Abstract
Tissue Engineering und Zelltherapie vielversprechend klinisch. In dieser Hinsicht multipotenten Zellen wie mesenchymalen Stammzellen (MSCs), können therapeutisch, in naher Zukunft wieder herzustellen Funktion geschädigte Organe verwendet. Dennoch einige technische Probleme, einschließlich der hochinvasiven Verfahren von MSCs und die Ineffizienz rund um ihre Verstärkung zu isolieren, behindern gegenwärtig die möglichen klinischen Verwendung dieser therapeutischen Modalitäten. Hierin stellen wir eine hocheffiziente Methode zur Erzeugung von dedifferenzierten Fettzellen (DFAT), MSC-ähnlichen Zellen. Interessanterweise kann DFAT Zellen in verschiedene Zelltypen, einschließlich adipogenen, osteogenen, chondrogenen Zellen und differenzieren. Obwohl andere Gruppen zuvor verschiedene Verfahren zur Erzeugung von DFAT Zellen aus reifen Fettgewebe präsentiert haben, unsere Methode ermöglicht es uns, mehr DFAT Zellen effizient zu produzieren. In dieser Hinsicht zeigen wir, dass DFAT Kulturmedium (DCM), ergänzt mit 20% FBS,ist wirksamer DFAT Zellen bei der Erzeugung als DMEM, ergänzt mit 20% FBS. Zusätzlich können die Zellen durch DFAT unserem Zellkulturverfahren hergestellt in verschiedene Gewebetypen redifferenziert werden. Als solche ein sehr interessantes und nützliches Modell für die Untersuchung von Gewebe Dedifferenzierung dargestellt.
Introduction
Die Zelltherapie und Tissue Engineering sind heiße Themen auf dem Gebiet der regenerativen Medizin 1-5. Während diese therapeutischen Modalitäten großes Versprechen halten, die derzeit einige technische Probleme, ihre klinische Anwendung behindern. In diesem Zusammenhang ist, wie bei der Erzeugung von iPS-Zellen, alle Therapien Tissue Engineering müssen Zellen frei von äußeren Gen Transduktionen produzieren, um die Sicherheit der Patienten zu gewährleisten. Dementsprechend waren wir die erste Gruppe erfolgreich menschliche DFAT Zellen produzieren 6. Mehrere andere Arbeitsgruppen haben unsere Methode , da angenommen DFAT Zellen von Säugetieren 7-9, weiter hervorheben , die Nützlichkeit unseres Modells zu generieren.
Im Laufe von mehreren Studien haben wir festgestellt, dass die Qualität der Zellkulturumgebung durch Einstellen des Inhalts des Zellmediums verändert werden. Diese Erkenntnis hat zu einer Erhöhung der Erfolgsrate von DFAT Zellproduktion geführt und Zellqualität verbessert; beide kritischen Faktoren ineffizient Zellen für zukünftige klinische Studien zu generieren. In dieser Hinsicht verbesserte einer DFAT Kulturmedium (DCM, ein Medium ähnliche Zellmedium stammen mesenchymalen, die rekombinantes humanes Insulin, Serumalbumin, L-Glutaminsäure, verschiedene Fettsäuren und Cholesterin enthält) und ein Verfahren zur DFAT Zellgeneration und Proliferation wurde entwickelt (weitere Informationen über den Inhalt von DCM ist auf Anfrage erhältlich). Mit dieser Methode hohe Qualität DFAT Zellen wurden mit der Fähigkeit, erzeugt in verschiedene Zelltypen, einschließlich adipogenen, osteogenen und chondrogenen Zellen zu differenzieren. Insgesamt verbessert diese validierten Zellkultur Protokoll, um die Qualität der DFAT Zellen und kann zur Verbesserung der klinischen Anwendung der Zelltherapie und Tissue Engineering sehr nützlich sein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Proben von menschlichem subkutanen Fettgewebes wurden von Patienten in der Chirurgie in der Abteilung für Plastische Chirurgie, Urologie, Kinderchirurgie und Orthopädische Chirurgie der Nihon Universität Itabashi Hospital (Tokyo, Japan) erhalten. Die Patienten gaben informierte Zustimmung geschrieben, und die Ethikkommission der Nihon University School of Medicine der Studie zugelassen.
