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Biology

इष्टतम Lentivirus उत्पादन और सेल संस्कृति शर्तों के लिए आवश्यक सफलतापूर्वक transduce प्राथमिक मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं

Published: July 22, 2016 doi: 10.3791/54176
Automatic Translation
1, 1, 2
1Division of Pulmonary, Allergy, Critical Care, and Sleep Medicine, University of Miami, Miller School of Medicine, 2Department of Cell Biology, University of Miami, Miller School of Medicine

Abstract

प्राथमिक मानव ब्रोन्कियल उपकला (HBe) कोशिकाओं हवा तरल इंटरफेस की स्थिति एक उपयोगी मॉडल का उपयोग प्रदान करता है एयरवे सेल भेदभाव और समारोह की प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो संस्कृति में। पिछले कुछ वर्षों में, ट्रांस्जीन प्रसव के लिए lentiviral वैक्टर का उपयोग आम बात बन गई। जबकि वहाँ कुछ गैर एचआईवी छद्म टाइप lentiviruses के साथ पूरी तरह से विभेदित एयरवे उपकला कोशिकाओं के पारगमन की खबरें हैं, कुल मिलाकर पारगमन क्षमता आम तौर पर कम से कम 15% है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक विश्वसनीय और कारगर तरीका lentiviruses का उत्पादन करने और प्राथमिक मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं transduce को प्रदान करता है। , Undifferentiated ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं, ब्रोन्कियल उपकला विकास मीडिया में पारगमन का उपयोग 4 के संक्रमण के कारक की बहुलता के साथ, जबकि कोशिकाओं देते हैं 100% के करीब क्षमता प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल का वर्णन है, कदम-दर-कदम, तैयारी और उच्च अनुमापांक lentiviral वैक्टर और वीं की एकाग्रताई पारगमन की प्रक्रिया। यह प्रयोगों है कि इष्टतम संस्कृति की स्थिति निर्धारित की प्राथमिक मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं की अत्यधिक कुशल transductions को प्राप्त करने की चर्चा है।

Introduction

प्रतिकृति-दोषपूर्ण, छद्म lentiviruses के विकास (एल.वी.) विट्रो 1 में ट्रांसजीन वितरित करने के लिए एक सुरक्षित और कारगर तरीका शोधकर्ताओं के साथ प्रदान की गई है। उनके दीर्घकालिक अभिव्यक्ति के कारण, इन एल.वी. भी विवो 2,3 में चिकित्सीय एजेंट के वितरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एल.वी. का उत्पादन कई plasmids के साथ मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) कोशिकाओं के सह अभिकर्मक की आवश्यकता है: हस्तांतरण वेक्टर, पैकेजिंग झूठ / पोल, पैकेजिंग फिरना, और vesicular stomatitis वायरस ग्लाइकोप्रोटीन (VSV जी) plasmids लिफाफा। तीसरी पीढ़ी के पैकेजिंग सिस्टम दूसरी पीढ़ी प्रणालियों की तुलना में सुरक्षित माना जाता है क्योंकि फिरना जीन एक अलग पैकेजिंग प्लाज्मिड पर इनकोडिंग है, जिससे पुनर्संयोजन की संभावना एक प्रतिकृति सक्षम lentivirus उत्पादन करने के लिए कम करने। हालांकि दूसरी पीढ़ी पैकेजिंग सिस्टम उपज पांच गुना अधिक कुल पारगमन इकाइयों, मूल वायरल जीनोम का विभाजन पैदा करने के लिएतीसरी पीढ़ी प्रणाली केवल न्यूनतम 3,4 पारगमन के स्तर में कमी आई है।

सेल लाइनों और अधिक आसानी से और कुशलता से transduced किया जा सकता है, शोधकर्ताओं, प्राथमिक कोशिकाओं के लिए उनके ध्यान स्थानांतरित कर दिया है, क्योंकि इन विवो के अधिक प्रतिनिधि ऊतकों 5,6 हैं। हालांकि, प्राथमिक कोशिकाओं पारगमन को आग रोक रहे हैं। जबकि पूरी तरह से भेदभाव कर एयरवे उपकला कोशिकाओं के पारगमन सूचित किया गया है, समग्र दक्षता 15% 7 को पार नहीं किया है।

यहाँ वर्णित एक प्रोटोकॉल है कि उच्च अनुमापांक LVS के उत्पादन की अनुमति देता है। एक कदम-दर-कदम दृष्टिकोण प्राथमिक HBE कोशिकाओं में लगभग 100% पारगमन दक्षता हासिल करने के लिए दिए गए है। अधिक विशेष रूप से, प्रोटोकॉल 3 सफल होने के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई इष्टतम संस्कृति की स्थिति का वर्णन है। संक्षेप में, HEK 293T कोशिकाओं EF-1 प्रमोटर बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट की ड्राइविंग अभिव्यक्ति के साथ lentiviral अभिव्यक्ति वेक्टर pCDH का उपयोग कर रहे हैं ट्रांसफ़ेक्टप्रोटीन (EGFP) या mCherry, एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन, और एक तीसरी पीढ़ी पैकेजिंग प्रणाली। मीडिया में जारी LVS बाद में 24 से 72 घंटा के लिए एकत्र कर रहे हैं। वायरस कणों एक पी 24 प्रतिजन एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) किट का उपयोग कर अनुमापांक अनुमान से पहले, पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी), वायरल एकाग्रता के लिए एक सुविधाजनक और आसान विधि के साथ केंद्रित कर रहे हैं। बाद में, undifferentiated प्राथमिक HBE कोशिकाओं, प्रसार मीडिया (ब्रोन्कियल उपकला मध्यम विकास या BEGM) 8 में transduced रहे हैं, जबकि संक्रमण की बहुलता पर (trypsinized किए जाने के बाद) संलग्न, (MOI) 4 के कारक, hexadimethrine ब्रोमाइड जोड़ने और 16 घंटे के लिए incubating ( रातोंरात)। कोशिकाओं तो अंतर करने के लिए अनुमति दी जाती है। चूंकि वायरल ट्रांस्जीन लंबी अवधि व्यक्त किया जाता है (उचित प्रमोटर का उपयोग कर, चर्चा देखें), अभिव्यक्ति या एक pseudostratified एयरवे उपकला में भेदभाव भर में बनाए रखा जाएगा भेदभाव के बाद (एक inducible प्रमोटर का उपयोग) प्रेरित किया जा सकता है।

