Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الأمثل الفيروسة البطيئة إنتاج وزراعة الخلايا الشروط الضرورية لبنجاح خلايا تنبيغ الإنسان الشعبي الأساسي طلائي

Published: July 22, 2016 doi: 10.3791/54176
Automatic Translation
1, 1, 2
1Division of Pulmonary, Allergy, Critical Care, and Sleep Medicine, University of Miami, Miller School of Medicine, 2Department of Cell Biology, University of Miami, Miller School of Medicine

Abstract

في الثقافة المختبر من خلايا الإنسان الأولية الظهارية الشعب الهوائية (HBE) باستخدام الظروف واجهة الهواء السائل يوفر نموذجا مفيدا لدراسة عمليات تمايز الخلايا الهوائية وظيفة. في السنوات القليلة الماضية، واستخدام ناقلات lentiviral للتسليم التحوير أصبح ممارسة شائعة. في حين أن هناك تقارير تنبيغ الهوائية الخلايا الظهارية متباينة تماما مع بعض lentiviruses كتبته الزائفة غير بفيروس نقص المناعة البشرية، وكفاءة تنبيغ الشاملة هي عادة ما تكون أقل من 15٪. بروتوكول المقدمة هنا يوفر طريقة موثوقة وفعالة لإنتاج lentiviruses وتنبيغ الخلايا الظهارية الشعب الهوائية الإنسان الأساسية. استخدام الخلايا الظهارية القصبية غير متمايزة، تنبيغ في وسائل الإعلام نمو الظهارية الشعب الهوائية، في حين أن نعلق الخلايا، مع تعدد العوامل إصابة 4 يوفر الكفاءات قريبة من 100٪. يصف هذا البروتوكول، خطوة بخطوة، وإعداد وتركيز ناقلات lentiviral ارتفاع عيار والعشرينعملية تنبيغ ه. ويناقش التجارب هي التي تحدد شروط الثقافة الأمثل لتحقيق transductions ذات كفاءة عالية للخلايا الظهارية القصبية الإنسان الأساسية.

Introduction

وقد وفرت تطوير، lentiviruses pseudotyped-تكرار معيب (LV) الباحثين وسيلة آمنة وفعالة لتوصيل الجينات المحورة في المختبر 1. بسبب التعبير على المدى الطويل، يمكن لهذه LV أيضا أن تستخدم لإيصال العوامل العلاجية في الجسم الحي 2،3. إنتاج LV يتطلب شارك في ترنسفكأيشن الكلى الجنينية البشرية (كلوة) خلايا مع العديد من البلازميدات: ناقل نقل، هفوة التعبئة والتغليف / بول، مراجعة التعبئة والتغليف، ومغلف حويصلي فيروس التهاب الفم بروتين سكري (VSV-G) البلازميدات. تعتبر أنظمة التعبئة والتغليف الجيل الثالث أكثر أمانا من أنظمة الجيل الثاني ليتم ترميز الجينات تزيد السرعة على البلازميد التعبئة والتغليف منفصلة، ​​مما يقلل من إمكانية إعادة التركيب لإنتاج تكرار الفيروسة البطيئة المختصة. على الرغم من أن أنظمة التعبئة والتغليف الجيل الثاني المحصول الكلي خمس وحدات التنبيغ أعلى أضعاف، وانقسام الجينوم الفيروسي الأصلي لخلقانخفض نظام الجيل الثالث على مستوى تنبيغ فقط الحد الأدنى 3،4.

بينما خطوط الخلايا يمكن transduced أكثر سهولة وكفاءة، تحولت الباحثين تركيزها على الخلايا الأولية، لأن هذه هي أكثر تمثيلا في الجسم الحي الأنسجة 5،6. ومع ذلك، الخلايا الأولية مستعصية على تنبيغ. في حين تم الإبلاغ عن تنبيغ الخلايا الظهارية مجرى الهواء متباينة تماما، لم تتجاوز الكفاءة العامة 15٪ 7.

وصفت هنا هو عبارة عن بروتوكول يتيح إنتاج لفس ارتفاع عيار. ويرد نهج خطوة بخطوة لتحقيق ما يقرب من 100٪ كفاءة ترنسدوكأيشن إلى خلايا HBE الأولية. وبشكل أكثر تحديدا، يصف بروتوكول الظروف المثلى ثقافة دور أساسي للنجاح 3. لفترة وجيزة، و transfected الخلايا 293T كلوة باستخدام lentiviral pCDH ناقلات التعبير مع EF-1 المروج القيادة التعبير عن تعزيز الفلورية الخضراء بروتين (EGFP) أو mCherry، وهو بروتين أحمر فلوري، ونظام التعبئة والتغليف من الجيل الثالث. يتم جمع لفس صدر في وسائل الإعلام 24-72 ساعة في وقت لاحق. تتركز جزيئات الفيروس مع البولي ايثيلين جلايكول (PEG)، وهي طريقة مريحة وسهلة للتركيز الفيروسي، قبل تقدير عيار استخدام عدة انزيم مرتبط P24 مستضد المناعي فحص (ELISA). وفي وقت لاحق، وtransduced خلايا HBE الأولية غير متمايزة في وسائل الاعلام انتشار (القصبي متوسط ​​النمو الظهاري أو BEGM) 8، في حين يعلق (بعد أن trypsinized)، في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) عامل 4، مضيفا بروميد hexadimethrine واحتضان لمدة 16 ساعة ( بين عشية وضحاها). ثم يسمح للخلايا للتمييز. منذ يتم التعبير عن التحوير الفيروسي على المدى الطويل (باستخدام المروج المناسب، انظر المناقشة)، وسيتم الحفاظ التعبير في جميع أنحاء التمايز في ظهارة الهوائية كاذبة أو يمكن أن يتسبب (باستخدام المروج محرض) بعد التمايز.

