Abstract
호흡기 세포 분화 및 기능의 처리를 연구하는 유용한 모델을 공기 - 액체 계면 상태를 제공하여 기본 인간 기관지 상피 (HBE) 세포의 시험 관내 배양한다. 지난 몇 년 동안, 유전자 전달에 대한 렌티 바이러스 벡터의 사용은 일반적인 관행이되었다. 특정 비 HIV 의사 입력 렌티 완전히 분화 된기도 상피 세포의 형질 도입의보고가 있지만, 전체의 전달 효율이 일반적으로 15 % 미만이다. 여기에 제시된 프로토콜은 신뢰할 수 있고 효율적인 방법 렌티 바이러스를 제조하고,이 차 인간 기관지 상피 세포를 형질 도입하기를 제공한다. 세포가 부착하는 동안 4 감염 인자의 다양성과 함께, 미분화 기관지 상피 세포, 기관지 상피 성장 배지에서 형질을 사용하여 100 %에 가까운 효율을 제공한다. 이 프로토콜은, 단계적으로 높은 역가 렌티 바이러스 벡터 및 제의 제조와 농도를 설명전자 전달 방법. 이는 일차 인간 기관지 상피 세포 transductions 고효율을 달성하기 위해 최적 배양 조건을 결정 실험을 설명한다.
Introduction
복제 결함, pseudotyped 렌티 바이러스의 개발 (LV)는 관내 1 유전자를 전달하기 위해 안전하고 효율적인 방법으로 연구자를 제공하고 있습니다. 그들의 장기 표현이 LV는 또한 생체 내에서 2,3- 치료제의 전달을 위해 사용될 수있다. LV의 생산은 여러 플라스미드 인간 배아 신장 (HEK) 세포의 공동 - 형질 필요 전이 벡터 포장 개그 / 폴, 포장의 회전을하고, 수 포성 구내염 바이러스 당 단백질 (VSV-G) 플라스미드 봉투. 레브 유전자하여 복제 가능 렌티 바이러스를 생산하는 재조합의 가능성을 감소시키는, 별도의 패키징 플라스미드 인코딩되기 때문에 제 3 세대 포장 시스템은 제 2 세대 시스템보다 안전한 것으로 간주된다. 2 세대 포장 시스템 다섯 배 더 높은 총 전달 유닛을 수득하지만, 원래의 바이러스 게놈의 분할 만드는3 세대 시스템은 최소한 3,4- 전달 레벨이 감소하고있다.
세포주를보다 쉽고 효율적으로 형질 도입 될 수 있지만 이러한 생체 더 대표는 5,6 어떤 조직이 있기 때문에, 연구자들은 일차 전지에 그들의 초점을 이동하고있다. 그러나, 일차 전지는 전달하는 내화물이다. 완전히 분화 된기도 상피 세포의 형질 도입이보고되었지만, 전체 효율은 15 % 7을 초과하지 않았다.
높은 역가의 정맥 주사의 생산을 가능하게하는 프로토콜은 여기에 설명한다. 단계별 접근법은 기본 HBE 세포로 거의 100 % 형질 도입 효율을 달성하기 위해 설명된다. 구체적으로는, 프로토콜은 3 성공 쓸모 최적 배양 조건을 설명한다. 간단히, HEK의 293T 세포는 향상된 녹색 형광의 EF-1 프로모터 구동 식으로 렌티 바이러스 발현 벡터 pCDH를 사용하여 형질단백질 (eGFP는) mCherry 또는 적색 형광 단백질, 및 제 3 세대의 패키징 시스템. 미디어에 발표 정맥 주사 이후 24 시간 (72)에 수집된다. 바이러스 입자는 P24 항원의 효소 면역 분석법 (ELISA) 키트를 사용하여 역가를 추정하기 전에, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 바이러스의 농도를 더욱 간편한 방법에 집중된다. 4 (MOI) 인자 감염 다중도에서 (트립신 처리 후)에 부착하는 동안 계속해서, 미분화 차 HBE 셀 (hexadimethrine 브로마이드를 첨가하고, 16 시간 동안 배양하고, 증식 배지 (기관지 상피 성장 배지 또는 BEGM) (8)에 형질 도입되고 밤새). 세포는 분화 할 수있다. 바이러스 유전자는 (설명을 참조 적절한 프로모터를 사용하는) 장기간 발현되므로, 발현은 pseudostratified기도 상피 세포로의 분화에 걸쳐 유지된다 또는 분화 후 (유도 성 프로모터를 사용하여) 유도 될 수있다.
