Abstract
A cultura in vitro de células primárias humanas epiteliais brônquicas (HBE) usando condições de interface ar-líquido fornece um modelo útil para estudar os processos de diferenciação e função das células das vias aéreas. Nos últimos anos, o uso de vectores lentivirais para a entrega do transgene tornou-se prática comum. Embora existam relatórios de transdução de células epiteliais das vias respiratórias totalmente diferenciadas com certos lentivírus digitado pseudo-não-HIV, a eficiência global de transdução é geralmente inferior a 15%. O protocolo aqui apresentado proporciona um método fiável e eficiente para a produção de lentivírus e a transdução de células epiteliais brônquicas humanas primárias. Usando células epiteliais brônquicas indiferenciadas, transdução em meio de crescimento epitelial brônquica, enquanto as células fixar, com uma multiplicidade de infecção de factor de 4 fornece eficiências perto de 100%. Este protocolo descreve, passo-a-passo, a preparação e concentração dos vectores lentivirais de título elevado e thprocesso de transdução de e. Discute-se as experiências que determinaram as condições de cultura ideais para atingir transduções altamente eficientes de células epiteliais brônquicas humanas primárias.
Introduction
O desenvolvimento de lentivírus, pseudotipados replicação deficiente (LV) forneceu aos investigadores um método seguro e eficiente para entregar transgenes in vitro 1. Devido à sua expressão a longo prazo, estes LV também poderia ser utilizada para a entrega de agentes terapêuticos in vivo 2,3. A produção de LV requer a co-transfecção de células de rim embrionário humano (HEK) com vários plasmídeos: vector de transferência, gag / pol de empacotamento, rev embalagem, e envelope glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSV-G) plasmídeos. Sistemas de empacotamento de terceira geração são considerados mais seguros do que os sistemas de segunda geração, porque o gene rev é codificada num plasmídeo de empacotamento separada, reduzindo assim a possibilidade de recombinação para produzir um lentivírus competente de replicação. Embora os sistemas de embalagem de segunda geração deu cinco unidades de transdução totais mais elevados de dobra, a divisão do genoma viral original para criaro sistema de terceira geração diminuiu o nível de transdução de apenas minimamente 3,4.
Enquanto linhas celulares podem ser transduzidas mais facilidade e eficiência, os investigadores mudaram seu foco para as células primárias, porque estes são mais representativos de tecidos in vivo 5,6. No entanto, as células primárias são refratários a transdução. Enquanto a transdução de células epiteliais das vias aéreas totalmente diferenciadas têm sido relatados, a eficiência global não excedeu 15% 7.
Aqui descrito é um protocolo que permite a produção de LVS-de título elevado. Uma abordagem passo-a-passo é delineada para atingir quase 100% de eficiência de transdução em células HBE primários. Mais especificamente, o protocolo descreve as condições óptimas de cultura para ter sucesso 3 instrumentais. Resumidamente, as células HEK 293T são transfectadas usando o pCDH lentiviral vector de expressão com o promotor de EF-1 dirigindo a expressão de verde fluorescente melhoradaproteína (eGFP) ou mCherry, uma proteína fluorescente vermelha, e um sistema de empacotamento de terceira geração. LVs libertados para os meios de comunicação são coletadas de 24 a 72 horas mais tarde. As partículas de vírus são concentradas com polietilenoglicol (PEG), um método conveniente e fácil de concentração virai, antes da estimação título utilizando um kit de ensaio imuno antigénio p24 ligado a enzima (ELISA). Subsequentemente, as células HBE primárias indiferenciadas são transduzidas em meios de proliferação (meio de crescimento epitelial brônquica ou BEGM) 8, quando a montar (depois de ser tripsinizadas), a uma multiplicidade de infecção factor 4 (MOI), a adição de brometo de hexadimetrina e incubando durante 16 horas ( pernoite). As células são então deixadas diferenciar. Uma vez que o transgene é expresso viral a longo prazo (usando o promotor apropriado, ver discussão), expressão vai ser mantida durante toda a diferenciação em um epitélio das vias respiratórias pseudo ou pode ser induzida (utilizando um promotor indutível) após a diferenciação.