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Protocol

1. चरण 1: HEK 293T की संस्कृति

  1. HEK कोशिकाओं मीडिया तैयार उच्च ग्लूकोज Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के लिए 10% (वी / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% (वी / वी) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़कर (HEK मीडिया के रूप में कहा गया है)।
  2. कोट एक 10 सेमी कोलेजन मैं मिक्स 30 आसुत जल के 2 मिलीलीटर में मैं कोलेजन की μl के साथ टिशू कल्चर पकवान। डिश पर मिश्रण बिखरा हुआ है और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटा और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं।
  3. मिश्रण निकालें और 15 मिनट के लिए एक लामिना का प्रवाह कैबिनेट में पकवान सूखी।
  4. 10 मिलीलीटर HEK मीडिया में 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं के घनत्व पर लेपित पकवान पर थाली HEK कोशिकाओं और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और 5% सीओ 2।
  5. HEK कोशिकाओं 50-60% मिला हुआ (चित्रा 1 ए, 2-3 दिनों चढ़ाना के बाद) कर रहे हैं, चरण के लिए 2. confluency के दृश्य मूल्यांकन के लिए पर्याप्त है आगे बढ़ना। कोई मात्रा का ठहराव की जरूरत है।
    नोट: HEK कोशिकाओं HEK मीडिया में सुसंस्कृत हैं (ऊपर देखें)। जब वे confluency तक पहुँचने, टीअरे विभाजित किया जा सकता है (उदाहरण के 1/5) या बाद में उपयोग के लिए नीचे जमे हुए।

2. स्टेज 2: HEK कोशिकाओं में उत्पादन और lentiviruses (LVS) की एकाग्रता

नोट: प्रोटोकॉल बीएसएल 2 अमरीका में + (बढ़ाया बीएसएल -2) की शर्तों के तहत संस्थागत और सरकारी नियमों के साथ लाइन में निष्पादित किया जाना चाहिए।

  1. एक कैल्शियम वर्षा प्रक्रिया का उपयोग कर Transfect (lipofectamine और अन्य अभिकर्मक एजेंटों कैल्शियम वर्षा प्रक्रिया के रूप में के रूप में कुशल नहीं थे)। एक वाणिज्यिक अभिकर्मक किट के उपयोग, reproducibility को आश्वस्त करने की सिफारिश की है, हालांकि प्रक्रिया के रूप में संशोधित किया गया है। कमरे के तापमान पर सभी अभिकर्मकों लाओ। इस दिन 0 है।
  2. HEK293 कोशिकाओं में से प्रत्येक 10 सेमी पकवान के लिए, मिश्रण लिफाफा डीएनए pMD2-VSVG के 4.5 माइक्रोग्राम, 7.5 माइक्रोग्राम पैकेजिंग डीएनए / pMDLg pRRE, 3.75 माइक्रोग्राम डीएनए pRSV-फिरना, lentiviral अभिव्यक्ति वेक्टर के 10 माइक्रोग्राम डीएनए, एक 2 एम कैल्शियम समाधान के 86 μl , और 700 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में बाँझ पानी(बाद के दो समाधान वाणिज्यिक अभिकर्मक किट में प्रदान की जाती हैं)।
  3. बूंद के लिहाज से, 700 (अभिकर्मक किट में एचबीएस) 2x HEPES बफर खारा के μl (लामिना का प्रवाह कैबिनेट में), जबकि vortexing जोड़ने के लिए और 30 मिनट (देर इंतज़ार कर रहे चरण 4 प्रदर्शन) के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  4. जल्दी ऊष्मायन समय के दौरान, एक स्लाइड पर मिश्रण की जमा 5 μl। एक 10x उद्देश्य के साथ एक खुर्दबीन के नीचे छोटी बूंद की जाँच करें, धीरे-धीरे ऊपर और नीचे ध्यान दे। एक ठीक वेग दिखाई जानी चाहिए, कैल्शियम फास्फेट वर्षा प्रक्रिया की पुष्टि (चित्रा 1 बी)।
  5. मिश्रण करने के लिए HEK कोशिकाओं मीडिया और पिपेट ऊपर और नीचे के 10 मिलीलीटर जोड़कर 30 मिनट के बाद वर्षा बंद करो।
  6. कदम 2.1-2.5 से HEK कोशिकाओं के पकवान ले लो, और मध्यम (0 दिन) को हटा दें। पकवान के किनारे के साथ सावधानी से और धीरे से 2.5 कदम से वेग समाधान जोड़ें।
  7. अगले दिन (1 दिन) को हटाने और वेग युक्त मध्यम त्यागने और यह w की जगहHEK माध्यम की ith 10 मिलीलीटर। माइक्रोस्कोप के तहत ठीक वेग लिए जाँच करें: यह कोशिकाओं (आंकड़े -1 सी और डी) के बीच खाली स्थान में डिश में दिखाई जानी चाहिए।
  8. 2 दिन, एक सिरिंज, फिल्टर एक 0.45 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से एक 40% पॉलीथीन ग्लाइकोल के 3.8 मिलीलीटर (खूंटी) समाधान युक्त एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में मीडिया के साथ इकट्ठा। पलटना 5x 4 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण करने के लिए और दुकान में कम से कम 24 घंटे के लिए (के लिए खूंटी के लिए फार्म का वेग, लेकिन 5 दिनों की तुलना में नहीं रह गया है) वायरस संग्रह के सभी जब तक पूरा कर रहे हैं।
  9. दिन 3 और 4 के 4 दिन पर दोहराएँ कदम 2.8 HEK मध्यम के साथ की जगह नहीं है, लेकिन 10% ब्लीच के साथ शुद्ध करना और पकवान त्यागें।
  10. अपकेंद्रित्र सभी संग्रह 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 1650 XG पर ट्यूब (आमतौर पर एक साथ 5 दिन पर सभी संग्रह) वायरस गोली। निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और फिर से इकट्ठा करने और खूंटी सतह पर तैरनेवाला के किसी भी शेष दूर करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1650 XG पर स्पिन।
  11. ResusPend amphotericin बी 8 बिना ब्रोन्कियल उपकला मध्यम विकास (BEGM) के 200 μl में प्रत्येक ट्यूब की गोली। उन्हें एक साथ पूल और 200 μl में विभाज्य। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर वायरस। एचआईवी -1 चुप (पी 24) प्रतिजन एलिसा परख प्रदर्शन करने के लिए एक अतिरिक्त 10 μl विभाज्य।
  12. एक वाणिज्यिक एलिसा किट का उपयोग करना, निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक पी 24 प्रतिजन परख करते हैं। परख स्नातकोत्तर / एमएल में वायरल पी 24 के एक अनुमान देता है।

