Abstract
In vitro-kultur av primære humane bronkiale epitel (HBE) celler ved anvendelse av luft-væske-grenseflate betingelser gir en nyttig modell for å studere prosesser av celledifferensiering i luftveiene og funksjon. I de siste årene har bruken av lentivirale vektorer for transgenet levering ble vanlig praksis. Mens det er rapporter om transduksjon av fullt differensierte luftveis epitelceller med visse ikke-HIV-pseudo-skrev lentiviruses, er den samlede transduksjon effektivitet vanligvis mindre enn 15%. Protokollen presenteres her gir en pålitelig og effektiv metode for å produsere lentiviruses og å omsette primære humane bronkiale epitelceller. Ved hjelp av udifferensierte bronkiale epitelceller, transduksjon i bronkial epitelial vekstmedier, mens cellene feste, med en multiplisitet av infeksjon faktor på 4 gir effektivitet nær 100%. Denne protokollen beskriver, trinn-for-trinn, utarbeidelse og konsentrasjonen av høy titer lentiviral vektorer og the transduksjon prosessen. Den drøfter eksperimentene som avgjorde de optimale dyrkningsforhold for å oppnå svært effektive transductions av primære humane bronkiale epitelceller.
Introduction
Utviklingen av replikering-defekt, pseudotyped lentiviruses (LV) har gitt forskere med en trygg og effektiv metode for å levere transgener in vitro 1. På grunn av deres langvarige ekspresjon, kunne disse LV også anvendes for levering av terapeutiske midler in vivo 2,3. Produksjonen av LV krever co-transfeksjon av humane embryonale nyre (HEK) celler med flere plasmider: transfer vektor, emballasje gag / pol, emballasje rev, og konvolutt vesikulær stomatitt viruset glykoprotein (VSV-G) plasmider. Tredje-generasjons emballasjesystemer anses som sikrere enn andre-generasjons systemer fordi den rev-gen er kodet på en separat emballasje plasmid, for derved å redusere muligheten for rekombinasjon for å fremstille et replikasjonskompetente lentivirus. Selv om andre generasjon emballasjesystemer gir fem ganger høyere totale transduksjon enheter, til delingen av den opprinnelige virusgenomet skapeden tredje generasjons system har redusert nivået av transduksjon bare minimalt 3,4.
Mens cellelinjer kan omformes mer enkelt og effektivt, har forskere skiftet fokus til primærceller, fordi disse er mer representativt for in vivo vev 5,6. Men primære celler er ildfaste til transduksjon. Mens transduksjon av fullt differensierte luftveis epitelceller er rapportert, har den totale effektiviteten ikke oversteg 15% 7.
Beskrevet her er en protokoll som tillater produksjon av høy titer LVS. En trinn-for-steg tilnærming er skissert for å oppnå nesten 100% transduksjon effektivitet i primær HBE celler. Mer spesifikt beskriver protokollen optimale dyrkningsforhold instrumentale å lykkes tre. I korthet, blir HEK-293T-celler transfektert ved hjelp av lentiviral ekspresjonsvektoren pCDH med EF-1 promotoren som driver ekspresjon av forbedret grønn fluorescerendeprotein (EGFP) eller mCherry, en rød fluorescerende protein, og en tredje generasjons pakkesystem. LVS slippes ut i media samles 24-72 timer senere. Viruspartiklene er konsentrert med polyetenglykol (PEG), en praktisk og enkel metode for viruskonsentrasjon, før titer estimering ved bruk av et p24-antigen enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA) kit. Deretter blir udifferensierte primære HBe-celler transdusert i proliferasjon media (bronkial epitelial vekstmedium eller BEGM) 8, mens feste (etter blir trypsinert), ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) faktor på 4, og legger hexadimethrine bromid og inkubering i 16 timer ( over natten). Cellene blir deretter lov til å differensiere. Siden virale transgenet blir uttrykt langtids (ved hjelp av passende promoter, se diskusjon), vil ekspresjon opprettholdes gjennom differensiering til en pseudostratified luftveisepitel eller kan være indusert (ved bruk av en induserbar promoter) etter differensiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Trinn 1: Culture of HEK 293T
- Forbered HEK celler materiale (som HEK media) ved tilsetning av 10% (v / v) føtalt bovint serum (FBS) og 1% (volum / volum) penicillin / streptomycin til høy glukose Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM).
