Abstract
In vitro-odling av primära humana bronkial epitel (HBE) celler med användning förhållanden luft-vätske-gränssnittet ger en användbar modell för att studera de processer av luftvägscelldifferentiering och funktion. Under de senaste åren har användningen av lentivirala vektorer för transgen leverans blev vanligt förekommande. Även om det finns rapporter om transduktion av fullt differentierade epitelceller i luftvägarna med vissa icke-HIV pseudo skrivit lentivirus, är den totala effektiviteten transduktion vanligtvis mindre än 15%. Protokollet som presenteras här ger en tillförlitlig och effektiv metod för att producera lentivirus och att transducera primära humana bronkiala epitelceller. Genom att använda odifferentierade bronkiala epitelceller, transduktion i bronkial epitel tillväxtmedier, medan cellerna fäster, med en infektionsfaktor på 4 tillhandahåller verkningsgrader som ligger nära 100%. Detta protokoll beskriver, steg-för-steg, beredning och koncentration av hög-titer lentivirala vektorer och the transduktion processen. Det diskuterar de experiment som bestäms de optimala odlingsbetingelser för att uppnå högeffektiva transduktioner av primära humana bronkiala epitelceller.
Introduction
Utvecklingen av replikationsdefekta, pseudotypade lentivirus (LV) har gett forskarna med en säker och effektiv metod för att leverera transgener in vitro en. På grund av deras långsiktiga uttryck, kan dessa LV även användas för leverans av terapeutiska medel in vivo 2,3. Produktionen av LV kräver samtransfektion av humana embryonala njur (HEK) -celler med flera plasmider: överföringsvektor, förpackning gag / pol, förpackning rev, och kuvert vesikulärt stomatitvirus glykoprotein (VSV-G) plasmider. Tredje generationens förpackningssystem anses säkrare än andra generationens system eftersom rev-genen är kodad på en separat packande plasmid, vilket minskar risken för rekombination för att producera en replikationskompetent lentivirus. Även andra generationens förpackningssystem ger fem gånger högre totala överföringsenheter, att uppdelningen av den ursprungliga virala genomet skapaden tredje generationens system har minskat graden av transduktion bara minimalt 3,4.
Medan cellinjer kan omvandlas enklare och effektivare, har forskare skiftat fokus till galvaniska element, eftersom dessa är mer representativa för in vivo vävnader 5,6. Emellertid primärceller är okänsliga för transduktion. Medan transduktion av fullt differentierade epitelceller i luftvägarna har rapporterats, har den totala effektiviteten inte överstiger 15% 7.
Beskrivs här är ett protokoll som möjliggör produktion av hög titer LVs. Ett steg-för-steg-metod beskrivs för att uppnå nästan 100% transduktionseffektiviteten i primära HBE celler. Närmare bestämt beskriver protokollet optimala odlingsbetingelser instrumentala att lyckas 3. I korthet HEK 293T-celler transfekterade med den lentivirala expressionsvektor pCDH med EF-1 promotor som driver uttryck av förbättrad grönt fluorescerandeprotein (EGFP) eller mCherry, en röd fluorescerande protein, och en tredje generationens förpackningssystem. LVs frigörs in i mediet uppsamlas 24-72 h senare. Viruspartiklarna är koncentrerade med polyetylenglykol (PEG), en bekväm och enkel metod för viral koncentration, innan titer uppskattning med användning av en p24-antigenenzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA) -kit. Därefter odifferentierade primära HBE-celler transduceras i proliferationsmedium (bronkial epitelial tillväxtmedium eller BEGM) 8, medan att fästa (efter att ha trypsineras), vid en multiplicitet av infektion (MOI) faktor av 4, lägga hexadimetrinbromid och inkubering under 16 timmar ( över natten). Cellerna tilläts sedan att differentiera. Eftersom den virala transgenen är uttryckt långsiktig (med hjälp av lämplig promotor, se diskussion), kommer uttrycket att bibehållas under hela differentiering till en pseudostratified luftvägsepitel eller kan induceras (med användning av en inducerbar promotor) efter differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Steg 1: Odling av HEK 293T
- Förbereda HEK-celler material (som kallas som HEK media) genom att tillsätta 10% (volym / volym) fetalt bovint serum (FBS) och 1% (volym / volym) penicillin / streptomycin till högt glukos Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM).