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Protocol
1. Fase 1: Cultura da HEK 293T
- Prepare meios células HEK (referido como meio de HEK) por adição de 10% (v / v) de soro fetal de bovino (FBS) e 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina a elevada glicose de Eagle Modificado Meio de Dulbecco (DMEM).
- Bata de um prato de 10 cm de cultura de tecidos com colagénio I. Mistura de 30 ul de colagénio I, em 2 ml de água destilada. Espalhar a mistura sobre o prato e incubar durante 2 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Remover a mistura e deixar secar o prato numa câmara de fluxo laminar durante 15 min.
- Placa células HEK para a placa revestida a uma densidade de 1 x 10 6 células em 10 ml de meio de HEK e incubar a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Quando as células HEK são 50-60% confluentes (Figura 1a, 2-3 dias após o plaqueamento), prossiga para a fase 2. Visual avaliação da confluência é suficiente. Sem quantificação é necessária.
Nota: as células HEK são cultivadas em meios de HEK (ver acima). Quando eles atingem a confluência, tEi pode ser dividido (por exemplo, 1/5) para baixo ou congelado para uma utilização posterior.
2. Fase 2: Produção e Concentração dos lentivírus (VEs) em células HEK
Nota: Os protocolos devem ser executadas em conformidade com as normas institucionais e governamentais sob + condições (Enhanced BSL-2) nos EUA BSL-2.
- Transfectar utilizando um procedimento de precipitação de cálcio (lipofectamina e outros agentes de transfecção não fosse tão eficiente quanto o procedimento de precipitação de cálcio). O uso de um kit comercial de transfecção é recomendado para assegurar a reprodutibilidade, embora o processo é modificado como se segue. Trazer todos os reagentes à temperatura ambiente. Este é o dia 0.
- Para cada placa de 10 cm de células HEK293, misturar 4,5 g de envelope de ADN PMD2-VSVG, 7,5 ug de embalagem ADN pMDLg / pRRE, 3,75? G de ADN de pRSV-Rev, 10 ug de ADN do vector de expressão de lentivírus, 86 ul de uma solução 2 M de cálcio , e água estéril num tubo de centrífuga de 15 ml para um volume final de 700 ul(As duas últimas soluções são fornecidas no kit de transfecção comercial).
- Gota a gota, adicionar 700 ul de solução salina tamponada com HEPES 2x (HBS, fornecidas com o kit de transfecção) aquando da mistura (na câmara de fluxo laminar) e incubar a temperatura ambiente durante 30 min (efectuar o passo 4, enquanto espera).
- Durante o tempo de incubação inicial, depósito de 5 ul da mistura sobre uma lâmina. Verifique a gota sob um microscópio com uma objetiva de 10X, concentrando-se lentamente para cima e para baixo. Um precipitado fino deve ser visível, confirmando o processo de precipitação de fosfato de cálcio (Figura 1b).
- Pare a precipitação após 30 minutos por adição de 10 ml de células HEK media e pipeta cima e para baixo para misturar.
- Leve o prato de células HEK do passo 2,1-2,5, e remover o meio (dia 0). Adicionar a solução do passo 2.5 precipitado cuidadosamente e lentamente ao longo da borda do prato.
- No dia seguinte (dia 1), remova e descarte o meio contendo o precipitado e substituí-lo wom 10 ml de meio de HEK. Verifique se o precipitado fino sob o microscópio: deve ser visível no prato em espaços vazios entre as células (Figuras 1C e D).
- No dia 2, recolhe meios de comunicação com uma seringa, filtrar através de um filtro de seringa de 0,45 um para um tubo de centrífuga de 15 ml contendo 3,8 ml de um polietileno-glicol 40% (PEG). Inverter 5x para misturar e armazenar a 4 ° C durante pelo menos 24 horas (para precipitar o PEG para formar, mas não mais do que 5 dias) até que todos os conjuntos de vírus estão completas.
- Repita o passo 2.8 nos dias 3 e 4. No dia 4 não coloque meio HEK mas descontaminar com 10% de água sanitária e rejeitar a placa.