- Belegge en 10 cm vevskulturskål med kollagen I. Bland 30 ul av kollagen i 2 ml destillert vann. Spre blandingen på fatet og inkuber i 2 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Fjerne blandingen og la den tørke fatet i en laminær strømningsskap i 15 min.
- Plate HEK-celler på den belagte tallerken ved en tetthet på 1 x 10 6-celler i 10 ml HEK-media og inkubert ved 37 ° C og 5% CO2.
- Når HEK celler er 50-60% konfluent (Figur 1a, 2-3 dager etter plating), går du videre til trinn 2. Visuell bedømmelse av konfluens er tilstrekkelig. Ingen kvantifisering er nødvendig.
Merk: HEK-celler dyrkes i HEK media (se ovenfor). Når de når konfluens, thei kan deles (f.eks 1/5) eller fryses ned for senere bruk.
2. Trinn 2: Produksjon og Konsentrasjon av lentiviruses (LVS) i HEK Cells
Merk: Protokollene skal utføres i tråd med institusjonelle og statlige reguleringer BSL-2 + (forbedret BSL-2) forhold i USA.
- Transfektere ved hjelp av et kalsium-utfelling prosedyre (lipofektamin og andre transfeksjon midler var ikke så effektiv som den kalsium-utfelling prosedyre). Anvendelse av et kommersielt kit transfeksjon anbefales for å sikre reproduserbarhet, skjønt fremgangsmåten er modifisert som følger. Bring alle reagenser til romtemperatur. Dette er dag 0.
- For hver 10 cm rett av HEK293 celler, bland 4,5 mikrogram av konvolutten DNA pMD2-VSVG, 7,5 mikrogram emballasje DNA pMDLg / pRRE, 3,75 ug DNA pRSV-rev, 10 ug DNA av lentiviral uttrykk vektor, 86 mL av en 2 M kalsium løsning , og sterilt vann i et 15 ml sentrifugerør til et sluttvolum på 700 ul(De to sistnevnte løsninger er gitt i den kommersielle transfeksjon kit).
- Dråpevis, tilsett 700 ul av 2x HEPES-bufret saltvann (HBS, gitt i transfeksjon kit) under snurring (i den laminære strømningsskap) og inkuber ved romtemperatur i 30 min (utføre trinn 4 mens de venter).
- I løpet av tidlig inkubasjonstid, innskudd 5 mL av blandingen på et lysbilde. Sjekk dråpen under et mikroskop med et 10X objektiv, fokuserte langsomt opp og ned. Et fint bunnfall skal være synlige, noe som bekrefter den kalsiumfosfatutfelling prosess (figur 1b).
- Stopp nedbør etter 30 min ved å legge til 10 ml HEK celler media og pipette opp og ned for å blande.
- Ta rett av HEK celler fra trinn 02.01 til 02.05, og fjern medium (dag 0). Legg bunnfallet fra trinn 2,5 sakte og forsiktig langs kanten av fatet.
- På neste dag (dag 1), og ta bort den medium som inneholder bunnfallet og erstatte den wed 10 ml HEK medium. Se etter den fine bunnfallet under mikroskopet: det bør være synlig i retten i tomrommene mellom cellene (figur 1c og d).
- På dag 2, samle media med en sprøyte, filtrer gjennom et 0,45 um sprøytefilter inn i et 15 ml sentrifugerør inneholdende 3,8 ml av en 40% polyetylenglykol (PEG) oppløsning. Inverter 5x å mikse og oppbevar ved 4 ° C i minst 24 timer (for PEG fremskynde til form, men ikke lenger enn 5 dager) før alle virus samlinger er fullført.
- Gjenta trinn 2,8 på dag 3 og 4. På dag fire ikke erstatte med HEK medium men rense med 10% blekemiddel og kast fatet.