الحمار = "jove_content"> هذا البروتوكول هو من اهتمام واسع للباحثين الذين يرغبون في استخدام خلايا HBE الأولية بدلا من خطوط الخلايا، ويمكن أن تكون قابلة للتكيف مع غيرها من الصعب تنبيغ أنواع الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. المرحلة 1: ثقافة كلوة 293T

  1. إعداد خلايا كلوة وسائل الإعلام (على النحو المشار إليه وسائل الإعلام كلوة) وذلك بإضافة 10٪ (ت / ت) مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ (ت / ت) البنسلين / الستربتومايسين إلى ارتفاع نسبة الجلوكوز Dulbecco لتعديل المتوسطة النسر (DMEM).
  2. طبقة واحدة 10 سم صحن زراعة الأنسجة مع الكولاجين الأول ميكس 30 ميكرولتر من الكولاجين أنا في 2 مل من الماء المقطر. نشر هذا المزيج على طبق واحتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  3. إزالة المزيج وترك الجافة طبق في مجلس الوزراء تدفق الصفحي لمدة 15 دقيقة.
  4. لوحة الخلايا كلوة على طبق المغلفة في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 6 خلايا في 10 مل سائل الإعلام كلوة واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  5. عندما خلايا كلوة هي 50-60٪ متكدسة (الشكل 1A، 2-3 أيام بعد الطلاء)، انتقل إلى مرحلة 2. التقييم البصري من confluency كافية. ليس هناك حاجة إلى تقدير.
    ملاحظة: خلايا كلوة يتم تربيتها في وسائل الإعلام كلوة (انظر أعلاه). عندما تصل confluency، رمهلا يمكن تقسيم (مثل 1/5) أو المجمدة أسفل لاستخدامها لاحقا.

2. المرحلة 2: الإنتاج وتركيز Lentiviruses (لفس) في خلايا كلوة

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ البروتوكولات بما يتماشى مع اللوائح المؤسسية والحكومية تحت + (تعزيز BSL-2) الأوضاع في الولايات المتحدة الأمريكية BSL-2.

  1. (كانت lipofectamine وغيرها من العوامل ترنسفكأيشن يست فعالة مثل إجراء هطول الكالسيوم) Transfect باستخدام إجراء هطول الكالسيوم. من المستحسن استخدام مجموعة ترنسفكأيشن التجارية لضمان إعادة الإنتاج، على الرغم من تعديل الإجراء على النحو التالي. تقديم جميع الكواشف إلى درجة حرارة الغرفة. هذا هو اليوم 0.
  2. لكل طبق 10 سم من خلايا HEK293، مزيج 4.5 ميكروغرام من المغلف الحمض النووي pMD2-VSVG، 7.5 ميكروغرام تغليف الحمض النووي pMDLg / pRRE، 3.75 ميكروغرام الحمض النووي pRSV-لفة، 10 ميكروغرام الحمض النووي من ناقلات التعبير lentiviral، 86 ميكرولتر من محلول 2 M الكالسيوم ، والماء المعقم في أنبوب الطرد المركزي 15 مل إلى الحجم النهائي من 700 ميكرولتر(ترد اثنين الحلول الأخيرة في عدة ترنسفكأيشن التجارية).
  3. قطرة من الحكمة، إضافة 700 ميكرولتر من مخزنة المالحة HEPES-2X (HBS، المنصوص عليها في عدة ترنسفكأيشن)، في حين vortexing ل(في مجلس الوزراء تدفق الصفحي)، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة (تنفيذ الخطوة 4 أثناء انتظار).
  4. خلال فترة الحضانة في وقت مبكر، إيداع 5 ميكرولتر من مزيج على شريحة. تحقق الحبرية تحت المجهر مع الهدف 10X، مع التركيز ببطء صعودا وهبوطا. وينبغي أن يكون راسب غرامة مرئية، مما يؤكد عملية ترسيب فوسفات الكالسيوم (الشكل 1B).
  5. توقف هطول الأمطار بعد 30 دقيقة وذلك بإضافة 10 مل من كلوة الخلايا وسائل الإعلام وماصة صعودا وهبوطا إلى المزيج.
  6. خذ طبق من خلايا كلوة من الخطوة 2.1-2.5، وإزالة المتوسطة (يوم 0). إضافة الحل راسب من الخطوة 2.5 بعناية وببطء على طول حافة الطبق.
  7. في اليوم التالي (يوم 1)، إزالة والتخلص من المتوسط ​​تحتوي على راسب واستبدالها ثإيث 10 مل من كلوة المتوسطة. تحقق من وراسب غرامة تحت المجهر: يجب أن تكون مرئية في طبق في المساحات الفارغة بين الخلايا (أرقام 1C ود).
  8. في يوم 2، وجمع وسائل الإعلام مع حقنة والتصفية من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرون في أنبوب الطرد المركزي 15 مل تحتوي على 3.8 مل من 40٪ البولي ايثيلين جلايكول (PEG) حل. عكس 5X لخلط وتخزين عند 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة (للPEG يعجل في تشكيل، ولكن لا تزيد عن 5 أيام) حتى كل من مجموعات الفيروسات هي كاملة.
  9. كرر الخطوة 2.8 في أيام 3 و 4. في يوم 4 لا تحل محل مع كلوة المتوسطة ولكن يطهر مع التبييض 10٪ وتجاهل الطبق.
  10. الطرد المركزي جميع أنابيب جمع (عادة جميع المجموعات معا في يوم 5) في 1650 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية لتكوير الفيروس. إزالة والتخلص من طاف، وتدور مرة أخرى في 1650 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية لجمع وإزالة أي المتبقية من PEG طاف.
  11. Resusيعتمدون بيليه من كل أنبوب في 200 ميكرولتر من الشعب الهوائية متوسطة النمو الظهاري (BEGM) دون أمفوتيريسين ب 8. تجمع بعضهم البعض، وقسامة في 200 ميكرولتر. فيروس مخزن في -80 درجة مئوية. قسامة من 10 ميكرولتر إضافية لأداء HIV-1 الكمامة (P24) المستضد ELISA الفحص.
  12. استخدام عدة ELISA التجارية، إجراء الفحص الجيني p24 وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. الفحص يعطي تقديرا للP24 الفيروسي في الغرام / مل.