3. चरण 3: संस्कृति प्राथमिक HBE प्रकोष्ठों

  1. 10 मिलीलीटर BEGM मीडिया में प्लेट HBE कोशिकाओं को एक कोलेजन मैं 10 सेमी टिशू कल्चर पकवान लेपित में 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं के घनत्व पर (100 μl amphotericin बी के साथ पारित होने के 0 कोशिकाओं संभव फंगल प्रदूषण को खत्म करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं)। 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और 5% सीओ 2।
  2. अगले दिन, मध्यम हटाने और 4 दिनों की कुल के लिए (0 कोशिकाओं पारित होने के लिए 100 μl amphotericin बी) के साथ 10 मिलीलीटर BEGM के साथ बदलें। इनक्यूबेटर पर लौटें।
  3. बाद 4 डीays, हर दूसरे दिन बिना मीडिया amphotericin बी बदलें केवल BEGM का उपयोग करें।
  4. कोशिकाओं 80-90% मिला हुआ (चित्रा 2A; ~ 7 दिन चढ़ाना के बाद) कर रहे हैं, पारगमन के साथ आगे बढ़ना (पारगमन से पहले तैयारी के लिए 3.5 पर ध्यान देना)। फिर, confluency के दृश्य मूल्यांकन के लिए पर्याप्त है। कोई मात्रा का ठहराव की जरूरत है।
  5. पारगमन के लिए पहले, कोट एक कोलेजन चतुर्थ समाधान के साथ पारगम्य समर्थन सम्मिलित बाँझ आसुत जल के साथ 1/10 पतला। प्रत्येक डालने के लिए 200 μl जोड़ें और लामिना का प्रवाह कैबिनेट में सूखे रात भर करते हैं।

4. स्टेज 4: HBE प्रकोष्ठों के पारगमन

  1. मीडिया निकालें, फॉस्फेट बफर खारा (EDTA / पीबीएस) में 1 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड में 0.1% trypsin के 3 मिलीलीटर जोड़ने और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट और 5% सीओ 2 सेते हैं। माइक्रोस्कोप (10X उद्देश्य) के तहत की जाँच करें देखने के लिए अगर सभी कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं। यदि नहीं, तो एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में लौटने।
  2. जब सभी कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं, 3 जोड़नेसोयाबीन trypsin अवरोध की मिलीलीटर (SBTI 1 मिलीग्राम / एमएल), मिश्रण और एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब को हस्तांतरण। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 460 XG पर कताई द्वारा गोली कोशिकाओं।
  3. BEGM के 3 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली निकालें और उनकी गिनती के साथ आगे बढ़ना।
  4. BEGM के 400 μl (2 टेबल देखें) में एक 12 मिमी पारगम्य समर्थन डालने के प्रति 2 एक्स 10 5 कोशिकाओं के अनुपात में Resuspend HBE कोशिकाओं (अब मार्ग 1 या P1)। इन पारगम्य समर्थन सम्मिलित करता है कि transduced किया जाएगा की राशि के आधार पर संख्या एक्सट्रपलेशन।
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सतह सतह क्षेत्र कोशिका गिनती मीडिया मात्रा (मीडिया)
10 सेमी पकवान 52.7 सेमी 2 1 एक्स 10 6 BEGM 10 मिलीलीटर
12 मिमी फिल्टर 1.13 सेमी 2 2 एक्स 10 5 BEGM 400 μl
24 मिमी फिल्टर 4.52 सेमी 2 8 x 10 5 BEGM 800 μl