- Coat en 10 cm vävnadsodlingsskål med kollagen I. Blanda 30 pl kollagen I i 2 ml destillerat vatten. Sprida blandningen på skålen och inkubera i 2 h vid 37 ° C och 5% CO2.
- Avlägsna blandningen och låt skålen torka i en skåp med laminärt flöde under 15 min.
- Plattan HEK-celler på det belagda skålen vid en densitet av 1 x 10 6 celler i 10 ml HEK media och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2.
- När HEK celler är 50-60% sammanflytande (Figur 1a, 2-3 dagar efter plätering), gå vidare till steg 2. Visuell bedömning av sammanväxning är tillräcklig. Det behövs ingen kvantifiering.
Notera: HEK-celler odlas i HEK-media (se ovan). När de når sammanflytning, thej kan delas (t.ex. 1/5) eller fryses ned för senare användning.
2. Steg 2: Produktion och Koncentration av Lentiviruses (LVs) i HEK celler
Obs: Protokollen bör utföras i linje med institutionella och statliga föreskrifter enligt BSL-2 + (förbättrade BSL-2) förhållanden i USA.
- Transfektera med användning av en kalciumfällningsförfarandet (lipofektamin och andra transfektionsmedel var inte lika effektiv som kalciumfällningsförfarandet). Användning av ett kommersiellt transfektion kit rekommenderas för att säkerställa reproducerbarhet, om förfarandet ändras på följande sätt. Ta alla reagenser till rumstemperatur. Detta är dag 0.
- För varje 10 cm skål av HEK293-celler, blanda 4,5 | j, g av kuvertet DNA pMD2-VSVG, 7,5 | ig förpackning DNA pMDLg / pRRE, 3,75 pg DNA pRSV-rev, 10 ^ g DNA från Lentiviral expressionsvektor, 86 pl av en 2 M kalciumlösning och sterilt vatten i en 15 ml centrifugrör till en slutlig volym av 700 | j, l(De två senare lösningarna är anordnade i den kommersiella transfektion kit).
- Droppvis, tillsätt 700 | il av 2x HEPES-buffrad saltlösning (HBS, som finns i transfektion kit) under virvling (i skåp med laminärt flöde) och inkubera vid rumstemperatur i 30 min (utför steg 4 i väntan).
- Under det tidiga inkubationstid, insättning 5 pl av blandningen på en bild. Kontrollera droppen under ett mikroskop med en 10X objektiv fokuserar långsamt upp och ner. En fin fällning bör vara synlig, vilket bekräftar den kalciumfosfatfällningsprocessen (figur 1b).
- Stoppa utfällningen efter 30 min genom tillsats av 10 ml av HEK-celler media och pipettera upp och ner för att blanda.
- Ta skålen för HEK celler från steg 2,1 till 2,5, och avlägsna mediet (dag 0). Lägg fällningen lösning från steg 2,5 försiktigt och långsamt längs kanten av skålen.
- Nästa dag (dag 1), avlägsna och kassera mediet innehållande fällningen och ersätta det wed 10 ml HEK medium. Kontrollera om den fina fällningen under mikroskop: det ska vara synlig i skålen i tomrummen mellan cellerna (figurerna 1c och d).
- På dag 2, samla media med en spruta, filtrera genom en 0,45 fim sprutfilter in i ett 15 ml centrifugrör innehållande 3,8 ml av en polyetylenglykol 40% (PEG) -lösning. Invertera 5x att blanda och förvara vid 4 ° C under åtminstone 24 h (för PEG utfällning att bilda, men inte längre än 5 dagar) tills alla virus samlingar är fullständiga.
