Abstract
Tissue engineering og celleterapi holde store løftet klinisk. I denne forbindelse, kan multipotente celler, slik som stamceller (MSC), anvendes terapeutisk, i nær fremtid, for å gjenopprette funksjon til skadede organer. Likevel, flere tekniske problemer, blant annet den svært invasiv prosedyre for å isolere MSC og ineffektiviteten rundt sin forsterkning, for tiden hemme den potensielle klinisk bruk av disse terapeutiske modaliteter. Heri, innfører vi en svært effektiv metode for generering av dedifferensierte fettceller (DFAT), MSC-lignende celler. Interessant, kan DFAT celler bli differensiert i flere celletyper, inkludert adipogenic, osteogene, og chondrogenic celler. Selv om andre grupper som tidligere har presentert ulike metoder for å generere DFAT celler fra modne fettvev, vår metode tillater oss å produsere DFAT cellene mer effektivt. I denne forbindelse, viser vi at DFAT kulturmedium (DCM), supplert med 20% FBS,er mer effektive i å generere DFAT celler enn DMEM, supplert med 20% FBS. I tillegg kan de DFAT celler som produseres av vår celledyrkningsmetode blir redifferentiated i flere typer vev. Som sådan, er en meget interessant og nyttig modell for studiet av vev dedifferentiation presentert.
Introduction
Celleterapi og tissue engineering er hot tema innen regenerativ medisin 1-5. Selv om disse terapeutiske modaliteter holde store løftet, flere tekniske problemer for øyeblikket hemme deres klinisk bruk. I denne forbindelse, som i genereringen av iPS celler, må alle vev konstruksjons terapier produsere celler fri for eksterne genet transductions for å opprettholde pasientens sikkerhet. Derved var vi den første gruppen for å kunne produsere menneskelige DFAT celler 6. Flere andre forskningsgrupper har siden vedtok vår metode for å generere DFAT celler med opphav hos pattedyr 7-9, ytterligere fremhever nytten av vår modell.
I løpet av flere studier er det funnet at kvaliteten av cellekulturen miljø kan modifiseres ved å justere innholdet av cellemediet. Dette funnet har ført til en økning i suksessrate på DFAT celleproduksjon og forbedret celle kvalitet; både kritiske faktorer ieffektivt generere celler for fremtidige kliniske studier. I denne forbindelse, en forbedret DFAT kulturmedium (DCM, et medium i likhet med mesenchymale stamceller medium, som inneholder rekombinant humant insulin, serum albumin, L-glutaminsyre, flere fettsyrer og kolesterol) og en fremgangsmåte for å DFAT cellegenerering og spredning ble utviklet (mer informasjon om innholdet i DCM er tilgjengelig på forespørsel). Ved hjelp av denne metoden høykvalitets DFAT celler ble samlet med evnen til å differensiere til en rekke celletyper, inkludert adipogenic, osteogene og chondrogenic celler. Til sammen øker dette validert cellekultur protokoll kvaliteten DFAT celler og kan være ganske nyttig for å styrke kliniske anvendelser av celleterapi og tissue engineering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prøver av menneskelig underhudsfett ble innhentet fra pasienter som gjennomgår kirurgi i Institutt for plastisk kirurgi, urologi, Pediatric Surgery og ortopediske inngrep i Nihon-universitetet Itabashi Hospital (Tokyo, Japan). Pasientene ga skriftlig informert samtykke, og etikkomiteen av Nihon University School of Medicine godkjent studiet.
1. Tissue Forberedelse
- Ta med vevsprøve fra operasjonsstuen til laboratoriet.
- Vask 1-2 g fettvev med 5 ml PBS (-) ved romtemperatur (RT) en gang, i en 50 ml tube og deretter plassere prøven i en 10 cm plastskål.
2. Collage Fordøyelse
- Fjern prøven fra PBS (-), og deretter legge til 10 ml steril 0,1% (vekt / volum) kollagenase oppløsning (Collagenase type II) til skålen som inneholdt den vevsprøve.
- Hakke vevet med kirurgiske sakser i ca. 15 minutter, inntil den når en most beståsering.
- Deretter fordøye det oppmalte vev i 0,1% (vekt / volum) kollagenase-løsning ved 37 ° C i 30 min (60 rpm) i et 50 ml rør med forsiktig risting på en ristemaskin.
- Filtrer den fordøyd prøven gjennom et 100 um filter over i et 50 ml rør. Deretter passerer 10 ml DCM (se tabell of Materials) supplert med 2% FBS gjennom filteret.
3. Cell Isolation
- Sentrifuger de filtrerte cellene ved 100 xg i 1 min ved RT.
- På dette punktet, fremstille 5 ml DCM supplert med 2% FBS i et 50 ml rør.
- Deretter utarbeide de flytende fettcellene ved hjelp av en 1000 mL pipette og tilsett cellene til en 50 ml tube inneholder medium.