तालिका 2: कोशिकाओं की संख्या प्रति मीडिया एक्सट्रपलेशन।

  1. 4 के संक्रमण (MOI) कारक की बहुलता का प्रयोग, सेल निलंबन के लिए वायरस का उचित मात्रा में जोड़ें।
  2. एक 2 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता के लिए hexadimethrine ब्रोमाइड जोड़ें।
  3. शिखर डिब्बे में मिश्रण प्रति पारगम्य समर्थन डालने (BEGM, HBE कोशिकाओं, वायरस और hexadimethrine ब्रोमाइड) के 400 μl बांटना, और basolateral डिब्बे में अकेला BEGM के 1 मिलीलीटर जोड़ें। नियंत्रण और परीक्षण puromycin चयन यदि लागू रूप में वायरस के बिना 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2. हमेशा प्लेट HBE कोशिकाओं में रात भर सेते हैं।
  4. अगले दिन, रेम परove शिखर और basolateral मीडिया, पीबीएस के साथ धोने, और हवा तरल इंटरफेस (अली) मीडिया 8 के साथ दोनों डिब्बों की जगह।
  5. जब कोशिकाओं मिला हुआ हैं, शिखर तरल पदार्थ (एक हवा तरल इंटरफेस की स्थापना के रूप में जाना जाता है) को हटा दें। नीचे डिब्बे हर दूसरे दिन में मध्यम (अली) को बदलने जारी रखें जब तक वे पूरी परिपक्वता तक पहुँचने; आमतौर पर 3 से 4 हफ्ते बाद।
    नोट: lentiviral वेक्टर ऐसे puromycin के रूप में एक चयन जीन होता है, कोशिकाओं एक चयन एकाग्रता की अवस्था के अनुसार puromycin जोड़कर चुना जा सकता है। HBE कोशिकाओं के लिए, 1 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता transduced कोशिकाओं के अनुरूप चयन के लिए आदर्श होने के लिए निर्धारित किया गया है। बहरहाल, यह एकाग्रता अन्य कक्षों या स्थितियों के लिए अलग हो सकता है और घटता की हत्या से निर्धारित किया जाना चाहिए। puromycin के अतिरिक्त के रूप में जल्दी के रूप में एक दिन शुरू कर सकते हैं के बाद मीडिया बाद में अली मीडिया या (2-3 दिन) द्वारा प्रतिस्थापित किया गया चयन जीन की पूर्ण अभिव्यक्ति की अनुमति है। एक डालने कि एच के लिए puromycin जोड़ना सुनिश्चित करेंके रूप में transduced नहीं किया गया। जब तक कोशिकाओं को पूरी तरह भेदभाव कर रहे हैं puromycin जोड़ा जा सकता है।

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Representative Results

चित्रा 1 अभिकर्मक प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं और समाधान का आकलन करने के विभिन्न महत्वपूर्ण कदम दर्शाया गया है। 1a चित्रा वायरस उत्पादन के लिए अभिकर्मक के लिए पहले HEK293T कोशिकाओं का इष्टतम confluency पता चलता है। यह महत्वपूर्ण है। यह है कि कोशिकाओं के पकवान भर में समान रूप से वितरित कर रहे हैं चित्रा 1 बी उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाशिकी और एक 10x उद्देश्य का उपयोग अभिकर्मक मिश्रण की एक बूंद में वेग का पता चलता है। अधिक अवक्षेप agglomerates रेत अनाज के बजाय की तरह लग रही है, और अधिक कुशल अभिकर्मक होगा। इस तस्वीर में, वेग एक सा मोटे है। वेग एक विश्वसनीय संकेत है कि क्या अभिकर्मक वायरस का एक उच्च अनुमापांक का उत्पादन होगा। तो सामग्री के किसी भी या तो गुम या खराब गुणवत्ता (उदाहरण के लिए वेक्टर डीएनए) की है, agglomerates बनेगी, जो एक अशुभ संकेत है। यदि यह मामला है, यह गर्भपात और प्रक्रिया को पुनः आरंभ करने के लिए समझदार है, कि सुनिश्चित कर रही हैसभी अवयवों मिश्रण में हैं, और / या वेक्टर डीएनए और पैकेजिंग डीएनए की गुणवत्ता की जाँच। चित्रा -1 सी ए के रूप में एक ही थाली से पता चलता रात ऊष्मायन के बाद। वेग है (और) किया जाना चाहिए कोशिकाओं के बीच में दिख रहा है। हमने देखा है कि कोशिकाओं को 24 घंटा के बाद अभिकर्मक के दौरान ज्यादा गुणा नहीं है।