- Upprepa steg 2,8 på dagarna 3 och 4. På dag 4 inte ersätta med HEK medium men sanera med 10% blekmedel och kasta skålen.
- Centrifugera alla uppsamlingsrören (normalt alla samlingar tillsammans på dag 5) vid 1650 xg under 20 min vid 4 ° C för att pelletera viruset. Avlägsna och kassera supernatanten, och snurra igen vid 1650 xg under 5 minuter vid 4 ° C för att samla in och ta bort eventuella kvarvarande av PEG supernatant.
- Resuspend pelleten av varje rör i 200 ^ bronkial epitelial tillväxtmedium (BEGM) utan amfotericin B 8. Pool ihop dem och delprov på 200 pl. Store virus vid -80 ° C. Alikvot ytterligare 10 | j, l för att utföra den HIV-1 Gag (p24) -antigen ELISA-analys.
- Användning av ett kommersiellt ELISA-kit, utför en p24-antigenanalys enligt tillverkarens protokoll. Analysen ger en uppskattning av viralt p24 i pg / ml.
3. Steg 3: Kultur Primär HBE Cells
- Plattan HBE-celler i 10 ml BEGM medium (med 100 | j, l amfotericin B om passagen 0-celler används för att eliminera möjliga svampkontaminering) vid en densitet av 1 x 10 6 celler i en kollagen I belagda 10 cm vävnadsodlingsskål. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO2.
- Nästa dag, ta bort mediet och ersätt med 10 ml BEGM (med 100 ul amfotericin B för passage 0-celler) för totalt 4 dagar. Återgå till inkubatorn.
- Efter 4 days, använd endast BEGM utan amfotericin B. Ändra media varannan dag.
- När cellerna är 80-90% konfluenta (Figur 2a; ~ 7 dagar efter plätering), fortsätt med överföring (uppmärksamma 3,5 för förberedelser innan överföring). Återigen, är tillräcklig visuell bedömning av sammanväxning. Det behövs ingen kvantifiering.
- Före transduktion, belägga släppliga stödinsatser med en kollagen IV lösning utspädd 1/10 med sterilt destillerat vatten. Tillsätt 200 pl till varje insats och låt torka över natten i skåp med laminärt flöde.
4. Steg 4: Transduktion av HBE celler
- Ta ut materialet, tillsätt 3 ml 0,1% trypsin i 1 mM etylendiamintetraättiksyra i fosfatbuffrad saltlösning (EDTA / PBS) och inkubera 5 min vid 37 ° C och 5% CO2. Kontrollera under mikroskop (10X objektiv) för att se om alla cellerna lossnat. Om inte, gå tillbaka till inkubatorn för ytterligare 5 minuter.
- När alla celler är fristående, tillsätt 3ml sojaböntrypsininhibitor (SBTI 1 mg / ml), blanda och överför till en 15 ml centrifugrör. Pellets cellerna genom centrifugering vid 460 xg under 5 min vid rumstemperatur.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 3 ml BEGM och fortsätt med att räkna.
- Resuspendera HBE-celler (nu passage en eller P1) vid ett förhållande av 2 x 10 5 celler per en 12 mm genomsläppligt stödinlägget i 400 | il BEGM (se tabell 2). Extrapolera dessa siffror baserade på mängden av genomträngliga stödinsatser som ska omvandlade.
| Yta | Ytarea | cell~~POS=TRUNC räkning~~POS=HEADCOMP | Media | Volym (media) |
| 10 cm skål | 52,7 cm 2 | 1 x 10 6 | BEGM | 10 ml | </ Tr>
| 12 mm filter | 1,13 cm 2 | 2 x 10 5 | BEGM | 400 ^ |
| 24 mm filter | 4,52 cm 2 | 8 x 10 5 | BEGM | 800 ^ |
Tabell 2: Media extrapolering per celltal.
- Med hjälp av en mångfald av infektion (MOI) faktor 4, tillsätt lämplig mängd virus till cellsuspensionen.
- Lägg hexadimetrinbromid till ett 2 | j, g / ml slutkoncentration.