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Protocol
1. 1 단계 : HEK 293T의 문화
- 고 글루코스 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)에 10 % (v / v)의 소 태아 혈청 (FBS), 1 % (v / v)의 페니실린 / 스트렙토 마이신을 첨가하여 (HEK 매체로 칭함) HEK 세포 매체를 준비한다.
- 코트 콜라겐 콜라겐 I. 믹스 30 μL I 증류수 2 ㎖에 한 10cm 조직 배양 접시. 접시에 믹스를 확산하고 37 ° C에서 2 시간 5 % CO 2 품어.
- 믹스를 제거하고 15 분 동안 층류 캐비닛의 접시를 건조하게 할 수 있습니다.
- HEK 10 ㎖ 배지에서 1 × 106 세포의 밀도로 피복 된 접시 상에 플레이트 HEK 세포를 37 ℃에서 배양한다, 5 % CO 2.
- HEK 세포 (2~3일 도금 후 그림 1a) 50-60% 합류 경우, 포화 상태의 2 비주얼 평가를 충분한되는 무대로 진행합니다. 어떤 정량화가 필요하지 않습니다.
참고 : HEK 세포 (위 참조) HEK 미디어에서 배양한다. 그들이 포화 상태에 도달 t헤이 분할 (예 : 1/5) 또는 나중에 사용하기 위해 아래로 고정 할 수 있습니다.
2. 2 단계 : HEK 세포의 생산 및 렌티 (정맥 주사)의 농도
참고 : 프로토콜은 BSL-2 미국에서 + (강화 BSL-2) 조건에서 기관 및 정부 규제에 맞춰 실행해야합니다.
- 칼슘 침전 절차를 사용하여 형질 (리포 펙 타민과 다른 형질 에이전트는 칼슘 침전 절차와 효율적하지 않았다). 다음과 같은 절차가 변경 되더라도 상업 형질 전환 키트의 사용은, 재현성을 보장하는 것이 좋습니다. 실온에 모든 시약을 가져와. 이 날 0입니다.
- HEK293 세포의 각 10cm 접시를 들어, 봉투 DNA pMD2 - VSVG의 4.5 μg의 7.5 μg의 DNA pMDLg / pRRE을 포장, 3.75 μg의 DNA pRSV 반전, 렌티 바이러스 발현 벡터의 10 μg의 DNA, 2 M 칼슘 용액 86 μl를 혼합 및 700 ㎕의 최종 부피로 15 mL의 원심 분리 튜브 내의 멸균(후자의 두 솔루션은 상업 형질 전환 키트에 제공된다).
- 현명한 드롭 (트랜 키트에 HBS) 배 HEPES 완충 식염수 700 ㎕를 (층류 캐비닛) 텍싱하면서 추가하고 30 분 (기다리는 동안 4 단계를 수행)을 실온에서 품어.
- 초기 배양 시간 동안, 슬라이드에 믹스의 예금 5 μL. 천천히 위아래로 초점을 10 배 목표와 현미경으로 액체 방울을 확인합니다. 미세한 침전물은 인산 칼슘 침전 방법을 확인하는 표시한다 (도 1B).
- 혼합하는 상하 HEK 세포 미디어와 피펫 10 ㎖를 첨가하여 30 분 후 침전를 중지합니다.
- 단계 2.1-2.5에서 HEK 세포의 접시를 타고와 매체 (0 일)을 제거합니다. 접시의 가장자리를 따라 조심스럽게 천천히 단계 2.5에서 침전물 솔루션을 추가합니다.
- 다음날 (1 일)에서 분리하고, 침전물을 함유하는 배지를 버리고 승 대체HEK 배지 10 ㎖ 번째. 현미경 미세 침전물 확인 : 그것은 세포 (도 1C 및 d) 사이의 빈 공간에 접시에 볼 수 있어야합니다.
- 제 2 일에, 40 %의 폴리에틸렌 글리콜 3.8 ㎖ (PEG) 용액을 함유하는 15 mL의 원심 분리 튜브에 0.45 ㎛의 주사기 필터를 통해 주사기, 필터 매체를 수집한다. 합니다 (PEG가 형성 침전,하지만 더 이상 오일보다 용) 바이러스 컬렉션의 모든 때까지 완료 반전 5 배는 최소 24 시간 동안 4 ℃에서 혼합하지 않고 저장합니다.
- 일 3 일 4 4. 단계를 반복 2.8 HEK 매체를 대체하지만 10 %의 표백제로 오염을 제거하고 요리를 폐기하지 않습니다.