- Sentrifuger alle prøverør (vanligvis alle samlinger sammen på dag 5) ved 1650 xg i 20 min ved 4 ° C til pellet viruset. Fjern og kast supernatanten, og spinne igjen på 1650 xg i 5 min ved 4 ° C for å samle inn og fjerne eventuelle gjenværende av PEG supernatant.
- resuspendertpend pellet av hvert rør i 200 ul bronkial epitelial vekstmedium (BEGM) uten amfotericin B 8. Pool dem sammen og alikvot på 200 ul. Lagres virus ved -80 ° C. Alikvot ytterligere 10 pl for å utføre den HIV-1 Gag (P24) antigen ELISA-analysen.
- Ved hjelp av et kommersielt ELISA kit, utføre en p24 antigen analyse i henhold til produsentens protokoll. Analysen gir et anslag av viral p24 i pg / ml.
3. Trinn 3: Kultur Primær HBe Cells
- Plate HBe-celler i 10 ml BEGM medium (med 100 ul amfotericin B hvis passasje 0 celler brukes for å eliminere mulig soppforurensning) ved en tetthet på 1 x 10 6 celler i en kollagen-belagte 10 cm vevskulturskål. Inkuber ved 37 ° C og 5% CO2.
- På den neste dag, fjern mediet og erstatte med 10 ml BEGM (med 100 ul amfotericin B for passasje 0-celler) i totalt 4 dager. Gå tilbake til inkubatoren.
- Etter 4 days, bruk kun BEGM uten amfotericin B. Endre media annenhver dag.
- Når cellene er 80-90% konfluent (figur 2a; ~ 7 dager etter plating), fortsette med transduksjon (ta hensyn til 3.5 for forberedelse før transduksjon). Igjen er tilstrekkelig visuell vurdering av sammenflytning. Ingen kvantifisering er nødvendig.
- Før transduksjon, belegge den permeable støtteinnsatser med en kollagen IV-oppløsning fortynnet 1/10 med sterilt destillert vann. Tilsett 200 ul til hver innsatsen og la tørke over natten i laminær skap.
4. Trinn 4: Transduksjon av HBE Cells
- Fjerne media, tilsett 3 ml 0,1% trypsin i 1 mM etylendiamintetraeddiksyre i fosfatbufret saltvann (EDTA / PBS) og inkuberes 5 minutter ved 37 ° C og 5% CO2. Sjekk under mikroskopet (10X objektiv) for å se om alle cellene er frittliggende. Hvis ikke, går du tilbake til inkubatoren for ytterligere 5 min.
- Når alle cellene er frittliggende, tilsett 3ml av soyabønne trypsin inhibitor (SBTI 1 mg / ml), bland og overfør til et 15 ml sentrifugerør. Pellet cellene ved spinning ved 460 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
- Fjern supernatanten og resuspender pellet inn i 3 ml BEGM og fortsette med telling.
- Resuspender HBe-celler (nå passasje ett eller P1) ved et forhold på 2 x 10 5 celler per en 12 mm permeabel bærende mellomlags i 400 ul BEGM (se tabell 2). Ekstrapolere disse tall basert på mengden av gjennomtrengelige støtteinnsatser som skal transduserte.
| Flate | Flateareal | legemer | Media | Volum (media) |
| 10 cm tallerken | 52,7 cm 2 | 1 x 10 6 | BEGM | 10 ml | </ Tr>
| 12 mm filter | 1,13 cm 2 | 2 x 10 5 | BEGM | 400 mL |
| 24 mm filter | 4,52 cm 2 | 8 x 10 5 | BEGM | 800 mikroliter |
Tabell 2: Media ekstrapolering per legemer.
- Ved hjelp av en multiplisitet av infeksjon (MOI) faktor på 4, tilsett passende volum av virus til cellesuspensjonen.
- Legg hexadimethrine bromid til en 2 pg / ml sluttkonsentrasjon.
- Tilsett 400 ul av mix (BEGM, HBE celler, virus og hexadimethrine bromide) per gjennomtrengelig støtte innsatsen i apikale rommet, og tilsett 1 ml BEGM alene til basolateral rommet. Inkuber over natten ved 37 ° C og 5% CO 2. alltid plate HBe-celler uten virus som kontroll og test puromycin utvalg hvis dette er aktuelt.
