Abstract
In vitro kweek van primaire menselijke bronchiale epitheelcellen (HBE) cellen met lucht-vloeistof interfaces verschaft een bruikbaar model voor de processen van luchtwegen celdifferentiatie en functie te bestuderen. In de afgelopen jaren is het gebruik van lentivirale vectoren voor transgene levering werd een gangbare praktijk. Hoewel er meldingen van transductie van volledig gedifferentieerde epitheelcellen met bepaalde niet-HIV-pseudo-getypeerde lentivirussen, de algehele transductie efficiëntie is meestal minder dan 15%. Het protocol hier gepresenteerde een betrouwbare en efficiënte methode om lentivirussen produceren en primaire menselijke bronchiale epitheelcellen transduceren. Gebruik ongedifferentieerde bronchiale epitheelcellen, transductie in bronchiale epitheel groeimedia, terwijl de cellen hechten, met een multipliciteit van infectie factor 4 verschaft efficiëntie bijna 100%. Dit protocol beschrijft, stap voor stap, de bereiding en de concentratie snel titer lentivirale vectoren en the transductie proces. Het bespreekt de experimenten dat de optimale kweekomstandigheden vastbesloten om zeer efficiënte transductie van primaire menselijke bronchiale epitheelcellen te bereiken.
Introduction
De ontwikkeling van replicatie-defecte, gepseudotypeerde lentivirussen (LV) voorziet onderzoekers met veilige en efficiënte methode om transgenen leveren in vitro 1. Vanwege hun lange-termijn expressie zouden deze LV ook worden gebruikt voor de afgifte van therapeutische middelen in vivo 2,3. De productie van LV vereist co-transfectie van menselijke embryonale nier (HEK) cellen met verschillende plasmiden: transfer vector, verpakking gag / pol, verpakking rev, en envelop vesiculaire stomatitis virus glycoproteïne (VSV-G) plasmiden. Derde generatie verpakkingssystemen geacht veiliger dan de tweede-generatie systemen, omdat het rev-gen wordt gecodeerd op een afzonderlijk inpak plasmide, waarbij de mogelijkheid van recombinatie tot een replicatie-competent lentivirus produceren verminderen. Hoewel de tweede generatie verpakkingssystemen op vijf maal hogere totale transductie eenheden, de splitsing van de oorspronkelijke virale genoom te creërende derde generatie systeem het niveau van transductie slechts minimaal 3,4 daalde.
Terwijl cellijnen makkelijker en efficiënter kunnen worden getransduceerd hebben onderzoekers hun focus primaire cellen verschoven, omdat deze representatiever in vivo weefsels 5,6. Echter, primaire cellen zijn ongevoelig voor transductie. Terwijl transductie van volledig gedifferentieerde epitheelcellen gemeld, is het totale rendement niet meer dan 15% 7.
hier beschreven is een protocol dat de productie van high-titer LVs maakt. Een stap-voor-stap benadering geschetst bijna 100% transductie in primaire HBE cellen bereiken. Meer specifiek protocol beschrijft de optimale kweekomstandigheden instrumentale slagen 3. In het kort worden HEK 293T-cellen getransfecteerd met de lentivirale expressievector pCDH de EF-1 promotor die expressie van versterkt groen fluorescenteiwit (eGFP) of mCherry, een rood fluorescerend eiwit, en een derde generatie verpakkingssysteem. LVs vrij in het medium worden verzameld 24 tot 72 uur later. De virusdeeltjes worden geconcentreerd met polyethyleenglycol (PEG), een gemakkelijke en eenvoudige methode van virale concentratie, voordat titer schatting met een p24 antigeen enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit. Vervolgens worden ongedifferentieerde primaire HBE cellen getransduceerd in proliferatiemedia (bronchiale epitheliale groeimedium of BEGM) 8, het vastmaken (na trypsine), bij een multipliciteit van infectie (MOI) factor 4, het toevoegen hexadimethrinebromide en incuberen gedurende 16 uur ( 's nachts). De cellen laat men daarna differentiëren. Aangezien het virale transgen tot expressie wordt gebracht op lange termijn (met de geschikte promoter, zie bespreking), zal expressie tijdens differentiatie worden gehandhaafd in een pseudo luchtwegepitheel of kan worden geïnduceerd (met een induceerbare promoter) na differentiatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fase 1: Culture of HEK 293T
- Bereid HEK cellen media (aangeduid als HEK media) door toevoeging van 10% (v / v) (v / v) foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine naar hoog glucose Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM).