- 4 ° C에서 20 분 동안 1,650 XG에 원심 분리기 모든 컬렉션 튜브 (함께 5 일에 일반적으로 모든 컬렉션) 바이러스 펠렛합니다. 제거하고 뜨는을 폐기하고, 수집 및 PEG 상등액의 나머지를 제거하기 위해 4 ° C에서 5 분 동안 1,650 XG에 다시 스핀.
- ResusPEND 암포 테리 신 B (8)가없는 기관지 상피 성장 배지 (BEGM) 200 ㎕를 각 튜브의 펠렛. 함께 수영장과 200 μL에서 나누어지는. -80 ° C에서 보관 바이러스. 에이즈-1 개그 (P24) 항원 ELISA 분석을 수행하기 위해 추가로 10 μl를 나누어지는.
- 시판 ELISA 키트를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 P24 항원 분석을 수행한다. 분석은 pg / ml 인에서 바이러스 P24의 추정치를 제공합니다.
3. 3 단계 : 문화 차 HBE 세포
- 10 ㎖ BEGM 매체에 플레이트 HBE 세포 I은 10cm 조직 배양 접시 코팅 콜라겐 1 × 106 세포의 밀도로 (100 μL 암포 테리 신 B와 통로 0 세포 수 진균의 오염을 제거하기 위해 사용되는 경우). 37 ° C에서 품어 5 % CO 2.
- 다음날, 배지를 제거하고 사일 총 (100 μL 통로 암포 테리 신 B와 0 세포)를 10 ㎖ BEGM 교체. 인큐베이터로 돌아갑니다.
- 4 D 후,AYS는 매일 암포 테리 신 B를 변경 매체없이 만 BEGM를 사용합니다.
- 세포가 80-90% 합류 (그림 2a; ~ 칠일 도금 후) 때, 전달 진행 (전달하기 전에 준비를 위해 3.5에주의). 또, 포화 상태의 시각적 평가는 충분하다. 어떤 정량화가 필요하지 않습니다.
- 전달에 앞서, 외투 콜라겐 IV 용액 투과성지지 인서트는 멸균 증류수로 1/10 희석 하였다. 각 삽입에 200 μl를 추가하고 층류 캐비닛 건조 하룻밤을 할 수 있습니다.
4. 4 단계 : HBE 세포의 형질 도입
- 용지를 꺼내 인산염 완충 생리 식염수 (EDTA / PBS)에 1 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 0.1 % 트립신 3 ㎖를 추가하고 37 ° C에서 5 분 5 % CO 2를 품어. 모든 세포가 분리되어 있는지 확인하기 위해 현미경 (10X 목적)에서 확인하십시오. 그렇지 않은 경우, 추가로 5 분 동안 인큐베이터로 돌아갑니다.
- 모든 세포가 분리되는 경우 (3)을 추가대두 트립신 억제제 ㎖ (SBTI 1 ㎎ / ㎖)을 혼합하고 15 mL의 원심 분리 튜브에 이송. 실온에서 5 분 동안 460 XG에서 회전하여 세포 펠렛.
- BEGM 3 ㎖에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거하고 계수를 진행합니다.
- BEGM 400 μL (표 2 참조)에서 하나 12mm 투과성지지 인서트 당 2 × 105 세포의 비율로 재현 탁 HBE 세포 (이제 통로 1 P1). 형질한다 투과성지지 인서트의 양에 기초하여 이들 숫자를 추정.
| 표면 | 표면적 | 세포 수 | 미디어 | 볼륨 (미디어) |
| 10cm 접시 | 52.7 cm (2) | 1 × 10 (6) | BEGM | 10 ml의 | </ TR>
| 12mm 필터 | 1.13 cm (2) | 2 × 10 5 | BEGM | 400 μL |
| 24mm 필터 | 4.52 cm (2) | 8 × 105 | BEGM | 800 μL |
표 2 : 세포 수에 따라 미디어 외삽.
- (4)의 감염 (MOI) 계수의 다양성을 이용하여 세포 현탁액으로 바이러스가 적절한 볼륨.
- 2 μg의 / ml의 최종 농도 hexadimethrine 브로마이드를 추가합니다.
- 꼭대기 실에 투과 지원 인서트 당 믹스 (BEGM, HBE 세포, 바이러스 및 hexadimethrine 브로마이드) 400 μl를 분배하고, 기저 구획에 혼자 BEGM 1 ㎖를 추가합니다. 제어 및 테스트 퓨로 마이신 선택 (해당하는 경우)와 같은 바이러스없이 37 ° C, 5 % CO 2. 항상 판 HBE 세포에서 밤새 품어.