- På neste dag, remove apikale og basolaterale media, vask med PBS, og erstatte begge lommer med luft-væske-grensesnittet (ALI) media 8.
- Når cellene er konfluente, fjerne apikale væske (kjent som etablerer en luft-væske-grensesnittet). Fortsett å endre medium (ALI) i bunnen rommet annenhver dag inntil de når full modenhet; vanligvis 3 til 4 uker senere.
Merk: Hvis lentiviral vektor inneholder et seleksjonsgen for eksempel puromycin, kan cellene bli valgt ved å tilsette puromycin ifølge et utvalg konsentrasjonskurven. For HBE celler, har en konsentrasjon på 1 mg / ml er fast bestemt på å være ideell for konsekvent utvalg av transduced celler. Dette kan imidlertid konsentrasjonen variere for de forskjellige celler eller tilstander og bør bestemmes ved å drepe kurver. Tilsetting av puromycin kan starte så tidlig som en dag etter at media har blitt erstattet av Ali media eller senere (2-3 dager) for å tillate fulle uttrykk for seleksjonsgenet. Sørg for å legge puromycin til en innstikk som hsom ikke har blitt omformet. Puromycin kan tilsettes inntil cellene er fullstendig differensiert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser forskjellige nøkkeltrinnene Ved vurdering av celler og oppløsninger under transfeksjonen prosessen. Figur 1a viser den optimale sammenflytning av HEK293T celler før transfeksjon for virusproduksjon. Det er viktig at cellene er fordelt jevnt i hele fatet. Figur 1b viser bunnfallet i en dråpe av blandingen transfeksjon ved hjelp av sterke felt optikk og et 10X objektiv. Jo mer utfellinger ligne sandkornene i stedet for agglomerater, jo mer effektiv transfeksjon være. I dette bildet er det bunnfall litt grov. Bunnfallet er en pålitelig indikator på om transfeksjon vil produsere en høy titer av viruset. Hvis noen av ingrediensene mangler eller er av dårlig kvalitet (vektor-DNA for eksempel), vil agglomerater form, som er et illevarslende tegn. Hvis dette er tilfelle, er det bedre å avbryte og starte prosedyren, og pass på atalle ingrediensene er i blandingen, og / eller kontroll av kvaliteten av vektor-DNA og DNA emballasje. Figur 1c viser det samme fatet som A, etter inkubasjon over natten. Bunnfallet er (og bør) synlig i mellom cellene. Vi la merke til at cellene ikke formere mye i løpet av 24 timer etter transfeksjon.
Figur 2 viser hvordan HBE cellene ser før og 3 dager etter transduksjon. Figur 2a viser ca 80% sammenflytende primære HBE celler før trypsinering og transduksjon. En 10 cm tallerken på 80% samløpet gir ca 4 x 10 6 celler. Figur 2b viser nesten 100% transduksjon av udifferensierte P1 HBE celler ved hjelp av en MOI av 4 på gjennomtrengelig støtte innsatsen. Når HBe-celler blir sådd ut på følgende permeable støtteinnsatser, cellene er forholdsvis flat. På dette bilde, høyden av cellene er bare noen få mikrometer noe som forklarer hvorfor0,4 um porer er synlige selv om cellene.