चित्रा 2 से पता चलता है कि कैसे HBE कोशिकाओं से पहले देखो और पारगमन। चित्रा 2A के बाद 3 दिन लगभग 80% मिला हुआ प्राथमिक HBE कोशिकाओं trypsinization और पारगमन के लिए पहले दर्शाया गया है। 80% संगम पर एक 10 सेमी पकवान लगभग 4 x 10 6 कोशिकाओं पैदावार। चित्रा 2 बी पारगम्य समर्थन डालने पर 4 के MOI का उपयोग कर undifferentiated P1 HBE कोशिकाओं के लगभग 100% पारगमन पता चलता है। HBE कोशिकाओं इन पारगम्य समर्थन सम्मिलित करता है पर चढ़ाया जाता है, कोशिकाओं अपेक्षाकृत फ्लैट हैं। इस तस्वीर पर, कोशिकाओं की ऊंचाई केवल कुछ माइक्रोन जो बताते हैं कि क्यों है0.4 माइक्रोन pores हालांकि कोशिकाओं दिखाई दे रहे हैं।

चित्रा 3 अनुकूलन प्रस्तुत प्रोटोकॉल के लिए अग्रणी प्रयोगों से पता चलता है। सभी प्रयोगों 2 एक्स 10 5 में अच्छी तरह से प्रति प्राथमिक HBE कोशिकाओं के साथ, कोलेजन मैं लेपित कुओं (24 अच्छी तरह से थाली) पर triplicates में प्रदर्शन किया गया है। अधिकांश प्रयोगों एक 2 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम hexadimethrine की BEGM मीडिया bromidein एकाग्रता के साथ 0.4 के MOI इस्तेमाल किया। फ्लोरोसेंट कोशिकाओं 3 दिन पारगमन के बाद गिना रहे थे। हालांकि प्रोटोकॉल की प्रारंभिक अनुकूलन प्लास्टिक पर प्रदर्शन किया गया है, परिणाम पारगम्य समर्थन सम्मिलित करता है पर इस बात की पुष्टि की है। इसके अलावा, पिछली रिपोर्टों की पुष्टि, पूरी तरह से अलग-अलग P1 HBE कोशिकाओं transduce को सफल नहीं हुए प्रयास करता है (नहीं दिखाया डेटा)। जैसा कि चित्र 3 ए में देखा, HBE कोशिकाओं के एक उच्च प्रतिशत अली की तुलना में BEGM मीडिया में transduced रहे हैं। कोशिकाओं BEGM मीडिया में पारगमन पहले दिन चढ़ाया जाता है, तो दक्षताकाफी जबकि कोशिकाओं (चित्रा 3 बी) संलग्न कर रहे हैं transducing की तुलना में कमी आई है। P1 HBE कोशिकाओं अली मीडिया (BEGM के बजाय) में पारगमन पहले दिन चढ़ाया जाता है, पारगमन दक्षता और आगे भी कम हो जाती है (डेटा) नहीं दिखाया। इन 2 मीडिया के बीच के अंतर को कैल्शियम की एकाग्रता है। BEGM मीडिया कैल्शियम (0.1 मिमी) अली मीडिया (1 मिमी) की तुलना में कम एकाग्रता है। कैल्शियम रूपों और तंग जंक्शनों को बनाए रखता है और इसलिए, यह मुश्किल बना सकता है वायरस कणों 9 पार और basolateral झिल्ली पर उनके रिसेप्टर्स का उपयोग करने के लिए। वास्तव में, कुछ संक्रमण उदाहरण 10 के लिए एथिलीन ग्लाइकोल tetraacetic एसिड (EGTA) का उपयोग कर तंग जंक्शनों में खलल न डालें से कम स्तर पर सफल रहे थे। जैसा कि पहले कहा, पूरी तरह से अलग-अलग P1 HBE कोशिकाओं आग रोक रहे हैं और केवल कम क्षमता 5-7, उच्च कैल्शियम युक्त मीडिया में तंग जंक्शनों के कारण हो सकता है जो साथ ट्रांसड्यूस जा सकता है। के लिए एक और स्पष्टीकरणपूरी तरह से विभेदित कोशिकाओं में कम पारगमन क्षमता एक सक्रिय mucociliary परिवहन व्यवस्था जहां बलगम एक बाधा के रूप में कार्य कर सकता है। या, के रूप में Bals एट अल। द्वारा रिपोर्ट, भेदभाव की अवस्था है जिसमें HBE कोशिकाओं रहे हैं, पारगमन क्षमता 10 के एक निर्धारण कारक है। तथ्य यह है कि अधिक कोशिकाओं अली मीडिया की तुलना में BEGM में transduced हो इस बयान (चित्रा 3 ए) का समर्थन करता है।

जैसा कि चित्र 3 बी में देखा है, लगभग 50% पारगमन क्षमता की वृद्धि हुई है जब कोशिकाओं जबकि कोशिकाओं की तुलना में संलग्न transduced थे मनाया गया दिन पहले चढ़ाया। जब पारगमन trypsinization 11 के बाद किया गया था उनके अध्ययन में, रिक्स एट अल। 20% की वृद्धि देखी गई। साथ में, इन परिणामों का सुझाव है कि मीडिया और कोशिकाओं की परिपक्वता के राज्य पारगमन सफलता की कुंजी है।