- 다음 날, REM 수면에비켜 혀끝과 기저 미디어, PBS로 세척하고, 공기 - 액체 인터페이스 (ALI) 미디어 8 두 구획을 교체합니다.
- 세포가 컨 플루 언트 될 때, (공기 - 액체 계면을 확립라고도 함) 꼭대기 유체를 제거한다. 그들은 완전한 성숙에 도달 할 때까지 바닥 구획 매일의 매체 (ALI)를 변경 계속; 보통 3 ~ 4 주 후.
주 : 렌티 바이러스 벡터는 퓨로 마이신과 같은 선별 유전자를 포함하는 경우, 세포를 선택 농도 곡선에있어서, 퓨로 마이신을 첨가하여 선택 될 수있다. HBE 세포, 1 μg의 / ml의 농도가 형질 도입 된 세포의 선택 일치 이상적인 것으로 결정되었다. 그러나,이 농도는 다른 세포 또는 조건과 다를 수 있습니다 곡선을 살해에 의해 결정되어야한다. 미디어가 선택 유전자의 전체 표현을 할 수 있도록 나중에 ALI 미디어 또는 (2-3 일)로 대체 한 후 퓨로 마이신의 추가는 이른로 하루를 시작하세요. 하나의 삽입 그 시간에 퓨로 마이신을 추가해야합니다같은 형질 도입되지 않았다. 세포가 완전히 분화까지 퓨로 마이신이 첨가 될 수있다.
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Representative Results
도 1은도 1a. 형질 감염 과정 셀 솔루션을 평가하는 다른 주요 단계를 도시 전에 바이러스 생산을위한 형질 전환에 HEK293T 세포의 최적의 포화 상태를 나타낸다. 이는 세포가 접시에 걸쳐 균등하게 분배하는 것이 중요하다.도 1b는 명 시야 광학계 및 10X 대물 렌즈를 이용하여 형질 전환 혼합물의 드롭 침전물을 보여주고있다. 더 많은 침전물이 모래 입자가 아닌 덩어리처럼, 더 효율적인 형질이 될 것입니다. 이 그림에서, 침전물 비트 조대하다. 침전물 형질 감염 바이러스의 높은 역가를 생성할지 여부를 신뢰성 지표이다. 재료 중 하나가 누락되거나 품질이 좋지 않은 (예를 들어 벡터 DNA) 중 하나 인 경우, 응집은 불길한 기호 인 형성 할 것이다. 이 경우, 그 확인하고, 중단하고 절차를 다시 현명모든 성분이 혼합에, 및 / 또는 벡터 DNA 포장 DNA의 품질을 검사. 하룻밤 배양 후, 1C은 동일한 접시 나타낸다. 침전물 (그리고해야한다) 세포 사이에 표시. 우리는 세포가 24 시간 다음 형질 동안 많은 증식하지 않는 것으로 나타났습니다.
HBE 세포가 이전에보고 전달. 그림 2a 후 3 일 트립신 및 전달하기 전에 약 80 % 합류 차 HBE 세포를 묘사하는 방법을 그림 2는 보여줍니다. 80 %의 합류에서의 10cm 접시는 약 4 × 10 6 세포를 얻을 수 있습니다. 그림 (b)는 투과 지원 삽입에 4의 MOI를 사용하여 미분화 P1 HBE 세포의 거의 100 % 전달을 보여줍니다. HBE 세포 투과성이지지 인서트에 도금되는 경우, 세포는 비교적 평평하다. 이 그림에서, 셀의 높이는 이유를 설명하는 몇 미크론0.4 μm의 모공 세포 비록 볼 수 있습니다.