- Centrífuga de todos os tubos de colheita (geralmente todas as coleções em conjunto no dia 5) a 1.650 g durante 20 min a 4 ° C para sedimentar o vírus. Retirar e descartar o sobrenadante, e girar novamente a 1.650 xg por 5 min a 4 ° C para recolher e remover qualquer remanescente de PEG sobrenadante.
- Resuspend a pelete de cada tubo, em 200 ul de meio de crescimento epitelial brônquica (BEGM) sem anfotericina B 8. Reuni-los em conjunto e a aliquota de 200 ul. vírus armazenar a -80 ° C. Alíquota um adicional de 10 ul de realizar o ensaio ELISA Gag de HIV-1 (p24) antigénio.
- Utilizando um kit de ELISA comercial, realizar um ensaio de antígeno p24 de acordo com o protocolo do fabricante. O ensaio dá uma estimativa da p24 viral em pg / ml.
3. Fase 3: células de cultura primária HBE
- Placa HBE células em 10 ml BEGM meios (100 ul com anfotericina B se 0 passagem células são usados para eliminar a possibilidade de contaminação por fungos) a uma densidade de 1 x 10 6 células em colagénio I revestido 10 centímetros prato de cultura de tecidos. Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2.
- No dia seguinte, remover o meio e substituir por 10 ml BEGM (com 100 ul de anfotericina B por células passagem 0) para um total de 4 dias. Voltar para incubadora.
- Após 4 days, use apenas BEGM sem meios anfotericina B. Alterar a cada dois dias.
- Quando as células são 80-90% confluentes (Figura 2a; ~ 7 dias após o plaqueamento), proceda com a transdução (preste atenção a 3,5 para preparação antes de transdução). Novamente, a avaliação visual de confluência é suficiente. Sem quantificação é necessária.
- Antes de transdução, revestir os insertos de suporte permeável com uma solução de colagénio IV diluídos a 1/10 com água destilada estéril. Adicionar 200 mL de cada inserção e deixar secar durante a noite na câmara de fluxo laminar.
4. Etapa 4: Transdução de Células HBE
- Remover o meio, adicionar 3 ml de tripsina a 0,1% em ácido etilenodiaminotetracético 1 mM em salino tamponado com fosfato (EDTA / PBS) e incuba-se 5 minutos a 37 ° C e 5% de CO 2. Verifique sob o microscópio (objetiva de 10X) para ver se todas as células são separadas. Se não, voltar para a incubadora para um adicional de 5 min.
- Quando todas as células são separadas, adicione 3ml de inibidor de tripsina de soja (SBTI 1 mg / ml), misturar e transferir para um tubo de centrífuga de 15 ml. Agregar as células por centrifugação a 460 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
- Remover o sobrenadante e pellet ressuspender em 3 ml de BEGM e prosseguir com a contagem.
- Ressuspender as células (HBE agora uma passagem ou P1) a uma razão de 2 x 10 5 células por um suporte permeável a inserção de 12 mm de 400 ul de BEGM (ver Tabela 2). Extrapolar estes números com base na quantidade de pastilhas de suporte permeável que vai ser transduzidas.
| Superfície | área de superfície | A contagem de células | meios de comunicação | Volume (media) |
| Placa de 10 cm | 52,7 cm 2 | 1 x 10 6 | BEGM | 10 ml | </ Tr>
| filtro de 12 milímetros | 1,13 cm 2 | 2 x 10 5 | BEGM | 400 ul |
| filtro de 24 milímetros | 4.52 cm 2 | 8 x 10 5 | BEGM | 800 ul |
Tabela 2: Meios extrapolações por contagem de células.
- Usando uma multiplicidade de infecção fator (MOI) de 4, adicionar o volume apropriado de vírus à suspensão de células.
- Adiciona-se brometo de hexadimetrina a um / ml de concentração final de 2 ug.
- Dispense 400 ul da mistura (BEGM, HBE células, vírus e brometo Hexadimetrina) por inserção de suporte permeável no compartimento apical, e adicionar 1 ml de BEGM sozinho para o compartimento basolateral. Incubar durante a noite a 37 ° C e 5% CO 2. Células Sempre placa HBE sem vírus como controle e seleção de teste puromicina se for o caso.