- Coat een 10 cm weefselkweekplaat met collageen I. Mix 30 ul collageen I in 2 ml gedestilleerd water. Verspreid het mengsel op de schaal en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- Verwijder het mengsel en laat de schotel drogen in een laminaire flowkast gedurende 15 minuten.
- Plaat HEK cellen op de gecoate schaal bij een dichtheid van 1 x 10 6 cellen in 10 ml HEK media en incuberen bij 37 ° C en 5% CO2.
- Wanneer HEK cellen 50-60% confluent (figuur 1a, 2-3 dagen na plating), ga dan naar fase 2. Visuele beoordeling van confluentie is voldoende. Geen kwantificatie nodig.
Opmerking: HEK cellen gekweekt in HEK media (zie hierboven). Wanneer ze confluentie bereiken, they kan worden gesplitst (bijvoorbeeld 1/5) of bevroren naar beneden voor later gebruik.
2. Fase 2: Productie en Concentratie van Lentivirussen (LVs) in HEK cellen
Opmerking: De protocollen moeten in overeenstemming met de institutionele en overheidsvoorschriften worden uitgevoerd onder BSL-2 + (enhanced BSL-2) omstandigheden in de Verenigde Staten.
- Transfecteren met een kalkafzetting procedure (lipofectamine en andere middelen transfectie niet zo efficiënt als de kalkafzetting procedure). Toepassing van een commerciële transfectie kit wordt aanbevolen om de reproduceerbaarheid te verzekeren, maar de procedure als volgt gewijzigd. Breng alle reagentia op kamertemperatuur. Dit is dag 0.
- Voor elke 10 cm schotel van HEK293 cellen, meng 4,5 ug envelop DNA pMD2-VSVG, 7,5 ug verpakking DNA pMDLg / pRRE, 3,75 ug DNA pRSV-rev, 10 ug DNA van lentivirale expressievector, 86 pi van een 2 M calcium-oplossing en steriel water in een 15 ml centrifugebuis een eindvolume van 700 gl(Deze laatste twee oplossingen worden in de commerciële transfectie kit).
- Druppelsgewijs, voeg 700 ul 2x HEPES gebufferde zoutoplossing (HBS, verschaft in de transfectie kit) terwijl vortexen (in de laminaire stroming kast) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten (stap 4 uitgevoerd tijdens het wachten).
- Tijdens het begin van de incubatietijd, stort 5 ul van de mix op een dia. Controleer de druppel onder een microscoop met een 10x objectief, gericht langzaam op en neer. Een fijn neerslag moet zichtbaar zijn, ter bevestiging van de calciumfosfaatprecipitatie werkwijze (figuur 1b).
- Stop de neerslag na 30 minuten door toevoeging van 10 ml van HEK cellen media en pipet op en neer om te mengen.
- Neem de schaal van HEK cellen uit stap 2,1-2,5, en verwijder het medium (dag 0). Voeg de oplossing uit stap precipitaat 2,5 voorzichtig en langzaam langs de rand van de schaal.
- Op de volgende dag (dag 1), te verwijderen en gooi het medium dat de neerslag en vervang deze wi 10 ml HEK medium. Controleer op de fijn neerslag onder de loep: het moet zichtbaar zijn in de schaal in lege ruimtes tussen de cellen (figuren 1c en d) zijn.
- Op dag 2, laat media met een spuit, filter door een 0,45 urn spuitfilter in een 15 ml centrifugebuis met 3,8 ml van een 40% polyethyleenglycol (PEG). Invertsuiker 5x te mengen en bewaar bij 4 ° C gedurende ten minste 24 uur (voor de PEG precipitaat te vormen, maar niet langer dan 5 dagen) totdat alle virus verzamelingen zijn voltooid.
- Herhaal stap 2.8 op dagen 3 en 4. Op dag 4 niet te vervangen door HEK medium maar te ontsmetten met 10% bleekmiddel en gooi de schotel.
