Abstract
In vitro kultur af primære humane bronkial epitelial (HBE) celler ved hjælp af luft-væske grænseflader giver en nyttig model til at studere de processer af luftvejene celledifferentiering og funktion. I de seneste år er anvendelsen af lentivirale vektorer til transgen levering blev almindelig praksis. Mens der er rapporter om transduktion af fuldstændigt differentierede luftvejsepitelceller med visse ikke-HIV pseudo-maskinskrevne lentivira, den samlede transduktion effektivitet er normalt mindre end 15%. Protokollen præsenteres her tilvejebringer en pålidelig og effektiv metode til at producere lentivira og at transducere primære humane bronkiale epitelceller. Brug af udifferentierede bronkiale epitelceller, transduktion i bronchieepithelceller vækstmedium, mens cellerne vedhæfte, med en infektionsmultiplicitet faktor 4 tilvejebringer effektivitet tæt på 100%. Denne protokol beskriver, trin-for-trin, forberedelse og koncentration af høj titer lentivirusvektorer og the transduktion proces. Det diskuterer de eksperimenter, der bestemmes de optimale dyrkningsbetingelser for at opnå højeffektive transduktion af primære humane bronkiale epitelceller.
Introduction
Udviklingen af replikationsdefekte, pseudotype lentivira (LV) har givet forskere med en sikker og effektiv metode til at levere transgener in vitro en. På grund af deres langsigtede ekspression, kan disse LV også anvendes til afgivelse af terapeutiske midler in vivo 2,3. Produktionen af LV kræver co-transfektion af humane embryoniske nyre (HEK) celler med flere plasmider: transfervektor, emballage gag / pol, emballage rev, og kuvert vesikulær stomatitis-virus glycoprotein (VSV-G) plasmider. Tredje generation emballeringssystemer anses sikrere end andengenerations systemer, fordi den rev-genet kodet på en separat emballage plasmid, hvorved muligheden for rekombination til frembringelse af et replikationskompetent lentivirus. Selvom andengenerations emballagesystemer giver fem gange højere samlede transduktion enheder, til opdelingen af den oprindelige virale genom skabeden tredje generation systemet er faldet niveauet for transduktion kun minimalt 3,4.
Mens cellelinjer kan transduceres nemmere og mere effektivt, har forskere flyttet deres fokus til primære celler, fordi disse er mere repræsentative for in vivo væv 5,6. Men primære celler er refraktære over for transduktion. Mens transduktion af fuldt differentierede luftvejs epitelial celler er blevet rapporteret, har den samlede effektivitet ikke oversteget 15% 7.
Beskrevet her er en protokol, der tillader produktion af høj titer LVs. En trin-for-trin tilgang er skitseret til at opnå næsten 100% transduktion effektivitet i primære HBE-celler. Mere specifikt protokollen beskriver de optimale dyrkningsbetingelser instrumentale at lykkes 3. Kort fortalt HEK 293T-celler transficeret under anvendelse af lentiviral ekspressionsvektor pCDH med EF-1a-promotoren driver ekspression af et forstærket grønt fluorescerendeprotein (eGFP) eller mCherry, et rødt fluorescerende protein, og en tredje generation pakkesystem. LVs frigives til medierne indsamles 24 til 72 timer senere. Viruspartiklerne er koncentreret med polyethylenglycol (PEG), en praktisk og nem metode til viral fusion, før titer estimation under anvendelse af et p24-antigen enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) kit. Efterfølgende udifferentierede primære HBE-celler transduceres i proliferationsmedier (bronchieepithelceller vækstmedium eller BEGM) 8, medens fastgørelse (efter at være trypsiniseret) ved en infektionsmultiplicitet (MOI) faktor 4, tilføjer hexadimethrinbromid og inkubering i 16 timer ( natten over). Cellerne får derefter lov til at differentiere. Da den virale transgen udtrykkes langsigtet (ved hjælp af passende promotor, se diskussionen), vil ekspression opretholdes under hele differentiering til en pseudostratified luftvejsepitel eller kan induceres (under anvendelse af en inducerbar promotor) efter differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Trin 1: Culture of HEK 293T
- Forbered HEK-celler medier (benævnt HEK medier) ved tilsætning af 10% (v / v) føtalt bovint serum (FBS) og 1% (v / v) penicillin / streptomycin til høj glucose Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM).