Figur 3 viser optimaliseringseksperimenter som fører til den presenterte protokollen. Alle eksperimenter er blitt utført i tre paralleller på kollagen-belagte brønner (24-brønners plate), med 2 x 10 5 primære HBe-celler per brønn. De fleste eksperimentene brukte en MOI på 0,4 med en 2 pg / ml sluttkonsentrasjon på hexadimethrine bromidein BEGM media. Fluorescerende celler ble talt 3 dager etter transduksjon. Selv om den første optimalisering av protokollen har blitt utført på plast, har resultatene blitt bekreftet på permeable støtteinnsatser. I tillegg har forsøk på å transdusere fullt differensierte P1 HBe-celler har ikke lykkes (data ikke vist), noe som bekrefter tidligere rapporter. Som vist i figur 3a, er en høyere prosentandel av HBE celler transduced i BEGM media i forhold til ALI. Dersom cellene blir sådd dagen før transduksjon i BEGM medier, er effektivitetener betydelig redusert sammenlignet med transducing mens celler fester (figur 3b). Når P1 HBe-celler blir sådd dagen før transduksjon i ALI media (i stedet for BEGM), avtar transduksjon effektiviteten ytterligere (data ikke vist). Forskjellen mellom disse 2 media er konsentrasjonen av kalsium. BEGM media inneholder en lav konsentrasjon av kalsium (0,1 mM) i forhold til ALI media (1 mM). Kalsium former og opprettholder tett veikryss og derfor kan gjøre det vanskelig for viruspartiklene for å krysse 9 og få tilgang til sine reseptorer ved basolateral membranen. Faktisk noen infeksjoner var vellykket ved lave nivåer ved å forstyrre tett veikryss ved hjelp av etylenglykol-tetraeddiksyre (EGTA) for eksempel 10. Som nevnt tidligere, fullt differensierte P1 HBE celler er ildfast og kan bare omformes med lav effektivitet 5-7, som kan være på grunn av tett veikryss i høyt kalsiumholdig media. En annen forklaring pålav transduksjon effektivitet i fullt differensierte celler er en aktiv mucociliary transportmekanisme hvor slim kunne fungere som en barriere. Eller, som rapportert av Bals et al., Er scenen for differensiering der HBE celler er en avgjørende faktor for transduksjon effektivitet 10. Det faktum at flere celler blir omformet i BEGM enn i ALI media støtter denne uttalelsen (figur 3a).
Som vist i figur 3b, ble det observert en økning på nesten 50% transduksjon effektivitet når cellene ble transdusert mens festing sammenlignet med celler sådd dagen før. I sin studie, Ricks et al. Viste en økning på 20% når transduksjon ble utført etter trypsinering 11. Sammen disse resultatene tyder på at media og staten av modenhet av celler er nøkkelen til transduksjon suksess.
Panelet i figur3c, demonstrerer hexadimethrine bromideplaying atrivial rolle i transduksjon effektivitet. Ikke desto mindre er bruken foreslått i denne protokollen, siden det ikke har noen negativ innvirkning, men kan muligens være fordelaktig. Hexadimethrine bromid er en kationisk polymer som brukes i virologi for å øke overføringseffektiviteten 12. Andre har publisert bruken av protamin, en annen kationisk polymer, men ingen signifikant forskjell ble funnet med hensyn transduksjon effektivitet sammenlignet med hexadimethrine bromid 13. Hexadimethrine bromide ikke påvirke veksten eller differensiering 14-16.
Til slutt ble forskjellige MOIS undersøkt i figur 3d: den høyeste transduksjon effektivitet oppsto sammen med en MOI på 4. Det var ingen signifikant forskjell mellom MOI 0,4 og 4, men MOI 4 transdusert 100% av HBE-celler, mens MOI 0,4 bare transdusert 75%. MOI definerer hvor mange viruspartikler will har potensial til å infisere en celle. Det finnes ulike metoder for å bestemme MOI. En av dem er å definere antallet overføringsenheter (TU). Ved hjelp av en ELISA, kan mengden av p24 antigen som skal bestemmes i pg / ml. Viral p24 i pikogram kan omdannes i TU, som er nødvendige for å beregne MOI. MOI beregnes ved å dele antall TU med antall celler. Det er 10-100 transduksjon enheter (TU) per pikogram p24. Alle referanser i teksten om MOI er basert på beregninger med 100 TU per pikogram p24. (Http://tronolab.epfl.ch/webdav/site/tronolab/shared/protocols/TUvsp24.html).