- Centrifugeer de verzamelbuizen (gewoonlijk alle collecties samen op dag 5) bij 1650 xg gedurende 20 min bij 4 ° C om het virus pellet. Verwijder de supernatant en weer draaien bij 1650 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C voor het verzamelen en verwijderen van overgebleven PEG supernatant.
- RESUShang de pellet van elke buis in 200 ul van bronchiale epitheliale groeimedium (BEGM) zonder amfotericine B 8. bundelen hen en monster bij 200 pl. WINKEL virus bij -80 ° C. Aliquot een additionele 10 pi met de HIV-1 Gag (p24) antigeen ELISA analyse uit te voeren.
- Met behulp van een commerciële ELISA kit, voeren een p24 antigeen test volgens het protocol van de fabrikant. De test geeft een schatting van de virale p24 in pg / ml.
3. Fase 3: Cultuur Primair HBE Cells
- Plaat HBE cellen in 10 ml BEGM medium (met 100 gl amfotericine B als passage 0 cellen worden gebruikt om mogelijke verontreiniging te elimineren schimmel) bij een dichtheid van 1 x 10 6 cellen in een collageen I beklede 10 cm weefselkweekplaat. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2.
- Op de volgende dag, verwijder het medium en te vervangen door 10 ml BEGM (met 100 ul amfotericine B voor passage 0 cellen) voor een totaal van 4 dagen. Keer terug naar incubator.
- Na 4 days, gebruik dan alleen BEGM zonder amfotericine B. Change media om de andere dag.
- Wanneer cellen 80-90% confluent (Figuur 2a; ~ 7 dagen na plating), doorgaan met transductie (let op 3,5 voor de voorbereiding voordat transductie). Nogmaals, visuele beoordeling van confluentie volstaat. Geen kwantificatie nodig.
- Voorafgaand aan transductie, laag het permeabele ondersteuningsinbrengingen met een collageen IV 1/10 verdund met steriel gedestilleerd water. Voeg 200 ul aan elke insert en laten drogen 's nachts in de laminaire stroming kast.
4. Fase 4: Transductie van HBE Cells
- Verwijderen media, voeg 3 ml 0,1% trypsine in 1 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur in fosfaatgebufferde zoutoplossing (EDTA / PBS) en incubeer 5 min bij 37 ° C en 5% CO2. Controleer onder de microscoop (10X objectieve) om te zien of alle cellen worden losgemaakt. Zo niet terug naar de incubator gedurende nog 5 min.
- Als alle cellen zijn vrijstaand, voeg 3ml sojaboontrypsineremmer (SBTI 1 mg / ml), mengen en overbrengen naar een 15 ml centrifugebuis. Pellet de cellen door het draaien bij 460 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 3 ml BEGM en ga verder met het tellen.
- Resuspendeer HBE-cellen (nu passage 1 of P1) in een verhouding van 2 x 10 5 cellen per 12 mm een doorlaatbare drager insert in 400 gl BEGM (zie tabel 2). Extrapoleren deze cijfers zijn gebaseerd op de hoeveelheid doorlaatbare ondersteuningsinbrengingen die worden getransduceerd.
| Oppervlak | Oppervlakte | celgetal | Media | Volume (media) |
| 10 cm schaaltje | 52,7 cm 2 | 1 x 10 6 | BEGM | 10 ml | </ Tr>
| 12 mm filter | 1,13 cm 2 | 2 x 10 5 | BEGM | 400 gl |
| 24 mm filter | 4,52 cm 2 | 8 x 10 5 | BEGM | 800 pl |
Tabel 2: Media extrapolatie per celgetal.
- Met een multipliciteit van infectie (MOI) factor 4, voeg de juiste hoeveelheid virus aan de celsuspensie.
- Voeg hexadimethrinebromide een 2 ug / ml eindconcentratie.
- Verdeel 400 pi van het mengsel (BEGM, HBE cellen, virussen en hexadimethrinebromide) per doorlaatbare drager inzetstuk in het apicale compartiment en voeg 1 ml BEGM alleen het basolaterale compartiment. Incubeer overnacht bij 37 ° C en 5% CO 2. Altijd plaat HBE cellen zonder virus als controle en test puromycineselectie als toepasselijk.