- Coat en 10 cm vævskulturskål med kollagen I. Mix 30 pi kollagen I i 2 ml destilleret vand. Spred blandingen på skålen og inkuberes i 2 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Fjern blandingen og lad skålen tørre i en laminar strømning i 15 min.
- Plade HEK-celler onto overtrukket skålen ved en densitet på 1 x 10 6 celler i 10 ml HEK medier og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2.
- Når HEK celler er 50-60% sammenflydende (figur 1a, 2-3 dage efter plating), gå videre til fase 2. Visuel vurdering af konfluens er tilstrækkelig. Der kræves ingen kvantificering.
Bemærk: HEK-celler dyrkes i HEK medier (se ovenfor). Når de flyder sammen, tHey kan opdeles (f.eks 1/5) eller frosset ned til senere brug.
2. Trin 2: Produktion og Koncentration af Lentivirus (LVs) i HEK celler
Bemærk: Protokollerne skal udføres i overensstemmelse med de institutionelle og statslige regler under BSL-2 + (forbedrede BSL-2) betingelser i USA.
- Transficere anvendelse af en calciumudfældning procedure (lipofectamin og andre transfektionsmidler, var ikke så effektivt som udfældningsprocedure calcium). Anvendelsen af et kommercielt transfektion kit anbefales at sikre reproducerbarhed, om proceduren er modificeret som følger. Lad alle reagenser til stuetemperatur. Dette er dag 0.
- For hver 10 cm skål af HEK293 celler, bland 4,5 ug konvolut DNA pMD2-VSVG, 7,5 pg emballage DNA pMDLg / pRRE, 3,75 mikrogram DNA pRSV-rev, 10 ug DNA af lentiviral ekspressionsvektor, 86 pi af en 2 M calcium løsning og sterilt vand i et 15 ml centrifugerør til et endeligt volumen på 700 pi(De to sidstnævnte løsninger er tilvejebragt i den kommercielle transfektion kit).
- Dråbevis tilsættes 700 pi 2x HEPES-bufret saltvand (HBS, tilvejebragt i transfektionskittet) medens der blev hvirvelbehandlet (i laminar strømning) og inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter (udføre trin 4, mens de venter).
- I den tidlige inkubationstid, depositum 5 pi af blandingen på et dias. Check dråben under et mikroskop med en 10X objektiv, der fokuserer langsomt op og ned. Et fint bundfald skal kunne ses, bekræfter calciumphosphatpræcipitering proces (figur 1b).
- Stop nedbør efter 30 min ved tilsætning af 10 ml af HEK celler medier og pipette op og ned for at blande.
- Tag fadet af HEK celler fra trin 2,1-2,5, og fjern mediet (dag 0). Tilføj bundfaldet løsning fra trin 2.5 forsigtigt og langsomt langs kanten af skålen.
- Den næste dag (dag 1), fjern og kassér medium, der indeholder bundfaldet og erstatte det wed 10 ml HEK medium. Tjek for den fine bundfald under lup: Det skal være synligt i skålen i tomme rum mellem cellerne (figur 1c og d).
- På dag 2, indsamle medier med en sprøjte, filtreres der gennem et 0,45 um sprøjte filter over i et 15 ml centrifugerør indeholdende 3,8 ml af en 40% polyethylenglycol (PEG) opløsning. Invert 5x at blande og opbevares ved 4 ° C i mindst 24 timer (for PEG udfældes til dannelse, men ikke længere end 5 dage), indtil alle virus samlinger er fuldført.
- Gentag trin 2.8 på dag 3 og 4. På dag 4 ikke erstatte med HEK medium men dekontamineres med 10% blegemiddel og kassér fadet.
