Abstract
Тканевая инженерия и клеточная терапия весьма перспективны клинически. В связи с этим, мультипотентных клетки, такие как мезенхимальные стволовые клетки (МСК), может быть использовано в терапевтических целях, в ближайшем будущем, для восстановления функции поврежденных органов. Тем не менее, некоторые технические вопросы, в том числе весьма инвазивной процедуры выделения MSCs и неэффективностью окружающих их усиление, в настоящее время препятствуют потенциальное клиническое применение этих терапевтических методов. Здесь мы вводим высокоэффективный метод для генерации дедифференцированных жировых клеток (DFAT), МСЦ-подобных клеток. Интересно отметить, что DFAT клетки могут быть дифференцированы в нескольких типах клеток, включая Adipogenic, остеогенных и хондрогенных клеток. Хотя другие группы ранее были представлены различные методы для создания клеток DFAT из зрелой жировой ткани, наш метод позволяет более эффективно производить клетки DFAT. В связи с этим, мы показали, что DFAT культуральную среду (ДХМ), дополненной 20% ФБС,более эффективен в создании клеток DFAT чем DMEM, дополненной 20% FBS. Кроме того, клетки, полученные DFAT нашим методом культивирования клеток может быть повторно дифференцироваться в несколько типов ткани. Таким образом, очень интересная и полезная модель для изучения дифференцировке тканей представлена.
Introduction
Клеточная терапия и тканевая инженерия являются горячие темы в области регенеративной медицины 1-5. В то время как эти терапевтические методы весьма перспективны, несколько технических вопросов, в настоящее время препятствуют их клинического применения. В связи с этим, как и в поколении плюрипотентных клеток, все тканевой инженерии терапии должны продуцировать клетки в отсутствие внешних каскадов, генов для того, чтобы поддерживать безопасность пациента. Соответственно, мы были первой группой , чтобы успешно производить клетки DFAT человека 6. Несколько других исследовательских групп , так как принят наш метод для создания DFAT клетки млекопитающего 7-9, дополнительно подчеркивая полезность нашей модели.
В течение нескольких исследований, мы обнаружили, что качество окружающей среды для культивирования клеток, может быть изменена путем корректировки содержания клеточной среды. Это открытие привело к увеличению скорости успеха производства DFAT клеток и улучшение качества клеток; оба решающими факторамиэффективно создания клеток для будущих клинических испытаний. В связи с этим, улучшенной DFAT культуральной среды (ДХМ, среду, подобную мезенхимальных стволовых клеток среду, которая содержит рекомбинантный человеческий инсулин, сывороточный альбумин, L-глутаминовую кислоту, несколько жирных кислот и холестерина), и способ для генерации DFAT клеток и пролиферация была разработана (более подробную информацию о содержании DCM предоставляется по запросу). С помощью этого метода высокого качества DFAT клетки генерировались с возможностью дифференцироваться в несколько типов клеток, в том числе Adipogenic, остеогенных и хондрогенных клеток. В целом, это подтверждено протоколом культуры клеток повышает качество клеток DFAT и может быть весьма полезным для повышения клинического применения клеточной терапии и тканевой инженерии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Образцы человеческого подкожной жировой клетчатки были получены от пациентов, перенесших операцию в департаментах пластической хирургии, урологии, детской хирургии и ортопедической хирургии Университета Нихон Итабаси больницы (Токио, Япония). Пациенты дали письменное информированное согласие, а Комитет по этике Университета Нихон Медицинской школы одобрил исследование.
1. Подготовка ткани
- Доведите образец ткани из операционной в лабораторию.
- Мытье 1-2 г жировой ткани с 5 мл PBS (-) при комнатной температуре (RT) один раз, в 50 мл пробирку, а затем поместить образец в 10 см пластиковую чашку.
2. коллагеназы
- Извлеките образец из PBS (-), а затем добавляют 10 мл стерильного 0,1% (вес / объем) раствора коллагеназы (коллагеназа типа II), в чашку, содержащую образец ткани.
- Фарш ткани с хирургическими ножницами в течение примерно 15 мин, пока она не достигнет протертые состоятьобразность.
- Впоследствии переваривать измельченной ткани в 0,1% (вес / объем) раствора коллагеназы при 37 ° С в течение 30 мин (60 оборотов в минуту) в 50 мл пробирку с осторожном встряхивании на качалке.
- Фильтр Расщепленный образец через фильтр с размером 100 мкм в 50 мл пробирку. Затем пройти 10 мл ДХМ (см таблицу материалов) , дополненной 2% FBS через фильтр.
3. Выделение клеток
- Центрифуга отфильтрованные клетки при 100 мкг в течение 1 мин при комнатной температуре.
- На данный момент, подготовить 5 мл ДХМ с добавлением 2% FBS в 50 мл пробирку.