चित्रा में पैनल-3 सी, यह दर्शाता है hexadimethrine पारगमन दक्षता में atrivial भूमिका bromideplaying। फिर भी, इसके उपयोग इस प्रोटोकॉल में सुझाव दिया है, क्योंकि यह कोई नकारात्मक प्रभाव पड़ता है लेकिन संभावित रूप से लाभप्रद हो सकता है। Hexadimethrine ब्रोमाइड एक cationic बहुलक कि पारगमन क्षमता को बढ़ाने के लिए 12 विषाणु विज्ञान में प्रयोग किया जाता है। दूसरों protamine, एक और cationic बहुलक के उपयोग को प्रकाशित किया है, लेकिन कोई महत्वपूर्ण अंतर पारगमन दक्षता के बारे में पाया गया था की तुलना में hexadimethrine ब्रोमाइड के लिए 13। Hexadimethrine ब्रोमाइड विकास और न ही भेदभाव 14-16 को प्रभावित नहीं करता।

अंत में, अलग-अलग MOIs चित्रा 3 डी में जांच की गई: उच्चतम पारगमन दक्षता 4. के MOI के साथ हुई MOI 0.4 और 4 के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर था, लेकिन, moi 4 जबकि MOI 0.4 HBE कोशिकाओं की 100% transduced केवल 75% transduced। MOI को परिभाषित करता है कि कितने वायरस वाई कणोंसंभावित एक कोशिका को संक्रमित करने के लिए होगा। वहाँ अलग अलग तरीकों MOI निर्धारित करने के लिए कर रहे हैं। उनमें से एक पारगमन इकाइयों (टीयू) की संख्या को परिभाषित करने के लिए है। एक एलिसा का उपयोग करना, पी 24 प्रतिजन की राशि स्नातकोत्तर / एमएल में निर्धारित किया जा सकता है। picograms में वायरल पी 24 टीयू, जो MOI गणना करने के लिए आवश्यक हैं में परिवर्तित किया जा सकता है। MOI कोशिकाओं की संख्या से टीयू की संख्या से विभाजित करके गणना की है। वहाँ 10-100 पारगमन इकाइयों (टीयू) picogram पी 24 के अनुसार कर रहे हैं। MOI के बारे में पाठ में सभी संदर्भ picogram पी 24 प्रति 100 टीयू के साथ गणना पर आधारित हैं। (Http://tronolab.epfl.ch/webdav/site/tronolab/shared/protocols/TUvsp24.html)।

आकृति 1
चित्रा 1:। HEK 293T कोशिकाओं के अभिकर्मक (क) HEK 293T कोशिकाओं के रूप में एक 10x उद्देश्य के तहत देखा 50-60% confluency हो गई। (ख) सभी Reage मिश्रण के बाद एक 5 μl बूंद 5 मिनट में दिखाई वेगमाइक्रोस्कोप (10X उद्देश्य) के तहत एनटीएस। (ग), कोशिकाओं के बगल में डिश में वेग रात भर अभिकर्मक (10X उद्देश्य) के बाद। (घ) (ग) के केंद्र की बढ़ाई। सफेद तीर ओर इशारा करते हुए वेग। स्केल बार = 100 माइक्रोन; के लिए ए, बी, और सी ही है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: NHBE कोशिकाओं के पारगमन (क) HBE कोशिकाओं 5 दिनों के लिए BEGM मीडिया में 80-90% confluency (लगभग 4 x 10 6 कोशिकाओं) (10X उद्देश्य) के लिए एक कोलेजन मैं लेपित पकवान में हो।। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (ख) EGFP पारगम्य समर्थन सम्मिलित करता है (12 मिमी), 3 दिनों के बाद पारगमन (confocal, 20X) पर HBE कोशिकाओं transduced। इस राज्य में HBE सेल रास फ्लैट हैं और झिल्ली के pores दिखाई दे रहे हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: पारगमन प्रोटोकॉल का अनुकूलन (क) पारगमन दक्षता पर मीडिया का प्रभाव।। (ख) HBE कोशिकाओं में पारगमन की तुलना एक दिन पहले और कोशिकाओं के पारगमन चढ़ाया जबकि संलग्न। (ग) पारगमन दक्षता पर hexadimethrine ब्रोमाइड का प्रभाव। (घ) विभिन्न MOIs के प्रयोग से उन्नत पारगमन क्षमता का मूल्यांकन। विश्लेषण छात्र की टी परीक्षण या Kruskal वालिस और डन एकाधिक तुलना परीक्षण का उपयोग किया गया था। त्रुटि सलाखों एसई प्रतिनिधित्व करते हैं और सभी * प्रतिनिधित्व पी <0.05।ww.jove.com/files/ftp_upload/54176/54176fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

प्रोटोकॉल यहाँ उल्लिखित 100% पारगमन क्षमता के करीब का आश्वासन दिया। हालांकि, वहाँ है कि इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं की प्रक्रिया के दौरान कदम उठाए हैं। उदाहरण के लिए, अभिकर्मक प्रक्रिया के दौरान, पारगमन मिश्रण में अवक्षेप की उपस्थिति (ड्रॉप) या डिश में पारगमन (आंकड़े 1 बी और डी) के बाद दिन एक अच्छा अभिकर्मक के लिए दोनों प्रासंगिक हैं। एक वेग या agglomerates की उपस्थिति के अभाव अभिकर्मक अभिकर्मकों में से एक की एक चूक, पीएच मुद्दा है, या एक बुरा प्लाज्मिड तैयारी की वजह से हो सकता है। वेग याद आ रही है, तो वहाँ एक उच्च संभावना है कि कोई भी दिखाई अगले दिन किया जाएगा। इसके अलावा, बहुत तेजी से अभिकर्मक मिश्रण या HEK मीडिया जोड़ने, HEK कोशिकाओं को अलग करने के लिए कारण हो सकता है अभिकर्मक और उपज निरोधक। एक अच्छी उपज का एक और संकेत centrifugation कदम से पहले 6 दिन पर है: एक सफेद वेग ट्यूब के नीचे में दिखाई जानी चाहिए। लगभग साथ एक बुरा अभिकर्मककोई वायरस इस सफेद वेग पैदा नहीं होगा। पारगमन की प्रक्रिया के दौरान, यह प्राथमिक HBE कोशिकाओं किया गया है कि डे के भेदभाव और उस आदेश में उच्च पारगमन क्षमता हासिल करने के लिए राज्य की तरह एक स्टेम सेल में हैं का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक वेक्टर ऐसे EGFP या mCherry के रूप में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन है कि आसानी से कल्पना की है युक्त का उपयोग एक अच्छा साधन हो सकता है।