그림 3은 제시된 프로토콜에 이르는 최적화 실험을 보여줍니다. 모든 실험은 웰 당 2 × 105 주 HBE 세포와 콜라겐 I 코팅 된 웰 (24- 웰 플레이트)에서 삼중으로 수행 하였다. 대부분의 실험은 BEGM 미디어 bromidein hexadimethrine의 2 μg의 / ㎖ 최종 농도 0.4의 MOI를 사용했다. 형광 세포 3 일 전달 후 계수 하였다. 프로토콜의 초기 최적화를 플라스틱 수행 되었으나, 그 결과 투과성지지 인서트에 확인되었다. 또한, 이전의보고 확인 (데이터는 도시하지 않음)에 성공하지 않았다 완전히 분화 P1 HBE 세포를 형질 도입하기 위해 시도한다. 도 3a에 도시 된 바와 같이, HBE 셀의 높은 비율은 ALI 비교 BEGM 배지에서 형질 도입된다. 세포 BEGM 매체에 전달되기 전에 일을 도금하는 경우, 효율셀 (도 3b)에 부착되는 동안 형질 도입에 비해 상당히 감소된다. P1 HBE 셀 (BEGM 대신의) ALI 매체에 전달되기 전에 도금 일 때, 전달 효율 (데이터 미도시)을 더욱 감소시킨다. 이들 두 미디어의 차이는 칼슘의 농도이다. BEGM 미디어는 ALI 미디어 (1 ㎜)에 비해 칼슘 (0.1 밀리미터)의 낮은 농도가 포함되어 있습니다. 칼슘 형태 및 단단한 접합부를 유지하고, 바이러스 입자 (9)을 통과하여 기저 막 그들의 수용체에 접근하기 때문에, 어렵게 만들 수있다. 사실, 어떤 감염 예 10 에틸렌 글리콜 디아민 테트라 아세트산 (EGTA)를 이용하여 단단히 접합을 방해하여 낮은 레벨에서 성공적이었다. 이전에 언급 한 바와 같이, 완전히 차별화 된 P1 HBE 세포는 내화 있습니다 만 높아 칼슘 함유 매체에 꽉 접합을 할 수있는 낮은 효율성을 5-7로 형질 도입 될 수있다. 또 다른 설명완전히 분화 된 세포에서 낮은 전달 효율 점액 장벽으로 작용할 수있는 활성 점액 섬모 반송기구이다. 발스 등.에 의해보고 나, HBE 셀 된 분화 단계는, 전달 효율 (10)의 결정 인자이다. 더 많은 세포가 ALI 미디어보다 BEGM에 형질 도입 얻을 사실은이 문장 (그림 3a)를 지원합니다.
도 3b에 도시 된 바와 같이 세포가 세포에 부착하는 동안 형질 비교했을 때, 약 50 %의 형질 도입 효율의 증가는 일 전에 도금을 관찰 하였다. 형질는 트립신 처리 (11) 이후에 수행 될 때 그들의 연구에서 릭스는 외. 20 %의 증가를 보였다. 함께, 이러한 결과는 미디어와 세포의 성숙의 상태가 전달 성공의 열쇠임을 시사한다.
그림의 패널3C는 hexadimethrine이 전달 효율 atrivial 역할을 bromideplaying 보여줍니다. 이 부정적인 영향을 미치지 않기 때문에 그럼에도 불구하고, 그것의 사용이 프로토콜에서 제안되어 있지만 잠재적으로 도움이 될 수 있습니다. Hexadimethrine 브로마이드 전달 효율을 향상 12 바이러스학에서 사용되는 양이온 성 중합체이다. 프로타민 기타 다른 양이온 성 중합체의 사용을 게시했지만, 유의 차가 hexadimethrine 13을 브롬화물에 비해 형질 도입 효율성과 관련이 발견되었다. Hexadimethrine 브로마이드 성장이나 분화 14-16 영향을주지 않습니다.
마지막으로, 다른 MOIs는도 3d 조사 하였다 : 가장 높은 형질 도입 효율을 MOI 0.4 및 4 사이에 유의 한 차이가 없었다 (4)의 MOI로 발생하지만, MOI 4 MOI 0.4 반면 HBE 세포를 100 % 형질 도입 75 %가 형질 도입. MOI는 바이러스가 위스콘신 입자 얼마나 많은 정의하나의 셀을 감염 가능성이있는 것이다. MOI를 결정하는 다른 방법이있다. 그 중 하나는 전달 유닛 (TU)의 개수를 정의하는 것이다. ELISA를 사용하여, P24 항원의 양을 pg / ml이다 결정될 수있다. 피코에서 바이러스 P24은 MOI를 계산하는데 필요한 TU에서 전환 될 수있다. MOI는 셀의 수에 의해 TU의 개수를 나눔으로써 계산된다. 피코 그램의 P24 당 10 ~ 100 전달 단위 (TU)가있다. MOI에 대한 텍스트의 모든 참조는 피코 그램의 P24 100 TU와 계산을 기반으로합니다. (http://tronolab.epfl.ch/webdav/site/tronolab/shared/protocols/TUvsp24.html).
