重要的是，将细胞在整个培养皿均匀分布。 图1b中揭示了在使用明视野光学系统和一个10X物镜的转染混合物一滴沉淀。越的析出物像砂粒，而不是附聚物，更有效的转染将。在这张图片中，沉淀物是有点粗糙。该沉淀物是一个可靠的指标转染是否会产生病毒的高滴度。如果任何成分是丢失或质量差（例如载体DNA），附聚物会形成，这是一种不祥的征兆。如果是这种情况，这是明智的中止并重新启动程序，确保所有的成分在混合，和/或检查的载体DNA和包装的DNA的质量。 图1c示出了同样的菜为A，过夜培养后。沉淀物是（并且应该是）在小区之间是可见的。我们注意到，该细胞不24小时转染后大部分期间繁殖。
图2显示了支气管上皮细胞前的外观和传导。 图2a后3天描绘了胰蛋白酶和转导前约80％汇合主支气管上皮细胞。在80％汇合10cm皿产生大约4×10 6个细胞。 图2b示出了在透气性支承插入物使用的4的MOI未分化P1 HBE细胞接近100％转导。当HBE细胞在这些可渗透支撑插入镀中，细胞是相对平坦的。在此画面中，细胞的高度只有几微米这解释了为什么0.4微米的毛孔虽然细胞可见。
图3示出了最优化的实验导致所呈现的协议。所有的实验都在一式三份的胶原蛋白I包被的孔（24孔板）被执行，以每孔2×10 5个初级HBE细胞。大多数的实验中使用的0.4的MOI用2微克/毫升最终的己二甲bromidein BEGM介质的浓度。荧光细胞转导后3天计数。尽管协议的初始优化已经对塑料进行，结果被证实性支撑插入。此外，试图将转导完全分化P1 HBE细胞没有成功（数据未显示），证实了以前的报告。如在图3a中看到的，HBE细胞的比例更高被转导在BEGM媒体相比的ALI。如果将细胞铺板一天转导之前在BEGM媒体，效率相比而细胞附着（ 图3b）转导的显著降低。当P1 HBE细胞铺一天急性肺损伤介质（而不是BEGM）转导之前，将转导效率甚至进一步降低（数据未显示）。这些2个媒体之间的差异是钙的浓度。 BEGM介质包含相比ALI媒体（1毫摩尔）钙（0.1毫摩尔）的低浓度。钙的形式和保持紧密连接，因此，可能难以为病毒颗粒穿越9和基底外侧膜访问他们的受体。事实上，某些感染成功以低水平通过破坏用乙二醇四乙酸（EGTA），例如10紧密连接。如前所述，完全分化P1 HBE细胞是耐火并仅可以以低效率5-7，这可能是由于在含有介质高钙紧密连接被转导。对于另一种解释在完全分化的细胞的低转染效率是有源纤毛输送机构，其中黏液可以充当一个屏障。或者，如通过的Bals 等报道，分化的阶段，其中HBE细胞，是的转导效率10的一个决定因素。更多的细胞得到转在BEGM比ALI媒体的事实支持这种说法（ 图3a）。
如在图3b中看到的，观察到的几乎50％的转导效率增加时，将细胞而附着的细胞相比，转导电镀的前一天。在他们的研究中，里克斯等显示的同比增长20％，当胰蛋白酶11后进行转导。总之，这些结果表明，培养基和细胞的成熟的状态的关键是转导的成功。
图面板3C，表明己二甲bromideplaying在转染效率atrivial作用。然而，它的用途，建议在这个协议中，因为它没有不利的影响，但有可能是有益的。聚凝胺是在病毒学用于提高转导效率12阳离子聚合物。他人已经发表了使用鱼精蛋白，另一个阳离子聚合物，但没有显著差异发现关于转导效率相比聚凝胺13。聚凝胺不影响增长，也没有分化14-16。
最后，不同的MOI在图3d进行了研究：最高转染效率发生与4的MOI有MOI 0.4和4之间无显著差异，但是，MOI 4转导的HBE细胞，而MOI 0.4 100％仅转导的75％。教学语言定义的病毒颗粒数量的Wi将不得不感染一个小区的潜力。有不同的方法来确定MOI。其中之一是定义的转导单位（TU）的数目。用ELISA，p24抗原的量可以在微克/毫升来确定。在皮克病毒的p24可在恩，这是必要的，以计算出的MOI进行转换。惯性矩除以TU的数目由细胞的数量计算的。有每皮克P24 10-100转导单位（TU）。在关于MOI文本的所有文献的基础上，每皮克P24 100 TU计算。 （http://tronolab.epfl.ch/webdav/site/tronolab/shared/protocols/TUvsp24.html）。