- Fördela 400 ul av blandningen (BEGM, HBE celler, virus och hexadimetrinbromid) per genomträngligt stöd insatsen i apikala facket, och tillsätt 1 ml BEGM ensam till basolaterala facket. Inkubera över natten vid 37 ° C och 5% CO 2. Alltid platta HBE celler utan virus som kontroll och prov puromycinselektion om tillämpligt.
- På nästa dag, remove apikala och basolaterala media, tvätta med PBS, och ersätta båda facken med luft-vätska gränssnitt (ALI) media 8.
- När cellerna sammanflytande, avlägsna apikala vätska (känd som upprättandet av en luft-vätske-gränssnitt). Fortsätt att ändra medium (ALI) i bottenutrymmet varannan dag tills de når full mognad; vanligen 3 till 4 veckor senare.
Obs: Om lentivirusvektorn innehåller en selektionsgen såsom puromycin, kan celler väljas genom att tillsätta puromycin enligt en kurva koncentration. För HBE celler, har en koncentration av 1 pg / ml bestämts att vara idealisk för konsekvent urval av omvandlade celler. Dock kan denna koncentration skiljer sig för andra celler eller tillstånd och bör bestämmas genom att döda kurvor. Tillsats av puromycin kan börja så tidigt som en dag efter det att media har ersatts av ALI media eller senare (2-3 dagar) för att tillåta fullt uttryck av selektionsgenen. Var noga med att lägga puromycin till en insats som hsom inte transducerats. Puromycin kan tillsättas tills cellerna är helt differentierade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar olika viktiga steg för att bedöma celler och lösningar under transfektionsbehandlingen. Figur 1a visar den optimala confluency av HEK293T celler före transfektion för virusproduktion. Det är viktigt att cellerna fördelas jämnt över hela skålen. Figur 1b visar fällningen i en droppe av transfektion blandningen med hjälp av ljusa fält optik och en 10X mål. Ju mer fällningarna ser ut som sandkorn i stället för agglomerat, kommer desto effektivare är transfektion vara. På den här bilden är fällningen lite grov. Fällningen är en pålitlig indikator om transfektionen kommer att producera en hög titer av viruset. Om någon av ingredienserna är antingen saknas eller av dålig kvalitet (vektor-DNA till exempel), kommer agglomerat bildas, vilket är ett illavarslande tecken. Om så är fallet, är det klokare att avbryta och starta proceduren, se till attalla ingredienser är i mixen, och / eller kontroll av kvaliteten på vektor-DNA och förpackning DNA. Figur 1c visar samma skålen som A, efter inkubation över natten. Fällningen är (och bör vara) synliga i mellan celler. Vi märkte att cellerna förökar sig inte mycket under 24 timmar efter transfektion.
Figur 2 visar hur HBE cellerna ser före och 3 dagar efter transduktion. Figur 2a visar ungefär 80% konfluenta primära HBE celler före trypsinering och transduktion. En 10 cm skål vid 80% sammanflödet ger ungefär 4 x 10 6 celler. Figur 2b visar nästan 100% transduktion av odifferentierade P1 HBE celler med användning av en MOI av fyra på genomträngligt stödinlägget. När HBE-celler stryks ut på dessa permeabla stödinlägg, cellerna är relativt platt. På denna bild, är höjden av cellerna endast ett fåtal mikron, vilket förklarar varför0,4 um porer syns även cellerna.