- Centrifuger alle indsamling rør (normalt alle samlinger sammen på dag 5) ved 1650 xg i 20 min ved 4 ° C til pelletering virus. Fjern og kassér supernatanten, og spin igen ved 1650 xg i 5 min ved 4 ° C for at indsamle og fjerne enhver resterende af PEG supernatant.
- Resuspend pelleten af hvert rør i 200 pi bronchieepithelceller vækstmedium (BEGM) uden amphotericin B 8. Pool dem sammen og prøve på 200 pi. Store virus ved -80 ° C. Alikvot yderligere 10 pi at udføre HIV-1 Gag (p24) antigen ELISA-assay.
- Anvendelse af et kommercielt ELISA-kit, udføre en p24 antigen assay ifølge producentens protokol. Assayet giver et estimat af viral p24 i pg / ml.
3. Trin 3: Kultur Primær HBE Cells
- Plade HBE-celler i 10 ml BEGM medier (med 100 pi amphotericin B, hvis passage 0 celler anvendes til at fjerne eventuel svampekontamination) ved en densitet på 1 x 10 6 celler i en collagen I overtrukne 10 cm vævskulturskål. Der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2.
- Den næste dag fjernes mediet og erstattes med 10 ml BEGM (med 100 pi amphotericin B for passage 0 celler) i i alt 4 dage. Retur til inkubator.
- Efter 4 days, brug kun BEGM uden amphotericin B. Skift medier hver anden dag.
- Når cellerne er 80-90% sammenflydende (figur 2a; ~ 7 dage efter plating), fortsæt med transduktion (vær opmærksom på 3,5 til forberedelse før transduktion). Igen, visuel vurdering af konfluens er tilstrækkelig. Der kræves ingen kvantificering.
- Forud for transduktion, belægge de permeable support skær med et kollagen IV løsning fortyndet 1/10 med sterilt destilleret vand. Tilføj 200 pi til hver indsats og lad tørre natten over i laminar strømning kabinet.
4. Trin 4: transduktion af HBE Cells
- Fjern mediet, tilsættes 3 ml 0,1% trypsin i 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre i phosphatpufret saltvand (EDTA / PBS) og inkuberes 5 minutter ved 37 ° C og 5% CO2. Kontroller under mikroskop (10X objektiv) for at se, om alle celler er fritliggende. Hvis ikke, vender tilbage til inkubatoren i yderligere 5 min.
- Når alle celler er fritliggende, tilsættes 3ml sojabønnetrypsininhibitor (SBTI 1 mg / ml), bland og overfør til et 15 ml centrifugerør. Pelletere cellerne ved centrifugering ved 460 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern supernatanten og resuspender pellet i 3 ml BEGM og fortsætte med at tælle.
- Resuspender HBE-celler (nu passage 1 eller P1) i et forhold på 2 x 10 5 celler pr en 12 mm permeable support insert i 400 pi BEGM (se tabel 2). Ekstrapolere disse tal baseret på mængden af permeable support skær, der vil blive transduceret.
| Overflade | Overfladeareal | celletal | Medier | Volumen (medie) |
| 10 cm skål | 52,7 cm 2 | 1 x 10 6 | BEGM | 10 ml | </ Tr>
| 12 mm filter | 1.13 cm 2 | 2 x 10 5 | BEGM | 400 pi |
| 24 mm filter | 4.52 cm 2 | 8 x 10 5 | BEGM | 800 pi |
Tabel 2: Medier ekstrapolation pr celletal.
- Ved hjælp af en infektionsmultiplicitet (MOI) faktor 4, tilsættes en passende mængde virus til cellesuspensionen.
- Tilføj hexadimethrinbromid til en 2 ug / ml slutkoncentration.
- Dispensér 400 pi af blandingen (BEGM, HBE-celler, virus og hexadimethrinbromid) pr permeabel støtte indsatsen ind i apikale kammer, og der tilsættes 1 ml BEGM alene til den basolaterale rum. Inkuber natten over ved 37 ° C og 5% CO 2. Altid plade HBE-celler uden virus som kontrol og udvælgelse test puromycin hvis relevant.
