Abstract
La culture in vitro de cellules humaines primaires épithéliales bronchiques (HBE) en utilisant des conditions d'interface air-liquide fournit un modèle utile pour étudier les processus de différenciation et de la fonction des cellules des voies respiratoires. Au cours des dernières années, l'utilisation de vecteurs lentiviraux pour la livraison de transgène est devenu pratique courante. Bien qu'il existe des rapports de transduction des cellules épithéliales des voies aériennes complètement différenciées avec certains lentivirus pseudo-typés non-VIH, l'efficacité globale de transduction est habituellement inférieure à 15%. Le protocole présenté ici fournit un procédé fiable et efficace pour produire des lentivirus et pour transduire des cellules épithéliales bronchiques humaines primaires. En utilisant des cellules epitheliales bronchiques non différenciées, une transduction dans un milieu de croissance épithéliale bronchique, tandis que les cellules se fixent, avec une multiplicité d'infection par le facteur de 4 fournit des rendements proches de 100%. Ce protocole décrit, étape par étape, la préparation et la concentration de titre élevé vecteurs lentiviraux et eprocessus de transduction de e. Il examine les expériences qui ont déterminé les conditions de culture optimales pour atteindre transductions très efficace de cellules épithéliales bronchiques humaines primaires.
Introduction
Le développement de la réplication défectueuse, lentivirus pseudotypés (LV) a fourni aux chercheurs une méthode sûre et efficace pour délivrer des transgènes in vitro 1. En raison de leur expression à long terme, celles - ci LV pourrait également être utilisé pour la délivrance d'agents thérapeutiques in vivo 2,3. La production de LV nécessite co-transfection de rein embryonnaire humain (HEK) cellules avec plusieurs plasmides: vecteur de transfert, emballage gag / pol, emballage rev et enveloppe vésiculaire glycoprotéine du virus de la stomatite (VSV-G) plasmides. Les systèmes d'emballage de troisième génération sont considérés comme plus sûrs que les systèmes de seconde génération , car le gène rev est codé sur un plasmide séparé emballage, réduisant ainsi la possibilité d' une recombinaison pour produire un lentivirus compétent pour la replication. Bien que les systèmes d'emballage de deuxième génération donnent cinq unités de pliage totales plus élevées de transduction, la scission du génome viral d'origine pour créerle système de troisième génération a diminué le niveau de transduction que très peu 3,4.
Bien que les lignées de cellules peuvent être transduites plus facilement et efficacement, les chercheurs ont déplacé leur attention vers les cellules primaires, car ceux - ci sont plus représentatifs de tissus in vivo 5,6. Cependant, les cellules primaires sont réfractaires à la transduction. Alors que la transduction des cellules de l' épithélium des voies respiratoires totalement différenciées ont été rapportés, le rendement global ne dépasse pas 15% 7.
Décrite ici est un protocole qui permet la production de LVs à titre élevé. Une approche étape par étape est décrite pour atteindre près de 100% d'efficacité de transduction dans les cellules HBE primaires. Plus précisément, le protocole décrit les conditions optimales de culture instrumentales pour réussir 3. En bref, les cellules HEK 293T sont transfectées en utilisant le lentiviral pCDH vecteur d'expression avec l'EF-1 promoteur dirigeant l'expression d'une meilleure fluorescente verteprotéine (EGFP) ou mCherry, une protéine fluorescente rouge, et un système d'emballage de troisième génération. LVs libérés dans les médias sont collectés 24-72 heures plus tard. Les particules virales sont concentrées avec du polyéthylène glycol (PEG), un procédé commode et rapide de la concentration virale, avant l'estimation du titre en utilisant un dosage par immunosorbant antigène p24 lié à une enzyme (ELISA) trousse. Par la suite, les cellules HBE primaires non différenciées sont transduits dans un milieu de prolifération (milieu de croissance de l' épithélium bronchique ou BEGM) 8, tandis que la fixation (après avoir été trypsinisées), à une multiplicité d'infection (MOI) facteur 4, en ajoutant le bromure d'hexadiméthrine et incubation pendant 16 heures ( pendant la nuit). Les cellules sont ensuite autorisées à se différencier. Étant donné que le transgène viral est exprimé à long terme (au moyen du promoteur approprié, voir la discussion), l'expression sera maintenue tout au long de la différenciation dans un épithélium respiratoire pseudostratifié ou peut être induite (en utilisant un promoteur inductible) après la différenciation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Étape 1: Culture de HEK 293T
- Préparer des cellules HEK supports (désignés comme HEK médias) en ajoutant 10% (v / v) de sérum de fœtus bovin (FBS) et 1% (v / v) de pénicilline / streptomycine à haute teneur en glucose milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM).