- Op de volgende dag, remove apicale en basolaterale media, wassen met PBS, en beide compartimenten met air-vloeistof interface (ALI) media 8 vervangen.
- Wanneer de cellen confluent, verwijder apicale vloeistof (bekend als oprichting van een lucht-vloeistof interface). Ga door het veranderen van het medium (ALI) in het onderste compartiment om de andere dag, totdat zij volledige rijpheid te bereiken; gewoonlijk 3-4 weken later.
Opmerking: Als de lentivirale vector bevat een selectiegen zoals puromycine, kunnen cellen worden geselecteerd door toevoeging puromycine volgens een selectie concentratiecurve. Voor HBE cellen, heeft een concentratie van 1 ug / ml bepaald ideaal voor consistente selectie van getransduceerde cellen. Dit kan echter concentratie verschillen van andere cellen of voorwaarden en worden bepaald door het doden curves. Toevoeging van puromycine kan al één dag nadat het medium is vervangen door ALI media of hoger (2-3 dagen) om de volledige expressie van het selectiegen mogelijk. Zorg ervoor dat u puromycine toe te voegen aan een insert dat hzo niet getransduceerd. Puromycine kan worden toegevoegd totdat de cellen volledig zijn gedifferentieerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont verschillende belangrijke stappen beoordelen cellen en oplossingen tijdens de transfectieproces. Figuur 1a toont de optimale samenvloeiing van HEK293T cellen voor transfectie voor virusproductie. Het is belangrijk dat de cellen gelijkmatig over de schotel zijn verdeeld. Figuur 1b toont het neerslag in een daling van de transfectie mengsel middels helderveld optiek en een 10X objectief. Naarmate de precipitaten eruit zandkorrels plaats agglomeraten, hoe efficiënter de transfectie zijn. Op deze foto, de neerslag is een beetje grof. Het precipitaat is een betrouwbare indicator of de transfectie een hoge titer van het virus zal produceren. Als een van de ingrediënten ontbreekt of van slechte kwaliteit (vector DNA bijvoorbeeld), zal agglomeraten vormen, dat is een onheilspellend teken. Als dit het geval is, is het verstandiger om af te breken en de procedure opnieuw te starten, om ervoor te zorgen datalle ingrediënten in het mengsel en / of de kwaliteitscontrole van het vector DNA en DNA verpakking. Figuur 1c toont dezelfde schotel als A, na een nacht incubatie. Het neerslag (en moeten) zichtbaar tussen cellen. We hebben gemerkt dat de cellen niet veel vermenigvuldigen tijdens de 24 uur na transfectie.
Figuur 2 toont hoe HBE cellen zien voor en 3 dagen na transductie. Figuur 2a toont ongeveer 80% confluente primaire HBE cellen voorafgaand aan trypsine en transductie. Een 10 cm schotel bij 80% confluentie levert ongeveer 4 x 10 6 cellen. Figuur 2b toont bijna 100% transductie van ongedifferentieerde P1 HBE-cellen met een MOI van 4 op doorlaatbare drager insert. Wanneer HBE cellen worden uitgeplaat op deze doorlaatbare ondersteuningsinbrengingen zijn de cellen relatief vlak. Op deze foto is de hoogte van de cellen is slechts een paar microns wat verklaart waarom de0,4 urn poriën zichtbaar hoewel de cellen.