3. المرحلة 3: خلايا الثقافة الابتدائية HBE

  1. لوحة الخلايا HBE في 10 مل BEGM وسائل الإعلام (مع 100 ميكرولتر الأمفوتريسين B إذا تم استخدام مرور 0 خلايا للقضاء على التلوث الفطري ممكن) في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 6 الخلايا في الكولاجين أنا المغلفة صحن 10 سم زراعة الأنسجة. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  2. في اليوم التالي، وإزالة المتوسطة واستبدالها مع 10 مل BEGM (مع 100 ميكرولتر الأمفوتريسين B للمرور 0 الخلايا) ليصبح المجموع 4 أيام. العودة إلى الحاضنة.
  3. بعد 4 دآيس، واستخدام BEGM فقط دون وسائل الاعلام أمفوتيريسين B. تغيير كل يوم.
  4. عندما الخلايا هي 80-90٪ متكدسة (الشكل 2A؛ ~ 7 أيام بعد الطلاء)، والمضي قدما مع التنبيغ (الالتفات إلى 3.5 لإعداد قبل تنبيغ). مرة أخرى، وتقييم البصرية من confluency كافية. ليس هناك حاجة إلى تقدير.
  5. قبل تنبيغ، معطف إدراج الدعم قابلة للاختراق مع حل الكولاجين الرابع مخففة 1/10 بالماء المقطر المعقم. إضافة 200 ميكرولتر من كل إدراج وترك بين عشية وضحاها الجاف في مجلس الوزراء تدفق الصفحي.

4. المرحلة 4: تنبيغ من خلايا HBE

  1. إزالة وسائل الإعلام، إضافة 3 مل من 0.1٪ التربسين في 1 ملم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل في الفوسفات مخزنة المالحة (EDTA / PBS)، واحتضان 5 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. الاختيار تحت المجهر (الهدف 10X) لمعرفة ما إذا كان يتم فصل كل الخلايا. إن لم يكن، والعودة إلى الحاضنة لمدة 5 دقائق إضافية.
  2. عندما يتم فصل كل الخلايا، إضافة 3مل من مثبط التربسين فول الصويا (SBTI 1 ملغ / مل)، وخلط ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. بيليه الخلايا من خلال الدوران في 460 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. إزالة طاف بيليه resuspend في 3 مل من BEGM والمضي قدما في العد.
  4. Resuspend الخلايا HBE (الآن مرور 1 أو P1) على نسبة 2 × 10 5 خلايا لكل واحد 12 ملم قابلة للاختراق إدراج الدعم في 400 ميكرولتر من BEGM (انظر الجدول 2). استقراء هذه الأرقام على أساس كمية من إدراج دعم نفاذية التي سيتم transduced.
</ tr>
سطح مساحة السطح تعداد الخلايا وسائل الإعلام حجم (وسائل الإعلام)
صحن 10 سم 52.7 سم 2 1 × 10 6 BEGM 10 مل
تصفية 12 ملم 1.13 سم 2 2 × 10 5 BEGM 400 ميكرولتر
تصفية 24 ملم 4.52 سم 2 8 × 10 5 BEGM 800 ميكرولتر

الجدول 2: وسائل الإعلام الاستقراء في عدد خلايا.