- Den næste dag, remove apikale og basolaterale medier, vask med PBS, og erstatte begge rum med luft-væske-interface (ALI) medier 8.
- Når celler er sammenflydende, fjerne apikal væske (kendt som oprettelse en luft-væske-grænseflade). Fortsæt ændre mediet (ALI) i den nederste rum hver anden dag, indtil de når fuld modenhed; sædvanligvis 3 til 4 uger senere.
Bemærk: Hvis den lentivirale vektor indeholder et selektionsgen, såsom puromycin kan celler selekteres ved tilsætning af puromycin ifølge en markering koncentrationskurve. For HBE-celler, har en koncentration på 1 ug / ml blevet bestemt til at være ideel til konsekvent selektion af transducerede celler. Dog kan denne koncentration variere for andre celler eller forhold, og bør bestemmes ved at dræbe kurver. Tilsætning af puromycin kan starte så tidligt som en dag efter medierne er blevet erstattet af ALI medier eller senere (2-3 dage) for at tillade den fulde udtryk af udvælgelsen genet. Vær sikker på at tilføje puromycin til en indsats, der hsom ikke er blevet transduceret. Puromycin kan tilsættes indtil cellerne er fuldt differentieret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser forskellige vigtige trin til vurdering celler og løsninger under transfektionsproces. Figur 1A viser den optimale konfluens på HEK293T celler før transfektion til virusproduktion. Det er vigtigt, at cellerne er jævnt fordelt i hele skålen. Figur 1b viser bundfaldet i en dråbe af transfektionsblandingen ved hjælp af lyse felt optik og en 10X objektiv. Jo mere præcipitaterne ligne sandkorn snarere end agglomerater, vil den mere effektive transfektionen være. I dette billede, bundfaldet er en smule grov. Bundfaldet er en pålidelig indikator hvorvidt transfektion vil producere en høj titer af virus. Hvis nogen af ingredienserne enten mangler eller er af dårlig kvalitet (vektor-DNA for eksempel), vil agglomerater dannes, hvilket er et ildevarslende tegn. Hvis dette er tilfældet, er det klogere at afbryde og genstarte procedure, og sørg for, atalle ingredienser er i blandingen, og / eller kontrol af kvaliteten af vektor-DNA'et og emballering DNA. Figur 1c viser den samme skål som A, efter inkubation natten over. Bundfaldet (og bør være) synlig i mellem celler. Vi bemærkede, at cellerne ikke formere meget under 24 timer efter transfektion.
Figur 2 viser, hvordan HBE-celler ser før og 3 dage efter transduktion. Figur 2a viser ca. 80% konfluente primære HBE-celler før trypsinbehandling og transduktion. En 10 cm skål ved 80% konfluens giver ca. 4 x 10 6 celler. Figur 2b viser næsten 100% transduktion af udifferentierede P1 HBE-celler under anvendelse af en MOI på 4 på permeable support insert. Når HBE-celler udplades på disse permeable support skær er cellerne forholdsvis flad. På dette billede er højden af cellerne er kun et par mikrometer hvilket forklarer, hvorfor0,4 um porer er synlige selvom cellerne.