संशोधनों के विभिन्न प्राथमिक कोशिकाओं को इस प्रोटोकॉल के अनुकूल बनाया जा सकता है। एक दृष्टिकोण मीडिया में कैल्शियम एकाग्रता को कम करने के लिए किया जाएगा। चित्रा 3 ए में देखा, BEGM मीडिया है कि कैल्शियम की कम एकाग्रता प्राथमिक HBE कोशिकाओं में महत्वपूर्ण उच्च पारगमन दक्षता के परिणामस्वरूप होता है का उपयोग कर के रूप में। एक और दृष्टिकोण MOI बढ़ाने के लिए हो सकता है। चित्रा 3 डी, उच्च MOI, बेहतर पारगमन दक्षता में दिखाया गया है। हालांकि, एक उच्च MOI का उपयोग कर कुछ कोशिकाओं को विषाक्त हो सकता है।

फिर भी, वहाँ कुछ limita हैं इस प्रोटोकॉल के लिए माहौल। इस तकनीक मार्ग 1 HBE कोशिकाओं का उपयोग कर विकसित किया गया है। प्रत्यारोपण के लिए खारिज कर दिया फेफड़े मानकों हेलसिंकी की घोषणा से स्थापित करने के लिए अनुसंधान अनुरूप करने के लिए उचित सहमति से प्राप्त किया गया। वाणिज्यिक स्रोतों से प्राथमिक HBE कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए महंगा हो सकता है। इन कोशिकाओं को आमतौर पर भी एक उच्च पारित होने पर ही उपलब्ध हैं। इस प्रोटोकॉल 2. से अधिक मार्ग पर परीक्षण नहीं किया गया है और एक सीमित कारक पी 24 एलिसा प्रतिजन परख है। कई कंपनियों ने किट लेकिन उच्च कीमत पर प्रदान करते हैं। इसके अलावा, परख द्वारा दिए गए वायरल एकाग्रता, केवल एक अनुमानित मूल्य परीक्षण के बाद से lentivirus पी 24 और नि: शुल्क पी 24 क्षणिक अभिकर्मक 17 के दौरान जारी का पता लगाता है। इसलिए, MOI के इस मूल्यांकन केवल एक अनुमान है। अंत में, अलग अभिव्यक्ति का उपयोग constructs (बड़ा या आकार में छोटे) एक ही परिणाम नहीं दे सकता है। उदाहरण के लिए, अलग-अलग क्षमता mCherry और EGFP (डेटा नहीं दिखाया गया है) का उपयोग कर दर्ज किया गया।

ईएनटी "> वहाँ अन्य तरीकों पर इस प्रोटोकॉल के लिए लाभ कर रहे हैं। उनमें से एक अभिकर्मक प्रक्रिया है। वास्तव में, प्रस्तावित प्रोटोकॉल इस तरह के उच्च वायरस titers है कि एकत्र मीडिया वायरस युक्त नहीं रह केंद्रित करने की आवश्यकता होगी उपज कर सकते हैं और इस्तेमाल किया जा सकता सीधे transduce के लिए कोशिकाओं। पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी), इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल वायरस ध्यान केंद्रित करने, स्तनधारी कोशिकाओं 18 को विषाक्त हो ज्ञात किया गया है। इसके अलावा, अगर उच्च MOI इस्तेमाल किया गया, इस विषाक्तता जोखिम भी अधिक वृद्धि होगी। हालांकि, यदि खूंटी एकाग्रता कदम अप्रचलित हो जाता है, शोधकर्ताओं ने कहा कि असफल रहा है transduce के लिए विषाक्तता प्रभाव के कारण lentiviruses के उपयोग पर पुनर्विचार हो सकता है। इस प्रोटोकॉल का एक अन्य लाभ प्लास्टिक या पारगम्य समर्थन सम्मिलित करता है पर पारगमन क्षमता में मतभेद की कमी है। होने का लाभ प्लास्टिक पर transduce करने में सक्षम है कि कम कोशिकाओं और वायरस कणों की जरूरत है। नतीजतन, कोशिकाओं पोस्ट पारगमन का विस्तार किया जा सकता है और स्थानांतरित कर दिया हैपारगम्य समर्थन सम्मिलित करता है पर जब मिला हुआ (डेटा) नहीं दिखाया।