- Revêtez un 10 cm de boîte de culture de tissu avec collagène I. Mix 30 pi de collagène I dans 2 ml d'eau distillée. Étaler le mélange sur le plat et incuber pendant 2 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Retirer le mélange et laisser le plat sec dans une hotte à flux laminaire pendant 15 min.
- Plaque cellules HEK sur le plat revêtu à une densité de 1 x 10 6 cellules dans 10 ml de milieu HEK et incuber à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Lorsque les cellules HEK sont 50-60% confluentes (figure 1a, 2-3 jours après le placage), passez à l' étape 2. L' évaluation visuelle de confluence est suffisante. Aucune quantification est nécessaire.
Remarque: les cellules HEK sont cultivées dans des milieux de HEK (voir ci-dessus). Quand ils atteignent la confluence, they peut être divisé (par exemple 1/5) ou congelés vers le bas pour une utilisation ultérieure.
2. Etape 2: Production et concentration des lentivirus (EFV) dans les cellules HEK
Remarque: Les protocoles doivent être exécutés en conformité avec les règlements institutionnels et gouvernementaux sous + (Enhanced BSL-2) conditions aux Etats-Unis BSL-2.
- Transfecter en utilisant une procédure de précipitation au calcium (lipofectamine et d'autres agents de transfection ne sont pas aussi efficaces que la procédure de précipitation de calcium). Utilisation d'un kit de transfection commercial est recommandé pour assurer la reproductibilité, bien que le mode opératoire est modifié comme suit. Amener tous les réactifs à température ambiante. Ceci est le jour 0.
- Pour chaque boîte de 10 cm de cellules HEK293, mélanger 4,5 pg d'enveloppe ADN PMD2-VSVG, 7,5 pg d'emballage ADN pMDLg / pRRE, 3,75 pg d'ADN pRSV--rev, 10 pg d'ADN du vecteur d'expression lentiviral, 86 pl d'une solution 2 M de calcium et de l'eau stérile dans un tube de centrifugation de 15 ml à un volume final de 700 ul(Les deux dernières solutions sont fournies dans le kit de transfection commerciale).
- Goutte à goutte, ajouter 700 ul de solution saline 2x tamponnée HEPES (HBS, fournies dans le kit de transfection), tandis que vortex (dans l'armoire à flux laminaire) et incuber à température ambiante pendant 30 min (effectuer l'étape 4 en attendant).
- Au cours de la période d'incubation précoce, dépôt de 5 ul du mélange sur une lame. Vérifiez la gouttelette sous un microscope avec un objectif 10X, en se concentrant lentement de haut en bas. Un précipité fin doit être visible, ce qui confirme le processus de précipitation de phosphate de calcium (figure 1b).
- Arrêter la précipitation après 30 min par addition de 10 ml de cellules HEK médias et pipette haut et bas pour mélanger.
- Prenez le plat de cellules HEK de l'étape 2,1-2,5, et éliminer le milieu (jour 0). Ajouter la solution de précipité de l'étape 2,5 soigneusement et lentement le long du bord du plat.
- Le lendemain (jour 1), enlever et jeter le milieu contenant le précipité et le remplacer wi-ième 10 ml de milieu HEK. Vérifier l'amende précipité sous le microscope: elle doit être visible dans le plat dans les espaces vides entre les cellules (figures 1c et d).
- Le jour 2, collecter des supports avec une seringue, filtrer à travers un filtre à seringue de 0,45 um dans un tube de 15 ml contenant 3,8 ml de centrifugeuse d'un polyéthylène-glycol à 40% (PEG) solution. Invert 5x pour mélanger et stocker à 4 ° C pendant au moins 24 heures (pour le PEG précipite pour former, mais pas plus de 5 jours) jusqu'à ce que toutes les collections de virus sont complets.