Fig. 1: Transfeksjon av HEK-293T-celler (a) HEK 293T-celler dyrket til 50-60% konfluens som sees under et 10X objektiv. (B) Presipitat synlig i en 5 ul dråpe 5 minutter etter blanding av alle reagents under mikroskop (10X objektiv). (C) Bunnfall i fatet ved siden av cellene, etter transfeksjon over natten (10X objektiv). (D) Forstørrelse av sentrum av (c). Hvit pil som peker til utfelles. Scale bar = 100 mikrometer; er den samme for a, b, og c. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Transduksjon av NHBE-celler (a) HBE-celler dyrket i en kollagen-belagt tallerken til 80-90% konfluens (ca. 4 x 10 6 celler) i BEGM media i 5 dager (10X objektiv).. Scale bar = 100 mikrometer. (B) EGFP transduced HBe celler på permeable støtteinnsatser (12 mm), 3 dager etter transduksjon (konfokal, 20X). Ved denne tilstanden, HBE cel ls er flat og membran porene er synlige. Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Optimalisering av transduksjon protokollen (a) Effekt av media på transduksjon effektivitet.. (B) Sammenligning av transduksjon i HBe-celler sådd ut på dagen før og transduksjon av celler under feste. (C) Påvirkning av hexadimethrine bromid på transduksjon effektivitet. (D) Evaluering av forbedrede transduksjon effektivitet ved hjelp av ulike Mois. Analysene ble utført ved hjelp av t-test eller Kruskal-Wallis og Dunn multippel sammenligningstest. Feilfelt representerer SE og alle * representerer p <0,05.ww.jove.com/files/ftp_upload/54176/54176fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen skissert her sikrer nær 100% overføringseffektivitet. Men det er skritt i prosessen som er viktig for å oppnå dette målet. For eksempel, under transfeksjon prosessen, tilstedeværelse av bunnfall i den transduksjon mix (drop) eller i fatet dagen etter transduksjon (fig 1 b og d) er begge relevante for en god transfeksjon. Fraværet av et bunnfall eller tilstedeværelsen av agglomerater kan være på grunn av en utelatelse av en av de transfeksjon reagensene, en pH problemet, eller en dårlig plasmid preparat. Dersom det mangler bunnfallet, er det en høy sannsynlighet for at ingen vil være synlig den neste dag. Videre legger transfeksjon mix eller HEK media for fort kan føre til at HEK celler til å løsne, hindrer transfeksjon og yield. En annen indikasjon på et godt utbytte er på dag 6 før sentrifugeringstrinnet: et hvitt bunnfall skal være synlig i bunnen av røret. En dårlig transfeksjon med nesteningen virus vil ikke lage dette hvitt bunnfall. Under transduksjon prosessen, er det viktig å bruke primære HBe-celler som har blitt de-differensiert og som er i en stamcellelignende tilstand for å oppnå høy effektivitet transduksjon. Anvendelsen av en vektor inneholdende et fluoriserende protein som EGFP eller mCherry som er lett visualisert kan være et godt verktøy.
Modifikasjoner kan gjøres for å tilpasse denne protokollen til forskjellige primære celler. En tilnærming ville være å redusere kalsiumkonsentrasjonen i mediet. Som vist i figur 3a, ved hjelp av BEGM media som inneholder en lavere konsentrasjon av kalsium resulterte i signifikant høyere transduksjon effektivitet i primær HBE-celler. En annen tilnærming kan være å øke MOI. Som vist i figur 3d, jo høyere MOI, jo bedre transduksjon effektivitet. Men ved hjelp av en høyere MOI kan bli giftig for noen celler.
Likevel er det noen limita sjoner til denne protokollen. Denne teknikken har blitt utviklet ved hjelp av passasjen 1 HBE celler. Lunger avvist for transplantasjon ble oppnådd med passende samtykke til forskning i samsvar med standarder fastsatt av Helsinkideklarasjonen. Innhenting av primær HBE celler fra kommersielle kilder kan være dyrt. Disse cellene er som regel også bare tilgjengelig ved et høyere passasje. Denne protokollen har ikke blitt testet på passasjer høyere enn 2. En annen begrensende faktor er p24 ELISA antigen-analysen. Flere selskaper tilbyr settet, men til høy pris. I tillegg er den virale konsentrasjonen gitt ved analysen, er bare en omtrentlig verdi siden testen påviser lentivirus p24 og p24 fri frigjøres under transient transfeksjon 17. Derfor er denne evalueringen av MOI bare et estimat. Til slutt, ved hjelp av ulike uttrykk konstruerer (større eller mindre i størrelse) kan ikke gi de samme resultatene. For eksempel ble forskjellige effektivitet registrert bruker mCherry og EGFP (data ikke vist).