- No dia seguinte, REMmídia apical e basolateral ove, lavar com PBS, e substituir os dois compartimentos com interface ar-líquido (ALI) media 8.
- Quando as células estão confluentes, remover o líquido apical (conhecido como o estabelecimento de uma interface ar-líquido). Continuar a alterar o meio (ALI) no compartimento de fundo a cada dois dias até atingirem a maturidade plena; geralmente de 3 a 4 semanas mais tarde.
Nota: Se o vector lentiviral que contém um gene de selecção tal como a puromicina, as células podem ser seleccionadas através da adição de puromicina de acordo com uma curva de concentração de selecção. Para as células HBE, uma concentração de 1 ug / ml foi determinado a ser ideal para a selecção de células transduzidas consistente. No entanto, esta concentração pode ser diferente para outras células ou condições e deve ser determinada por curvas de matar. A adição de puromicina pode começar tão cedo quanto um dia depois de os meios de comunicação foi substituída pela mídia ALI ou posteriores (2-3 dias) para permitir a plena expressão do gene de selecção. Certifique-se de adicionar puromicina a uma inserção que hcomo não foram transduzidas. Puromicina pode ser adicionado até que as células são totalmente diferenciadas.
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Representative Results
A Figura 1 ilustra diferentes passos chave de avaliar células e soluções durante o processo de transfecção. A Figura 1A mostra a confluência óptimo das células HEK293T antes da transfecção para a produção de vírus. É importante que as células são distribuídos uniformemente ao longo do prato. Figura 1b revela o precipitado em uma gota da mistura de transfecção utilizando brilhantes óptica de campo e uma objectiva 10X. Quanto mais os precipitados olhar como grãos de areia, em vez de aglomerados, o mais eficiente a transfecção será. Neste quadro, o precipitado é um pouco grosseiro. O precipitado é um indicador fiável se a transfecção irá produzir um título elevado de vírus. Se qualquer um dos ingredientes está ausente ou de má qualidade (DNA vector, por exemplo), aglomerados irá formar, o que é um mau sinal. Se este for o caso, é mais sensato para abortar e reiniciar o procedimento, certificando-se queTodos os ingredientes estão em mistura, e / ou verificação da qualidade do ADN do vector e o ADN de embalagem. A Figura 1C mostra o mesmo prato como A, depois incubação durante a noite. O precipitado é (e deve ser) visível entre as células. Notamos que as células não se multiplicam muito durante a 24 horas após a transfecção.
A Figura 2 mostra como as células HBE olhar antes e 3 dias após a transdução. A Figura 2A representa cerca de 80% de células confluentes HBE primária antes da tripsinização e transdução. Um prato de 10 cm a 80% de confluência rende aproximadamente 4 x 10 6 células. A Figura 2b mostra quase 100% de transdução de células indiferenciadas P1 HBE utilizando uma MOI de 4 na inserção de suporte permeável. Quando as células são plaqueadas em HBE estes insertos de suporte permeável, as células são relativamente plana. Nesta imagem, a altura das células é de apenas alguns microns o que explica por que o0,4 uM poros são visíveis embora as células.