- Répétez l'étape 2.8 aux jours 3 et 4. Le jour 4 ne remplace pas avec le milieu HEK mais décontaminez avec 10% de l'eau de Javel et jeter le plat.
- Centrifuger tous les tubes de collecte (habituellement toutes les collections ensemble le jour 5) à 1.650 xg pendant 20 min à 4 ° C pour sédimenter le virus. Retirer et jeter le surnageant, et tourner à nouveau à 1.650 xg pendant 5 min à 4 ° C pour recueillir et enlever tout reste de PEG surnageant.
- ResusPend le culot de chaque tube dans 200 ul de milieu de croissance de l' épithélium bronchique (BEGM) sans amphotéricine B 8. Les réunir et aliquote à 200 pi. virus de magasin à -80 ° C. Aliquoter supplémentaires 10 pi pour effectuer la Gag (p24) antigène test VIH-1 ELISA.
- En utilisant un kit ELISA du commerce, effectuer un dosage de l'antigène p24 selon le protocole du fabricant. L'essai donne une estimation de la p24 virale en pg / ml.
3. Étape 3: Cellules Culture HBE primaire
- Plaque de cellules HBE dans 10 ml BEGM milieu (avec 100 ul d' amphotéricine B si le passage 0 cellules sont utilisées pour éliminer la possibilité d'une contamination fongique) à une densité de 1 x 10 6 cellules d'un collagène de type I enduisais 10 cm de boîte de culture tissulaire. Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Le lendemain, retirez le support et le remplacer par 10 ml BEGM (avec 100 ul amphotéricine B pour le passage 0 cellules) pour un total de 4 jours. Retour à l'incubateur.
- Après 4 days, utilisez uniquement BEGM sans amphotéricine B. Changer les médias tous les jours.
- Lorsque les cellules sont 80-90% confluentes (Figure 2a; ~ 7 jours après le placage), procéder à la transduction (attention à 3,5 pour la préparation avant la transduction). Encore une fois, une évaluation visuelle de confluence est suffisante. Aucune quantification est nécessaire.
- Avant la transduction, enduire les inserts de support perméable à une solution de collagène IV, dilué à 1/10 avec de l'eau distillée stérile. Ajouter 200 pi à chaque insert et laisser sécher pendant la nuit dans la hotte à flux laminaire.
4. Etape 4: transduction des cellules HBE
- Retirer le support, ajouter 3 ml de trypsine à 0,1% dans de l' acide éthylènediaminetétraacétique 1 mM dans du tampon phosphate salin (EDTA / PBS) et incuber pendant 5 minutes à 37 ° C et 5% de CO 2. Vérifiez sous le microscope (objectif 10X) pour voir si toutes les cellules sont détachées. Sinon, retournez à l'incubateur pendant 5 minutes supplémentaires.
- Lorsque toutes les cellules sont détachés, ajouter 3ml d'inhibiteur de trypsine de soja (SBTI 1 mg / ml), mélanger et transférer dans un tube centrifuger de 15 ml. Sédimenter les cellules par centrifugation à 460 g pendant 5 min à température ambiante.
- Retirer le surnageant et remettre le culot dans 3 ml de BEGM et procéder à comptage.
- Resuspendre les cellules HBE (maintenant passage 1 ou P1) à un rapport de 2 x 10 5 cellules par 12 mm , une pièce rapportée de support perméable dans 400 ul de BEGM (voir le tableau 2). Extrapoler ces valeurs en fonction de la quantité d'inserts de support perméable qui sera transduites.
| Surface | Surface | Nombre de cellules | Médias | Volume (médias) |
| Boîte de 10 cm | 52,7 cm 2 | 1 x 10 6 | BEGM | 10 ml | </ Tr>
| filtre 12 mm | 1,13 cm 2 | 2 x 10 5 | BEGM | 400 ul |
| filtre 24 mm | 4,52 cm 2 | 8 x 10 5 | BEGM | 800 pi |
Tableau 2: extrapolation des médias par le nombre de cellules.
- En utilisant une multiplicité d'infection (MOI) de facteur 4, ajouter le volume approprié de virus à la suspension cellulaire.