- Затем, нарисуйте вверх плавающих жировых клеток с помощью 1000 мкл пипетку и добавьте клетки 50 мл пробирку, содержащую среду с.
- Впоследствии, встряхнуть 50 мл пробирку осторожно перемешать среду DCM с клетками.
- Затем, отцентрифугировать пробирку при 100 х г в течение 1 мин при комнатной температуре.
- Откажитесь среды в нижней части трубки, используя 18 г иглу и 20 мл шприца.
- Затем добавляют 10 мл DCM supplemented с 2% FBS в собранных клеток.
- Смешайте DCM с клетками путем встряхивания 50 мл трубку осторожно.
- Отцентрифугировать пробирку при 100 х г в течение 1 мин при комнатной температуре.
4. Покрытие клетки
- Добавить 41 мл ДХМ или DMEM, дополненной 20% FBS до 12,5 см колбу.
- Далее, используя 200 мкл пипеткой добавляют 40 мкл жировых клеток в колбу.
- Затем заполнить колбу с DCM или DMEM, дополненной 20% FBS. ШАГ КРИТИЧЕСКОЕ: На данный момент, убедитесь, что клетки разбросаны по всей среде. Визуально проверьте отдельные клетки, а затем держать колбу на крышке круглой чашке Петри, чтобы держать его квартиру.
- Наконец, колбу помещают внутри инкубатора и оставить его ненарушенных в 5% CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 7 дней.
- После недельной инкубации, инвертировать колбу и проверять клетки DFAT. Затем оценить DFAT поколение клеток знания , как описано 10 , так как в этой точке fibroblAST-подобные клетки (DFAT клетки) расположены в регионах, отличных от жировых клеток.
- Добавляют 5 мл ДХМ или DMEM с добавлением 20% FBS в колбу после удаления предыдущей клеточной культуральной среды. Дайте клеткам DFAT расти еще на одну неделю после того, как изменения среды.
- С помощью счетчика клеток, подсчитывают количество клеток DFAT, генерируемых при различных условиях культивирования клеток (ДХМ против DMEM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом исследовании, метод и инструментарий для генерации DFAT клеток была улучшена (Рисунок 1). Наш метод позволяет генерировать клетки DFAT использованием как DCM и среды DMEM , содержащей 20% FBS (рис 2А). Таким образом, мы сравнили эффективность DCM и DMEM в формировании клеток DFAT. В связи с этим ДХМ усиленной пролиферации клеток DFAT в три раза по сравнению с DMEM, независимо от количества адипоцитов (фиг.2А и В). Использование 20% FBS, также усиливает рост клеток по сравнению с протоколами, с использованием 10% FBS (данные не показаны). Кроме того , мы подтвердили , что клетки , полученные с использованием DFAT DCM обладают способностью redifferentiate в адипоциты и дифференцироваться в остеобласты (рисунок 3). Метод анализов описан в нашем предыдущем исследовании 6.
7 / 54177fig1.jpg "/>
На рисунке 1:. Схематическое изображение выделения, дедифференцировку, и культура зрелых адипоцитов Небольшой кусочек жировой ткани, переваривают 0,1% коллагеназы. После центрифугирования однокамерные адипоциты были изолированы от плавающего слоя. Выделенные клетки культивировали в колбах, заполненных средой, содержащей 20% FBS, в течение 7 дней. Во время культивирования клетки прикреплены и уплощенная к верхней поверхности колбы, а затем были преобразованы в клетки DFAT. Затем Колбы переворачивают и DFAT клетки культивировали с использованием обычных способов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: ДХМ усиливает генерацию DFAT клеток. (
Рис . 3: мультилинейной потенциал клеток DFAT клетки человека DFAT , сгенерированные с помощью ДХМ культивировали в течение 3 -х недель в соответствующих индукционных средах для оценки повторной дифференцировки и дифференцировки способности клеток DFAT. сБыли проанализированы гезов для остеогенных (ALP и ализарин красный S), липогенный (масло красно-O) мощности. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Зрелые адипоциты , которые проходят в пробирке дедифференциации, процесс , известный как потолок культуры, может вернуться к более примитивным фенотипа и получить пролиферативные способности. Эти клетки называются дедифференцируются жир (DFAT) клеток. Мультилинейной дифференциацию потенциал клеток DFAT оценивали. Проточная цитометрия анализ и анализ экспрессии генов показал , что DFAT клетки были весьма однородны по сравнению с ИСС 6. На самом деле, клетка-поверхностный антиген профиль клеток DFAT очень похожа на те , что в ИСС 6. Соответственно, DFAT клетки могут функционировать подобно MSCs.