图1：HEK 293T细胞的转染 （a）根据一个10X物镜所见的HEK 293T细胞生长至50-60％汇合。 （b）以5微升一滴5分钟沉淀可见混合所有reage后显微镜（10X物镜）下NTS。在培养皿（C）沉淀旁细胞，以下过夜转染（10X物镜）。 （D）（C）的中心放大。白色箭头指向沉淀。比例尺= 100微米;是A，B和C是一样的。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：NHBE 细胞转导 （ 一 ）生长在胶原蛋白I包被培养皿HBE细胞至80-90％汇合（约4×10 6个细胞）在BEGM媒体5天（10X物镜）。比例尺= 100微米。 （ 二 ）绿色荧光蛋白转上性支撑插件（12mm）中，3天后期转导（焦，20X）HBE细胞。在这种状态下，HBE CEL LS是平的，该膜的孔是可见的。比例尺= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3： 转协议的优化 （ 一 ）对转染效率的影响媒体。 （b）如HBE细胞转导的比较镀前一天和细胞的转导，而附接。 （ 三 ）聚凝胺对转染效率的影响。采用不同的MOI提高转导效率的（d）评价。使用学生t检验或秩和检验和邓恩的多重比较试验进行分析。误差棒代表SE和所有的*表示P <0.05。ww.jove.com/files/ftp_upload/54176/54176fig3large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这里所概述的协议保证接近100％转导效率。但是，也有在此过程中是实现这一目标的重要步骤。例如，在转染过程中，析出物中的转导结构的存在（下降），或在培养皿后转导（ 图1b和d）该天是一个良好的转染都相关。没有沉淀物或附聚物的存在可能是由于在转染试剂中的一个的遗漏，pH值的问题，或坏质粒制备。如果沉淀缺失，有很高的可能性，没有将可见的第二天。此外，加入转染混合物或HEK媒体太快可能导致HEK细胞分离，阻碍转染和产量。良好的产率的另一迹象是在离心步骤前第6天：白色沉淀应在管的底部是可见的。一个坏转，几乎没有病毒不会造成这种白色沉淀。在转导过程中，它是利用主HBE细胞已去分化，并且是在像状态的干细胞，以实现高转导效率是至关重要的。使用含有荧光蛋白，如绿色荧光蛋白或mCherry，很容易可视化的载体可以是一个很好的工具。
修改可以作出来适应这个协议不同的原代细胞。一种方法是，以减少在媒体中的钙浓度。如见于图3a中 ，使用含有钙的较低浓度导致初级HBE细胞显著更高的转导效率BEGM介质。另一种方法可以增加MOI。 如图3d中 ，越高的MOI，更好的转导效率。然而，使用较高的MOI可能成为有毒的某些细胞。
然而，也有一些limita系统蒸发散该协议。这种技术已使用通道1的HBE细胞的发展。拒绝移植的肺的研究符合要求的由赫尔辛基宣言规定的标准适当的同意获得。从商业来源获得主HBE细胞可以是昂贵的。这些细胞通常也只可在更高的通路。该协议还没有被比2更高的通道测试的另一个限制因素是在P24 ELISA抗原检测。有几家公司提供的工具包，但在成本高。此外，通过测定给定的病毒浓度，只是因为测试检测慢病毒p24和瞬时转染17过程中释放的游离的p24的近似值。因此，MOI本次评测的只是一个估计。最后，使用不同的表达构建（在尺寸更大或更小）可能无法得到相同的结果。例如，不同的效率用mCherry和eGFP的（数据未示出）记录。
ENT“>有优势此协议通过其他方法。其中之一是转染过程。事实上，所提出的协议可以得到如此高的病毒滴度，这将不再需要含有病毒的收集介质进行浓缩，并可以使用直接转导的细胞。聚乙二醇（PEG），在该协议用 于浓缩病毒，已被公知的是有毒的哺乳动物细胞18。另外，如果更高的MOI被使用，这将更加增大毒性危险。但是，如果PEG浓缩步骤变得过时，已成功研究人员转导因毒性作用可能重新考虑使用慢病毒。该协议的另一个优点是缺乏对塑料或性支撑插入在转导效率的差异。被好处能够转导上的塑料是较少所需要的细胞和病毒颗粒。其结果是，细胞可以被扩展后转导，并转移到透气性支承插入时（数据未显示）汇合。载体的选择取决于几个问题，如转导的细胞嘌呤或标记蛋白的表达的选择，例如绿色荧光蛋白（GFP）。但是也有一些适合的（pRRLsinPPT.CMV.MCS.Wpre，PCDH-EF1-MCS-IRES-普罗，PCDH-EF1-MCS-T2A-普罗，pGEM-T中易）15,19-21提供多种商业载体。