- Ajouter le bromure hexadimethrine à un 2 pg / ml de concentration finale.
- Distribuer 400 ul du mélange (BEGM, HBE cellules, le virus et le bromure de hexadimethrine) par insertion de support perméable dans le compartiment apical, et ajouter 1 ml de BEGM seul le compartiment basolatéral. Incuber une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2. cellules Toujours plaque de HBE sans virus que le contrôle et la sélection de puromycine de test le cas échéant.
- Le lendemain, remmédias apical et basolatéral ove, lavage avec du PBS, et remplacer les deux compartiments avec l' interface air-liquide (ALI) médias 8.
- Lorsque les cellules sont confluentes, éliminer le liquide apicale (connu comme l'établissement d'une interface air-liquide). Continuer de changer le milieu (ALI) dans le compartiment inférieur tous les deux jours jusqu'à ce qu'ils atteignent leur pleine maturité; généralement 3 à 4 semaines plus tard.
Remarque: Si le vecteur lentiviral contient un gène de sélection tel que la puromycine, les cellules peuvent être sélectionnées par l'addition de puromycine selon une courbe de concentration de sélection. Pour les cellules HBE, une concentration de 1 ug / ml a été déterminé comme idéal pour la sélection de cellules transduites cohérente. Cependant, cette concentration peut être différente pour d'autres cellules ou conditions et devrait être déterminée en tuant des courbes. L'addition de puromycine peut commencer dès le lendemain de la presse a été remplacé par les médias ALI ou plus tard (2-3 jours) pour permettre la pleine expression du gène de sélection. Soyez sûr d'ajouter puromycine à un insert hcomme non transduites. Puromycine peut être ajoutée jusqu'à ce que les cellules sont complètement différenciées.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figure 1 illustre les différentes étapes clés d'évaluation de cellules et de solutions pendant le processus de transfection. La figure 1a représente la confluence optimale des cellules HEK293T avant la transfection pour la production de virus. Il est important que les cellules sont réparties uniformément dans le plat. La figure 1b montre le précipité dans une goutte du mélange de transfection utilisant une optique de champ lumineux et un objectif 10X. Plus les précipités ressemblent à des grains de sable plutôt que des agglomérats, plus efficace la transfection sera. Dans cette image, le précipité est un peu grossier. Le précipité est un indicateur fiable si la transfection va produire un titre élevé de virus. Si l'un des ingrédients est manquant ou de mauvaise qualité (ADN vecteur, par exemple), agglomérats forment, ce qui est un signe de mauvais augure. Si tel est le cas, il est plus sage d'abandonner et recommencer la procédure, faire en sorte quetous les ingrédients sont dans le mélange, et / ou le contrôle de la qualité de l'ADN du vecteur et l' ADN de l' emballage. La figure 1c montre le même plat comme A, après une nuit d' incubation. Le précipité est (et doit être) visible entre les cellules. Nous avons remarqué que les cellules ne se multiplient pas beaucoup au cours de la 24 heures après la transfection.
La figure 2 montre comment les cellules HBE regardent avant et 3 jours après la transduction. Figure 2A représente environ 80% confluentes cellules HBE primaire avant trypsine et la transduction. Un plat de 10 cm à 80% de confluence donne environ 4 x 10 6 cellules. Figure 2b représente près de 100% transduction des cellules P1 HBE indifférenciées en utilisant une MOI de 4 sur insert de support perméable. Lorsque les cellules HBE sont plaquées sur ces inserts de support perméable, les cellules sont relativement stables. Sur cette photo, la hauteur des cellules est à seulement quelques microns, ce qui explique pourquoi la0,4 um pores sont visibles si les cellules.