  1. باستخدام وافر من العدوى عامل (وزارة الداخلية) 4، إضافة الحجم المناسب من الفيروس إلى الخلية تعليق.
  2. إضافة بروميد hexadimethrine إلى 2 ميكروغرام / مل تركيز النهائي.
  3. الاستغناء عن 400 ميكرولتر من مزيج (BEGM، HBE الخلايا، الفيروسات وبروميد hexadimethrine) في إدراج دعم منفذة في حجرة قمي، وإضافة 1 مل من BEGM وحده إلى مقصورة basolateral. احتضان ليلا 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. خلايا دائما لوحة HBE دون الفيروسات، والتحكم واختيار اختبار بوروميسين إن وجدت.
  4. في اليوم التالي، عينيوسائل الإعلام قمي وbasolateral الامد، ويغسل مع برنامج تلفزيوني، واستبدال كل من المقصورات مع واجهة الهواء السائل (علي) وسائل الاعلام 8.
  5. عندما متموجة الخلايا، وإزالة السوائل القمي (المعروف باسم إنشاء واجهة الهواء السائل). نستمر في تغيير المتوسطة (علي) في حجرة أسفل كل يوم حتى تصل إلى مرحلة النضج الكامل. في وقت لاحق عادة 3-4 أسابيع.
    ملاحظة: إذا كان يحتوي على ناقلات lentiviral جين اختيار مثل بوروميسين، وخلايا يمكن اختيار بإضافة بوروميسين وفقا لمنحنى تركيز الاختيار. لخلايا HBE، وقد تم تحديد تركيز 1 ميكروغرام / مل لتكون مثالية لاختيار متسقة من الخلايا transduced. ومع ذلك، قد تختلف هذه تركيز للخلايا أو غيره من الظروف وينبغي أن تحدد عن طريق قتل المنحنيات. إضافة بوروميسين يمكن أن تبدأ في وقت مبكر من يوم واحد بعد أن تم استبدال وسائل الاعلام وسائل الاعلام ALI أو في وقت لاحق (2-3 أيام) للسماح للتعبير الكامل للجين الاختيار. تأكد من إضافة بوروميسين لإدراج واحد أن حكما لم يتم transduced. يمكن إضافة بوروميسين حتى تتمايز الخلايا بشكل كامل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الشكل 1 يصور الخطوات الرئيسية المختلفة لتقييم الخلايا وحلول أثناء عملية ترنسفكأيشن. الشكل 1A يظهر confluency الأمثل للخلايا HEK293T قبل ترنسفكأيشن لإنتاج الفيروس. من المهم أن يتم توزيع الخلايا بالتساوي في جميع أنحاء الطبق. 1B الشكل يكشف راسب في قطرة من خليط ترنسفكأيشن باستخدام البصريات مجال مشرق والهدف 10X. أكثر من رواسب تبدو وكأنها حبيبات الرمل بدلا من الكتل، وأكثر كفاءة ترنسفكأيشن يكون. في هذه الصورة، يعجل هو خشن بعض الشيء. يعجل هو مؤشر موثوق به سواء على ترنسفكأيشن سوف ينتج ارتفاع عيار من الفيروس. إذا كان أي من المكونات إما مفقودة أو ذات نوعية رديئة (ناقلات الحمض النووي على سبيل المثال)، والكتل، والذي بدوره هو نذير شؤم. إذا كان هذا هو الحال، فمن الحكمة لإجهاض وإعادة تشغيل الإجراء، والتأكد من أنجميع المكونات في هذا المزيج، و / أو فحص جودة من الحمض النووي والحمض النووي ناقلات التعبئة والتغليف. ويبين الشكل 1C نفس الطبق أ، بعد الحضانة بين عشية وضحاها. يعجل هو (وينبغي أن يكون) واضحة في ما بين الخلايا. لاحظنا أن الخلايا لا تتكاثر كثيرا خلال ال 24 ساعة ترنسفكأيشن التالية.

ويبين الشكل 2 كيف تبدو قبل خلايا HBE و 3 أيام بعد تنبيغ. 2A الرقم يصور ما يقرب من 80٪ متموجة خلايا HBE الأساسي قبل trypsinization وترنسدوكأيشن. طبق 10 سم في 80٪ التقاء ينتج ما يقرب من 4 × 10 6 خلايا. يبين الشكل 2B ما يقرب من 100٪ تنبيغ من خلايا غير متمايزة P1 HBE استخدام وزارة الداخلية من 4 على إدراج دعم منفذ. عندما ومطلي خلايا HBE على هذه إدراج الدعم قابلة للاختراق، وخلايا مسطحة نسبيا. على هذه الصورة، وارتفاع الخلايا ليست سوى بضعة ميكرونات وهو ما يفسر لماذا0.4 ميكرون المسام واضحة على الرغم من أن الخلايا.