- Deretter rist 50 ml rør forsiktig for å blande DCM medium med cellene.
- Deretter, sentrifuger røret ved 100 xg i 1 min ved RT.
- Kast medium ved bunnen av røret ved å bruke en 18 G nål og en 20 ml sprøyte.
- Deretter legger 10 ml DCM supplemented med 2% FBS til de innsamlede cellene.
- Bland DCM med cellene ved å riste 50 ml rør forsiktig.
- Sentrifuger rør ved 100 xg i 1 min ved RT.
4. Plating Cells
- Legg 41 ml DCM eller DMEM supplert med 20% FBS i en 12,5 cm kolbe.
- Deretter ved bruk av en 200 ul pipette legge til 40 mL av fettceller til kolben.
- Deretter fylles kolben med DCM eller DMEM supplert med 20% FBS. KRITISK STEP: På dette punktet, sørge for at cellene er spredt over hele mediet. Visuell kontroll av frittliggende celler og etterpå holde flasken på lokket av en runde petriskål for å holde den flat.
- Til slutt, plasser kolben inne i kuvøse og la den uforstyrret i en 5% CO 2 inkubator ved 37 ° C i 7 dager.
- Etter en uke med inkubasjon, snu flasken og se etter DFAT celler. Deretter vurdere DFAT celle generasjon ferdigheter som beskrevet 10 siden på dette punktet fibroblAST-lignende celler (DFAT celler) er lokalisert i områder skiller seg fra fettcellene.
- Tilsett 5 ml DCM eller DMEM supplert med 20% FBS til kolben etter fjerning av de foregående cellekulturmedium. La de DFAT cellene til å vokse i en uke etter å ha endret mediet.
- Ved hjelp av en celleteller, teller antall DFAT celler oppnådd under ulike celledyrkningsforhold (DCM vs. DMEM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne studien ble metoden og verktøykasse for DFAT celle generasjon forbedret (Figur 1). Vår metode tillater oss å generere DFAT celler ved hjelp av både DCM og DMEM medium som inneholder 20% FBS (figur 2A). Som sådan, sammenlignet vi effektiviteten av DCM og DMEM i å generere DFAT celler. I denne forbindelse, DCM forbedret DFAT celleproliferasjon med tre ganger sammenlignet med DMEM, uavhengig av antall adipocytter (figur 2A og B). Anvendelse av 20% FBS fremmer også celleveksten i forhold til protokoller ved hjelp av 10% FBS (data ikke vist). Vi videre bekreftet at DFAT celler produseres ved hjelp av DCM har muligheten til å redifferentiate inn adipocytter og differensiere til osteoblaster (figur 3). Fremgangsmåten for analysene er beskrevet i vårt tidligere studium 6.
7 / 54177fig1.jpg "/>
Fig. 1: Et skjematisk viser den isolerings, dedifferentiation, og kulturen av modne adipocytter En liten del av fettvev ble spaltet med 0,1% kollagenase. Etter sentrifugering ble adipocytter-kammer isolert fra det flytende sjiktet. De isolerte celler ble dyrket i kolber som er fylt med medium inneholdende 20% FBS i 7 dager. Under kultur ble cellene festet og flatet til den øvre overflate av kolbene og deretter ble omdannet til DFAT celler. Deretter ble flaskene snudd og DFAT celler ble dyrket ved hjelp av konvensjonelle metoder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: DCM forbedrer DFAT celle generasjon. (
Figur 3:. Multilineage potensialet DFAT celler menneske DFAT celler generert ved hjelp DCM ble dyrket i 3 uker i de aktuelle induksjons media for å evaluere redifferentiation og differensierings evner DFAT celler. den calen ble analysert for osteogene (ALP og Alizarin rød S), adipogenic (Oil rød-O) kapasitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modne adipocytter som gjennomgår in vitro dedifferentiation, en prosess som kalles tak kultur, kan gå tilbake til en mer primitiv fenotype og få proliferativ evner. Disse cellene er referert til som dedifferensieres fett (DFAT) celler. Den multilineage differensiering potensialet til DFAT celler ble evaluert. Flow cytometri analyse og genuttrykk analyse viste at DFAT celler var svært homogen i forhold til ASCer 6. Faktisk er den celle-overflateantigenet profil DFAT celler meget lik dem som finnes i ASCer 6. Følgelig kan DFAT celler fungere på samme måte som MSC.