La figure 3 montre des expériences d'optimisation conduisant au protocole présenté. Toutes les expériences ont été réalisées en triple sur enduit I puits de collagène (plaque 24 puits), avec 2 x 10 5 cellules HBE primaires par puits. La plupart des expériences ont utilisé un MOI de 0,4 avec un 2 pg / ml de concentration finale de hexadimethrine bromidein BEGM médias. Les cellules fluorescentes ont été comptées 3 jours après la transduction. Même si l'optimisation initiale du protocole a été effectué sur le plastique, les résultats ont été confirmés sur des inserts de support perméables. En outre, les tentatives pour transduire des cellules complètement différenciées HBE P1 n'a pas réussi (données non présentées), ce qui confirme les rapports précédents. Comme on le voit sur la figure 3a, un pourcentage plus élevé de cellules HBE sont transduits dans BEGM support par rapport à ALI. Si les cellules sont ensemencées la veille dans des milieux de transduction BEGM, l'efficacitéest significativement diminué par rapport à la transduction tandis que les cellules attachent (Figure 3b). Lorsque les cellules sont étalées P1 HBE le jour avant la transduction in ALI média (au lieu de BEGM), l'efficacité de transduction diminue encore davantage (données non présentées). La différence entre ces 2 médias est la concentration de calcium. BEGM support contient une faible concentration en calcium (0,1 mM) par rapport aux médias ALI (1 mM). Formes de calcium et maintient des jonctions serrées et donc, il pourrait être difficile pour les particules de virus à traverser 9 et accéder à leurs récepteurs à la membrane basolatérale. En fait, certaines infections ont réussi à de faibles concentrations en perturbant les jonctions serrées à l' aide de l' acide tétraacétique d' éthylène glycol (EGTA) , par exemple 10. Comme indiqué précédemment, les cellules P1 HBE complètement différenciées sont réfractaires et ne peuvent être transduites avec de faibles rendements 5-7, qui pourraient être dues à des jonctions serrées en haute calcium contenant les médias. Une autre explication defaible efficacité de transduction dans des cellules complètement différenciées est un mécanisme de transport mucociliaire actif où le mucus pourrait agir comme une barrière. Ou bien , comme indiqué par Bals et al., Le stade de différenciation des cellules dans lesquelles sont HBE, est un facteur déterminant de l' efficacité de transduction 10. Le fait que plus de cellules se transduites en BEGM que dans ALI multimédia prend en charge cette déclaration (Figure 3a).
Comme on le voit sur la figure 3b, on a observé une augmentation de près de 50% l' efficacité de transduction lorsque les cellules ont été transduites tout en attachant par rapport aux cellules plaquées le jour précédent. Dans leur étude, Ricks et al. A montré une augmentation de 20% lors de la transduction a été réalisée après trypsinisation 11. Ensemble, ces résultats suggèrent que les médias et l'état de maturité des cellules est la clé du succès de transduction.
Le panneau de la figure3c, démontre hexadimethrine bromideplaying rôle atrivial dans l' efficacité de transduction. Néanmoins, son utilisation est suggéré dans ce protocole, car il n'a pas d'impact négatif, mais pourrait être bénéfique. Hexadiméthrine bromure est un polymère cationique qui est utilisé en virologie pour améliorer l' efficacité de transduction 12. D' autres ont publié l'utilisation de protamine, un autre polymère cationique, mais aucune différence significative n'a été observée en ce qui concerne l' efficacité de transduction par rapport à hexadimethrine bromure 13. Bromure Hexadimethrine n'a pas d' impact ni la croissance différenciation 14-16.
Enfin, les différents IAM ont été étudiés sur la Figure 3d: l'efficacité de transduction plus élevée est produite avec une MOI de 4. Il n'y avait pas de différence significative entre MOI 0,4 et 4, cependant, MOI 4 transduite 100% des cellules HBE tandis que MOI 0,4 seulement transduites 75%. Le MOI définit combien virus particules will ont la capacité d'infecter une cellule. Il existe différentes méthodes pour déterminer la MOI. L'un d'eux consiste à définir le nombre d'unités de transduction (TU). En utilisant un ELISA, la quantité d'antigène p24 peut être déterminée en pg / ml. p24 virale en picogrammes peut être converti en TU, qui sont nécessaires pour le calcul de la MOI. Le MOI est calculé en divisant le nombre de TU par le nombre de cellules. Il y a 10-100 unités de transduction (TU) par picogramme p24. Toutes les références dans le texte concernant MOI sont basées sur des calculs avec 100 TU par picogramme p24. (Http://tronolab.epfl.ch/webdav/site/tronolab/shared/protocols/TUvsp24.html).