ويبين الشكل 3 تجارب الأمثل المؤدي إلى بروتوكول المعروضة. وقد تم تنفيذ جميع التجارب في يثلث على الآبار أنا المغلفة الكولاجين (لوحة 24 أيضا)، مع 2 × 10 5 خلايا HBE الأولية لكل بئر. واستخدمت معظم التجارب وزارة الداخلية من 0.4 مع 2 ميكروغرام / مل تركيز النهائي من hexadimethrine bromidein سائل الإعلام BEGM. احصي الخلايا الفلورسنت بعد 3 أيام تنبيغ. على الرغم من أن التحسين الأولي للبروتوكول تم تنفيذها على البلاستيك، وقد أكدت النتائج على إدراج الدعم قابلة للاختراق. وبالإضافة إلى ذلك، يحاول تنبيغ الخلايا P1 HBE متباينة تماما لم تنجح (لا تظهر البيانات)، مما يؤكد التقارير السابقة. كما رأينا في الشكل 3A، وtransduced نسبة أعلى من خلايا HBE في وسائل الإعلام BEGM مقارنة ALI. إذا ومطلي الخلايا قبل يوم تنبيغ في وسائل الإعلام BEGM، وكفاءةوانخفضت بشكل ملحوظ مقارنة transducing في حين أن الخلايا يتم إرفاق (الشكل 3B). عندما يتم مطلي الخلايا P1 HBE قبل تنبيغ في وسائل الإعلام علي (بدلا من BEGM) في اليوم، وكفاءة تنبيغ تنخفض إلى أبعد من ذلك (لا تظهر البيانات). الفرق بين هذه الوسائط 2 هو تركيز الكالسيوم. يحتوي BEGM وسائل الإعلام على تركيز منخفض من الكالسيوم (0.1 ملم) مقارنة مع وسائل الاعلام علي (1 ملم). أشكال الكالسيوم ويحافظ على منعطفات ضيقة، وبالتالي، يمكن أن تجعل من الصعب على جزيئات الفيروس لعبور 9 و الوصول مستقبلاتها في غشاء basolateral. في الواقع، كانت بعض الالتهابات ناجحة عند مستويات منخفضة عن طريق تعطيل منعطفات ضيقة باستخدام حمض tetraacetic جلايكول الإثيلين (EGTA) على سبيل المثال 10. كما ذكر سابقا، والخلايا P1 HBE متباينة تماما والحرارية، ويمكن transduced فقط مع الكفاءة المنخفضة 5-7، والتي يمكن أن يكون راجعا إلى منعطفات ضيقة في ارتفاع الكالسيوم التي تحتوي على وسائل الاعلام. تفسير آخر لانخفاض كفاءة ترنسدوكأيشن في خلايا متمايزة تماما هي آلية النقل مخاطي هدبي نشطة حيث المخاط يمكن أن يكون بمثابة حاجز. أو، كما ذكرت من قبل بالز وآخرون، مرحلة التمايز في الخلايا التي HBE هي، هي العامل الحاسم في كفاءة تنبيغ 10. حقيقة أن أكثر من الخلايا الحصول على transduced في BEGM من وسائل الإعلام ALI يدعم هذا البيان (الشكل 3A).

كما رأينا في الشكل 3B، لوحظت زيادة ما يقرب من 50٪ من الكفاءة تنبيغ عندما تم transduced الخلايا في حين ربط بالمقارنة مع خلايا مطلي قبل اليوم. في دراستهم، ريكس وآخرون أظهرت زيادة قدرها 20٪ عندما تم إجراء التنبيغ بعد trypsinization 11. معا، وتشير هذه النتائج إلى أن وسائل الإعلام وحالة نضج الخلايا هي المفتاح لنجاح تنبيغ.

لوحة في الشكل3C، يدل hexadimethrine bromideplaying دور atrivial في كفاءة تنبيغ. ومع ذلك، يقترح استخدامها في هذا البروتوكول لأنه ليس له أي تأثير سلبي ولكن من المحتمل أن يكون مفيدا. بروميد Hexadimethrine هو البوليمر الموجبة التي يتم استخدامها في علم الفيروسات لتعزيز الكفاءة تنبيغ 12. وقد نشرت الآخرين استخدام بروتامين، وآخر الموجبة البوليمر، ولكن لم يوجد فرق كبير فيما يتعلق كفاءة ترنسدوكأيشن مقارنة hexadimethrine بروميد 13. بروميد Hexadimethrine لا يؤثر النمو ولا التمايز 14-16.

وأخيرا، تم التحقيق موييس مختلفة في الشكل 3D: سجلت أعلى كفاءة تنبيغ مع وزارة الداخلية من 4. لم يكن هناك فرق كبير بين وزارة الداخلية 0.4 و 4، ولكن وزارة الداخلية 4 transduced 100٪ من خلايا HBE في حين وزارة الداخلية 0.4 transduced فقط 75٪. تعرف وزارة الداخلية عدد فيروس الجسيمات وايليرة لبنانية لديها القدرة على إصابة خلية واحدة. هناك طرق مختلفة لتحديد وزارة الداخلية. واحد منهم هو تحديد عدد الوحدات التنبيغ (TU). باستخدام الاليزا، كمية المستضد P24 يمكن تحديد جزء من الغرام / مل. P24 الفيروسي في بيكوغرام يمكن تحويلها في TU، والتي هي ضرورية لحساب وزارة الداخلية. يتم احتساب وزارة الداخلية من خلال قسمة عدد TU من قبل عدد من الخلايا. هناك 10-100 وحدة تنبيغ (TU) في P24 بيكو غرام. وتستند جميع المراجع في النص فيما يتعلق زارة الداخلية على حسابات مع 100 TU في P24 بيكو غرام. (http://tronolab.epfl.ch/webdav/site/tronolab/shared/protocols/TUvsp24.html).