Figur 3 viser optimeringseksperimenter fører til den præsenterede protokol. Er udført Alle forsøg i triplikater på kollagen I overtrukne brønde (24-brønds plade), med 2 x 10 5 primære HBE-celler pr. De fleste eksperimenter anvendt en MOI på 0,4 med en 2 ug / ml endelig koncentration af hexadimethrin bromidein BEGM medier. Fluorescerende celler blev talt 3 dage efter transduktion. Selvom den indledende optimering af protokol er blevet udført på plast, har resultaterne blevet bekræftet på permeable support skær. Desuden har forsøg på at transducere fuldstændigt differentierede P1 HBE-celler lykkedes ikke (data ikke vist), hvilket bekræfter tidligere rapporter. Som det ses i figur 3a, er en højere procentdel af HBE celler transduceres i BEGM medier i forhold til ALI. Hvis cellerne udplades dagen før transduktion i BEGM medier, effektivitetener betydeligt formindsket sammenlignet med transduktion mens celler vedhæfter (figur 3b). Når P1 HBE-celler udplades dagen før transduktion i ALI medier (i stedet for BEGM), aftager transduktionseffektiviteten yderligere (data ikke vist). Forskellen mellem disse 2 medier er koncentrationen af calcium. BEGM medier indeholder en lav koncentration af calcium (0,1 mM) sammenlignet med ALI media (1 mM). Calcium former og vedligeholder tætte forbindelser, og derfor kunne gøre det vanskeligt for viruspartikler til at krydse 9 og få adgang til deres receptorer på den basolaterale membran. Faktisk nogle infektioner var vellykket på lave niveauer ved at ødelægge tight junctions ved hjælp ethylenglycol tetraeddikesyre (EGTA) for eksempel 10. Som tidligere nævnt, fuldt differentierede P1 HBE celler er refraktære og kan kun transduceres med lave virkningsgrader 5-7, hvilket kan skyldes tætte forbindelser i højt calcium holdige medier. En anden forklaring pålav transduktion effektivitet i fuldt differentierede celler er en aktiv mukociliær transport mekanisme, hvor slim kunne fungere som en barriere. Eller, som rapporteret af Bals et al., Den fase af differentiering, hvor HBE celler er, er en afgørende faktor for transduktion effektivitet 10. Det faktum, at flere celler bliver transduceres i BEGM end i ALI -medier dette udsagn (figur 3a).
Som det ses i figur 3b, blev der observeret en stigning på næsten 50% transduktionseffektivitet når cellerne blev transduceret mens fastgørelse sammenlignet med celler udpladet dagen før. I deres undersøgelse, Ricks et al. Viste en stigning på 20%, når transduktion blev udført efter trypsinbehandling 11. Sammen disse resultater tyder på, at medier og staten af modenhed af celler er nøglen til transduktion succes.
Panelet i figur3c, demonstrerer hexadimethrin bromideplaying atrivial rolle i transduktionseffektivitet. Alligevel foreslås dets anvendelse i denne protokol, da det ikke har nogen negativ virkning, men kunne potentielt være gavnlig. Hexadimethrinbromid er en kationisk polymer, der anvendes i virologi at øge transduktionseffektiviteter 12. Andre har offentliggjort anvendelsen af protamin, et andet kationisk polymer, men ingen signifikant forskel blev fundet med hensyn transduktionseffektivitet forhold til hexadimethrinbromid 13. Hexadimethrinbromid ikke påvirker vækst eller differentiering 14-16.
Endelig blev forskellige MOI undersøgt i figur 3d: det højeste transduktionseffektiviteten forekom med en MOI på 4. Der var ingen signifikant forskel mellem MOI 0,4 og 4, dog MOI 4 transduceres 100% af HBE-celler, hvorimod MOI 0.4 kun transduceret 75%. MOI definerer, hvordan mange viruspartikler will har potentiale til at inficere en celle. Der findes forskellige metoder til fastlæggelse af MOI. En af dem er at definere antallet af transduktion enheder (TU). Anvendelse af et ELISA, kan mængden af p24-antigen bestemmes i pg / ml. Viral p24 i picogram kan konverteres i TU, som er nødvendige for at beregne MOI. MOI beregnes ved at dividere antallet af TU med antallet af celler. Der er 10-100 transduktion enheder (TU) pr picogram p24. Alle henvisninger i teksten vedrørende MOI er baseret på beregninger med 100 TU per picogram p24. (Http://tronolab.epfl.ch/webdav/site/tronolab/shared/protocols/TUvsp24.html).