Figure 1:. La transfection de cellules HEK 293T (a) des cellules HEK 293T cultivées jusqu'à une confluence de 50 à 60% comme on le voit sous un objectif 10X. (B) Précipiter visible dans un 5 pi baisse de 5 min après mélange tout reagents sous le microscope (objectif 10X). (C) Précipiter dans le plat à côté des cellules, après transfection pendant une nuit (objectif 10X). (D) Le grossissement du centre (c). Blanc flèche pointant vers précipiter. Barre d'échelle = 100 pm; est le même pour a, b, et c. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Transduction de cellules NHBE (a) les cellules HBE cultivées dans un plat revêtu de collagène de type I à 80-90% de confluence (environ 4 x 10 6 cellules) dans BEGM médias pendant 5 jours (objectif 10X).. Barre d'échelle = 100 um. (B) eGFP transduction des cellules HBE sur inserts perméables de support (12 mm), 3 jours après transduction (confocale, 20X). A ce stade, HBE cel ls sont plats et les pores de la membrane sont visibles. Barre d' échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Optimisation du protocole de transduction (a) Impact des médias sur l' efficacité de transduction.. (B) Comparaison de transduction dans les cellules HBE plaqué la veille et la transduction des cellules tout en attachant. (C) Influence du bromure d'hexadiméthrine sur l' efficacité de transduction. (D) l' évaluation de l' amélioration des efficacités de transduction à l' aide de différents IAM. L'analyse a été réalisée en utilisant le test t de Student ou un test de comparaison multiple de Kruskal-Wallis et Dunn. Les barres d'erreur représentent SE et tout * représentent p <0,05.ww.jove.com/files/ftp_upload/54176/54176fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le protocole décrit ici assure près de 100% l'efficacité de transduction. Cependant, il y a des étapes au cours du processus qui sont importants pour atteindre cet objectif. Par exemple, pendant le processus de transfection, la présence de précipités dans le mélange de transduction (goutte) ou dans le plat du jour après transduction (figures 1 b et d) sont pertinents pour une bonne transfection. L'absence d'un précipité ou la présence d'agglomérats peut être due à une omission de l'un des réactifs de transfection, un problème de pH ou une mauvaise préparation du plasmide. Si le précipité est manquant, il y a une forte probabilité que aucun ne sera visible le lendemain. En outre, en ajoutant le mélange de transfection ou HEK médias trop rapide peut provoquer les cellules HEK se détacher, ce qui entrave la transfection et le rendement. Une autre indication d'un bon rendement est d'au jour 6 avant l'étape de centrifugation: un précipité blanc doit être visible dans la partie inférieure du tube. Une mauvaise transfection avec presqueaucun virus ne va pas créer ce précipité blanc. Pendant le processus de transduction, il est essentiel d'utiliser des cellules HBE primaires qui ont été dé-différenciées et qui sont dans une des cellules souches comme l'état afin de réaliser des économies élevées de transduction. L'utilisation d'un vecteur contenant une protéine fluorescente telle que l'eGFP ou mCherry qui est facilement visualisé peut être un bon outil.
Des modifications pourraient être apportées pour adapter ce protocole aux différentes cellules primaires. Une approche serait de réduire la concentration de calcium dans les médias. Comme on le voit sur la figure 3a, en utilisant des milieux BEGM qui contient une plus faible concentration de calcium conduit à significative l' efficacité de transduction plus élevée dans les cellules HBE primaires. Une autre approche pourrait consister à augmenter le MOI. Comme on le voit sur la figure 3d, plus la MOI, meilleure est l'efficacité de transduction. Cependant, en utilisant un MOI plus élevé pourrait devenir toxique pour certaines cellules.
Néanmoins, il y a quelques limita tions à ce protocole. Cette technique a été développée en utilisant le passage 1 des cellules HBE. Poumons rejetés pour la transplantation ont été obtenus avec le consentement approprié pour la recherche conforme aux normes établies par la déclaration d'Helsinki. L'obtention de cellules HBE primaires à partir de sources commerciales peut être coûteux. Ces cellules sont généralement aussi disponible uniquement sur un passage supérieur. Ce protocole n'a pas été testé sur des passages supérieurs à 2. Un autre facteur limitant est le test ELISA p24 d'antigène. Plusieurs compagnies offrent le kit, mais à un coût élevé. En outre, la concentration virale donnée par le dosage, est seulement une valeur approchée puisque le test détecte p24 et p24 lentivirus libre libéré lors de la transfection transitoire 17. Par conséquent, cette évaluation de MOI est seulement une estimation. Enfin, en utilisant l'expression différentes constructions (plus ou moins grande taille) ne peut pas donner les mêmes résultats. Par exemple, des rendements différents ont été enregistrés à l'aide mCherry et eGFP (données non présentées).