شكل 1
الشكل 1: ترنسفكأيشن من الخلايا 293T كلوة (أ) خلايا كلوة 293T نما إلى 50-60٪ confluency كما رأينا في إطار الهدف 10X. (ب) يعجل مرئية في 5 ميكرولتر انخفاض 5 دقائق بعد خلط كل reageاليلة تحت المجهر (الهدف 10X). (ج) يعجل في صحن بجانب الخلايا بعد ترنسفكأيشن بين عشية وضحاها (الهدف 10X). (د) التكبير من مركز (ج). البيضاء السهم يشير إلى يعجل. شريط مقياس = 100 ميكرون. هو نفسه بالنسبة لأ، ب، ج. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: تنبيغ الخلايا NHBE (أ) خلايا HBE نمت في الكولاجين أنا طبق المغلفة إلى 80-90٪ confluency (حوالي 4 × 10 6 خلايا) في وسائل الإعلام BEGM لمدة 5 أيام (الهدف 10X). شريط مقياس = 100 ميكرون. (ب) transduced EGFP خلايا HBE على إدراج نفاذية الدعم (12 ملم)، 3 أيام بعد تنبيغ (متحد البؤر، 20X). في هذه الحالة، HBE سل ليرة سورية مسطحة ومسام الغشاء ومرئية. مقياس شريط = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: تحسين فعالية بروتوكول التنبيغ (أ) تأثير وسائل الإعلام على كفاءة ترنسدوكأيشن. (ب) مقارنة تنبيغ في خلايا HBE مطلي قبل يوم وتنبيغ من الخلايا في حين ربط. (ج) تأثير بروميد hexadimethrine على كفاءة ترنسدوكأيشن. (د) تقييم كفاءة ترنسدوكأيشن تحسين استخدام مختلف موييس. تم إجراء تحليل باستخدام اختبار (ت) الطالب أو في كروسكال واليس ودان التجارب المقارنة متعددة. تمثل أشرطة الخطأ SE وجميع * يمثل ف <0.05.ww.jove.com/files/ftp_upload/54176/54176fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بروتوكول المذكورة هنا يؤكد ما يقرب من 100٪ من الكفاءة تنبيغ. ومع ذلك، هناك خطوات خلال العملية التي تعتبر مهمة لتحقيق هذا الهدف. على سبيل المثال، أثناء عملية ترنسفكأيشن، وجود رواسب في مزيج التنبيغ (قطرة) أو في طبق اليوم بعد تنبيغ (أرقام 1B ود) وكلاهما ذات الصلة لترنسفكأيشن جيد. غياب راسب أو وجود تكتلات ويمكن أن يعزى ذلك إلى إغفال واحدة من الكواشف ترنسفكأيشن، قضية الحموضة، أو إعداد البلازميد سيئة. إذا كان راسب مفقود، وهناك احتمال كبير أن أيا منها لن يكون مرئيا في اليوم التالي. وعلاوة على ذلك، إضافة مزيج ترنسفكأيشن أو وسائل الإعلام كلوة سريع جدا قد يسبب الخلايا كلوة لفصل، تحول دون ترنسفكأيشن والعائد. دليل آخر على عائد جيد هو في يوم 6 قبل خطوة الطرد المركزي: يجب أن تكون راسب أبيض واضح في الجزء السفلي من الأنبوب. وترنسفكأيشن سيئة مع ما يقرب منلن الفيروس لا يخلق هذا راسب أبيض. أثناء عملية تنبيغ، لا بد من استخدام خلايا HBE الأولية التي تم المتباينة دي والتي هي في الخلايا الجذعية مثل الدولة من أجل تحقيق الكفاءة تنبيغ عالية. استخدام ناقلات تحتوي على بروتين فلوري مثل EGFP أو mCherry التي تصور بسهولة يمكن أن يكون وسيلة جيدة.

يمكن إجراء تعديلات على التكيف مع هذا البروتوكول إلى الخلايا الأولية المختلفة. يمكن للمرء أن يكون النهج للحد من تركيز الكالسيوم في وسائل الإعلام. كما رأينا في الشكل 3A، وذلك باستخدام وسائل الإعلام BEGM التي تحتوي على تركيز أقل من الكالسيوم أسفرت كبيرة أعلى كفاءة ترنسدوكأيشن في خلايا HBE الأولية. وثمة نهج آخر يمكن أن يكون لزيادة وزارة الداخلية. كما هو مبين في الشكل 3D، وارتفاع وزارة الداخلية، وأفضل كفاءة ترنسدوكأيشن. ومع ذلك، وذلك باستخدام وزارة الداخلية أعلى قد تصبح سامة للبعض الخلايا.

ومع ذلك، هناك بعض limita ستعقد لهذا البروتوكول. وقد تم تطوير هذه التقنية باستخدام ممر 1 خلايا HBE. تم الحصول على الرئتين رفض لزرع بموافقة المناسبة لالمطابقة الأبحاث إلى المعايير التي وضعتها إعلان هلسنكي. يمكن الحصول على خلايا HBE الأولية من مصادر تجارية أن تكون مكلفة. هذه الخلايا عادة ما تكون أيضا متوفرة فقط في ممر العالي. لم يتم اختباره هذا البروتوكول على الممرات أعلى من 2. العوامل التي تحد آخر هو P24 ELISA مستضد الفحص. العديد من الشركات تقدم عدة ولكن بتكلفة عالية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تركيز الفيروسية التي قدمها الفحص، ليست سوى قيمة تقريبية منذ اختبار يكشف P24 P24 الفيروسة البطيئة ومجاني تم طرحه خلال ترنسفكأيشن عابر 17. لذلك، وهذا التقييم من وزارة الداخلية هو مجرد تقدير. وأخيرا، وذلك باستخدام تعبير مختلفة يبني (أكبر أو أصغر حجما) قد لا تعطي نفس النتائج. على سبيل المثال، سجلت كفاءات مختلفة باستخدام mCherry وEGFP (لا تظهر البيانات).