ent "> Det er fordeler med denne protokollen over andre metoder. En av dem er transfeksjon prosessen. Faktisk kan den foreslåtte protokollen gi slike høy Virustitere at de innsamlede medier som inneholder virus vil ikke lenger trenger å være konsentrert og kan brukes direkte til transduce celler. Polyetylenglykol (PEG), anvendt i denne protokollen for å konsentrere viruset, har vært kjent for å være giftig for pattedyrceller 18. i tillegg, hvis høyere MOI ble brukt, ville dette øke toksisiteten risikoen enda mer. imidlertid hvis PEG konsentrasjonstrinnet blir foreldet, til forskere som har vært mislykket transduce grunn av giftvirkninger kanskje revurdere bruken av lentiviruses. en annen fordel med denne protokollen er mangelen på forskjeller i overføringseffektivitet på plast eller permeable støtteinnsatser. fordelen av å være i stand til å transdusere på plast er at færre celler og viruspartikler er nødvendig. som et resultat av at cellene kan ekspanderes stolpe transduksjon og overførtpå permeable støttedokumentasjon når sammenflytende (data ikke vist).Valget av vektorene er avhengig av flere forhold, slik som valg av transduserte celler med puromycin eller ekspresjon av markørproteiner så som grønt fluorescerende protein (GFP). Det finnes flere kommersielle vektorer tilgjengelig som er egnet (pRRLsinPPT.CMV.MCS.Wpre, pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro, pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro, pGEM-T Easy) 15,19-21. Valg av arrangører skaper utfordringer, siden brukte CMV promoter er forstummet i differensiert luftveis epitelceller 15. For ciliated celle-spesifikke uttrykk, anbefales bruk av reven-j1 promoter. Alternativt kan den EF-1-promoteren kan benyttes for ekspresjon i alle luftveisceller 20,21. Hvis protein overekspresjon er søkt, vil størrelsen av innsatsen bestemme, i en del, transduksjon effektivitet. Imidlertid kan store størrelser innpasses sett fra vellykket transduksjon av full-lengde løselig adenylylcyklase 22 sikret lab har publisert flere vellykkede overekspresjon konstruerer 15,16,20-22. For shRNA uttrykk (vanligvis under U6 eller H1 promoter), vil flere konstruksjoner må bli utforsket. Dette kan være kjedelig med tester foretatt ved slutten av differensiering (PCR og vestlig blotting), men fremgangsmåten kan ikke bli forkortet fordi ikke-differensierte celler ikke være en god representasjon av suksess for celler som gjennomgår differensiering. Igjen, har laboratoriet publisert flere vellykkede shRNA konstruerer 14,20,21,23.
Ved hjelp av denne protokollen, kan flere forskere være aktivert for å forbedre tidligere dårlige transductions. Noen vil kanskje synes det er nyttig å øke effektiviteten ved å gjøre noen justeringer. Noen vil kanskje bruke dette verktøyet til å oppdage nye biologiske prosesser eller for å være i stand til å bevise konsepter, både ved hjelp av knockdown eller overekspresjon strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker Liv Alliance Organ Recovery Agency ved Universitetet i Miami for å gi lungene. Vi takker også Dr. Lisa Künzi for DNA preparat som brukes for eksperimentene er vist i figur 2B og 3-D, Dr. Ben Gerovac og Lisa Novak for mCherry virus anvendt for eksperimentene i figur 3A til C. Vi takker også Gabriel Gaidosh fra fotostudio, Department of Ophthalmology ved Universitetet i Miami.