Figuur 3 toont optimalisatie experimenten die tot de gepresenteerde protocol. Alle experimenten werden uitgevoerd in triplo op collageen I beklede putjes (24 putjes plaat), met 2 x 10 5 primaire HBE cellen per putje. De meeste experimenten gebruikt een MOI van 0,4 met 2 ug / ml eindconcentratie van hexadimethrine bromidein BEGM media. Fluorescerende cellen geteld 3 dagen na transductie. Hoewel de initiële optimalisatie van het protocol is uitgevoerd op plastic, zijn de resultaten bevestigd doorlaatbare steun inserts. Verder probeert volledig gedifferentieerde P1 HBE transduceren lukte niet (gegevens niet getoond) bevestigde eerdere verslagen. Zoals blijkt uit figuur 3a, wordt een hoger percentage HBE cellen getransduceerd in BEGM media opzichte van ALI. Als de cellen worden uitgeplaat op de dag vóór transductie in BEGM media, de efficiëntiesignificant verlaagd vergeleken met transduceren terwijl cellen hechten (figuur 3b). Wanneer P1 HBE cellen de dag worden uitgeplaat voor transductie in ALI media (in plaats van BEGM), transductie efficiëntie daalt verder (gegevens niet getoond). Het verschil tussen deze 2 media is de calciumconcentratie. BEGM medium bevat een lage calciumconcentratie (0,1 mM) in vergelijking met ALI media (1 mM). Calcium formulieren en onderhoudt strakke kruispunten en daarom kan het moeilijk te maken voor de virusdeeltjes te steken 9 en toegang krijgen tot hun receptoren op het basolaterale membraan. In feite, bepaalde infecties waren succesvol in geringe hoeveelheden door het verstoren tight junctions behulp ethyleenglycol azijnzuur (EGTA), bijvoorbeeld 10. Zoals eerder vermeld, volledig gedifferentieerde P1 HBE cellen ongevoelig en kunnen alleen worden getransduceerd met lage efficiënties 5-7, die kan worden veroorzaakt door tight junctions in hoge calcium bevattende media. Een andere verklaring voorlage transductie efficiëntie in volledig gedifferentieerde cellen is een actieve mucociliaire transportmechanisme waarbij slijm zou kunnen fungeren als een barrière. Of, zoals gerapporteerd door Bals et al., Het stadium van differentiatie waarin HBE cellen, is een bepalende factor transductierendement 10. Het feit dat meer cellen krijgen getransduceerd in BEGM dan in ALI media ondersteunt deze uitspraak (Figuur 3a).
Zoals blijkt uit figuur 3b, is een toename van bijna 50% transductie waargenomen wanneer de cellen werden getransduceerd tijdens het bevestigen ten opzichte van de cellen uitgeplaat dag voor. In hun studie, Ricks et al. Vertoonden een stijging van 20% bij transductie werd uitgevoerd na trypsine 11. Tezamen suggereren deze resultaten dat media en de toestand van rijpheid van cellen is de sleutel tot succes transductie.
Het paneel in figuur3c, demonstreert hexadimethrine bromideplaying atrivial rol in de transductie efficiëntie. Toch is het gebruik voorgesteld in dit protocol, omdat het heeft geen negatieve gevolgen, maar kan mogelijk nuttig zijn. Hexadimethrinebromide een kationisch polymeer dat wordt gebruikt in de virologie transductie efficiënties 12 verbeteren. Anderen hebben het gebruik van protamine, een andere kationische polymeer gepubliceerd, maar er is geen significant verschil gevonden met betrekking tot transductie efficiency in vergelijking met hexadimethrinebromide 13. Hexadimethrinebromide heeft geen invloed op de groei of differentiatie 14-16.
Tenslotte werden verschillende MOI's onderzocht in figuur 3d: de hoogste efficiëntie transductie optraden met een MOI van 4. Er was geen significant verschil tussen de MOI 0,4 en 4, echter MOI 4 getransduceerde 100% van HBE cellen terwijl MOI 0,4 getransduceerd slechts 75%. De MOI bepaalt hoeveel virusdeeltjes will hebben het potentieel om een cel te infecteren. Er zijn verschillende methoden om de MOI bepalen. Een daarvan is het aantal transductie eenheden (TU) definiëren. Met een ELISA, kan de hoeveelheid p24 antigen bepaald pg / ml. Virale p24 in picogram kan worden omgezet in TU, die nodig zijn om de MOI te berekenen. De MOI wordt berekend door het aantal TU te delen door het aantal cellen. Er zijn 10-100 transductie eenheden (TU) per picogram p24. Alle verwijzingen in de tekst over MOI zijn gebaseerd op berekeningen met 100 TU per picogram p24. (Http://tronolab.epfl.ch/webdav/site/tronolab/shared/protocols/TUvsp24.html).
