Abstract
Hava yolu hücre farklılaşması ve fonksiyon işlemlerini incelemek için yararlı bir model hava-sıvı arayüzü koşulları sağlar kullanılarak primer insan bronş epitel (HBE) hücrelerin in vitro kültüründe. Son birkaç yıl içinde, transgen teslimat için lentiviral vektörleri kullanımı yaygın bir uygulama haline gelmiştir. belli olmayan HIV sözde yazılan Lentivirüslerden tamamen farklılaşmış solunum yolu epitel hücreleri iletimi raporlar varken, genel transdüksiyon verimliliği genellikle% 15'den az olduğunu. Burada sunulan protokol güvenilir ve etkili bir metot lentivirüsler üretmek ve primer insan bronş epitel hücreleri nakletmek için içerir. Hücreler takmak da 4 enfeksiyonun faktörü bir çoğu ile, farklılaşmamış bronşiyal epitel hücreleri, bronşiyal epitel büyüme ortamında transdüksiyonunu kullanılarak% 100'e yakın verimlilik sağlar. Bu protokol, adım-adım, yüksek titre lentiviral vektörler ve th hazırlanması ve konsantrasyon açıklare transdüksiyon süreci. Bu primer insan bronş epitel hücrelerinin yüksek verimli transductions elde etmek için uygun kültür koşulları tespit deneyleri anlatılır.
Introduction
Replikasyon-kusurlu, pseudotyped Lentivirüslerden gelişimi (LV) in vitro 1 transgenlerin sunmak için güvenli ve etkin bir yöntemle araştırmacılar sağlamıştır. Nedeniyle uzun vadeli ifade, bu AG, aynı zamanda, in vivo 2,3 terapötik maddelerin uygulanması için de kullanılabilir. LV üretimi birçok plazmid ile insan embriyonik böbrek (HEK) hücrelerinin ko-transfeksiyon için gereken: transfer vektörü, ambalaj gag / pol, ambalaj rev ve veziküler stomatit virüsü glikoproteini (VSV-G) plazmidler zarf. REV geni, böylece bir replikasyon yetkili lentivirüs üretilmesi için rekombinasyon olasılığını azaltarak ayrı bir ambalaj plasmid üzerinde kodlandığı için üçüncü nesil paketleme sistemleri ikinci kuşak sistemler daha güvenli olarak kabul edilir. İkinci nesil ambalaj sistemleri beş kat daha fazla toplam iletim üniteleri verim rağmen, orijinal viral genomun bölünmüş oluşturmak içinÜçüncü nesil sistem sadece minimal 3,4 transdüksiyon seviyesini azalmıştır.
Hücre hatları daha kolay ve verimli bir transduced edilebilir olsa da, bu in vivo daha iyi temsil 5,6 dokular, çünkü, araştırmacılar, birincil hücreler kendi yoğunlaştırdığını var. Bununla birlikte, birincil hücreler transdüksiyona dirençli bulunmaktadır. Farklılaşmış hava yolu epitel hücrelerinin transdüksiyonu rapor edilmiş olmasına rağmen, genel verimlilik% 15 7 aşmamıştır.
yüksek titre LVS üretimine olanak sağlayan bir protokol aşağıda tarif edilmiştir. Bir adım-adım yaklaşımı birincil HBE hücrelerine neredeyse% 100 transdüksiyon verim elde etmek için belirtilmiştir. Daha spesifik olarak, protokol 3 başarılı olmak için enstrümantal optimum kültür koşullarını tanımlamaktadır. Kısaca HEK 293T hücreleri gelişmiş yeşil floresan EF-1 promotörü tahrik ifade ile lentiviral ifade vektörü pCDH kullanılarak transfekte edilirprotein (EGFP) ya MCherry kırmızı flöresanlı protein ve bir üçüncü nesil ambalajlama sistemi. ortama salınan LVs sonra 24 saat 72 toplanır. Virüs partikülleri, p24 antijen enzim bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) kiti kullanılarak titre tahmin önce, polietilen glikol (PEG), viral konsantrasyona uygun ve kolay bir yöntem ile konsantre edilmiştir. 4 (MOI) bir faktör bir enfeksiyon çokluğunda (tripsinize sonra) takarken sonra, diferansiyasyonlu olmayan primer HBE hücreleri (heksadimetrin bromit ekleme ve 16 saat inkübe, proliferasyon ortam (bronşiyal epitel büyüme ortam ya Begm) 8 transdüksiyona bir gecede). Hücreler daha sonra ayırt etmek için izin verilir. Viral transgen (tartışma uygun promotör kullanılarak) uzun vadeli ifade edildiğinden, bu ifade bir yalancı solunum yolu epitelinde farklılaşma boyunca muhafaza edilir veya farklılaşmadan sonra (indüklenebilir bir promotör kullanılarak) indüklenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Aşama 1: HEK 293T Kültür
- Yüksek glikoz Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM)% 10 (h / h) cenin sığır serumu (FBS) ve% 1 (h / h), penisilin / streptomisin eklenmesi ile (HEK ortam olarak adlandırılır) HEK hücreleri ortamı hazırlar.
- Kat kollajen, kollajen I Çeşitli 30 ul bir damıtılmış su ve 2 ml bir kez 10 cm doku kültürü çanağı. Tabak üzerine yayıldı karışımı 37 ° C de 2 saat ve% 5 CO2 inkübe edilir.
- karışımı çıkarın ve 15 dakika boyunca bir laminer akış kabini bulaşık kurumaya bırakın.
- 10 mi HEK ortamında 1 x 10 6 hücre yoğunluğunda kaplanmıştır tabağa levhalar HEK hücreleri 37 ° C 'de inkübe etmek ve% 5 CO2.
- HEK hücreleri (2-3 gün sonra kaplama Şekil 1a)% 50-60 konfluent olduğunda, confluency 2. Görsel değerlendirme yeterlidir sahneye geçin. Hiçbir ölçümü gereklidir.
Not: HEK hücreleri (yukarıya bakın) HEK ortamda kültürlenir. Onlar confluency ulaşmak, they bölünmüş (örneğin 1/5) ya da daha sonra kullanılmak üzere aşağı dondurulabilir.
2. Aşama 2: HEK Hücreleri Üretimi ve Lentiviruses (karaciğer hacimleri) Yoğunlaşma
Not: protokolleri BSL-2 ABD'de + (gelişmiş BSL-2) koşullar altında kurumsal ve hükümet düzenlemelerine uygun olarak yürütülmelidir.
- Bir kalsiyum çökeltme prosedürü kullanarak Transfect (lipofektamin ve diğer transfeksiyon ajanları kalsiyum yağış prosedürü kadar verimli değildi). Prosedür aşağıdaki gibi tadil edilmiş olmasına rağmen, ticari bir transfeksiyon kiti kullanılarak yeniden üretilebilirliğinin temini için tavsiye edilir. Oda sıcaklığına Tüm reaktifler getirin. Bu gün 0'dır.
- HEK293 hücrelerinin her 10 cm tabak için, zarf DNA, pMD2-VSVG 4.5 ug, 7.5 ug DNA, pMDLg / pRRE ambalajlar, 3.75 ug DNA, pRSV-rev, lentiviral sentezleme vektörünün 10 ug DNA, 2 M, kalsiyum çözeltisinin 86 ul karıştırın ve 700 ul son hacim olması için 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne steril su(Bu sonraki iki çözüm, ticari transfeksiyon kiti temin edilmiştir).
- Bilge-Drop (transfeksiyon kitinde HBS) 2x HEPES tamponlu tuz 700 ul (laminer akış kabini içinde) vorteks ederken eklemek ve 30 dakika (beklerken adım 4 gerçekleştirin) oda sıcaklığında kuluçkaya yatmaktadır.
- Erken inkübasyon süresi boyunca, bir slayt karışımı mevduat 5 ul. Yavaş yavaş yukarı ve aşağı odaklanarak, 10X amacı ile mikroskop altında damlacık kontrol edin. İnce bir çökelti, kalsiyum fosfat çökeltme işlemi teyit görünür olmalıdır (Şekil 1b).
- karıştırmak için yukarı ve aşağı HEK hücreleri medya ve pipet 10 ml ilave edilerek 30 dakika sonra çökelmesini durdurun.
- Adım 2,1-2,5 den HEK hücrelerinin çanak alın ve orta (gün 0) çıkarın. yemeğin kenarından dikkatlice ve yavaşça adım 2.5 den çökelti çözüm ekleyin.
- Ertesi gün (gün 1) Açık, kaldırmak ve çökelti içeren orta atmak ve w yerineHEK ortamının i 10 mi. Mikroskop altında ince çökelti olup olmadığını kontrol edin: Bu hücreler (Şekil 1c ve d) arasındaki boş alanlarda tabağına görünür olmalıdır.
- 2. günde,% 40 polietilen glikol, 3.8 mi (PEG) çözeltisi ihtiva eden 15 ml'lik bir santrifüj tüpü içine, bir 0.45 um şırınga filtre ile bir şırınga filtresi ile ortam toplama. (PEG oluşturmak üzere çökeltilmesi, ancak 5 günden fazla için) virüsü koleksiyonları tüm tamamlanıncaya kadar Ters 5x en az 24 saat süre ile 4 ° C'de karıştırın ve saklamak için.
- gün 3 ve 4. günde 4. adımı yineleyin 2.8 HEK orta ile değiştirin ama% 10 çamaşır suyu ile temizleyin ve çanak atmayın.
- 4 ° C'de 20 dakika boyunca 1,650 x g'de santrifüjleyin tüm toplama tüpleri (birlikte, 5. günde genellikle tüm toplama) virüsü peletine. Süpernatantı çıkarın ve atın ve toplamak ve herhangi bir PEG süpernatant kalan çıkarmak için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.650 xg'de tekrar dönerler.
- Resuspend amfoterisin B 8 olmayan bronşiyal epitel büyüme ortam (Begm) 200 ul her bir tüp pelet. araya havuzuna ve 200 ul tümbölen. -80 ° C'de saklayın virüsü. HIV-1 Gag (P24) antijen ELISA deneyi gerçekleştirmek için ilave bir 10 ul tablet.
- ticari bir ELISA kiti kullanılarak üreticinin protokolüne göre, bir p24 antijen tahlilini gerçekleştirmek. Tahlil pg / ml viral p24 bir tahmin verir.
3. Aşama 3: Kültür İlköğretim HBE Hücreler
- 10 mi Begm ortam Plaka HBE hücreleri I 10 cm doku kültürü çanağı kaplanmış bir kolajen 1 x 10 6 hücre yoğunluğunda (100 ul amfoterisin B kanalı 0 hücreleri mümkün fungal kirlenmeyi elimine etmek için kullanılması durumunda). 37 ° C'de inkübe edilir ve% 5 CO2.
- Bir sonraki gün, ortam çıkarın ve 4 günlük bir toplam (geçişi için 100 ul amfoterisin B 0 hücreleri) 10 mi Begm ile değiştirin. inkübatör dönmek.
- 4 Gün sonraays, her geçen gün amfoterisin B Değişim medya olmadan sadece Begm kullanın.
- Hücreler% 80-90 ortak akışlı (Şekil 2a; ~ 7 gün sonra kaplama) olduğunda, transdüksiyon devam (transdüksiyon öncesi hazırlık için 3.5 dikkat). Yine, konfluent görsel değerlendirmesi yeterlidir. Hiçbir ölçümü gereklidir.
- transdüksiyon önce, ceket kolajen IV çözeltisi ile geçirgen destek uçlar steril damıtılmış su ile 1/10 seyreltilmiştir. Her ekleme 200 ul ekleyin ve laminer akış kabini kuru gecede izin verin.
4. Aşama 4: HBE Hücreler İletimi
- Ortamı çıkarın fosfat tamponlu tuzlu su (EDTA / PBS) içinde 1 mM etilendiamintetraasetik asit,% 0.1 tripsin 3 ml ilave edilir ve 37 ° C'de 5 dakika ve% 5 CO2 inkübe edin. tüm hücreleri müstakil olup olmadığını görmek için mikroskop (10X objektif) altında kontrol edin. Aksi takdirde, ilave bir 5 dakika boyunca inkübatör dönmek.
- tüm hücreleri müstakil zaman, 3 eklemeksoya fasulyesi tripsin inhibitörü mi (SBTI 1 mg / ml) karışımı ve 15 ml santrifüj tüpüne transfer. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 460 x g'de iplik hücreleri Pelet.
- Begm 3 ml içine süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın ve sayma işlemine devam edin.
- Begm 400 ul (bakınız Tablo 2) 'de, bir 12 mm geçirgen destek uç başına 2 x 10 5 hücre oranında yeniden süspanse HBE hücreler (şimdi kanalı 1 ya da P1). transduced edilecek geçirgen destek ekler miktarına göre bu sayıları tahmin.
| Yüzey | Yüzey alanı | Hücre sayımı | medya | Hacim (medya) |
| 10 cm çanak | 52.7 cm2 | 1 x 10 6 | begm | 10 mi | </ Tr>
| 12 mm filtre | 1.13 cm2 | 2 x 10 5 | begm | 400 ul |
| 24 mm filtre | 4.52 cm2 | 8 x 10 5 | begm | 800 ul |
Tablo 2: hücre sayımı başına Medya sınırlandırmaktadır.
- 4 enfeksiyon (MOI) faktörünün çok sayıda kullanılarak, hücre süspansiyonunun virüsün uygun hacimde ekleyin.
- 2 ug / ml nihai konsantrasyona heksadimetrin bromit ekleyin.
- apikal bölmeye geçirgen destek insert başına mix (Begm, HBE hücreleri, virüs ve hexadimethrine bromür) 400 ul koyun ve bazolateral bölmeye tek başına Begm 1 ml ekleyin. Kontrol ve test puromisin seçimi varsa da virüs olmadan 37 ° C ve% 5 CO 2. Her zaman plaka HBE hücreleri gecede inkübe.
- Ertesi gün, rem üzerindeove en üst ve taban ortamı, PBS ile yıkayın ve hava-sıvı arayüzü (ALI), medya 8 her iki bölümü değiştirin.
- Hücreler birleştiklerinde, ne olursa olsun, (bir hava-su ara-yüzünün kurulması olarak da bilinir), apikal sıvıyı. onlar tam olgunluğa ulaşana kadar alt bölmeye her gün de orta (ALI) değişen devam edin; genellikle 3 ila 4 hafta sonra.
Not: lentiviral vektör, puromisin gibi bir seçim genini ihtiva ise hücreler bir seçme konsantrasyonu eğrisine göre puromisin eklenerek seçilebilir. HBE hücreleri için, 1 ug / ml bir konsantrasyon kalıt aktarımlı hücrelerin istikrarlı seçimi için ideal olduğu tespit edilmiştir. Bununla birlikte, bu konsantrasyon diğer hücrelere veya koşullar için farklı olabilir ve eğrileri öldürerek belirlenmelidir. Medya seçimi geninin tam ifadesini izin sonrası ALI medya ya da (2-3 gün) tarafından değiştirildikten sonra puromycin ilavesi gibi erken bir sürede güne başlayabilirsiniz. bir parçanın bu h puromisin eklemek için emin olunolarak transduced edilmemiştir. Hücreler tamamen farklılaşmış kadar puromycin eklenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 1a Şekil. Transfeksiyon sürecinde hücreleri ve çözümleri değerlendirmek farklı anahtar adımları göstermektedir önce virüs üretimi için transfeksiyon için HEK293T hücrelerinin optimum confluency gösterir. Hücreler çanak boyunca eşit olarak dağıtılmış olması önemlidir. 1b parlak bir alan optik ve 10X objektif kullanılarak transfeksiyon karışımı bir damla çökelti ortaya Şekil. Daha fazla çökeltiler kum taneleri yerine aglomeralarla benziyor, daha verimli transfeksiyon olacaktır. Bu resimde, çökelti biraz kabadır. Çökelek transfeksiyon virüsünün yüksek titresi üretecek olup güvenilir bir göstergedir. maddelerden herhangi eksik veya kalitesiz (örneğin vektör DNA) ya ise, topaklar uğursuz bir işaret olduğu, oluşturacaktır. Bu durumda, o emin, iptal ve prosedürü yeniden başlatmak için akıllıcaTüm katkı maddeleri karışımı, ve / veya vektör DNA ve paketleme DNA kalitesini kontrol etmek. Gece boyunca inkübasyondan sonra, 1c A ile aynı çanak göstermektedir. Çökelek (ve olmalıdır) hücreler arasında görünür. Biz hücreler 24 saat aşağıdaki transfeksiyon sırasında çok çarpma olmadığını fark ettim.
HBE Hücreler daha önce bakmak ve iletimi. Şekil 2a 3 gün sonra trypsinization ve transdüksiyon öncesinde yaklaşık% 80 konfluent birincil HBE hücreleri gösteriyor nasıl Şekil 2. % 80 izdiham A 10 cm çanak yaklaşık 4 x 10 6 hücre verir. Şekil 2b geçirgen destek insert üzerinde 4'lük bir İçişleri Bakanlığı ile farklılaşmamış P1 HBE hücrelerinin yaklaşık% 100 iletimini göstermektedir. HBE Hücreler bu geçirgen destek ekler üzerinde kaplama zaman, hücreler nispeten düzdür. Bu resimde, hücrelerin yüksekliği açıklar neden sadece birkaç mikron0,4 mikron gözenekleri hücreler olsa görebilir.
Şekil 3, sunulan protokol giden optimizasyon deneyleri gösterir. Tüm deneyler, göz başına 2 x 10 5 primer HBE hücreleri ile, kolajen I kuyucuklar (24 çukurlu plaka) üzerine üç kez gerçekleştirilmiştir. Çoğu deney Begm ortam bromidein heksadimetrin bir 2 ug / ml nihai konsantrasyonuna sahip 0.4 MOI kullanılır. Flöresanlı hücreler 3 gün transdüksiyon sonra sayılmıştır. Protokolün ilk optimizasyon plastik üzerinde gerçekleştirilen olsa bile, sonuç geçirgen destek ekler teyit edilmiştir. Buna ek olarak, önceki raporlar teyit (veriler gösterilmemiştir) başarılı olamadı tamamen farklılaşmış P1 HBE hücreleri nakletmek için çalışır. Şekil 3a'da görüldüğü gibi, HBE hücrelerinin daha yüksek bir yüzdesi ALI göre Begm medya iletilir. Hücreler Begm medya iletimi gün önce kaplama ise, verimlilikhücreleri (Şekil 3b) takılarak ise transducing göre anlamlı derecede düşme olduğu. P1 HBE hücreleri (yerine Begm arasında) ALI medyada transdüksiyon bir gün önce kaplama zaman, transdüksiyon verimliliği (veriler gösterilmemiştir) daha da azalır. Bu 2 ortamı arasındaki fark, kalsiyum konsantrasyonudur. Begm ortam ALİ ortam (1 mM) ile karşılaştırıldığında kalsiyum (0.1 mM), düşük konsantrasyonu içerir. Kalsiyum formları ve sıkı kavşaklar korur ve virüs parçacıkları 9 çapraz ve bazolateral membran kendi reseptörlerini erişmek için bu nedenle zor yapabiliriz. Aslında, bazı enfeksiyonlar, örneğin 10 etilen glikol tetraasetik asit (EGTA) ile sıkı kavşaklar bozarak düşük seviyelerde başarılı olmuştur. Daha önce belirtildiği gibi, tam olarak farklılaşmış P1 HBE hücreleri direnç gösteren ve yüksek olması nedeniyle, kalsiyum ihtiva eden ortam içinde sıkı bir bağlantı yerlerine olabilir, düşük verimlilik, 5-7, transdüksiyona edilebilir. başka bir açıklamasıTamamen farklılaşmış hücrelerin düşük transdüksiyon verimliliği mukus bir bariyer olarak hareket olabilir aktif Mukosiliyer ulaşım mekanizmasıdır. Bals ve ark. Tarafından bildirilen veya, HBE hücreleri olduğu farklılaşma aşamasında, transdüksiyon verimliliği 10 bir belirleyici etkendir. Daha fazla hücre ALI ortam daha Begm transdüksiyona olsun olması, bu açıklama (Şekil 3a) destekler.
Şekil 3b'de de görüldüğü gibi hücreler hücrelere kıyasla takarken transdüse edildiğinde, yaklaşık% 50 transdüksiyon verimliliği bir artış bir gün önce, kaplama gözlenmiştir. Transdüksiyon tripsinizasyonu 11 sonra yapıldığında yaptıkları çalışmada, Ricks ve ark.,% 20 oranında bir artış gösterdi. Birlikte, bu sonuçlar medya ve hücrelerin olgunluk durumu transdüksiyon başarının anahtarı olduğunu göstermektedir.
Şekil panel3c, heksadimetrin transdüksiyon verimliliği atrivial rol bromideplaying gösterir. hiçbir olumsuz etkisi vardır çünkü Bununla birlikte, kullanımı bu protokolde önerilmektedir ancak potansiyel olarak yararlı olabilir. Heksadimetrin bromit transdüksiyon verimliliği 12 geliştirmek için viroloji kullanılan bir katyonik polimerdir. Diğerleri protamin, başka katyonik polimerin kullanımını yayınlanmış, ancak anlamlı bir fark hexadimethrine 13 bromür ile karşılaştırıldığında iletim verimliliği konusunda bulundu. Hexadimethrine bromür büyüme ne de farklılaşmasını 14-16 etkilemez.
Son olarak, farklı Mois Şekil 3d araştırılmıştır: En yüksek iletim verimliliği İçişleri 0.4 ve 4 arasında anlamlı bir fark yoktu 4'ün bir İçişleri Bakanlığı ile meydana gelen, ancak İçişleri Bakanlığı 4 İçişleri Bakanlığı 0.4 iken HBE hücrelerinin% 100 transduced sadece% 75 transduced. İçişleri Bakanlığı virüs wi parçacıklar kaç tanımlarbir hücreyi enfekte potansiyeline sahip olacak. İçişleri Bakanlığı belirlemek için farklı yöntemler vardır. Bunlardan biri iletim birimi (TU) sayısını belirlemektir. bir ELISA kullanılarak, p24 antijen miktarı, pg / ml cinsinden belirlenebilir. pikogram viral p24 MOI hesaplanması için gerekli olan TU, dönüştürülebilir. İçişleri Bakanlığı hücrelerinin sayısına göre TU sayısına bölünmesiyle hesaplanır. pikogram p24 başına 10-100 iletim üniteleri (TU) bulunmaktadır. İçişleri Bakanlığı ile ilgili metinde bütün referanslar pikogram p24 başına 100 TU ile hesaplamalara dayanır. (Http://tronolab.epfl.ch/webdav/site/tronolab/shared/protocols/TUvsp24.html).
Şekil 1:. 10X objektif altında görüldüğü gibi HEK 293T hücrelerinin Transfeksiyon (a) HEK 293T hücreleri% 50-60 confluency büyüdü. (B) reage karıştırıldıktan sonra, 5 ul damla 5 dakika içinde gözle görülen bir çökeltimikroskobu (10X objektif) kapsamında NTS. (C) bir karışımı, transfeksiyon (10X objektif) sonra hücreler, bir sonraki kabı tortular. (D) (c) 'nin merkezi büyütme. Beyaz ok işaret çöktürmek için. Ölçek çubuğu = 100 mikron; a, b ve c için aynıdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: NHBE hücreleri İletimi (a) HBE hücreler 5 gün boyunca Begm ortamı% 80-90 konflüansa (yaklaşık olarak 4 x 10 6 hücre) (10X objektif) bir kolajen I kaplı tabak içinde büyütülür.. Ölçek çubuğu = 100 mikron. (B) eGFP geçirgen destek ekler (12 mm), 3 gün sonrası transdüksiyon (konfokal, 20X) hakkında HBE hücreleri transduced. Bu konumda, HBE cel ls düz ve zarının gözenekleri görebilir. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: iletim protokolünün optimizasyonu transdüksiyon verimliliği medya (a) etkisi.. Takarken (b) HBE hücrelerinde iletimi karşılaştırılması gün önce ve hücrelerin iletimini kaplı. (C) iletim verimliliği hexadimethrine bromür etkisi. Farklı Mois kullanarak gelişmiş iletim verimliliği (d) Değerlendirme. Analiz Student t-testi veya Kruskal-Wallis ve Dunn çoklu karşılaştırma testi kullanılarak yapıldı. Hata çubukları SE temsil ve tüm * p <0.05 temsil etmektedir.ww.jove.com/files/ftp_upload/54176/54176fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada özetlenen protokol% 100 iletim verimliliği yakın sağlar. Bununla birlikte, bu hedefe ulaşmak için önemli olan işlem sırasında adım vardır. Örneğin, transfeksiyon işlemi sırasında, transdüksiyon karışımı çökeltilerin varlığı (damla) veya çanak transdüksiyon (Şekil 1b ve d) gün sonra iyi bir transfeksiyon için uygun hem de. bir çökelti ya da topakların bulunması olmaması transfeksiyon reaktifleri birinin bir eksiklik, bir pH sorun, ya da kötü bir plazmid hazırlama nedeniyle olabilir. çökelti eksik ise, hiçbiri ertesi gün görünür olacak ihtimali çok yüksek bulunmaktadır. Ayrıca, transfeksiyon ve verimi engelleyici, HEK hücreleri ayırmak neden olabilir çok hızlı transfeksiyon karışımı veya HEK medya ekleyerek. İyi bir verim diğer bir göstergesi santrifüj aşamasından önce 6 gün olan beyaz bir çökelti tüpün alt görünür olmalıdır. Neredeyse ile kötü transfeksiyonhiçbir virüs bu beyaz çökelti oluşturmaz. iletim sürecinde, de-farklılaşmış ve yüksek iletim verimliliği elde etmek için devlet gibi bir kök hücre vardır edilmiş birincil HBE hücrelerini kullanmak için çok önemlidir. Kolayca görüntülenmiştir örneğin eGFP ya mCherry gibi bir floresan protein ihtiva eden bir vektörün kullanımı iyi bir araç olabilir.
Değişiklikler Farklı birincil hücreler için bu protokolü adapte yapılabilir. Bir yaklaşım medyada kalsiyum konsantrasyonunu azaltmak olacaktır. Birincil HBE hücrelerinde önemli ölçüde daha yüksek transdüksiyon verimliliği ile sonuçlanmıştır kalsiyum daha düşük bir konsantrasyonda içerir Begm ortamı kullanılarak, Şekil 3a'da görüldüğü gibi. Başka bir yaklaşım İçişleri Bakanlığı artırmak olabilir. Şekil 3d, yüksek İçişleri Bakanlığı, daha iyi iletim verimliliği gösterildiği gibi. Ancak, daha yüksek İçişleri Bakanlığı kullanarak bazı hücrelere toksik hale gelebilir.
Bununla birlikte, bazı kısıtlamalarla vardır Bu protokole leri. Bu teknik, pasajı 1 HBE hücreleri kullanılarak geliştirilmiştir. nakli için reddedilen Akciğerler Helsinki ilanından tarafından belirlenen standartlara araştırma uymadığım için uygun rızası ile elde edilmiştir. ticari kaynaklardan primer HBE hücreleri elde pahalı olabilir. Bu hücreler aynı zamanda genellikle daha yüksek bir geçit de kullanılabilir. Bu protokol Başka sınırlayıcı faktör p24 ELISA antijen tahlil 2'den yüksek geçişleri üzerinde test edilmemiştir. Birçok şirket kiti ancak yüksek maliyetle sunuyoruz. Buna ek olarak, tahlil tarafından verilen viral konsantrasyon test lentivirüs p24 ve geçici transfeksiyon 17 sırasında ortaya çıkan serbest p24 algılar çünkü sadece yaklaşık bir değerdir. Bu nedenle, İçişleri Bakanlığı bu değerlendirme sadece bir tahmindir. Son olarak, farklı ifadesini kullanarak aynı sonuçları vermeyebilir (boyut olarak büyük veya küçük) oluşturur. Örneğin, muhtelif etkinliklerindeki mCherry ve eGFP (veriler gösterilmemiştir) kullanılarak kaydedildi.
ent "> avantajları, diğer yöntemlere göre, bu protokol vardır. Bunlardan biri, transfeksiyon işlemidir. Aslında önerilen protokol virüsleri ihtiva eden toplanan ortam artık konsantre edildi gerekecektir yüksek virüs titreleri elde ve kullanılabilir şirketinden. virüsü konsantre Bu protokolde kullanılan polietilen glikol (PEG), memeli hücreleri 18 karşı toksik olduğu bilinmektedir hücreleri. transdüksiyonu için daha yüksek bir MOI kullanıldı, buna ek olarak, bu daha fazla toksisite riski artar. Bununla birlikte, PEG konsantrasyonu adım eski hale gelirse, başarısız olmuştur araştırmacılar Lentivirüslerden kullanımını yeniden gözden geçirebileceğini toksisite etkileri nedeniyle uyum sağlamak. Bu protokolün diğer bir avantajı plastik veya geçirgen destek ekler üzerinde iletim verimliliği farklılıklar olmaması. olmanın yararı plastik transdüksiyonu için mümkün hücre ve virüs parçacıkları gereklidir az. Bunun bir sonucu olarak, hücrelerin, gerek post transdüksiyon genişletilmiş transfer edilebilmesidirkonfluent (veriler gösterilmemiştir) zaman geçirgen destek ekler üzerine.Vektörlerin seçimi, yeşil flüoresan protein (GFP) gibi puromisin veya işaret proteinlerinin ekspresyonu ile dönüştürülmüş hücrelerin seçimi gibi çeşitli konularda, bağlıdır. Uygun (pRRLsinPPT.CMV.MCS.Wpre, pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro, pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro, pGEM-T Kolay) 15,19-21 olan mevcut çoklu ticari vektörler vardır. Yaygın olarak kullanılan CMV promoter farklılaşmış hava yolu epitel hücrelerinde 15 susturuldu beri ortakların seçimi, meydan okuyucudur. kirpikli hücreye özel ekspresyon için, tilki J1 promoterinin kullanılması tavsiye edilir. Seçenek olarak ise, EF-1 promotörü, tüm hava yolu hücreleri 20,21 ekspresyon için kullanılabilir. proteini aşırı ekspresyonu isteniyorsa, eklemenin boyutu parçası transdüksiyon verimliliği, belirleyecektir. Tam uzunlukta çözünür adenilat siklaz 2 başarılı iletimi ile görüldüğü gibi Ancak, büyük boyutlarda kalabilirler2 hayranlarıyla laboratuvar yayınladı birçok başarılı aşın 15,16,20-22 oluşturur. (Genellikle U6 veya H1 promotör altında) ShRNA ifadesi için, birden fazla yapıları keşfedilmeyi gerekecektir. Bu farklılaşma (PCR ve batı blot) sonunda yapılan testlerle sıkıcı olabilir, ancak olmayan farklılaşmış hücreler farklılaşma geçiren hücreler için başarı iyi bir temsil olmayabilir çünkü süreç kısaltılmış edilemez. Yine, laboratuvar yayınladı birden başarılı shRNA 14,20,21,23 oluşturur.
Bu protokolü kullanarak, daha fazla araştırmacılar önemli ölçüde önceki kötü transductions iyileştirmek için etkin olabilir. Bazı yararlı bir kaç ayarlamalar yaparak verimliliği artırmak için bulabilirsiniz. Bazı yeni biyolojik süreçleri keşfetmek için bu aracı kullanabilirsiniz olabilir ya da her ikisi devirme veya ekspresyonu stratejileri kullanarak, kavram ispat edebilmek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz akciğerleri sağlamak için Miami Üniversitesi Yaşam Alliance Organ Kurtarma Ajansı teşekkür ederim. Ayrıca Ayrıca Gabriel Gaidosh ederiz Şekil 2B ve 3-D, C Şekil 3A'da deneyler için kullanılan MCherry virüsü Dr. Ben Gerovac ve lisa Novak gösterilen deney için kullanılan DNA hazırlanması için Lisa KUNZI ederiz görüntüleme tesis, Miami Üniversitesi'nde Göz Hastalıkları Anabilim Dalı.
Bu çalışma NIH, CF Vakfı ve Dr. Matthias Salathe Uçuş Görevlisi Tıbbi Araştırma Enstitüsü hibe sponsorluğunda edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | 12306C | use at 10% |
| DMEM | Thermo Scientific | 11995-040 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Thermo Scientific | 15140-122 | use at 1x |
| Collagen I | BD Biosciences | 354231 | dilute 1:75 in distilled water |
| Calphos | Clontech | 631312 | Transfection kit containing 2 M Calcium solution, 2x HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O |
| Polythylene glycol 8000 | VWR scientific | 101108-210 | stock of 40% |
| Amphotericin B | Sigma | A9528 | use at 1x |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Transwell 12 mm | Corning | 3460 | |
| Collagen IV | Sigma | C7521 | dilute 1:10 in distilled water |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | stock of 2 mg/ml |
| Puromycin (10.000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | use at 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 | lentiviral expression vector |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | packaging DNA |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | packaging DNA |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | packaging DNA |
References
- Ding, B., Kilpatrick, D. L. Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons. Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).
- Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Jr Gene therapy progress and prospects: development of improved lentiviral and retroviral vectors--design, biosafety, and production. Gene Ther. 12, 1089-1098 (2005).
- Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnol. 13, (2013).
- Delenda, C. Lentiviral vectors: optimization of packaging, transduction and gene expression. J Gene Med. 6 Suppl 1, S125-S138 (2004).
- Gresch, O., Altrogge, L. Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells. Methods Mol Biol. 801, 65-74 (2012).
- Jordan, E. T., Collins, M., Terefe, J., Ugozzoli, L., Rubio, T. Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells. J Biomol Tech. 19, 328-334 (2008).
- Castillon, N., et al. Regeneration of a well-differentiated human airway surface epithelium by spheroid and lentivirus vector-transduced airway cells. J Gene Med. 6, 846-856 (2004).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. 107, 183-206 (2005).
- Gonzalez-Mariscal, L., et al. Role of calcium in tight junction formation between epithelial cells. Am J Physiol. 259, C978-C986 (1990).
- Bals, R., et al. Transduction of well-differentiated airway epithelium by recombinant adeno-associated virus is limited by vector entry. J Virol. 73, 6085-6088 (1999).
- Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 17, 441-450 (2008).
- Davis, H. E., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 97, 159-172 (2002).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, 341-347 (2013).
- Manzanares, D., et al. Functional apical large conductance, Ca2+-activated, and voltage-dependent K+ channels are required for maintenance of airway surface liquid volume. J Biol Chem. 286, 19830-19839 (2011).
- Schmid, A., et al. Real-time analysis of cAMP-mediated regulation of ciliary motility in single primary human airway epithelial cells. J Cell Sci. 119, 4176-4186 (2006).
- Unwalla, H. J., Ivonnet, P., Dennis, J. S., Conner, G. E., Salathe, M. Transforming growth factor-beta1 and cigarette smoke inhibit the ability of beta2-agonists to enhance epithelial permeability. Am J Respir Cell Mol Biol. 52, 65-74 (2015).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6, (2006).
- Schneiderman, S., Farber, J. L., Baserga, R. A simple method for decreasing the toxicity of polyethylene glycol in mammalian cell hybridization. Somatic Cell Genet. 5, 263-269 (1979).
- Schmid, A., et al. Soluble adenylyl cyclase is localized to cilia and contributes to ciliary beat frequency regulation via production of cAMP. J Gen Physiol. 130, 99-109 (2007).
- Manzanares, D., et al. Airway Surface Dehydration by Transforming Growth Factor beta (TGF-beta) in Cystic Fibrosis Is Due to Decreased Function of a Voltage-dependent Potassium Channel and Can Be Rescued by the Drug Pirfenidone. J Biol Chem. 290, 25710-25716 (2015).
- Manzanares, D., et al. IFN-gamma-mediated reduction of large-conductance, Ca2+-activated, voltage-dependent K+ (BK) channel activity in airway epithelial cells leads to mucociliary dysfunction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L453-L462 (2014).
- Chen, X., et al. A soluble adenylyl cyclase form targets to axonemes and rescues beat regulation in soluble adenylyl cyclase knockout mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 51, 750-760 (2014).
- Ransford, G. A., et al. Pannexin 1 contributes to ATP release in airway epithelia. Am J Respir Cell Mol Biol. 41, 525-534 (2009).