1. Gewebepräparation
- Bringen Sie die Gewebeprobe aus dem Operationssaal zu Labor.
- Wash 1-2 g Fettgewebe mit 5 ml PBS (-) bei Raumtemperatur (RT) einmal, in einem 50-ml-Röhrchen und dann die Probe in einem 10 cm Plastikschale.
2. Collagenaseverdau
- Entfernen der Probe aus der PBS (-), dann werden 10 ml steriler 0,1% (w / v) Lösung Kollagenase (Kollagenase Typ II) in die Schale der Gewebeprobe enthält.
- Mince das Gewebe mit einer chirurgischen Schere für etwa 15 Minuten, bis er eine pürierte erreicht bestehenparenz.
- Anschließend verdauen das zerkleinerte Gewebe in dem 0,1% (w / v) Kollagenase-Lösung bei 37 ° C für 30 min (60 rpm) in einem 50 ml Röhrchen unter leichtem Schütteln auf einem Schüttler.
- Filtern Sie die aufgeschlossene Probe durch ein 100 um-Filter in ein 50 ml Röhrchen. Als nächstes wurden 10 ml DCM passieren mit 2% FBS durch den Filter ergänzt (siehe Tabelle der Materialien).
3. Zell Isolation
- Zentrifugieren der filtrierten Zellen bei 100 · g für 1 min bei RT.
- An dieser Stelle vorbereiten 5 ml DCM mit 2% FBS in einer 50-ml-Tube ergänzt.
- die schwimmenden Fettzellen unter Verwendung einer 1000 ul Pipette und fügen Sie die Zellen in ein 50 ml Röhrchen, das Medium Als nächstes erstellen.
- Anschließend schütteln Sie die 50-ml-Röhrchen vorsichtig das DCM-Medium mit den Zellen zu mischen.
- Zentrifuge dann das Rohr bei 100 × g für 1 min bei RT.
- Verwerfen das Medium an der Unterseite des Rohrs eine 18 G-Nadel und einer 20 ml Spritze.
- Als nächstes werden 10 ml DCM supplemented mit 2% FBS zu den gesammelten Zellen.
- Mischen Sie die DCM mit den Zellen durch Schütteln des 50-ml-Röhrchen sanft.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 100 g für 1 min bei RT.
4. Plating Cells
- Hinzufügen 41 ml DCM oder DMEM, supplementiert mit 20% FBS auf eine 12,5 cm-Kolben.
- Als nächstes wird unter Verwendung einer 200 ul Pipette 40 ul Fettzellen in den Kolben hinzufügen.
- Dann füllen Sie den Kolben mit DCM oder DMEM mit 20% FBS ergänzt. Kritischste Schritt: An dieser Stelle sicher, dass die Zellen im gesamten Medium verteilt sind. Eine Sichtprüfung der abgelösten Zellen und danach den Kolben eines runden Petrischale auf dem Deckel halten es flach zu halten.
- Schließlich wird der Kolben im Inkubator und lassen Sie es für 7 Tage bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator ungestört.
- Nach einer Woche Inkubation kehren die Kolben und prüfen, ob DFAT Zellen. Als nächstes beurteilen Tüchtigkeit DFAT Zellgeneration wie seit fibrobl an dieser Stelle 10 beschriebenast-ähnlichen Zellen (DFAT Zellen) werden in den Regionen unterscheiden sich von Fettzellen.
- 5 ml DCM oder DMEM, supplementiert mit 20% FBS in den Kolben der früheren Zellkulturmedium nach der Entfernung. Lassen Sie die DFAT Zellen für eine weitere Woche zu wachsen, nachdem das Medium verändert.