Figur 3 visar optimering experiment som ledde till den presenterade protokollet. Alla experiment har utförts i triplikat på kollagen I belagda brunnar (24-brunnar), med 2 x 10 5 primära HBE celler per brunn. De flesta experiment användes en MOI av 0,4 med en 2 | ig / ml slutlig koncentration av hexadimethrine bromidein BEGM medier. Fluorescerande celler räknades 3 dagar efter transduktion. Även om den initiala optimering av protokollet har utförts på plast, har resultaten bekräftats på permeabla stödinsatser. Dessutom försök att omvandla fullt differentierade P1 HBE celler lyckades inte (data visas ej), vilket bekräftar tidigare rapporter. Som framgår av figur 3a, är en större andel av HBE celler omvandlas i BEGM media jämfört med ALI. Om cellerna pläteras dagen före transduktion i BEGM media, effektivitetensignifikant minskat jämfört med transduktion medan celler fästa (figur 3b). När P1 HBE celler stryks dagen före transduktion i ALI media (i stället för BEGM), minskar transduktionseffektiviteten ännu längre (data ej visade). Skillnaden mellan dessa 2 medier är koncentrationen av kalcium. BEGM medier innehåller en låg koncentration av kalcium (0,1 mM) jämfört med ALI-media (1 mM). Kalcium formulär och underhåller tight junctions och därför kan göra det svårt för viruspartiklar att passera 9 och komma åt sina receptorer på basolaterala membranet. I själva verket vissa infektioner var framgångsrika vid låga nivåer genom att störa tight junctions som använder etylenglykol tetraättiksyra (EGTA) till exempel 10. Som tidigare nämnts, helt differentierade P1 HBE celler är eldfasta och kan bara omvandlas med låg effektivitet 5-7, vilket kan bero på tight junctions i hög kalciuminnehållande media. En annan förklaring tilllåg transduktion effektivitet i helt differentierade celler är en aktiv mukociliär transportmekanism där slem skulle kunna fungera som en barriär. Eller, som rapporterats av Bals et al., Är det skede av differentiering där HBE celler är en avgörande faktor för transduktionseffektiviteten 10. Det faktum att fler celler får omvandlas i BEGM än i ALI media stöder detta uttalande (figur 3a).
Som framgår av figur 3b, var en ökning med nästan 50% transduktionseffektiviteten observerades när cellerna transducerades medan fastsättning jämfört med celler pläterade dagen före. I deras studie Ricks et al. Visade en ökning med 20% när transduktion utfördes efter trypsinisering 11. Tillsammans utgör dessa resultat tyder på att media och staten mognad av celler är nyckeln till överföring framgång.
Panelen i figur3c visar hexadimethrine bromideplaying atrivial roll i transduktion effektivitet. Ändå är dess användning föreslås i detta protokoll eftersom det inte har någon negativ inverkan, men skulle kunna vara till nytta. Hexadimetrinbromid är en katjonisk polymer som används i virologi för att förbättra omvandlingsverkningsgrader 12. Andra har publicerat användningen av protamin, en annan katjonisk polymer, men ingen signifikant skillnad hittades beträffande transduktion verkningsgrad jämfört med hexadimetrinbromid 13. Hexadimetrinbromid inte påverka tillväxten eller differentiering 14-16.
Slutligen har olika MOIs undersöktes i figur 3d: den högsta transduktionseffektiviteten inträffade med en MOI av 4. Det var ingen signifikant skillnad mellan MOI 0,4 och 4, dock MOI 4 transducerade 100% av HBE-celler medan MOI 0,4 bara transducerade 75%. MOI definierar hur många viruspartiklar will har potential att infektera en cell. Det finns olika metoder för att bestämma MOI. En av dem är att definiera antalet överföringsenheter (TU). Användning av en ELISA kan mängden av p24-antigen bestämmas i pg / ml. Viral p24 i pikogram kan omvandlas i TU, som är nödvändiga för att beräkna MOI. MOI beräknas genom att dividera antalet TU med antalet celler. Det finns 10-100 överföringsenheter (TU) per pikogram p24. Alla referenser i texten om MOI bygger på beräkningar med 100 TU per pikogram p24. (Http://tronolab.epfl.ch/webdav/site/tronolab/shared/protocols/TUvsp24.html).