启动子的选择提出了挑战，因为通常使用的CMV启动子是在分化的呼吸道上皮细胞15沉默。对于纤毛细胞特异性表达，建议使用狐狸-J1子。可替代地，EF-1启动子可以在所有的气道细胞20,21被用于表达。如果蛋白过度表达时，关于插入物的大小将决定，部分，转导效率。然而，全长可溶性腺苷酸环化酶2的成功传导所看到大尺寸可以容纳2 .The实验室发表了几次成功的表达构建15,16,20-22。用于shRNA表达（下，通常在U6或H1启动子），多个构建体将不得不加以探讨。这可与在分化（PCR和蛋白质印迹）的端部做的测试繁琐，但过程不能缩写自未分化的细胞可能不会成功经历分化的细胞的良好表示。此外，该实验室已发表 多成功的shRNA构建14,20,21,23。
使用该协议，越来越多的研究者可能会启用显著改善以前差转导。有些人可能会发现它有用通过一些调整，增加了效率。有些人可能会用这个工具来发现新的生物过程，或者能够证明的概念，无论是使用击倒或过度表达的策略。
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Acknowledgments
我们感谢迈阿密大学的生命器官联盟追回署提供的肺部。我们也感谢丽莎昆兹博士用于图2B和3-D，本Gerovac博士和丽莎·诺瓦克在图3A至C.用于实验的mCherry病毒所示的实验DNA准备，我们也感谢加布里埃尔Gaidosh从成像设备，眼科在迈阿密大学。
这项研究是由来自美国国立卫生研究院，在CF基金会和乘务员医学研究所的马蒂亚斯Salathe博士助学金资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | 12306C | use at 10% |
| DMEM | Thermo Scientific | 11995-040 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Thermo Scientific | 15140-122 | use at 1x |
| Collagen I | BD Biosciences | 354231 | dilute 1:75 in distilled water |
| Calphos | Clontech | 631312 | Transfection kit containing 2 M Calcium solution, 2x HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O |
| Polythylene glycol 8000 | VWR scientific | 101108-210 | stock of 40% |
| Amphotericin B | Sigma | A9528 | use at 1x |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Transwell 12 mm | Corning | 3460 | |
| Collagen IV | Sigma | C7521 | dilute 1:10 in distilled water |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | stock of 2 mg/ml |
| Puromycin (10.000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | use at 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 | lentiviral expression vector |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | packaging DNA |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | packaging DNA |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | packaging DNA |
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