A Figura 3 mostra experiências de optimização que conduzem ao protocolo apresentado. Todas as experiências foram realizadas em triplicado em poços revestidos de colagénio I (placa de 24 poços), com 2 x 10 5 células por poço HBE primárias. A maioria das experiências usou um MOI de 0,4 com uma concentração de 2 ug / mL de concentração final de hexadimetrina bromidein meios BEGM. As células fluorescentes foram contadas 3 dias após a transdução. Mesmo que a optimização inicial do protocolo foi realizado em plástico, os resultados foram confirmados em inserções de suporte permeável. Além disso, as tentativas para transduzir células P1 HBE completamente diferenciados não teve êxito (dados não mostrados), confirmando relatórios anteriores. Como se pode ver na Figura 3a, uma maior percentagem de células transduzidas são HBE em meios BEGM comparação com LPA. Se as células são plaqueadas no dia antes em meio de transdução BEGM, a eficiênciasignificativamente é reduzido em comparação com transdução enquanto as células estão anexando (Figura 3b). Quando as células são plaqueadas P1 HBE no dia antes em meio de transdução de Ali (em vez de BEGM), a eficácia de transdução diminui ainda mais (dados não mostrados). A diferença entre estes meios 2 representa a concentração de cálcio. meios BEGM contém uma baixa concentração de cálcio (0,1 mM) em relação aos meios de Ali (1 mM). Formas de cálcio e mantém junções apertadas e, portanto, poderia tornar difícil para as partículas do vírus para cruzar 9 e acessar seus receptores na membrana basolateral. Na verdade, algumas infecções foram bem sucedidos em níveis baixos por perturbar junções apertadas utilizando ácido tetra-etilenoglicol (EGTA), por exemplo, 10. Como indicado anteriormente, as células P1 HBE completamente diferenciadas são refractários e só pode ser transduzida com baixas eficiências de 5-7, que pode ser devido a zonas de oclus em meios contendo elevado teor em cálcio. Outra explicação parabaixa eficiência de transdução em células totalmente diferenciadas é um mecanismo de transporte mucociliar ativo, onde o muco poderia agir como uma barreira. Ou, como relatado por Bals et ai., A fase de diferenciação em que as células são HBE, é um factor determinante da eficiência de transdução de 10. O fato de que mais células se transduzidas em BEGM do que em media ALI apoia esta afirmação (Figura 3a).
Como pode ser visto na Figura 3b, foi observado um aumento de quase 50% de eficiência de transdução quando as células foram transduzidas ao anexar em comparação com células plaqueadas no dia anterior. Em seu estudo, Ricks et al. Mostrou um aumento de 20% quando transdução foi realizada após tripsinização 11. Juntos, esses resultados sugerem que a mídia e ao estado de maturidade das células é a chave para o sucesso de transdução.
O painel na Figura3c, demonstra hexadimetrina bromideplaying atrivial papel na eficácia de transdução. No entanto, seu uso é sugerido neste protocolo, uma vez que não tem qualquer impacto negativo, mas poderia ser benéfico. Brometo de hexadimetrina é um polímero catiónico que é usada na virologia para melhorar as eficiências de transdução de 12. Outros publicaram o uso de protamina, outro polímero catiônico, mas nenhuma diferença significativa foi encontrada sobre a eficiência de transdução em comparação com Hexadimetrina brometo 13. Brometo de Hexadimetrina não tem impacto sobre o crescimento, nem diferenciação 14-16.
Finalmente, diferentes MOI foram investigados na Figura 3D: a maior eficiência de transdução ocorreu com uma MOI de 4. Não houve diferença significativa entre a MOI de 0,4 e 4, no entanto, MOI 4 transduzidas 100% das células enquanto HBE MOI de 0,4 única transduzidas 75%. O MOI define quantos vírus partículas will tem o potencial para infectar uma célula. Existem diferentes métodos para determinar a MOI. Um deles é o de definir o número de unidades de transdução (TU). Usando um ELISA, a quantidade de antigénio p24 pode ser determinada em pg / mL. p24 viral em picogramas pode ser convertido em TU, que são necessários para calcular a MOI. A MOI é calculado dividindo o número de TU ao número de células. Há 10-100 unidades de transdução (TU) por p24 picograma. Todas as referências no texto sobre MOI são baseadas em cálculos com 100 TU por p24 picograma. (Http://tronolab.epfl.ch/webdav/site/tronolab/shared/protocols/TUvsp24.html).