Figuur 1:. Transfectie van HEK 293T cellen (a) HEK 293T cellen gekweekt tot 50-60% confluentie gezien onder een 10X objectief. (B) neerslaan toegankelijk in een 5 ul druppel 5 minuten na mengen alle reaNTS onder de microscoop (10X objectief). (C) neerslaan in de schaal naast de cellen, na overnacht transfectie (10X objectief). (D) vergroting van het midden van (c). Witte pijl neer te slaan. Schaal bar = 100 micrometer; is hetzelfde voor a, b en c. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Transductie van NHBE cellen (a) HBE cellen gekweekt in een collageen I gecoate schaal tot 80-90% confluentie (ongeveer 4 x 10 6 cellen) in BEGM media gedurende 5 dagen (10X objectief).. Schaal bar = 100 micrometer. (B) eGFP getransduceerde HBE cellen op doorlaatbare steun inzetstukken (12 mm), 3 dagen na transductie (confocale, 20X). Op deze staat, HBE cel ls zijn vlak en poriën van het membraan zichtbaar. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Optimalisatie van transductie protocol (a) Invloed van media op transductie efficiëntie.. (B) Vergelijking van transductie in HBE cellen uitgeplaat de dag vóór en transductie van cellen tijdens het bevestigen. (C) Invloed van hexadimethrinebromide op transductie efficiëntie. (D) evaluatie van verbeterde transductie efficiëntie met verschillende MOI's. Analyse werd uitgevoerd onder toepassing van t-test van Student of Kruskal-Wallis en Dunn's meervoudige vergelijkingstest. Error bars vertegenwoordigt SE en alle * vertegenwoordigen p <0,05.ww.jove.com/files/ftp_upload/54176/54176fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol hier geschetste verzekert bijna 100% transductie efficiëntie. Echter, er treden tijdens het proces van belang om dit doel te bereiken zijn. Bijvoorbeeld, tijdens het transfectieproces de aanwezigheid van neerslagen in de transductie mix (druppel) of in de schaal de dag na transductie (Figuren 1b en d) zijn zowel van toepassing voor goede transfectie. De afwezigheid van een neerslag of de aanwezigheid van agglomeraten kan te wijten zijn aan een weglaten van een van de transfectie reagentia, een pH afgifte of een slechte plasmide preparaat. Wanneer de neerslag ontbreekt, is er een grote kans dat niemand de volgende dag zichtbaar is. Bovendien, het toevoegen van de transfectie mix of HEK media te snel kan ertoe leiden dat de HEK cellen los te maken, belemmeren transfectie en opbrengst. Een andere indicatie van een goede opbrengst op dag 6 voor het centrifugatiestap: een wit neerslag moet zichtbaar zijn in de bodem van de buis. Een slechte transfectie bijnageen virus zal deze witte neerslag niet maken. Tijdens de transductie proces, is het cruciaal om primaire HBE cellen die zijn de-gedifferentieerd en die zich in een stamcel-achtige toestand om hoge transductie efficiëntie te bereiken gebruiken. Het gebruik van een vector die een fluorescent eiwit zoals eGFP of mCherry die gemakkelijk gevisualiseerd kan een goed hulpmiddel zijn.
Wijzigingen kunnen worden gemaakt om dit protocol om verschillende primaire cellen aan te passen. Een benadering is om de calciumconcentratie verminderen in de media. Zoals blijkt uit figuur 3a, met behulp BEGM media die een lagere concentratie van calcium resulteerde in significant hogere transductie efficiëntie in primaire HBE cellen bevat. Een andere benadering zou zijn de MOI verhogen. Zoals getoond in figuur 3d, hoe hoger de MOI, hoe beter de transductie efficiëntie. Het gebruik van een hogere MOI kan toxisch voor bepaalde cellen.
Toch zijn er een aantal beper ties om dit protocol. Deze techniek is ontwikkeld met behulp passage 1 HBE cellen. Longen afgewezen voor transplantatie werden verkregen met de juiste toestemming voor onderzoek dat voldoet aan de door de verklaring van Helsinki vastgestelde normen. Verkrijgen primaire HBE cellen uit commerciële bronnen kan duur zijn. Deze cellen zijn meestal ook alleen een hogere passage. Dit protocol is niet getest op passages hoger dan 2. Een andere beperkende factor is de p24-antigeen-ELISA-test. Verschillende bedrijven bieden de kit maar tegen hoge kosten. Bovendien de virale concentratie die door de test slechts een benaderingswaarde aangezien de test lentivirus p24 en p24 vrije vrijkomen bij transiënte transfectie 17 detecteert. Daarom is deze evaluatie van de MOI is slechts een schatting. Bovendien zullen, met verschillende expressieconstructen (groter of kleiner) niet dezelfde resultaten geven. Zo werden verschillende efficiënties opgenomen met mCherry en eGFP (gegevens niet getoond).