Den andre gruppe som har med hell generert DFAT celler benyttes et DMEM F12 cellekulturmedium supplert med 20% kalveserum 7-8. Selv om vi forsøkte å fremstille DFAT celler ved hjelp av et cellekulturmedium supplert med 10% FBS, antallet DFAT celler som produseres med denne protokollen var signifikant lavere enn whøne supplert med 20% FBS (data ikke vist). Derfor er det FBS konsentrasjonen og / eller dens innhold viktig for enten dedifferentiation av DFAT celler og / eller proliferasjon av celler DFAT. Som en del av en fremtidig studie, vil vi forsøke å ytterligere belyse den mekanismen som serum innhold regulerer DFAT celle generasjon og spredning. På den annen side inneholder mindre DCM glukose, fettsyrer og andre kjemikalier enn de DMEM anvendt i vårt studium. Denne variasjonen i cellekulturmedium bestanddeler kan modulere effektiviteten av både DFAT celledannelse og vekst. Faktisk, lav glukosekonsentrasjon øker svakt effektiviteten av DFAT cellegenerering ved bruk av DMEM (data ikke vist). Selv om de nøyaktige mekanismer som ligger under DCM effekt på DFAT celledannelse og vekst er ukjente, postulerer vi her at konsentrasjonen av enkelte mellomstore bestanddeler driver disse cellulære hendelsene. Videre studier er nødvendig for å avklare dette punktet. Dessuten, siden vi har testet en Limited antall DMEM formuleringer, er videre eksperimenter pålagt å sammenligne effektiviteten av andre DMEM variasjoner (f.eks DMEM inneholder L-glutamin eller pyridoksin) i å produsere DFAT celler.
Selv om vi er i stand til å produsere DFAT celler, de molekylære mekanismene som styrer DFAT celle generasjon er fortsatt uklart. Lignende spørsmål omgir produksjonen av iPS celler 11. Som sådan klinisk bruk av disse terapeutiske modaliteter vil kreve ytterligere utforskning av cellen statlige reguleringsmekanismer. Derfor tror vi på det sterkeste at DFAT celler gi en modell for å belyse hvordan cellene tilbake til en stamcellelignende tilstand, uten eksterne genet transductions. DFAT celle produksjonsprotokoller er derfor optimalisert for tiden for bruk i fremtidige kliniske studier.
Sikre at kollagenase behandling og fett celle isolasjon er begge utført riktig er en nøkkelfaktor i vellykket generere DFAT celler ved hjelp av denne protokollen. ca.opriate bruk av fine saks og fjerning av bobler under kultur også hjelpe til med å forbedre DFAT celleproliferasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CSTI303-MSC medium | CSTI | 87-671 | This medium is defined as DCM in the text |
| PBS(-) | Wako | 166-23555 | It does not contain Mg2+ and Ca2+ |
| DMEM medium | Gibco | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 172012 | |
| Collagenase type II | Sigma | C-6885 | |
| Scissors | Takasago Medical Industry Co., Ltd | TKZ-F2194-1 | |
| Shaker | TAITEC | Bioshaker V.BR-36 | |
| Falcon Cell Strainer 100 μm Yellow | CORNING LIFE SCIENCES | DL 352360 | |
| Falcon 12.5 cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Blue Vented Screw Cap | CORNING LIFE SCIENCES | 353107 | |
| 18 G needle | NIPRO | 02-002 | |
| 20 ml Syringe | NIPRO | 08-753 | |
| Z Series Coulter Counter | BECKMAN COULTER | 383550 |
References
- Lanzoni, G., et al. Concise review: clinical programs of stem cell therapies for liver and pancreas. Stem Cells. 31 (10), 2047-2060 (2013).
- de Girolamo, L., et al. Mesenchymal stem/stromal cells: a new "cells as drugs" paradigm. Efficacy and critical aspects in cell therapy. Curr. Pharm. Des. 19 (13), 2459-2473 (2013).
- Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell. Rev. 7 (2), 269-291 (2011).
- Yan, J., Tie, G., Xu, T. Y., Cecchini, K., Messina, L. M. Mesenchymal stem cells as a treatment for peripheral arterial disease: current status and potential impact of type II diabetes on their therapeutic efficacy. Stem Cell. Rev. 9 (3), 360-372 (2013).
- Ringden, O., Keating, A. Mesenchymal stromal cells as treatment for chronic GVHD. Bone Marrow Transplant. 46 (2), 163-164 (2011).
- Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J. Cell. Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
- Lessard, J., et al. Generation of human adipose stem cells through dedifferentiation of mature adipocytes in ceiling cultures. J. Vis. Exp. (97), (2015).
- Lessard, J., et al. Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling. PLoS One. 10 (3), 0122065 (2015).
- Peng, X., et al. Phenotypic and Functional Properties of Porcine Dedifferentiated Fat Cells during the Long-Term Culture In Vitro. Biomed. Res. Int. 2015, 673651 (2015).
- Kono, S., Kazama, T., Kano, K., Harada, K., Uechi, M., Matsumoto, T. Phenotypic and functional properties of feline dedifferentiated fat cells and adipose-derived stem cells. Vet. J. 199 (1), 88-96 (2014).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