Figur 1:. Transfektion av HEK 293T-celler (a) HEK 293T-celler odlas till 50-60% konfluens sett under ett 10X objektiv. (B) Fäll synlig i en 5 l droppe 5 minuter efter blandning av alla ReageNTS under mikroskop (10X objektiv). (C) fällning i skålen intill cellerna, efter över natten transfektion (10X objektiv). (D) Förstoring av centrum av (c). Vit pil som pekar för att fälla. Skalstreck = 100 | im; är densamma för a, b och c. klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Transduktion av NHBE celler (a) HBE celler odlas i en kollagen I belagda skålen till 80-90% konfluens (ca 4 x 10 6 celler) i BEGM media för 5 dagar (10X objektiv).. Skalstreck = 100 | j, m. (B) EGFP transducerade HBE celler på permeabla stödinsatser (12 mm), 3 dagar efter transduktion (konfokal, 20X). Vid detta tillstånd, HBE cel ls är platt och membranets porer är synliga. Skalstreck = 100 nm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Optimering av transduktion protokoll (a) Effekterna av media på transduktionseffektiviteten.. (B) Jämförelse av transduktion i HBE celler pläterade dagen innan och transduktion av celler medan fästa. (C) Inverkan av hexadimetrinbromid på transduktionseffektiviteten. (D) Utvärdering av förbättrade omvandlingseffektivitet med hjälp av olika molekyler av intresse. Analys utfördes med användning av Students t-test eller Kruskal-Wallis och Dunns multipla jämförelsetest. Felstaplar representerar SE och alla * representerar p <0,05.ww.jove.com/files/ftp_upload/54176/54176fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det protokoll som beskrivs här försäkrar nära 100% omvandlingseffektivitet. Men det finns åtgärder under processen som är viktiga för att uppnå detta mål. Till exempel, under transfektion processen, förekomsten av fällningar i transduktion mix (droppe) eller i skålen dagen efter transduktion (Figurerna 1b och d) är både relevant för en bra transfektion. Frånvaro av en fällning eller närvaron av agglomerat kan bero på ett utelämnande av en av de transfektionsreagens, ett pH-fråga, eller en dålig plasmidberedning. Om utfällningen saknas, det finns en hög sannolikhet för att ingen kommer att vara synlig nästa dag. Dessutom tillsätta transfektion mix eller HEK media för snabbt kan orsaka HEK celler att lösgöra, hindrar transfektion och avkastning. En annan indikation på en god avkastning är vid dag 6 före centrifugeringssteget: en vit fällning ska vara synlig i botten av röret. En dålig transfektion med nästaninget virus kommer inte att skapa denna vit fällning. Under omvandlingsprocessen, är det viktigt att använda primära HBE celler som har de-differentierade och som är i en stamcellsliknande tillstånd för att uppnå höga överföringseffektivitet. Användningen av en vektor innehållande ett fluorescerande protein, såsom EGFP eller mCherry som lätt visualiseras kan vara ett bra verktyg.
Modifieringar kan göras för att anpassa detta protokoll för olika primära celler. Ett tillvägagångssätt skulle vara att minska kalciumkoncentrationen i media. Såsom framgår av figur 3a, med hjälp av BEGM media som innehåller en lägre koncentration av kalcium resulterade i signifikant högre transduktionseffektiviteten i primära HBE-celler. En annan metod kan vara att öka MOI. Såsom visas i figur 3d, desto högre MOI är, desto bättre transduktionseffektiviteten. Däremot kan med hjälp av en högre MOI bli giftigt för vissa celler.
Det finns dock några limita ningar till detta protokoll. Denna teknik har utvecklats med hjälp av passage 1 HBE celler. Lungor avvisade för transplantation erhölls med lämplig samtycke till forskning som överensstämmer med normer som fastställts av Helsingforsdeklarationen. Erhålla primära HBE-celler från kommersiella källor kan vara dyra. Dessa celler är oftast också endast tillgänglig på en högre passage. Detta protokoll har inte testats på passager högre än 2. En annan begränsande faktor är p24 ELISA antigenanalys. Flera företag erbjuder satsen men till hög kostnad. Dessutom viruskoncentrationen av analysen är endast ett ungefärligt värde eftersom testet upptäcker lentivirus p24 och fri p24 frigörs under transient transfektion 17. Därför är denna utvärdering av MOI bara en uppskattning. Slutligen, med hjälp av olika expressionskonstruktioner (större eller mindre i storlek) får inte ge samma resultat. Till exempel, har olika verkningsgrader som spelats in med mCherry och EGFP (data visas ej).