그림 1. 10 배의 대물 따라 본의 HEK 293T 세포의 형질 감염은 (a)의 HEK 293T 세포를 50-60 %의 컨 플루 언시로 성장시킨다. (나) 모든 reage를 혼합 한 후 5 ㎕를 드롭 5 분에 볼 수 침전물현미경 (10X 목적)에서 국세청. (c)에 하룻밤 형질 (10X 목표) 다음, 세포 옆에있는 접시에 침전물. (d) (c)의 중심부의 확대. 화이트 가리키는 화살표는 침전한다. 스케일 바 = 100 μm의; A, B 및 C에 대해 동일합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : NHBE 세포의 형질 도입 (A) HBE 세포 5 일 BEGM 미디어에서 80~90%의 컨 플루 (약 4 × 10 6 세포) (10X 목적)에 콜라겐 I 코팅 접시에 성장.. 스케일 바 = 100 μm의. (b)에 eGFP는이 투과 지원 인서트 (12mm) 3 일 후 전달 (공 초점, 20X)에 HBE 세포를 형질 도입. 이 상태에서, HBE의 CEL LS는 평평 멤브레인의 기공 볼 수 있습니다. 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 전달 프로토콜의 최적화 전달 효율에 미디어의 (a)에 영향.. 연결 상태 (b)는 HBE 세포에서 전달의 비교는 전날과 세포의 전달 도금. (c) 전달 효율 hexadimethrine 브로마이드의 영향을 미친다. 다른 MOIs을 사용하여 개선 전달 효율의 (d)에 평가. 분석은 학생의 t- 테스트 또는 크루스 칼 - 월리스 던의 다중 비교 테스트를 사용하여 수행 하였다. 오류 바 SE를 대표하고 모든 * P <0.05를 나타냅니다.ww.jove.com/files/ftp_upload/54176/54176fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 100 % 전달 효율에 가까운 보장합니다. 그러나,이 목표를 달성하기 위해 중요한 과정에서 단계가있다. 예를 들어, 형질 전환 과정은 형질 믹스 석출물의 존재 (드롭) 또는 접시에 형질 도입 (도 1b 및 d) 다음날 좋은 형질 대한 중요한 양이다. 침전 또는 응집의 존재 유무는 형질 전환 시약 중 하나의 누락, pH가 문제 또는 불량 플라스미드 제조에 기인 할 수있다. 침전물이없는 경우, 아무도 그 다음날 볼 수 없습니다 가능성이 매우 높습니다. 또한, 형질 전환 및 수율을 방해은 HEK 세포가 분리 될 수 있습니다 너무 빨리 형질 혼합 또는 HEK 미디어를 추가. 좋은 수율의 또 다른 표시는 원심 분리 단계 이전에 6 일째에 있습니다 : 흰색 침전물 튜브의 하단에 표시해야한다. 거의와 나쁜 형질더 바이러스는이 백색 침전물을 생성하지 않습니다. 형질 도입 절차 동안, 탈 분화 높은 형질 도입 효율을 달성하기 위해 상태와 같은 줄기 세포에 한 HBE 차 전지를 사용하는 것이 중요하다. 쉽게 가시화 eGFP는 같은 또는 mCherry 같은 형광 단백질을 함유하는 벡터의 사용은 우수한 도구가 될 수있다.
수정은 다른 일차 전지에이 프로토콜을 적용하도록 할 수 있습니다. 하나의 방법은 매체의 칼슘 농도를 감소시키는 것이다. 기본 HBE 세포에서 유의 한 높은 전달 효율의 결과 칼슘의 낮은 농도를 포함 BEGM 매체를 사용하여도 3a에 도시 된 바와 같이. 또 다른 방법은 MOI를 증가시킬 수 있었다. 도 3d는 높은 MOI수록 전달 효율에 도시 된 바와 같이. 그러나, 높은 MOI를 사용하면 일부 세포에 독성이 될 수 있습니다.
그럼에도 불구하고, 일부 limita있다 이 프로토콜에 TIONS. 이 기술은 1 통로 HBE 세포를 사용하여 개발되었다. 이식 거부 폐는 헬싱키 선언에 의해 설정된 기준에 연구 순응에 대한 적절한 동의를 얻었다. 상용 소스에서 차 HBE 세포를 얻는 것은 비용이 많이들 수 있습니다. 이 세포는 일반적으로 더 높은 경과시에만 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또 다른 제한 요소가 P24 ELISA 항원 분석 2.보다 높은 구절에서 테스트되지 않았습니다. 몇몇 회사는 키트 그러나 높은 비용을 제공합니다. 또한, 분석에 의해 소정의 바이러스 농도가 테스트 렌티 P24과 일시적인 형질 감염 17 일 동안 방출 자유 P24 검출 이후 단지 대략적인 값이다. 따라서, MOI의이 평가는 추정이다. 마지막으로, 다른 표현을 사용하여 동일한 결과를 제공하지 않을 수 (크기가 크거나 작은) 구성한다. 예를 들어, 상이한 효율성을 mCherry 및 eGFP는 (데이터 미도시)를 사용하여 기록 하였다.