वैक्टर के चुनाव ऐसे हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के रूप में इस तरह के puromycin या मार्कर प्रोटीन की अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसड्यूस कक्षों के चयन के रूप में कई मुद्दों पर निर्भर करता है। वहाँ कई वाणिज्यिक उपलब्ध है कि उपयुक्त (pRRLsinPPT.CMV.MCS.Wpre, pCDH-EF1-एमसीएस IRES-Puro, pCDH-EF1-एमसीएस-T2A-Puro, pGEM टी आसान) 15,19-21 हैं वैक्टर हैं। के बाद से आमतौर पर इस्तेमाल किया सीएमवी प्रमोटर भेदभाव एयरवे उपकला कोशिकाओं 15 में खामोश है प्रमोटरों का चयन, चुनौती बन गया है। रोमक सेल विशिष्ट अभिव्यक्ति के लिए, लोमड़ी-J1 प्रमोटर के उपयोग की सिफारिश की है। वैकल्पिक रूप से, EF-1 प्रमोटर सभी एयरवे कोशिकाओं 20,21 में अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रोटीन overexpression की मांग की है, तो डालने के आकार का निर्धारण करेगा, भाग, पारगमन दक्षता में। हालांकि, बड़े आकार के रूप में पूर्ण लंबाई घुलनशील adenylyl साइक्लेज 2 का सफल पारगमन द्वारा देखा समायोजित किया जा सकता2 व्याप्ति प्रयोगशाला प्रकाशित किया है कई सफल overexpression 15,16,20-22 निर्माण करती है। shRNA अभिव्यक्ति (आमतौर पर U6 या एच 1 प्रमोटर के तहत) के लिए, कई निर्माणों का पता लगाया जा होगा। यह भेदभाव (पीसीआर और पश्चिमी सोख्ता) के अंत में किया परीक्षण के साथ कठिन हो सकता है, लेकिन जब से गैर विभेदित कोशिकाओं भेदभाव के दौर से गुजर कोशिकाओं के लिए सफलता का एक अच्छा प्रतिनिधित्व नहीं हो सकता प्रक्रिया संक्षिप्त नहीं किया जा सकता। फिर, प्रयोगशाला प्रकाशित किया है कई सफल shRNA 14,20,21,23 निर्माण करती है।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, अधिक शोधकर्ताओं काफी पिछले गरीब transductions में सुधार करने के लिए सक्षम हो सकता है। कुछ लोग इसे उपयोगी कुछ समायोजन करके क्षमता बढ़ाने के लिए मिल सकता है। कुछ नए जैविक प्रक्रियाओं की खोज करने के लिए इस उपकरण का उपयोग कर सकते हैं या अवधारणाओं साबित करने के लिए, दोनों पछाड़ना या overexpression रणनीतियों का उपयोग कर सकता है।

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Acknowledgments

हम फेफड़ों प्रदान करने के लिए मियामी विश्वविद्यालय के लाइफ एलायंस अंग रिकवरी एजेंसी धन्यवाद। हम यह भी डीएनए चित्रा 2 बी और 3-डी, सी के लिए आंकड़े 3 ए में प्रयोगों के लिए इस्तेमाल mCherry वायरस के लिए डॉ बेन Gerovac और लिसा नोवाक में दिखाया प्रयोगों के लिए इस्तेमाल तैयारी के लिए डॉ लिसा Künzi धन्यवाद हम भी गेब्रियल Gaidosh धन्यवाद इमेजिंग सुविधा से, मियामी विश्वविद्यालय में नेत्र विज्ञान विभाग।

इस अध्ययन एनआईएच, सीएफ फाउंडेशन और उड़ान परिचर चिकित्सा अनुसंधान संस्थान डॉ मथायस Salathe करने से अनुदान द्वारा प्रायोजित किया गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK293T/17 cells ATCC CRL-11268
Fetal bovine serum (FBS)  Sigma 12306C use at 10%
DMEM Thermo Scientific 11995-040
Penicillin/Streptomycin (100x) Thermo Scientific 15140-122 use at 1x
Collagen I BD Biosciences 354231 dilute 1:75 in distilled water
Calphos Clontech 631312 Transfection kit containing 2 M Calcium solution, 2x HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O
Polythylene glycol 8000 VWR scientific 101108-210 stock of 40%
Amphotericin B Sigma A9528 use at 1x
Trypsin Sigma T4799
Soybean trypsin inhibitor Sigma T9128
Transwell 12 mm Corning 3460
Collagen IV Sigma C7521 dilute 1:10 in distilled water
Hexadimethrine bromide Sigma H9268 stock of 2 mg/ml
Puromycin (10.000x) Thermo Scientific A11138-03 use at 1x
Alliance HIV-1 p24 ELISA PerkinElmer NEK050001KT
F12 Thermo Scientific 11765-054
pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro System Biosciences CD532A-2 lentiviral expression vector
pMD2-VSVG Addgene 12259 packaging DNA
pMDLg/pRRE Addgene 12251 packaging DNA
pRSV-rev Addgene 12253 packaging DNA

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References

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सूक्ष्म जीव विज्ञान अंक 113 प्राथमिक मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं lentiviral वेक्टर पारगमन ब्रोन्कियल उपकला मध्यम विकास हवा तरल इंटरफेस मध्यम संक्रमण की बहुलता
इष्टतम Lentivirus उत्पादन और सेल संस्कृति शर्तों के लिए आवश्यक सफलतापूर्वक transduce प्राथमिक मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं
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Baumlin-Schmid, N., Salathe, M.,… More

Baumlin-Schmid, N., Salathe, M., Fregien, N. L. Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (113), e54176, doi:10.3791/54176 (2016).

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