Другая группа , которая успешно генерироваться клетки DFAT использовали DMEM F12 , среда для культивирования клеток , дополненной 20% сыворотки теленка 7-8. Несмотря на то, мы пытались получить клетки DFAT с использованием клеточной культуральной среде, содержащей 10% FBS, количество клеток DFAT, произведенных с этим протоколом была значительно ниже, чем Wкурица, дополненной 20% FBS (данные не показаны). Таким образом, концентрация ФБС и / или его содержание имеет важное значение для любого дифференцировке клеток DFAT и / или пролиферации клеток DFAT. В рамках будущего исследования, мы попытаемся выяснить в дальнейшем механизм, посредством которого содержание в сыворотке крови поколения клеток регулирует DFAT и пролиферацию. С другой стороны, ДХМ содержит меньше глюкозы, жирных кислот и других химических веществ, чем DMEM, используемый в нашем исследовании. Эта изменчивость в среде для культивирования клеток компоненты могут модулировать эффективность как генерации клеток DFAT и роста. На самом деле, низкая концентрация глюкозы незначительно повышает эффективность генерации DFAT клеток при использовании DMEM (данные не показаны). Хотя точные механизмы, лежащие в основе эффекта смесь хлористого метилена по генерации клеток DFAT и роста неизвестны, мы допускаем здесь, что концентрация некоторых средних составляющих приводит в этих клеточных событий. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы прояснить этот момент. Кроме того, так как мы тестировали LIMITEd количество составов DMEM, дальнейшие эксперименты необходимы , чтобы сравнить эффективность других вариаций DMEM (например, DMEM , содержащий L-глутамина или пиридоксин) в клетки , продуцирующие DFAT.
Несмотря на то, что мы в состоянии производить клетки DFAT, молекулярные механизмы, регулирующие формирование DFAT клеток до сих пор неясно. Подобные вопросы производства плюрипотентных клеток 11. В качестве такого клинического применения этих терапевтических методов потребует дальнейшего изучения регуляторных механизмов состояния клетки. Соответственно, мы считаем, что DFAT клетки представляют собой модель для выяснения, как клетки возвращаются к стволовые клетки, как состояние, свободна от внешних каскадов, генов. производство клеток протоколы DFAT поэтому, оптимизируется в настоящее время для использования в будущих клинических испытаниях.
Обеспечение изоляции обработки коллагеназой и жировых клеток оба выполнены должным образом является ключевым фактором в успешной генерации клеток DFAT с использованием этого протокола. проверopriate использование тонких ножниц и удаления пузырьков во время культивирования также способствуют повышению пролиферации клеток DFAT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CSTI303-MSC medium | CSTI | 87-671 | This medium is defined as DCM in the text |
| PBS(-) | Wako | 166-23555 | It does not contain Mg2+ and Ca2+ |
| DMEM medium | Gibco | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 172012 | |
| Collagenase type II | Sigma | C-6885 | |
| Scissors | Takasago Medical Industry Co., Ltd | TKZ-F2194-1 | |
| Shaker | TAITEC | Bioshaker V.BR-36 | |
| Falcon Cell Strainer 100 μm Yellow | CORNING LIFE SCIENCES | DL 352360 | |
| Falcon 12.5 cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Blue Vented Screw Cap | CORNING LIFE SCIENCES | 353107 | |
| 18 G needle | NIPRO | 02-002 | |
| 20 ml Syringe | NIPRO | 08-753 | |
| Z Series Coulter Counter | BECKMAN COULTER | 383550 |
References
- Lanzoni, G., et al. Concise review: clinical programs of stem cell therapies for liver and pancreas. Stem Cells. 31 (10), 2047-2060 (2013).
- de Girolamo, L., et al. Mesenchymal stem/stromal cells: a new "cells as drugs" paradigm. Efficacy and critical aspects in cell therapy. Curr. Pharm. Des. 19 (13), 2459-2473 (2013).
- Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell. Rev. 7 (2), 269-291 (2011).
- Yan, J., Tie, G., Xu, T. Y., Cecchini, K., Messina, L. M. Mesenchymal stem cells as a treatment for peripheral arterial disease: current status and potential impact of type II diabetes on their therapeutic efficacy. Stem Cell. Rev. 9 (3), 360-372 (2013).
- Ringden, O., Keating, A. Mesenchymal stromal cells as treatment for chronic GVHD. Bone Marrow Transplant. 46 (2), 163-164 (2011).
- Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J. Cell. Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
- Lessard, J., et al. Generation of human adipose stem cells through dedifferentiation of mature adipocytes in ceiling cultures. J. Vis. Exp. (97), (2015).
- Lessard, J., et al. Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling. PLoS One. 10 (3), 0122065 (2015).
- Peng, X., et al. Phenotypic and Functional Properties of Porcine Dedifferentiated Fat Cells during the Long-Term Culture In Vitro. Biomed. Res. Int. 2015, 673651 (2015).
- Kono, S., Kazama, T., Kano, K., Harada, K., Uechi, M., Matsumoto, T. Phenotypic and functional properties of feline dedifferentiated fat cells and adipose-derived stem cells. Vet. J. 199 (1), 88-96 (2014).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