Denne studien har blitt sponset med tilskudd fra NIH, CF Foundation og Flight Attendant Medical Research Institute Dr. Matthias Salathe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | 12306C | use at 10% |
| DMEM | Thermo Scientific | 11995-040 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Thermo Scientific | 15140-122 | use at 1x |
| Collagen I | BD Biosciences | 354231 | dilute 1:75 in distilled water |
| Calphos | Clontech | 631312 | Transfection kit containing 2 M Calcium solution, 2x HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O |
| Polythylene glycol 8000 | VWR scientific | 101108-210 | stock of 40% |
| Amphotericin B | Sigma | A9528 | use at 1x |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Transwell 12 mm | Corning | 3460 | |
| Collagen IV | Sigma | C7521 | dilute 1:10 in distilled water |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | stock of 2 mg/ml |
| Puromycin (10.000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | use at 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 | lentiviral expression vector |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | packaging DNA |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | packaging DNA |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | packaging DNA |
References
- Ding, B., Kilpatrick, D. L. Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons. Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).
- Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Jr Gene therapy progress and prospects: development of improved lentiviral and retroviral vectors--design, biosafety, and production. Gene Ther. 12, 1089-1098 (2005).
- Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnol. 13, (2013).
- Delenda, C. Lentiviral vectors: optimization of packaging, transduction and gene expression. J Gene Med. 6 Suppl 1, S125-S138 (2004).
- Gresch, O., Altrogge, L. Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells. Methods Mol Biol. 801, 65-74 (2012).
- Jordan, E. T., Collins, M., Terefe, J., Ugozzoli, L., Rubio, T. Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells. J Biomol Tech. 19, 328-334 (2008).
- Castillon, N., et al. Regeneration of a well-differentiated human airway surface epithelium by spheroid and lentivirus vector-transduced airway cells. J Gene Med. 6, 846-856 (2004).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. 107, 183-206 (2005).
- Gonzalez-Mariscal, L., et al. Role of calcium in tight junction formation between epithelial cells. Am J Physiol. 259, C978-C986 (1990).
- Bals, R., et al. Transduction of well-differentiated airway epithelium by recombinant adeno-associated virus is limited by vector entry. J Virol. 73, 6085-6088 (1999).
- Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 17, 441-450 (2008).
- Davis, H. E., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 97, 159-172 (2002).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, 341-347 (2013).
- Manzanares, D., et al. Functional apical large conductance, Ca2+-activated, and voltage-dependent K+ channels are required for maintenance of airway surface liquid volume. J Biol Chem. 286, 19830-19839 (2011).
- Schmid, A., et al. Real-time analysis of cAMP-mediated regulation of ciliary motility in single primary human airway epithelial cells. J Cell Sci. 119, 4176-4186 (2006).
- Unwalla, H. J., Ivonnet, P., Dennis, J. S., Conner, G. E., Salathe, M. Transforming growth factor-beta1 and cigarette smoke inhibit the ability of beta2-agonists to enhance epithelial permeability. Am J Respir Cell Mol Biol. 52, 65-74 (2015).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6, (2006).
- Schneiderman, S., Farber, J. L., Baserga, R. A simple method for decreasing the toxicity of polyethylene glycol in mammalian cell hybridization. Somatic Cell Genet. 5, 263-269 (1979).
- Schmid, A., et al. Soluble adenylyl cyclase is localized to cilia and contributes to ciliary beat frequency regulation via production of cAMP. J Gen Physiol. 130, 99-109 (2007).
- Manzanares, D., et al. Airway Surface Dehydration by Transforming Growth Factor beta (TGF-beta) in Cystic Fibrosis Is Due to Decreased Function of a Voltage-dependent Potassium Channel and Can Be Rescued by the Drug Pirfenidone. J Biol Chem. 290, 25710-25716 (2015).
- Manzanares, D., et al. IFN-gamma-mediated reduction of large-conductance, Ca2+-activated, voltage-dependent K+ (BK) channel activity in airway epithelial cells leads to mucociliary dysfunction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L453-L462 (2014).
- Chen, X., et al. A soluble adenylyl cyclase form targets to axonemes and rescues beat regulation in soluble adenylyl cyclase knockout mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 51, 750-760 (2014).
- Ransford, G. A., et al. Pannexin 1 contributes to ATP release in airway epithelia. Am J Respir Cell Mol Biol. 41, 525-534 (2009).