ent "> Er zijn voordelen bij het protocol boven andere. Eén daarvan is het transfectieproces. In feite kan de voorgestelde protocol zoals hoge virus titers dat de verzamelde media die virussen niet langer moeten worden geconcentreerd op en kan worden gebruikt direct transduceren cellen. Polyethyleenglycol (PEG), in dit protocol virusconcentraat, bekend is toxisch voor zoogdiercellen 18 zijn. Bovendien, als hogere MOI gebruikt, dit zou nog het risico toxiciteit. echter, indien de PEG concentratiestap veroudert, onderzoekers die ongelijk zijn transduceren gevolg van toxische effecten van het gebruik van lentivirussen kunnen herzien. Een ander voordeel van dit protocol is het gebrek aan verschillen in transductie efficiënties op plastic of doorlaatbare ondersteuningsinbrengingen. het voordeel dat kunnen transduceren op plastic is dat minder cellen en virusdeeltjes nodig. Hierdoor kunnen de cellen worden uitgebreid na transductie en overgebrachtop doorlaatbare ondersteuningsinbrengingen bij confluente (gegevens niet getoond).De keuze van de vectoren is afhankelijk van een aantal kwesties, zoals selectie van getransduceerde cellen met puromycine of expressie van marker eiwitten zoals groen fluorescerend eiwit (GFP). Er zijn meerdere commerciële vectoren beschikbaar die geschikt (pRRLsinPPT.CMV.MCS.Wpre, pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro, pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro, pGEM-T Easy) 15,19-21 zijn. Selectie van promotors stelt uitdagingen, aangezien de meest gebruikte CMV promoter wordt het zwijgen opgelegd in gedifferentieerde epitheelcellen 15. Voor ciliated cel-specifieke expressie, wordt het gebruik van de vos-J1 promotor aanbevolen. Als alternatief kan de EF-1 promoter worden gebruikt voor expressie in alle luchtwegen cellen 20,21. Als eiwitoverexpressie wordt gevraagd, zal de grootte van de insertie te bepalen, gedeeltelijk transductie efficiëntie. Toch kunnen aanzienlijke afmetingen worden ondergebracht gezien door succesvolle transductie van volledige lengte oplosbaar adenylaatcyclase 22 .De lab publiceerde diverse succesvolle overexpressie construeert 15,16,20-22. Voor shRNA expressie (meestal onder de U6 of H1 promoter) zullen meerdere constructen moeten worden onderzocht. Dit kan vervelend met tests uitgevoerd aan het einde van differentiatie (PCR en Western blotting), maar het proces kan niet worden verkort aangezien niet-gedifferentieerde cellen geen goede weergave van succes voor cellen ondergaan differentiatie zijn. Nogmaals, heeft het lab publiceerde meerdere succesvolle shRNA construeert 14,20,21,23.
Met behulp van dit protocol, kunnen meer onderzoekers in staat worden gesteld om een aanzienlijke verbetering van de vorige slechte transducties. Sommigen vinden het misschien nuttig zijn om de efficiëntie te verhogen door het maken van een paar aanpassingen. Sommigen zullen deze tool gebruiken om nieuwe biologische processen te ontdekken of in staat zijn om concepten te bewijzen, zowel met behulp van knock-down of overexpressie strategieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken de Life Alliance Organ Recovery Agency van de Universiteit van Miami voor het verstrekken van de longen. Wij danken ook Dr. Lisa Künzi de DNA bereiding voor de in figuur 2B en 3-D, Dr. Ben Gerovac en Lisa Novak de mCherry virus gebruikt voor de experimenten in Figuren 3A tot C. experimenten Wij danken ook Gabriel Gaidosh uit de imaging faciliteit, afdeling Oogheelkunde aan de Universiteit van Miami.