والأنف والحنجرة "> هناك مزايا لهذا البروتوكول خلال وسائل أخرى. واحد منهم هو عملية ترنسفكأيشن. في الواقع، يمكن أن البروتوكول المقترح تسفر هذه التتر عالية فيروس أن وسائل الإعلام التي تم جمعها تحتوي على فيروسات لن تحتاج إلى التركيز ويمكن استخدامها مباشرة إلى تنبيغ الخلايا. البولي ايثيلين جلايكول (PEG)، وتستخدم في هذا البروتوكول على التركيز فيروس، كان معروفا أن تكون سامة للخلايا الثدييات (18). وبالإضافة إلى ذلك، إذا تم استخدام أعلى وزارة الداخلية، وهذا من شأنه أن يزيد من خطر التسمم حتى أكثر من ذلك. ومع ذلك، إذا أصبحت خطوة تركيز PEG عفا عليها الزمن، الباحثون أن لم تكلل بالنجاح لتنبيغ بسبب تأثيرات سمية قد تعيد النظر في استخدام lentiviruses. ميزة أخرى لهذا البروتوكول هو عدم وجود اختلافات في الكفاءة تنبيغ على البلاستيك أو إدراج الدعم قابلة للاختراق، والاستفادة من كونها قادرة على تنبيغ على البلاستيك غير أن أقل هناك حاجة إلى خلايا وجزيئات الفيروس. ونتيجة لذلك، فإن الخلايا يمكن توسيع مشاركة التنبيغ ونقلعلى إدراج الدعم نفاذية عندما (لا تظهر البيانات) متموجة.

اختيار ناقلات يعتمد على العديد من القضايا، مثل اختيار الخلايا transduced مع بوروميسين أو التعبير عن البروتينات علامة مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP). هناك عدة ناقلات التجارية المتاحة التي هي مناسبة (pRRLsinPPT.CMV.MCS.Wpre، pCDH-EF1-MCS-IRES-بورو، pCDH-EF1-MCS-T2A-بورو، pGEM-T سهل) 15،19-21. اختيار من المروجين تحديات، حيث يتم إسكات CMV المروج التي تستخدم عادة في مجرى الهواء متباينة الخلايا الظهارية 15. للتعبير عن خلية محددة مهدبة، فمن المستحسن استخدام المروج الثعلب-J1. بدلا من ذلك، المروج EF-1 يمكن أن تستخدم للتعبير في كل خلايا الشعب الهوائية 20،21. إذا سعى overexpression البروتين، فإن حجم إدراج تحديد، في جزء منه، وكفاءة تنبيغ. ومع ذلك، وأحجام كبيرة يمكن استيعابها كما يراها تنبيغ بنجاح كامل طول أدينيليل للذوبان محلقة 2وقد نشرت 2. ومختبر عدة overexpression الناجح يبني 15،16،20-22. لshRNA التعبير (عادة تحت U6 أو مروج H1)، وبنيات متعددة يتعين استكشافها. وهذا يمكن أن تكون مملة مع الاختبارات التي أجريت في نهاية التمايز (PCR والنشاف الغربي)، ولكن هذه العملية لا يمكن اختصار منذ خلايا غير متمايزة قد لا يكون تمثيل جيد لنجاح الخلايا التي تمر التمايز. مرة أخرى، نشرت مختبر متعددة ناجحة shRNA يبني 14،20،21،23.

باستخدام هذا البروتوكول، قد تمكن من الباحثين إلى حد كبير تحسين transductions الفقيرة السابقة. قد يجد البعض أنه من المفيد لزيادة الكفاءة من خلال جعل بعض التعديلات. قد تستخدم بعض هذه الأداة لاكتشاف العمليات البيولوجية جديدة أو لتكون قادرة على إثبات المفاهيم، سواء باستخدام ضربة قاضية أو overexpression الاستراتيجيات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

نشكر الوكالة الحياة التحالف الجهاز الانتعاش من جامعة ميامي لتوفير الرئتين. كما نشكر الدكتورة ليزا Künzi لإعداد الحمض النووي المستخدمة في التجارب هو مبين في الشكل 2B و 3-D، الدكتور بن Gerovac وليزا نوفاك لفيروس mCherry المستخدمة في التجارب في الأرقام 3A إلى C. كما نشكر غابرييل Gaidosh من مرفق التصوير، قسم طب العيون في جامعة ميامي.