ent "> Det finns fördelar med detta protokoll jämfört med andra metoder. En av dem är transfektionsbehandlingen. I själva verket kan det föreslagna protokollet ger så höga virustitrar som de insamlade media som innehåller virus kommer inte längre behöver koncentreras och skulle kunna användas direkt att transducera celler. Polyetylenglykol (PEG), som används i detta protokoll för att koncentrera viruset har varit kända för att vara toxiska för däggdjursceller 18. Dessutom, om högre MOI användes detta skulle öka risken toxicitet ännu mer. Men om koncentrationssteg PEG blir föråldrad, forskare som har varit misslyckade transducera på grund av toxiska effekter kan ompröva användningen av lentivirus. En annan fördel med detta protokoll är bristen på skillnader i omvandlingseffektivitet på plast eller genomträngliga stödinsatser. fördelen med att vara kunna transducera på plast är att färre celler och viruspartiklar som behövs. som ett resultat av att cellerna kan expanderas inlägget transduktion och överfördespå genomsläppliga stödinsatser när sammanflytande (data visas ej).Valet av vektorer beror på flera frågor, såsom urval av omvandlade celler med puromycin eller uttryck av markörproteiner såsom grönt fluorescerande protein (GFP). Det finns flera kommersiella vektorer tillgängliga som är lämpliga (pRRLsinPPT.CMV.MCS.Wpre, pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro, pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro, pGEM-T Easy) 15,19-21. Val av promotorer innebär utmaningar, eftersom den allmänt använda CMV-promotorn tystas i differentierade epitelceller i luftvägarna 15. För flimmercellspecifika uttryck, är användningen av räv-j1 promotor rekommenderas. Alternativt kan EF-1-promotorn användas för uttryck i alla luftvägsceller 20,21. Om proteinuttryck söks, kommer storleken på insatsen bestämma delvis transduktionseffektiviteten. Däremot kan stora storlekar rymmas som ses av framgångsrik transduktion av fullängds löslig adenylylcyklas 22 .Det lab har publicerat flera framgångsrika uttryck konstruktioner 15,16,20-22. För shRNA uttryck (vanligen under U6 eller H1 promotor), kommer flera konstruktioner måste utforskas. Detta kan vara långtråkig med tester utförda vid slutet av differentiering (PCR och Western blotting), men processen kan inte förkortas eftersom icke-differentierade celler inte kan vara en bra representation av framgång för celler som genomgår differentiering. Återigen har labbet publicerat flera framgångsrika shRNA konstruktioner 14,20,21,23.
Med hjälp av detta protokoll, kan fler forskare ges möjlighet att avsevärt förbättra tidigare dåliga transduktioner. Vissa kanske tycker att det är lämpligt att öka effektiviteten genom att göra några justeringar. Vissa kan använda detta verktyg för att upptäcka nya biologiska processer eller för att kunna bevisa begrepp, både med hjälp av knockdown eller överuttryck strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar Life Alliance Organ Recovery Agency vid University of Miami för att ge lungorna. Vi vill också tacka Dr Lisa Künzi för DNA-beredning användes för experimenten som visas i figur 2B och 3-D, Dr Ben Gerovac och Lisa Novak för mCherry virus som användes för experimenten i figurerna 3A till C. Vi tackar också Gabriel Gaidosh från bildanläggningen, Ögonkliniken vid University of Miami.