Dit onderzoek is mede mogelijk gemaakt door subsidies van de NIH, de CF Foundation en de Flight Attendant Medical Research Institute aan Dr. Matthias Salathé.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | 12306C | use at 10% |
| DMEM | Thermo Scientific | 11995-040 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Thermo Scientific | 15140-122 | use at 1x |
| Collagen I | BD Biosciences | 354231 | dilute 1:75 in distilled water |
| Calphos | Clontech | 631312 | Transfection kit containing 2 M Calcium solution, 2x HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O |
| Polythylene glycol 8000 | VWR scientific | 101108-210 | stock of 40% |
| Amphotericin B | Sigma | A9528 | use at 1x |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Transwell 12 mm | Corning | 3460 | |
| Collagen IV | Sigma | C7521 | dilute 1:10 in distilled water |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | stock of 2 mg/ml |
| Puromycin (10.000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | use at 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 | lentiviral expression vector |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | packaging DNA |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | packaging DNA |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | packaging DNA |
References
- Ding, B., Kilpatrick, D. L. Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons. Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).
- Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Jr Gene therapy progress and prospects: development of improved lentiviral and retroviral vectors--design, biosafety, and production. Gene Ther. 12, 1089-1098 (2005).
- Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnol. 13, (2013).
- Delenda, C. Lentiviral vectors: optimization of packaging, transduction and gene expression. J Gene Med. 6 Suppl 1, S125-S138 (2004).
- Gresch, O., Altrogge, L. Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells. Methods Mol Biol. 801, 65-74 (2012).
- Jordan, E. T., Collins, M., Terefe, J., Ugozzoli, L., Rubio, T. Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells. J Biomol Tech. 19, 328-334 (2008).
- Castillon, N., et al. Regeneration of a well-differentiated human airway surface epithelium by spheroid and lentivirus vector-transduced airway cells. J Gene Med. 6, 846-856 (2004).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. 107, 183-206 (2005).
- Gonzalez-Mariscal, L., et al. Role of calcium in tight junction formation between epithelial cells. Am J Physiol. 259, C978-C986 (1990).
- Bals, R., et al. Transduction of well-differentiated airway epithelium by recombinant adeno-associated virus is limited by vector entry. J Virol. 73, 6085-6088 (1999).
- Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 17, 441-450 (2008).
- Davis, H. E., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 97, 159-172 (2002).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, 341-347 (2013).
- Manzanares, D., et al. Functional apical large conductance, Ca2+-activated, and voltage-dependent K+ channels are required for maintenance of airway surface liquid volume. J Biol Chem. 286, 19830-19839 (2011).
- Schmid, A., et al. Real-time analysis of cAMP-mediated regulation of ciliary motility in single primary human airway epithelial cells. J Cell Sci. 119, 4176-4186 (2006).
- Unwalla, H. J., Ivonnet, P., Dennis, J. S., Conner, G. E., Salathe, M. Transforming growth factor-beta1 and cigarette smoke inhibit the ability of beta2-agonists to enhance epithelial permeability. Am J Respir Cell Mol Biol. 52, 65-74 (2015).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6, (2006).
- Schneiderman, S., Farber, J. L., Baserga, R. A simple method for decreasing the toxicity of polyethylene glycol in mammalian cell hybridization. Somatic Cell Genet. 5, 263-269 (1979).
- Schmid, A., et al. Soluble adenylyl cyclase is localized to cilia and contributes to ciliary beat frequency regulation via production of cAMP. J Gen Physiol. 130, 99-109 (2007).
- Manzanares, D., et al. Airway Surface Dehydration by Transforming Growth Factor beta (TGF-beta) in Cystic Fibrosis Is Due to Decreased Function of a Voltage-dependent Potassium Channel and Can Be Rescued by the Drug Pirfenidone. J Biol Chem. 290, 25710-25716 (2015).
- Manzanares, D., et al. IFN-gamma-mediated reduction of large-conductance, Ca2+-activated, voltage-dependent K+ (BK) channel activity in airway epithelial cells leads to mucociliary dysfunction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L453-L462 (2014).
- Chen, X., et al. A soluble adenylyl cyclase form targets to axonemes and rescues beat regulation in soluble adenylyl cyclase knockout mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 51, 750-760 (2014).
- Ransford, G. A., et al. Pannexin 1 contributes to ATP release in airway epithelia. Am J Respir Cell Mol Biol. 41, 525-534 (2009).