ent "> Il y a des avantages à ce protocole sur les autres méthodes. L'un d'eux est le processus de transfection. En fait, le protocole proposé peut donner de tels titres élevés de virus qui ne seront plus besoin des médias collectés contenant des virus à se concentrer et pourrait être utilisé directement à la transduction de cellules. le polyéthylène glycol (PEG), utilisé dans ce protocole pour concentrer le virus, a été connu pour être toxique pour les cellules de mammifères 18. en outre, si MOI plus élevé ont été utilisés, ce qui augmenterait le risque de toxicité encore plus. Cependant, si l'étape de concentration de PEG devient obsolète, les chercheurs qui ont échoué à transduction en raison des effets de toxicité pourraient reconsidérer l'utilisation des lentivirus. Un autre avantage de ce protocole est le manque de différences dans les efficacités de transduction sur plastique ou inserts de support perméables. l'avantage d'être capable de transduire en plastique est que moins de cellules et les particules virales sont nécessaires. en conséquence, les cellules peuvent être développées et transférées après la transductionsur des inserts de support perméable lorsque confluentes (données non présentées).Le choix des vecteurs dépend de plusieurs questions, telles que la sélection de cellules transduites avec la puromycine ou l'expression de protéines marqueurs tels que la protéine fluorescente verte (GFP). Il existe de multiples vecteurs commerciaux disponibles qui conviennent (pRRLsinPPT.CMV.MCS.Wpre, pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro, pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro, pGEM-T Easy) 15,19-21. La sélection des promoteurs pose des défis, puisque le promoteur CMV couramment utilisé est réduit au silence dans les voies respiratoires différenciées des cellules épithéliales 15. Pour l'expression spécifique des cellules ciliées, utilisation du promoteur fox-j1 est recommandé. En variante, le promoteur EF-1 peut être utilisé pour l' expression dans les cellules des voies respiratoires 20,21. Si surexpression de la protéine est demandée, la taille de l'insert déterminera, en partie, l'efficacité de transduction. Cependant, les grandes tailles peuvent être logés comme on le voit par transduction réussie de pleine longueur adénylyl cyclase soluble 22 .Le laboratoire a publié plusieurs surexpression succès construit 15,16,20-22. Pour l'expression shRNA (généralement sous le promoteur U6 ou H1), de multiples constructions devront être explorées. Cela peut être fastidieux avec des tests réalisés à la fin de la différenciation (PCR et Western blot), mais le processus ne peut pas être abrégée puisque les cellules non différenciées peuvent ne pas être une bonne représentation de la réussite pour les cellules en cours de différenciation. Encore une fois, le laboratoire a publié plusieurs succès shRNA construit 14,20,21,23.
En utilisant ce protocole, plusieurs chercheurs pourraient être permis d'améliorer de manière significative transductions pauvres précédents. Certains pourraient trouver utile d'augmenter l'efficacité en faisant quelques ajustements. Certains pourraient utiliser cet outil pour découvrir de nouveaux procédés biologiques ou pour être en mesure de prouver les concepts, à la fois en utilisant knockdown ou surexpression stratégies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Nous remercions l'Agence de l'Université de Miami vie Alliance Organ Recovery pour fournir les poumons. Nous remercions également le Dr Lisa Künzi pour la préparation de l'ADN utilisé pour les expériences présentées dans la figure 2B et 3-D, le Dr Ben Gerovac et Lisa Novak pour le virus mCherry utilisé pour les expériences sur les figures 3A à C. Nous remercions également Gabriel Gaidosh de l'installation d'imagerie, Département d'ophtalmologie à l'Université de Miami.