Figur 1:. Transfektion af HEK 293T-celler (a) HEK 293T-celler dyrket til 50-60% konfluens som set under et 10X objektiv. (B) Præcipiter synlig i en 5 pi dråbe 5 min efter blanding al ReageNTS under lup (10X objektiv). (C) udfældes i skålen ved siden af cellerne, efter overnight transfektion (10X objektiv). (D) Forstørrelse af centrum af (c). Hvid pil, der peger til udfældning. Scale bar = 100 um; er den samme for a, b, og c. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Transduktion af NHBE-celler (a) HBE-celler dyrket i en collagen I overtrukket skål til 80-90% konfluens (ca. 4 x 10 6 celler) i BEGM medier i 5 dage (10X objektiv).. Scale bar = 100 um. (B) eGFP transducerede HBE-celler på permeable support skær (12 mm), 3 dage efter transduktion (konfokal, 20X). På denne tilstand, HBE cel ls er flade og membranens porer er synlige. Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Optimering af transduktion protokol (a) Virkning af medier på transduktion effektivitet.. (B) Sammenligning af transduktion i HBE-celler udpladet dagen før og transduktion af celler, mens fastgørelse. (C) Indflydelse af hexadimethrinbromid på transduktionseffektivitet. (D) Evaluering af forbedrede transduktion effektivitet ved hjælp af forskellige MOI. Analyse blev udført under anvendelse af t-test eller Kruskal-Wallis og Dunns multiple sammenligningstest. Fejl- søjler repræsenterer SE og alle * repræsenterer p <0,05.ww.jove.com/files/ftp_upload/54176/54176fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her sikrer tæt på 100% transduktionseffektiviteter. Men der er skridt i løbet af processen, der er vigtige for at nå dette mål. For eksempel under transfektionsproces, tilstedeværelsen af præcipitater i transduktionen mix (drop) eller i skålen dagen efter transduktion (figur 1b og d) begge relevante for en god transfektion. Fraværet af et bundfald eller tilstedeværelsen af agglomerater kan skyldes en udeladelse af en af transfektionsreagenser, et pH problem, eller en dårlig plasmidpræparat. Hvis der mangler bundfaldet, er der stor sandsynlighed for, at ingen vil være synlig næste dag. Desuden tilføjer transfektion mix eller HEK medier for hurtigt kan forårsage HEK celler til at frigøre, hindre transfektion og udbytte. En anden indikation af et godt udbytte er på dag 6 før centrifugeringstrinnet: et hvidt bundfald skal være synlig i bunden af røret. En dårlig transfektion med næstenintet virus vil ikke skabe denne hvide bundfald. Under transduktion processen, er det afgørende at bruge primære HBE-celler, der er blevet de-differentierede, og som er i en stamcelle lignende tilstand for at opnå høje transduktion effektivitet. Anvendelsen af en vektor indeholdende et fluorescerende protein, såsom eGFP eller mCherry der er let visualiseres kan være et godt værktøj.
Ændringer kunne gøres for at tilpasse denne protokol til forskellige primære celler. Én fremgangsmåde ville være at reducere koncentrationen af calcium i mediet. Som det ses i figur 3a, ved hjælp BEGM medie, der indeholder en lavere koncentration af calcium i signifikant højere transduktionseffektivitet i primære HBE-celler. En anden fremgangsmåde kunne være at øge MOI. Som vist i figur 3d, jo højere MOI, jo bedre transduktionseffektivitet. ved anvendelse af en højere MOI, kan dog blive toksisk for nogle celler.
Alligevel er der nogle egrænsninger tioner til denne protokol. Denne teknik er blevet udviklet ved hjælp af passage 1 HBE-celler. Lunger afvist til transplantation blev opnået med passende samtykke til forskning i overensstemmelse med de standarder fastsat af erklæringen fra Helsinki. Opnåelse primære HBE-celler fra kommercielle kilder kan være dyrt. Disse celler er sædvanligvis også kun tilgængelige ved en højere passage. Denne protokol er ikke blevet testet på passager højere end 2. En anden begrænsende faktor er p24 ELISA-antigen assay. Flere virksomheder tilbyder sættet men til en høj pris. Derudover viral fusion afgivet assayet, er kun en omtrentlig værdi siden testen detekterer lentivirus p24 og fri p24 frigives under transient transfektion 17. Derfor er denne evaluering af MOI er kun et skøn. Endelig med forskelligt ekspressionskonstruktioner (større eller mindre i størrelse), kan ikke give de samme resultater. For eksempel blev forskellige effektiviteter registreret under anvendelse mCherry og eGFP (data ikke vist).