Figura 1:. A transfecção de células HEK 293T (a) células HEK 293T cultivadas até 50-60% de confluência como visto sob uma objectiva 10X. (B) Precipitar visível numa atmosfera de 5 ul gota 5 minutos após a mistura de todos REAGEnts sob o microscópio (objetiva de 10X). (C) precipitado no prato ao lado das células, durante a noite, após a transfecção (objectiva 10X). (D) Ampliação do centro de (c). Branco seta apontando para precipitar. Barra de escala = 100 pm; é a mesma para a, b, e c. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Transdução de células NHBE (a) células crescidas em HBE um colagénio I revestido prato de 80-90% de confluência (aproximadamente 4 x 10 6 células) em meios BEGM durante 5 dias (objectiva 10X).. Barra de escala = 100 pm. (B) eGFP transduzidas células HBE em inserções permeáveis de apoio (12 mm), 3 dias após a transdução (confocal, 20X). Neste estado, cel HBE ls são planas e os poros da membrana são visíveis. Barra de escala = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Otimização de protocolo de transdução (a) impacto da mídia sobre a eficiência de transdução.. (B) Comparação de transdução em células HBE plaqueadas no dia anterior e na transdução de células quando a montar. (C) Influência de brometo de hexadimetrina na eficácia de transdução. (D) Avaliação da maior eficiência de transdução utilizando diferentes MOI. A análise foi realizada usando o teste t de Student ou o teste de comparação múltipla de Kruskall-Wallis e Dunn. As barras de erro representam SE e todos os * representam p <0,05.ww.jove.com/files/ftp_upload/54176/54176fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo aqui descrito assegura perto de 100% de eficiência de transdução. No entanto, existem passos durante o processo, que são importantes para alcançar este objectivo. Por exemplo, durante o processo de transfecção, a presença de precipitados na mistura de transdução (gota) ou no prato do dia após a transdução (Figuras 1b e d) são ambos relevantes para uma boa transfecção. A ausência de um precipitado ou a presença de aglomerados pode ser devido a uma omissão de um dos reagentes de transfecção, um problema de pH, ou uma preparação de plasmídeo má. Se o precipitado é ausente, existe uma alta probabilidade de que nenhum será visível no dia seguinte. Além disso, a adição da mistura de transfecção ou mídia HEK rápido demais pode causar as células HEK destacar, dificultando transfecção e rendimento. Outra indicação de um bom rendimento é no dia 6 antes do passo de centrifugação: um precipitado branco deve ser visível na parte inferior do tubo. Um mau transfecção com quasenenhum vírus não vai criar esta precipitado branco. Durante o processo de transdução, é fundamental a utilização de células HBE primários que têm sido de-diferenciados e que estão em uma célula-tronco como o estado a fim de alcançar altas eficiências de transdução. O uso de um vector que contém uma proteína fluorescente tal como eGFP ou mCherry que é facilmente visualizada pode ser uma boa ferramenta.
Modificações podem ser feitas para adaptar este protocolo para células primárias diferentes. Uma abordagem seria para reduzir a concentração de cálcio na mídia. Como pode ser visto na Figura 3A, utilizando meios BEGM que contém uma menor concentração de cálcio resultou na maior eficiência de transdução em células significativa HBE primárias. Outra abordagem poderia ser o aumento da MOI. Tal como mostrado na Figura 3d, quanto maior for o MOI, melhor a eficácia de transdução. No entanto, usando um MOI mais elevado pode tornar-se tóxico para algumas células.
No entanto, existem alguns Limita ções para este protocolo. Esta técnica foi desenvolvida usando a passagem 1 células HBE. Pulmões rejeitados para transplante foram obtidos com o consentimento apropriado para conformação de pesquisa com as normas estabelecidas pela Declaração de Helsinki. A obtenção de células primárias HBE a partir de fontes comerciais, pode ser caro. Estas células são normalmente também só está disponível em uma passagem superior. Este protocolo não foi testado em passagens superiores a 2. Outro fator limitante é o ensaio de antigénio ELISA p24. Várias empresas oferecem o kit, mas a um custo elevado. Além disso, a concentração viral dada pelo ensaio, é apenas um valor aproximado desde que o teste detecta p24 e p24 lentivírus livre libertada durante a transfecção transitória 17. Portanto, essa avaliação de MOI é apenas uma estimativa. Finalmente, utilizando-se diferentes construções de expressão (maior ou menor em tamanho) pode não dar os mesmos resultados. Por exemplo, diferentes eficiências foram registados utilizando mCherry e eGFP (dados não mostrados).