ENT "> 이점은 다른 방법에 비해,이 프로토콜이있다. 그 중 하나는 형질 공정이다. 실제로, 제안 된 프로토콜이 바이러스를 포함하는 수집 된 미디어가 더 이상 집중 될 필요가 높은 바이러스 역가를 얻을 수 있고, 사용될 수있다 직접. 바이러스 집중이 프로토콜에서 사용 된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를, 포유류 세포 18의 독성이 알려져있다 세포. 형질 도입하는 높은 MOI를 사용한다면 또한이 더욱 독성 위험이 증가된다. 그러나, 페그 농축 단계가 폐기 될 경우, 성공적이지 않은 연구자 렌티 바이러스의 사용을 다시 생각해 독성 효과에 의한 형질 도입한다.이 프로토콜의 또 다른 이점은 플라스틱 또는 투과성지지 인서트에 전달 효율의 차이의 부족이다. 있다는 이점을 플라스틱에 형질 도입 할 수있는 세포 및 바이러스 입자가 필요한 적은. 그 결과, 세포가 형질 도입 후 확대되어 전송 될 수 있다는합류 (데이터는 도시하지 않음) 때 투과성 지지체 상에 인서트.벡터의 선택은 녹색 형광 단백질 (GFP) 등의 퓨로 마이신 또는 마커 단백질의 발현과 형질 세포의 선택과 같은 몇 가지 문제에 따라 달라집니다. 적절한 (pRRLsinPPT.CMV.MCS.Wpre, pCDH-EF1-MCS-IRES-순수하지 않아, pCDH-EF1-MCS-T2A-순수하지 않아,을 pGEM-T 쉬운) 15,19-21입니다 가능한 여러 상업 벡터가 있습니다. 일반적으로 사용되는 CMV 프로모터는 차별화 된기도 상피 세포 (15)에 침묵하고 있기 때문에 프로모터의 선택은, 도전 포즈. 섬모 세포 특이 적 발현를 들어, 여우-J1 촉진제의 사용을 권장합니다. 대안 적으로, EF-1 프로모터 모두기도 셀 (20, 21)에서의 발현을 위해 사용될 수있다. 단백질 과발현이 추구되는 경우, 삽입물의 크기는 일부가 전달 효율이 결정된다. 전장 수용성 아데 닐 레이트 사이 클라 제 (2)의 성공적인 전달 볼 그러나 큰 크기는 수용 될 수있다2 국지적 연구소가 발표 한 몇 가지 성공적인 과발현은 15,16,20-22를 구성한다. (일반적으로 U6 또는 H1 프로모터에서) shRNA를 발현를 들어, 여러 구조가 탐구해야합니다. 이 분화 (PCR 및 서쪽 블로 팅)의 말에 완료 테스트와 지루한 될 수 있지만, 비 분화 된 세포가 분화를 겪고 세포에 대한 성공의 좋은 표현되지 않을 수 있기 때문에 프로세스는 생략 할 수 없습니다. 다시, 연구소가 발표 한 여러 성공의 shRNA는 14,20,21,23를 구성한다.
이 프로토콜을 이용하여, 더 많은 연구가 상당히 이전 불량한 transductions을 개선하는 것을 가능하게 할 수있다. 일부는 유용한 몇 가지 조정하여 효율성을 증가 찾을 수 있습니다. 일부는 새로운 생물학적 과정을 발견하기 위해이 도구를 사용할 수 있습니다 또는 둘 최저 또는 과발현 전략을 사용하여, 개념을 입증 할 수있는.
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Acknowledgments
우리는 폐를 제공하기 위해 마이애미 대학의 생명 얼라이언스 장기 복구 기관 감사합니다. 우리는 또한 우리는 또한 가브리엘 Gaidosh 감사도 2b 및 3-D, C.에도 3a에 실험에 사용되는 mCherry 바이러스 박사 벤 Gerovac 리사 노박에 나타난 실험에 사용되는 DNA의 준비를 위해 박사 리사 Künzi 감사합니다 이미징 시설에서, 마이애미 대학 안과학 교실.