- Mit Hilfe eines Zellzählers, zählen die Anzahl der DFAT unter verschiedenen Zellkulturbedingungen (DCM gegen DMEM) erzeugten Zellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dieser Studie wurde das Verfahren und das Toolkit für DFAT Zellgeneration verbessert (Abbildung 1). Unser Verfahren ermöglicht es uns , DFAT Zellen sowohl mit DCM und DMEM - Medium , das 20% FBS (2A) zu erzeugen. Als solche verglichen wir die Effizienz von DCM und DMEM DFAT Zellen zu erzeugen. In dieser Hinsicht verbesserte DCM DFAT Zellproliferation durch drei Mal , wenn auf DMEM verglichen, unabhängig von der Anzahl von Adipozyten (2A und B). Unter Verwendung von 20% FBS verbessert auch das Zellwachstum im Vergleich zu den Protokollen unter Verwendung von 10% FBS (Daten nicht gezeigt). Wir bestätigten ferner , daß DFAT Zellen unter Verwendung von DCM haben die Fähigkeit , hergestellt in Adipozyten zu Redifferenzierung und in Osteoblasten (Abbildung 3) unterscheiden. Das Verfahren für die Assays ist in unserer früheren Studie 6 beschrieben.
7 / 54177fig1.jpg "/>
Abb . 1: Eine schematische Darstellung der Isolierung, Entdifferenzierung und Kultur von reifen Adipozyten Ein kleines Stück Fettgewebe wurde mit 0,1% Kollagenase verdaut. Nach der Zentrifugation wurden unilokuläre Adipozyten aus der Schwimmschicht isoliert. Die isolierten Zellen wurden in Kolben gefüllt mit 20% FBS-Medium für 7 Tage enthält. Während der Kultur, die Zellen befestigt und abgeflacht auf die obere Oberfläche der Kolben und dann DFAT Zellen umgewandelt wurden. Als nächstes wurden die Kolben wurden umgedreht und DFAT Zellen unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren kultiviert. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: DCM verbessert DFAT Zellgeneration. (
Abbildung 3:. Multilineage Potential von DFAT Zellen Menschliche erzeugt DFAT Zellen unter Verwendung von DCM waren für 3 Wochen in den entsprechenden Induktionsmedien kultiviert , die Redifferenzierung und Differenzierungsfähigkeiten von DFAT Zellen zu bewerten. Die cells wurden für osteogene (ALP und Alizarin Rot S) analysiert, adipogenetische (Öl rot-O) Kapazität. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ältere Adipozyten , die in vitro Dedifferenzierung, ein Verfahren bekannt , als Deckenkultur unterzogen werden , können zu einer primitiveren Phänotyp zurückkehren und proliferativen Fähigkeiten gewinnen. Diese Zellen werden als dedifferenzierte Fett (DFAT) -Zellen bezeichnet. Die multilineage Differenzierungspotential von DFAT Zellen wurde bewertet. Durchflusszytometrie Analyse und Genexpressionsanalyse ergab , dass DFAT Zellen im Vergleich zu ASCS 6 sehr homogen waren. In der Tat ist das Zelloberflächenantigen Profil von DFAT Zellen , ähnlich den in ASCs gefunden 6. Dementsprechend kann DFAT Zellen funktionieren ähnlich wie MSCs.
Die andere Gruppe , die DFAT Zellen erfolgreich erzeugt hat 7-8 eine DMEM F12 Zellkulturmedium genutzt , ergänzt mit 20% Kälberserum. Obwohl wir DFAT Zellen mit einem Zellkulturmedium mit 10% FBS, die Anzahl der Zellen erzeugt DFAT mit diesem Protokoll war signifikant niedriger als w ergänzt herzustellen versuchtHenne mit 20% FBS ergänzt (Daten nicht gezeigt). Daher ist die FBS-Konzentration und / oder ihr Inhalt wichtig für entweder Dedifferenzierung von DFAT Zellen und / oder Proliferation von Zellen DFAT. Im Rahmen einer zukünftigen Studie, werden wir versuchen, weiter zu den Mechanismus aufzuklären, durch die Serumgehalt DFAT Zellgeneration und die Proliferation regelt. Auf der anderen Seite enthält DCM weniger Glucose, Fettsäuren und andere Chemikalien als das DMEM in unserer Studie verwendet. Diese Variabilität in Zellkulturmedium Bestandteile können die Effizienz von sowohl DFAT Zellgeneration und Wachstum modulieren. In der Tat etwas niedriger Glucosekonzentration, die Effizienz der DFAT Zellgeneration verbessert bei Verwendung von DMEM (Daten nicht gezeigt). Obwohl die genauen Mechanismen DCM Wirkung zugrunde liegen auf DFAT Zellgeneration und das Wachstum nicht bekannt sind, postulieren wir hier, dass die Konzentration von bestimmten Medium Bestandteile dieser zellulären Ereignisse antreibt. Weitere Studien sind erforderlich, diesen Punkt zu klären. Darüber hinaus haben, da wir eine limite getestetd Anzahl von DMEM Formulierungen sind weitere Experimente erforderlich , um die Effizienz von anderen DMEM Variationen (zB DMEM , das L-Glutamin oder Pyridoxin) in der Herstellung von DFAT Zellen zu vergleichen.
Obwohl wir DFAT Zellen sind in der Lage zu produzieren, ist die molekularen Mechanismen, regeln DFAT Zellgeneration noch unklar. Ähnliche Fragen umgeben die Herstellung von iPS - Zellen 11. Als solche klinische Anwendung dieser therapeutischen Modalitäten wird die weitere Erforschung von Zell staatlichen Regulierungsmechanismen erfordern. Dementsprechend sind wir davon überzeugt, dass DFAT Zellen ein Modell zur Verfügung stellen für die Aufklärung, wie Zellen auf einer Stammzelle ähnlichen Zustand zurückkehren, frei von äußeren Gen Transduktionen. DFAT Zellproduktion Protokolle sind daher werden derzeit in zukünftigen klinischen Studien für den Einsatz optimiert.
richtig beide ausgeführt werden, die Kollagenase Behandlung und Fettzellisolierung sicherzustellen, ist ein wichtiger Faktor bei der erfolgreichen DFAT Zellen zu erzeugen unter Verwendung dieses Protokolls. Appropriate Verwendung einer feinen Schere und Entfernung von Blasen während der Kultur auch Hilfe DFAT Zellproliferation bei der Verbesserung.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CSTI303-MSC medium | CSTI | 87-671 | This medium is defined as DCM in the text |
| PBS(-) | Wako | 166-23555 | It does not contain Mg2+ and Ca2+ |
| DMEM medium | Gibco | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 172012 | |
| Collagenase type II | Sigma | C-6885 | |
| Scissors | Takasago Medical Industry Co., Ltd | TKZ-F2194-1 | |
| Shaker | TAITEC | Bioshaker V.BR-36 | |
| Falcon Cell Strainer 100 μm Yellow | CORNING LIFE SCIENCES | DL 352360 | |
| Falcon 12.5 cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Blue Vented Screw Cap | CORNING LIFE SCIENCES | 353107 | |
| 18 G needle | NIPRO | 02-002 | |
| 20 ml Syringe | NIPRO | 08-753 | |
| Z Series Coulter Counter | BECKMAN COULTER | 383550 |
References
- Lanzoni, G., et al. Concise review: clinical programs of stem cell therapies for liver and pancreas. Stem Cells. 31 (10), 2047-2060 (2013).
- de Girolamo, L., et al. Mesenchymal stem/stromal cells: a new "cells as drugs" paradigm. Efficacy and critical aspects in cell therapy. Curr. Pharm. Des. 19 (13), 2459-2473 (2013).
- Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell. Rev. 7 (2), 269-291 (2011).
- Yan, J., Tie, G., Xu, T. Y., Cecchini, K., Messina, L. M. Mesenchymal stem cells as a treatment for peripheral arterial disease: current status and potential impact of type II diabetes on their therapeutic efficacy. Stem Cell. Rev. 9 (3), 360-372 (2013).
- Ringden, O., Keating, A. Mesenchymal stromal cells as treatment for chronic GVHD. Bone Marrow Transplant. 46 (2), 163-164 (2011).
- Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J. Cell. Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
- Lessard, J., et al. Generation of human adipose stem cells through dedifferentiation of mature adipocytes in ceiling cultures. J. Vis. Exp. (97), (2015).
- Lessard, J., et al. Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling. PLoS One. 10 (3), 0122065 (2015).
- Peng, X., et al. Phenotypic and Functional Properties of Porcine Dedifferentiated Fat Cells during the Long-Term Culture In Vitro. Biomed. Res. Int. 2015, 673651 (2015).
- Kono, S., Kazama, T., Kano, K., Harada, K., Uechi, M., Matsumoto, T. Phenotypic and functional properties of feline dedifferentiated fat cells and adipose-derived stem cells. Vet. J. 199 (1), 88-96 (2014).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