Denna studie har sponsrats av anslag från NIH, CF Foundation och flygvärdinna Medical Research Institute till Dr. Matthias Salathé.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | 12306C | use at 10% |
| DMEM | Thermo Scientific | 11995-040 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Thermo Scientific | 15140-122 | use at 1x |
| Collagen I | BD Biosciences | 354231 | dilute 1:75 in distilled water |
| Calphos | Clontech | 631312 | Transfection kit containing 2 M Calcium solution, 2x HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O |
| Polythylene glycol 8000 | VWR scientific | 101108-210 | stock of 40% |
| Amphotericin B | Sigma | A9528 | use at 1x |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Transwell 12 mm | Corning | 3460 | |
| Collagen IV | Sigma | C7521 | dilute 1:10 in distilled water |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | stock of 2 mg/ml |
| Puromycin (10.000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | use at 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 | lentiviral expression vector |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | packaging DNA |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | packaging DNA |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | packaging DNA |
References
- Ding, B., Kilpatrick, D. L. Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons. Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).
- Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Jr Gene therapy progress and prospects: development of improved lentiviral and retroviral vectors--design, biosafety, and production. Gene Ther. 12, 1089-1098 (2005).
- Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnol. 13, (2013).
- Delenda, C. Lentiviral vectors: optimization of packaging, transduction and gene expression. J Gene Med. 6 Suppl 1, S125-S138 (2004).
- Gresch, O., Altrogge, L. Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells. Methods Mol Biol. 801, 65-74 (2012).
- Jordan, E. T., Collins, M., Terefe, J., Ugozzoli, L., Rubio, T. Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells. J Biomol Tech. 19, 328-334 (2008).
- Castillon, N., et al. Regeneration of a well-differentiated human airway surface epithelium by spheroid and lentivirus vector-transduced airway cells. J Gene Med. 6, 846-856 (2004).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. 107, 183-206 (2005).
- Gonzalez-Mariscal, L., et al. Role of calcium in tight junction formation between epithelial cells. Am J Physiol. 259, C978-C986 (1990).
- Bals, R., et al. Transduction of well-differentiated airway epithelium by recombinant adeno-associated virus is limited by vector entry. J Virol. 73, 6085-6088 (1999).
- Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 17, 441-450 (2008).
- Davis, H. E., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 97, 159-172 (2002).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, 341-347 (2013).
- Manzanares, D., et al. Functional apical large conductance, Ca2+-activated, and voltage-dependent K+ channels are required for maintenance of airway surface liquid volume. J Biol Chem. 286, 19830-19839 (2011).
- Schmid, A., et al. Real-time analysis of cAMP-mediated regulation of ciliary motility in single primary human airway epithelial cells. J Cell Sci. 119, 4176-4186 (2006).
- Unwalla, H. J., Ivonnet, P., Dennis, J. S., Conner, G. E., Salathe, M. Transforming growth factor-beta1 and cigarette smoke inhibit the ability of beta2-agonists to enhance epithelial permeability. Am J Respir Cell Mol Biol. 52, 65-74 (2015).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6, (2006).
- Schneiderman, S., Farber, J. L., Baserga, R. A simple method for decreasing the toxicity of polyethylene glycol in mammalian cell hybridization. Somatic Cell Genet. 5, 263-269 (1979).
- Schmid, A., et al. Soluble adenylyl cyclase is localized to cilia and contributes to ciliary beat frequency regulation via production of cAMP. J Gen Physiol. 130, 99-109 (2007).
- Manzanares, D., et al. Airway Surface Dehydration by Transforming Growth Factor beta (TGF-beta) in Cystic Fibrosis Is Due to Decreased Function of a Voltage-dependent Potassium Channel and Can Be Rescued by the Drug Pirfenidone. J Biol Chem. 290, 25710-25716 (2015).
- Manzanares, D., et al. IFN-gamma-mediated reduction of large-conductance, Ca2+-activated, voltage-dependent K+ (BK) channel activity in airway epithelial cells leads to mucociliary dysfunction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L453-L462 (2014).
- Chen, X., et al. A soluble adenylyl cyclase form targets to axonemes and rescues beat regulation in soluble adenylyl cyclase knockout mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 51, 750-760 (2014).
- Ransford, G. A., et al. Pannexin 1 contributes to ATP release in airway epithelia. Am J Respir Cell Mol Biol. 41, 525-534 (2009).