ent "> Há vantagens a este protocolo sobre outros métodos. Um deles é o processo de transfecção. Na verdade, o protocolo proposto pode produzir tais títulos elevados de vírus que a mídia recolhidos que contenham vírus já não precisam de ser concentrado e poderia ser usado directamente para transduzir células. o polietileno glicol (PEG), utilizados no presente protocolo para concentrar vírus, tem sido conhecido por ser tóxico para células 18 de mamíferos. Além disso, se foram usadas maior MOI, isso iria aumentar o risco de toxicidade ainda mais. no entanto, se a etapa de concentração de PEG torna-se obsoleto, os pesquisadores que tenham sido bem sucedidos para transduzir devido aos efeitos de toxicidade poderia reconsiderar o uso de lentivírus. Outra vantagem deste protocolo é a falta de diferenças na eficiência de transdução de plástico ou inserções de suporte permeável. o benefício de ser capaz de transduzir em plástico é que são necessários menos células e partículas de vírus. Como resultado, as células podem ser expandidas pós transdução e transferidospara pastilhas de suporte permeável quando confluentes (dados não mostrados).A escolha de vetores depende de vários fatores, tais como a selecção de células transduzidas com puromicina ou a expressão de proteínas marcadoras, como a proteína verde fluorescente (GFP). Existem vários vetores comerciais disponíveis que são adequados (pRRLsinPPT.CMV.MCS.Wpre, pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro, pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro, pGEM-T Easy) 15,19-21. A selecção de promotores coloca desafios, uma vez que o promotor de CMV frequentemente utilizado é silenciada em vias aéreas células epiteliais diferenciadas 15. Para a expressão específica de células ciliadas, é recomendada a utilização do promotor de Fox-J1. Alternativamente, o promotor EF-1 pode ser utilizado para a expressão em todas as células das vias respiratórias 20,21. Se superexpressão da proteína é procurado, o tamanho da inserção irá determinar, em parte, a eficiência de transdução. No entanto, os tamanhos grandes podem ser acomodados como pode ser visto através de transdução de sucesso de comprimento completo da adenilil-ciclase solúvel dois2 .A laboratório publicou vários superexpressão de sucesso constrói 15,16,20-22. Para a expressão de shRNA (geralmente sob a U6 ou H1 promotor), múltiplas construções terá que ser explorado. Isto pode ser tediosa com testes realizados no final de diferenciação (PCR e Western blotting), mas o processo não pode ser abreviado vez que as células não diferenciadas pode não ser uma boa representação de sucesso para células em diferenciação. Mais uma vez, o laboratório publicou múltipla sucesso shRNA constrói 14,20,21,23.
Usando este protocolo, mais pesquisadores pode estar activado para que possa melhorar significativamente transduções pobres anteriores. Alguns podem achar que é útil para aumentar as eficiências, fazendo alguns ajustes. Alguns podem usar esta ferramenta para descobrir novos processos biológicos ou para ser capaz de provar conceitos, ambos usando knockdown ou superexpressão estratégias.
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Acknowledgments
Agradecemos a Agência de Recuperação Vida Alliance Organ, da Universidade de Miami para fornecer pulmões. Agradecemos também o Dr. Lisa Künzi para a preparação de DNA utilizado para os experimentos mostrados na figura 2B e 3-D, Dr. Ben Gerovac e Lisa Novak para o vírus mCherry utilizado para os experimentos nas Figuras 3A a C. Também agradecemos Gabriel Gaidosh a partir da instalação de imagem do Departamento de Oftalmologia da Universidade de Miami.
Este estudo foi patrocinado por doações do NIH, a Fundação CF eo hospedeiros de bordo Medical Research Institute com o Dr. Matthias Salathe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | 12306C | use at 10% |
| DMEM | Thermo Scientific | 11995-040 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Thermo Scientific | 15140-122 | use at 1x |
| Collagen I | BD Biosciences | 354231 | dilute 1:75 in distilled water |
| Calphos | Clontech | 631312 | Transfection kit containing 2 M Calcium solution, 2x HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O |
| Polythylene glycol 8000 | VWR scientific | 101108-210 | stock of 40% |
| Amphotericin B | Sigma | A9528 | use at 1x |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Transwell 12 mm | Corning | 3460 | |
| Collagen IV | Sigma | C7521 | dilute 1:10 in distilled water |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | stock of 2 mg/ml |
| Puromycin (10.000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | use at 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 | lentiviral expression vector |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | packaging DNA |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | packaging DNA |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | packaging DNA |
References
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