Cette étude a été parrainée par des subventions du NIH, la Fondation de la mucoviscidose et de l'agent de bord Institut de recherche médicale au Dr Matthias Salathé.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | 12306C | use at 10% |
| DMEM | Thermo Scientific | 11995-040 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Thermo Scientific | 15140-122 | use at 1x |
| Collagen I | BD Biosciences | 354231 | dilute 1:75 in distilled water |
| Calphos | Clontech | 631312 | Transfection kit containing 2 M Calcium solution, 2x HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O |
| Polythylene glycol 8000 | VWR scientific | 101108-210 | stock of 40% |
| Amphotericin B | Sigma | A9528 | use at 1x |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Transwell 12 mm | Corning | 3460 | |
| Collagen IV | Sigma | C7521 | dilute 1:10 in distilled water |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | stock of 2 mg/ml |
| Puromycin (10.000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | use at 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 | lentiviral expression vector |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | packaging DNA |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | packaging DNA |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | packaging DNA |
References
- Ding, B., Kilpatrick, D. L. Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons. Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).
- Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Jr Gene therapy progress and prospects: development of improved lentiviral and retroviral vectors--design, biosafety, and production. Gene Ther. 12, 1089-1098 (2005).
- Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnol. 13, (2013).
- Delenda, C. Lentiviral vectors: optimization of packaging, transduction and gene expression. J Gene Med. 6 Suppl 1, S125-S138 (2004).
- Gresch, O., Altrogge, L. Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells. Methods Mol Biol. 801, 65-74 (2012).
- Jordan, E. T., Collins, M., Terefe, J., Ugozzoli, L., Rubio, T. Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells. J Biomol Tech. 19, 328-334 (2008).
- Castillon, N., et al. Regeneration of a well-differentiated human airway surface epithelium by spheroid and lentivirus vector-transduced airway cells. J Gene Med. 6, 846-856 (2004).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. 107, 183-206 (2005).
- Gonzalez-Mariscal, L., et al. Role of calcium in tight junction formation between epithelial cells. Am J Physiol. 259, C978-C986 (1990).
- Bals, R., et al. Transduction of well-differentiated airway epithelium by recombinant adeno-associated virus is limited by vector entry. J Virol. 73, 6085-6088 (1999).
- Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 17, 441-450 (2008).
- Davis, H. E., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 97, 159-172 (2002).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, 341-347 (2013).
- Manzanares, D., et al. Functional apical large conductance, Ca2+-activated, and voltage-dependent K+ channels are required for maintenance of airway surface liquid volume. J Biol Chem. 286, 19830-19839 (2011).
- Schmid, A., et al. Real-time analysis of cAMP-mediated regulation of ciliary motility in single primary human airway epithelial cells. J Cell Sci. 119, 4176-4186 (2006).
- Unwalla, H. J., Ivonnet, P., Dennis, J. S., Conner, G. E., Salathe, M. Transforming growth factor-beta1 and cigarette smoke inhibit the ability of beta2-agonists to enhance epithelial permeability. Am J Respir Cell Mol Biol. 52, 65-74 (2015).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6, (2006).
- Schneiderman, S., Farber, J. L., Baserga, R. A simple method for decreasing the toxicity of polyethylene glycol in mammalian cell hybridization. Somatic Cell Genet. 5, 263-269 (1979).
- Schmid, A., et al. Soluble adenylyl cyclase is localized to cilia and contributes to ciliary beat frequency regulation via production of cAMP. J Gen Physiol. 130, 99-109 (2007).
- Manzanares, D., et al. Airway Surface Dehydration by Transforming Growth Factor beta (TGF-beta) in Cystic Fibrosis Is Due to Decreased Function of a Voltage-dependent Potassium Channel and Can Be Rescued by the Drug Pirfenidone. J Biol Chem. 290, 25710-25716 (2015).
- Manzanares, D., et al. IFN-gamma-mediated reduction of large-conductance, Ca2+-activated, voltage-dependent K+ (BK) channel activity in airway epithelial cells leads to mucociliary dysfunction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L453-L462 (2014).
- Chen, X., et al. A soluble adenylyl cyclase form targets to axonemes and rescues beat regulation in soluble adenylyl cyclase knockout mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 51, 750-760 (2014).
- Ransford, G. A., et al. Pannexin 1 contributes to ATP release in airway epithelia. Am J Respir Cell Mol Biol. 41, 525-534 (2009).