본 연구는 NIH의 CF 재단과 박사 마티아스 Salathe에 승무원 의학 연구소에서 보조금을 후원하고있다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | 12306C | use at 10% |
| DMEM | Thermo Scientific | 11995-040 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Thermo Scientific | 15140-122 | use at 1x |
| Collagen I | BD Biosciences | 354231 | dilute 1:75 in distilled water |
| Calphos | Clontech | 631312 | Transfection kit containing 2 M Calcium solution, 2x HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O |
| Polythylene glycol 8000 | VWR scientific | 101108-210 | stock of 40% |
| Amphotericin B | Sigma | A9528 | use at 1x |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Transwell 12 mm | Corning | 3460 | |
| Collagen IV | Sigma | C7521 | dilute 1:10 in distilled water |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | stock of 2 mg/ml |
| Puromycin (10.000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | use at 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 | lentiviral expression vector |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | packaging DNA |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | packaging DNA |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | packaging DNA |
References
- Ding, B., Kilpatrick, D. L. Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons. Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).
- Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Jr Gene therapy progress and prospects: development of improved lentiviral and retroviral vectors--design, biosafety, and production. Gene Ther. 12, 1089-1098 (2005).
- Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnol. 13, (2013).
- Delenda, C. Lentiviral vectors: optimization of packaging, transduction and gene expression. J Gene Med. 6 Suppl 1, S125-S138 (2004).
- Gresch, O., Altrogge, L. Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells. Methods Mol Biol. 801, 65-74 (2012).
- Jordan, E. T., Collins, M., Terefe, J., Ugozzoli, L., Rubio, T. Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells. J Biomol Tech. 19, 328-334 (2008).
- Castillon, N., et al. Regeneration of a well-differentiated human airway surface epithelium by spheroid and lentivirus vector-transduced airway cells. J Gene Med. 6, 846-856 (2004).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. 107, 183-206 (2005).
- Gonzalez-Mariscal, L., et al. Role of calcium in tight junction formation between epithelial cells. Am J Physiol. 259, C978-C986 (1990).
- Bals, R., et al. Transduction of well-differentiated airway epithelium by recombinant adeno-associated virus is limited by vector entry. J Virol. 73, 6085-6088 (1999).
- Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 17, 441-450 (2008).
- Davis, H. E., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 97, 159-172 (2002).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, 341-347 (2013).
- Manzanares, D., et al. Functional apical large conductance, Ca2+-activated, and voltage-dependent K+ channels are required for maintenance of airway surface liquid volume. J Biol Chem. 286, 19830-19839 (2011).
- Schmid, A., et al. Real-time analysis of cAMP-mediated regulation of ciliary motility in single primary human airway epithelial cells. J Cell Sci. 119, 4176-4186 (2006).
- Unwalla, H. J., Ivonnet, P., Dennis, J. S., Conner, G. E., Salathe, M. Transforming growth factor-beta1 and cigarette smoke inhibit the ability of beta2-agonists to enhance epithelial permeability. Am J Respir Cell Mol Biol. 52, 65-74 (2015).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6, (2006).
- Schneiderman, S., Farber, J. L., Baserga, R. A simple method for decreasing the toxicity of polyethylene glycol in mammalian cell hybridization. Somatic Cell Genet. 5, 263-269 (1979).
- Schmid, A., et al. Soluble adenylyl cyclase is localized to cilia and contributes to ciliary beat frequency regulation via production of cAMP. J Gen Physiol. 130, 99-109 (2007).
- Manzanares, D., et al. Airway Surface Dehydration by Transforming Growth Factor beta (TGF-beta) in Cystic Fibrosis Is Due to Decreased Function of a Voltage-dependent Potassium Channel and Can Be Rescued by the Drug Pirfenidone. J Biol Chem. 290, 25710-25716 (2015).
- Manzanares, D., et al. IFN-gamma-mediated reduction of large-conductance, Ca2+-activated, voltage-dependent K+ (BK) channel activity in airway epithelial cells leads to mucociliary dysfunction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L453-L462 (2014).
- Chen, X., et al. A soluble adenylyl cyclase form targets to axonemes and rescues beat regulation in soluble adenylyl cyclase knockout mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 51, 750-760 (2014).
- Ransford, G. A., et al. Pannexin 1 contributes to ATP release in airway epithelia. Am J Respir Cell Mol Biol. 41, 525-534 (2009).