ent "> Der er fordele til denne protokol i forhold til andre metoder. En af dem er transfektionsproces. Faktisk kan den foreslåede protokol opnåelse sådanne høje virustitere, at de indsamlede medier indeholdende virus ikke længere vil skulle koncentreres og kunne anvendes direkte til at transducere celler. Polyethylenglycol (PEG), der anvendes i denne protokol til at koncentrere virus, har været kendt for at være giftige for pattedyrceller 18. Desuden, hvis højere MOI blev anvendt, ville det øge toksiciteten risikoen endnu mere. Men hvis PEG-koncentration skridt bliver forældet, forskere, der har været forgæves transducere skyldes toksiske virkninger måske genoverveje brugen af lentivirus. En anden fordel ved denne protokol er manglen på forskelle i transduktion effektivitet på plast eller gennemtrængelige support skær. fordelen ved at være stand til at transducere på plast er, at færre er brug celler og viruspartikler. som et resultat heraf kan cellerne ekspanderes efter transduktion og overførtpå permeable support indlæg, når sammenflydende (data ikke vist).Valget af vektorer afhænger af flere spørgsmål, såsom udvælgelse af transducerede celler med puromycin eller udtryk for markørproteiner såsom grøn fluorescerende protein (GFP). Der er flere kommercielle vektorer rådighed, der er egnede (pRRLsinPPT.CMV.MCS.Wpre, pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro, pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro, pGEM-T Easy) 15,19-21. Udvælgelse af promotorer udgør en udfordring, eftersom almindeligt anvendte CMV-promotoren er stumme i differentieret luftvejsepitelceller 15. For cilierede celle-specifikke udtryk, anbefales brug af ræven-j1 promotor. Alternativt kan den EF-1a-promotoren anvendes til ekspression i alle luftvejs celler 20,21. Hvis der søges protein overekspression, vil størrelsen af insertet bestemme, delvis transduktionseffektivitet. Imidlertid kan store størrelser rummes som set af vellykket transduktion af fuldlængde opløseligt adenylylcyclase 22 .Den lab har udgivet flere succesrige overekspression konstruerer 15,16,20-22. For shRNA udtryk (som regel under U6 eller H1 promotor), vil flere konstruktioner skulle udforskes. Dette kan være trættende med tests udført i slutningen af differentiering (PCR og western blotting), men processen kan ikke forkortes, da ikke-opdelte celler ikke kan være en god repræsentation af succes for celler, der undergår differentiering. Igen har laboratoriet offentliggjort flere vellykkede shRNA konstruktioner 14,20,21,23.
Ved hjælp af denne protokol, kan flere forskere være aktiveret til en betydelig forbedring tidligere dårlige transduktioner. Nogle vil måske finde det nyttigt at øge effektiviteten ved at foretage et par justeringer. Nogle vil måske bruge dette værktøj til at opdage nye biologiske processer eller kunne bevise koncepter, både ved hjælp af Knockdown eller overekspression strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker Life Alliance Organ Recovery Agency fra University of Miami for at levere lungerne. Vi takker også Dr. Lisa Künzi for DNA præparat, der anvendes til forsøgene er vist i figur 2B og 3-D, Dr. Ben Gerovac og Lisa Novak for mCherry virus anvendt til forsøgene i figur 3A til C. Vi takker også Gabriel Gaidosh fra imaging facilitet, Institut for Oftalmologi ved University of Miami.