وقد رعت هذه الدراسة من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة، ومؤسسة التليف الكيسي ومضيفات معهد البحوث الطبية الدكتور ماتياس Salathe.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK293T/17 cells ATCC CRL-11268
Fetal bovine serum (FBS)  Sigma 12306C use at 10%
DMEM Thermo Scientific 11995-040
Penicillin/Streptomycin (100x) Thermo Scientific 15140-122 use at 1x
Collagen I BD Biosciences 354231 dilute 1:75 in distilled water
Calphos Clontech 631312 Transfection kit containing 2 M Calcium solution, 2x HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O
Polythylene glycol 8000 VWR scientific 101108-210 stock of 40%
Amphotericin B Sigma A9528 use at 1x
Trypsin Sigma T4799
Soybean trypsin inhibitor Sigma T9128
Transwell 12 mm Corning 3460
Collagen IV Sigma C7521 dilute 1:10 in distilled water
Hexadimethrine bromide Sigma H9268 stock of 2 mg/ml
Puromycin (10.000x) Thermo Scientific A11138-03 use at 1x
Alliance HIV-1 p24 ELISA PerkinElmer NEK050001KT
F12 Thermo Scientific 11765-054
pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro System Biosciences CD532A-2 lentiviral expression vector
pMD2-VSVG Addgene 12259 packaging DNA
pMDLg/pRRE Addgene 12251 packaging DNA
pRSV-rev Addgene 12253 packaging DNA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ding, B., Kilpatrick, D. L. Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons. Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).
  2. Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Jr Gene therapy progress and prospects: development of improved lentiviral and retroviral vectors--design, biosafety, and production. Gene Ther. 12, 1089-1098 (2005).
  3. Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnol. 13, (2013).
  4. Delenda, C. Lentiviral vectors: optimization of packaging, transduction and gene expression. J Gene Med. 6 Suppl 1, S125-S138 (2004).
  5. Gresch, O., Altrogge, L. Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells. Methods Mol Biol. 801, 65-74 (2012).
  6. Jordan, E. T., Collins, M., Terefe, J., Ugozzoli, L., Rubio, T. Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells. J Biomol Tech. 19, 328-334 (2008).
  7. Castillon, N., et al. Regeneration of a well-differentiated human airway surface epithelium by spheroid and lentivirus vector-transduced airway cells. J Gene Med. 6, 846-856 (2004).
  8. Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. 107, 183-206 (2005).
  9. Gonzalez-Mariscal, L., et al. Role of calcium in tight junction formation between epithelial cells. Am J Physiol. 259, C978-C986 (1990).
  10. Bals, R., et al. Transduction of well-differentiated airway epithelium by recombinant adeno-associated virus is limited by vector entry. J Virol. 73, 6085-6088 (1999).
  11. Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 17, 441-450 (2008).
  12. Davis, H. E., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 97, 159-172 (2002).
  13. Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, 341-347 (2013).
  14. Manzanares, D., et al. Functional apical large conductance, Ca2+-activated, and voltage-dependent K+ channels are required for maintenance of airway surface liquid volume. J Biol Chem. 286, 19830-19839 (2011).
  15. Schmid, A., et al. Real-time analysis of cAMP-mediated regulation of ciliary motility in single primary human airway epithelial cells. J Cell Sci. 119, 4176-4186 (2006).
  16. Unwalla, H. J., Ivonnet, P., Dennis, J. S., Conner, G. E., Salathe, M. Transforming growth factor-beta1 and cigarette smoke inhibit the ability of beta2-agonists to enhance epithelial permeability. Am J Respir Cell Mol Biol. 52, 65-74 (2015).
  17. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6, (2006).
  18. Schneiderman, S., Farber, J. L., Baserga, R. A simple method for decreasing the toxicity of polyethylene glycol in mammalian cell hybridization. Somatic Cell Genet. 5, 263-269 (1979).
  19. Schmid, A., et al. Soluble adenylyl cyclase is localized to cilia and contributes to ciliary beat frequency regulation via production of cAMP. J Gen Physiol. 130, 99-109 (2007).
  20. Manzanares, D., et al. Airway Surface Dehydration by Transforming Growth Factor beta (TGF-beta) in Cystic Fibrosis Is Due to Decreased Function of a Voltage-dependent Potassium Channel and Can Be Rescued by the Drug Pirfenidone. J Biol Chem. 290, 25710-25716 (2015).
  21. Manzanares, D., et al. IFN-gamma-mediated reduction of large-conductance, Ca2+-activated, voltage-dependent K+ (BK) channel activity in airway epithelial cells leads to mucociliary dysfunction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L453-L462 (2014).
  22. Chen, X., et al. A soluble adenylyl cyclase form targets to axonemes and rescues beat regulation in soluble adenylyl cyclase knockout mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 51, 750-760 (2014).
  23. Ransford, G. A., et al. Pannexin 1 contributes to ATP release in airway epithelia. Am J Respir Cell Mol Biol. 41, 525-534 (2009).

Tags

علم الأحياء المجهرية، العدد 113، والخلايا الظهارية القصبية الإنسان الأساسية، ناقلات lentiviral، التنبيغ، الشعب الهوائية متوسطة النمو الظهاري، الهواء السائل والمتوسطة واجهة، وافر من العدوى
الأمثل الفيروسة البطيئة إنتاج وزراعة الخلايا الشروط الضرورية لبنجاح خلايا تنبيغ الإنسان الشعبي الأساسي طلائي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baumlin-Schmid, N., Salathe, M.,… More

Baumlin-Schmid, N., Salathe, M., Fregien, N. L. Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (113), e54176, doi:10.3791/54176 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter