Abstract
组织工程和细胞治疗临床上具有很大的希望。在这方面，多能细胞，如间充质干细胞（MSC），可以用于治疗，在不久的将来，恢复功能受损的器官。尽管如此，一些技术问题，包括分离MSC和周围的放大的低效率的高度侵入性过程，目前阻碍潜在临床使用这些治疗方法的。这里，我们引入去分化的脂肪细胞（DFAT），MSC样细胞的产生一种高效的方法。有趣的是，DFAT细胞可以分化成多种细胞类型，包括脂肪形成，成骨和软骨形成细胞。虽然其他团体先前已经提出从成熟脂肪组织产生DFAT细胞的各种方法，我们的方法使我们能够更有效地生产DFAT细胞。在这方面，我们表明，DFAT培养基（DCM）中，FBS的补充有20％，是在产生DFAT细胞比的DMEM，补充有20％FBS的更有效。此外，通过我们的细胞培养方法生产的DFAT细胞可以再分化成几个组织类型。因此，一个非常有趣和有用的组织分化的研究模型。
Introduction
细胞治疗和组织工程是在再生医学1-5领域热点话题。虽然这些治疗方法具有很大的希望，一些技术问题目前阻碍其临床应用。在这方面，如在iPS细胞的产生，所有组织工程的治疗必须产生自由外部基因转导的细胞中，以维持患者的安全。因此，我们成功地制造人类细胞DFAT 6第一组。其他几个研究组已经自从采用我们的方法，以产生哺乳动物来源7-9 DFAT细胞，进一步凸显了模型的有效性。
以上几项研究的过程中，我们发现，细胞培养环境的质量可以通过调节细胞培养基的内容进行修改。这个发现导致增加DFAT电池生产的成功率，提高小区质量;在这两个关键因素有效地产生用于将来的临床试验的细胞。在这方面，一种改进的DFAT培养基（DCM中，一个介质类似于间充质干细胞培养基，其中包含重组人胰岛素，血清白蛋白，L-谷氨酸，几个脂肪酸和胆固醇）和DFAT细胞生成的方法和增殖，开发（约DCM的内容的更多信息可应要求提供）。与分化成多种细胞类型，包括脂肪形成，成骨和软骨形成细胞的能力中产生用此方法的高质量DFAT细胞。总之，这验证了细胞培养协议增强DFAT细胞的质量和可用于增强细胞治疗和组织工程的临床应用中十分有用。
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Protocol
在整形外科，泌尿外科，小儿外科和日本大学板桥医院（东京，日本）的矫形外科的部门接受手术的患者中，获得了人类皮下脂肪样本。患者签署知情同意书，和医学的日本大学伦理委员会批准了这项研究。
1.组织准备
- 从手术室到实验室使组织样品。
- 洗涤1-2克脂肪组织用5ml的PBS（ - ）在室温（RT）下一次，在50ml管中，然后将在10cm的塑料盘的样品。
2.胶原酶消化
- （ - ）从PBS取出样品，然后加入10毫升的无菌0.1％（重量/体积）的胶原酶溶液（胶原酶II型），以含有所述组织样本的菜。
- 讳言与外科剪刀组织约15分钟，直到它到达一个泥组成ency。
- 接着，消化在0.1％的组织糜（重量/体积）胶原酶在37℃下进行30分钟（每分钟60转）中的50ml管振荡器上轻轻搅拌溶液。
- 过滤通过100微米的过滤器将消化的样品到50毫升管中。接着，通过10ml DCM中的（见材料的表 ）通过过滤器补充有2％FBS的。
3.细胞分离
- 离心过滤的细胞以100×g离心在RT 1分钟。
- 在这一点上，制备溶于5ml DCM中补充有在50ml管中的2％FBS的。
- 接着，绘制了使用1000微升吸管漂浮脂肪细胞，将细胞添加至含有50毫升管中。
- 随后，轻轻摇晃50毫升管混合的细胞DCM网上平台。
- 然后，离心管中，于100×g离心在RT 1分钟。
- 用18G的针和20毫升注射器丢弃在管底部的介质。
- 接下来，加入10 mL DCM的S有2％FBS upplemented向收集的细胞。
- 通过轻轻摇晃50毫升管与细胞混合DCM。
- 离心管中，于100×g离心在RT 1分钟。
4.电镀细胞
- 添加41毫升DCM或DMEM中补充有20％FBS的一个12.5厘米烧瓶中。
- 接着，用200μl移液管添加40μl的脂肪细胞的烧瓶中。
- 然后，填充用DCM或DMEM补充有20％FBS的烧瓶中。关键步骤：在这一点，确保细胞在整个介质传播。目视检查脱落的细胞，之后保持一个圆形培养皿的盖子瓶以保持其平整。
- 最后，放置在培养箱内的烧瓶中，并把它在一个5％CO 2培养箱不受干扰在37℃下7天。
- 孵化一个星期之后，反转瓶和检查DFAT细胞。接下来，评估如因为在这一点上fibrobl描述10 DFAT细胞生成能力AST样细胞（DFAT细胞）位于从脂肪细胞中不同的区域。
- 加5毫升DCM中或DMEM之后除去前面的细胞培养基补充有20％FBS的烧瓶中。允许DFAT细胞改变介质后成长为一个星期。
- 使用细胞计数器，计数各个细胞培养条件（DCM与DMEM）下产生DFAT细胞的数目。
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Representative Results
在这项研究中，DFAT细胞生成的方法和工具包进行了改进（ 图1）。我们的方法允许我们使用DCM和含有20％FBS的（ 图2A）的DMEM培养基中，以产生DFAT细胞。因此，我们比较DCM和DMEM中在产生DFAT细胞的效率。在这方面，相比于DMEM时，无论脂肪细胞的数量（ 图2A和B）的DCM中增强由三次DFAT细胞增殖。用20％相比，使用10％FBS的（数据未示出）的协议时的FBS也增强细胞生长。我们进一步证实，使用DCM产生DFAT细胞具有再分化成脂肪细胞和成骨细胞分化（ 图3）的能力。用于测定的方法，在我们以前的研究6进行说明。
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图 1： 示意性描绘的分离，去分化，和成熟脂肪细胞的培养一小块脂肪组织中的溶液用0.1％胶原酶消化。离心后，单房脂肪细胞从浮层分离。分离的细胞在填充有含20％FBS的7天培养基瓶中培养。期间培养，细胞附着和扁平的瓶的上表面上，然后转化为DFAT细胞。接下来，将瓶倒置，用传统的方法进行培养DFAT细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：DCM 增强DFAT细胞的产生。 （
图 3：用DCM生成DFAT细胞多向潜在人DFAT细胞在适当的诱导培养基来评价DFAT细胞的再分化和分化的能力培养3周。的C厄尔进行了分析骨碱性磷酸酶（ALP和茜素红S），脂肪细胞（油红-O）的能力。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
成熟脂肪细胞的进行体外分化，被称为天花板文化的过程，可以恢复到一个更原始的表型和增殖获得能力。这些细胞被称为去分化脂肪（DFAT）细胞。 DFAT细胞的多向分化潜能进行了评价。流式细胞术分析和基因表达分析表明，DFAT细胞相比的ASC 6是高度均匀的。事实上，DFAT细胞的细胞表面抗原轮廓是非常类似于在携带者6找到。因此，DFAT细胞可能功能类似于干细胞。
已成功生成利用补充有20％小牛血清的7-8的DMEM F12细胞培养基DFAT细胞，另一组。虽然我们尝试使用补充有10％FBS的细胞培养基以产生DFAT细胞，用该协议产生DFAT细胞数的W显著低母鸡补充有20％FBS的（数据未示出）。因此，在FBS浓度和/或它的内容为DFAT细胞或分化和/或DFAT细胞增殖重要的。作为未来研究的一部分，我们将尝试进一步阐明由血清含量支配DFAT细胞的产生和增殖的机制。另一方面，DCM含有较少的葡萄糖，脂肪酸和其它化学品比DMEM在我们的研究中使用。这种变化在细胞培养基成分可以调节两个DFAT细胞的产生和生长的效率。实际上，低的葡萄糖浓度略提高DFAT细胞生成的使用DMEM时的效率（数据未显示）。虽然上DFAT细胞生成和生长底层DCM的效果的确切机制是未知的，我们在这里假定，某些介质成分的浓度驱动这些细胞事件。还需要进一步的研究来澄清这一点。此外，由于我们已经测试了LIMITE的DMEM制剂d的数目，则需要进一步的实验生产DFAT细胞比较其它的DMEM变化（ 例如 ，DMEM含有L-谷氨酰胺或吡哆醇）的效率。
虽然我们能够生产DFAT细胞，执政DFAT细胞生成的分子机制目前还不清楚。类似的问题围绕生产iPS细胞11。因此临床上使用这些治疗方法都需要的细胞状态的调节机制进一步探索。因此，我们坚信，DFAT细胞阐明提供了一个模型细胞是如何返回到干细胞样状态，不受外界的基因转导的。因此DFAT电池生产协议，目前正在优化，为今后的临床试验中使用。
确保胶原酶处理和脂肪细胞的分离都被正确执行是在成功地产生使用该协议DFAT细胞的关键因素。 APPR培养期间opriate使用细剪刀和去除气泡的也有助于增强DFAT细胞增殖。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CSTI303-MSC medium | CSTI | 87-671 | This medium is defined as DCM in the text |
| PBS(-) | Wako | 166-23555 | It does not contain Mg2+ and Ca2+ |
| DMEM medium | Gibco | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 172012 | |
| Collagenase type II | Sigma | C-6885 | |
| Scissors | Takasago Medical Industry Co., Ltd | TKZ-F2194-1 | |
| Shaker | TAITEC | Bioshaker V.BR-36 | |
| Falcon Cell Strainer 100 μm Yellow | CORNING LIFE SCIENCES | DL 352360 | |
| Falcon 12.5 cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Blue Vented Screw Cap | CORNING LIFE SCIENCES | 353107 | |
| 18 G needle | NIPRO | 02-002 | |
| 20 ml Syringe | NIPRO | 08-753 | |
| Z Series Coulter Counter | BECKMAN COULTER | 383550 |
References
- Lanzoni, G., et al. Concise review: clinical programs of stem cell therapies for liver and pancreas. Stem Cells. 31 (10), 2047-2060 (2013).
- de Girolamo, L., et al. Mesenchymal stem/stromal cells: a new "cells as drugs" paradigm. Efficacy and critical aspects in cell therapy. Curr. Pharm. Des. 19 (13), 2459-2473 (2013).
- Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell. Rev. 7 (2), 269-291 (2011).
- Yan, J., Tie, G., Xu, T. Y., Cecchini, K., Messina, L. M. Mesenchymal stem cells as a treatment for peripheral arterial disease: current status and potential impact of type II diabetes on their therapeutic efficacy. Stem Cell. Rev. 9 (3), 360-372 (2013).
- Ringden, O., Keating, A. Mesenchymal stromal cells as treatment for chronic GVHD. Bone Marrow Transplant. 46 (2), 163-164 (2011).
- Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J. Cell. Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
- Lessard, J., et al. Generation of human adipose stem cells through dedifferentiation of mature adipocytes in ceiling cultures. J. Vis. Exp. (97), (2015).
- Lessard, J., et al. Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling. PLoS One. 10 (3), 0122065 (2015).
- Peng, X., et al. Phenotypic and Functional Properties of Porcine Dedifferentiated Fat Cells during the Long-Term Culture In Vitro. Biomed. Res. Int. 2015, 673651 (2015).
- Kono, S., Kazama, T., Kano, K., Harada, K., Uechi, M., Matsumoto, T. Phenotypic and functional properties of feline dedifferentiated fat cells and adipose-derived stem cells. Vet. J. 199 (1), 88-96 (2014).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