Denne undersøgelse er blevet sponsoreret af tilskud fra NIH, CF Foundation og stewardesse Medical Research Institute til Dr. Matthias Salathe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | 12306C | use at 10% |
| DMEM | Thermo Scientific | 11995-040 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Thermo Scientific | 15140-122 | use at 1x |
| Collagen I | BD Biosciences | 354231 | dilute 1:75 in distilled water |
| Calphos | Clontech | 631312 | Transfection kit containing 2 M Calcium solution, 2x HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O |
| Polythylene glycol 8000 | VWR scientific | 101108-210 | stock of 40% |
| Amphotericin B | Sigma | A9528 | use at 1x |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Transwell 12 mm | Corning | 3460 | |
| Collagen IV | Sigma | C7521 | dilute 1:10 in distilled water |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | stock of 2 mg/ml |
| Puromycin (10.000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | use at 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 | lentiviral expression vector |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | packaging DNA |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | packaging DNA |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | packaging DNA |
References
- Ding, B., Kilpatrick, D. L. Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons. Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).
- Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Jr Gene therapy progress and prospects: development of improved lentiviral and retroviral vectors--design, biosafety, and production. Gene Ther. 12, 1089-1098 (2005).
- Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnol. 13, (2013).
- Delenda, C. Lentiviral vectors: optimization of packaging, transduction and gene expression. J Gene Med. 6 Suppl 1, S125-S138 (2004).
- Gresch, O., Altrogge, L. Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells. Methods Mol Biol. 801, 65-74 (2012).
- Jordan, E. T., Collins, M., Terefe, J., Ugozzoli, L., Rubio, T. Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells. J Biomol Tech. 19, 328-334 (2008).
- Castillon, N., et al. Regeneration of a well-differentiated human airway surface epithelium by spheroid and lentivirus vector-transduced airway cells. J Gene Med. 6, 846-856 (2004).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. 107, 183-206 (2005).
- Gonzalez-Mariscal, L., et al. Role of calcium in tight junction formation between epithelial cells. Am J Physiol. 259, C978-C986 (1990).
- Bals, R., et al. Transduction of well-differentiated airway epithelium by recombinant adeno-associated virus is limited by vector entry. J Virol. 73, 6085-6088 (1999).
- Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 17, 441-450 (2008).
- Davis, H. E., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 97, 159-172 (2002).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, 341-347 (2013).
- Manzanares, D., et al. Functional apical large conductance, Ca2+-activated, and voltage-dependent K+ channels are required for maintenance of airway surface liquid volume. J Biol Chem. 286, 19830-19839 (2011).
- Schmid, A., et al. Real-time analysis of cAMP-mediated regulation of ciliary motility in single primary human airway epithelial cells. J Cell Sci. 119, 4176-4186 (2006).
- Unwalla, H. J., Ivonnet, P., Dennis, J. S., Conner, G. E., Salathe, M. Transforming growth factor-beta1 and cigarette smoke inhibit the ability of beta2-agonists to enhance epithelial permeability. Am J Respir Cell Mol Biol. 52, 65-74 (2015).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6, (2006).
- Schneiderman, S., Farber, J. L., Baserga, R. A simple method for decreasing the toxicity of polyethylene glycol in mammalian cell hybridization. Somatic Cell Genet. 5, 263-269 (1979).
- Schmid, A., et al. Soluble adenylyl cyclase is localized to cilia and contributes to ciliary beat frequency regulation via production of cAMP. J Gen Physiol. 130, 99-109 (2007).
- Manzanares, D., et al. Airway Surface Dehydration by Transforming Growth Factor beta (TGF-beta) in Cystic Fibrosis Is Due to Decreased Function of a Voltage-dependent Potassium Channel and Can Be Rescued by the Drug Pirfenidone. J Biol Chem. 290, 25710-25716 (2015).
- Manzanares, D., et al. IFN-gamma-mediated reduction of large-conductance, Ca2+-activated, voltage-dependent K+ (BK) channel activity in airway epithelial cells leads to mucociliary dysfunction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L453-L462 (2014).
- Chen, X., et al. A soluble adenylyl cyclase form targets to axonemes and rescues beat regulation in soluble adenylyl cyclase knockout mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 51, 750-760 (2014).
- Ransford, G. A., et al. Pannexin 1 contributes to ATP release in airway epithelia. Am J Respir Cell Mol Biol. 41, 525-534 (2009).
